RU2093574C1

RU2093574C1 - Strain of hybrid cultured cells mus musculus l used for preparing monoclonal antibody raised to pig jgg

Info

Publication number: RU2093574C1
Application number: RU95104960A
Authority: RU
Inventors: О.А. Верховский; Ю.Н. Федоров; Т.А. Феоктистова
Original assignee: Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им.Я.Р.Коваленко
Priority date: 1995-03-31
Filing date: 1995-03-31
Publication date: 1997-10-20
Also published as: RU95104960A

Abstract

FIELD: veterinary biotechnology. SUBSTANCE: invention relates to preparing the strain of hybrid cultured murine cells producing monoclonal antibodies raised to pig IgG. Strain is obtained by fusion of murine splenocytes of the strain Balb/c immunized with pig IgG with myeloma P3-X63-Ag8-653 cells. Antibodies relate to isotype IgG2b, show precipitating activity and high specificity with respect to pig IgG. Invention can be used for development of diagnostic reagents for detection of pig IgG in biological fluids. EFFECT: strain indicated above, enhanced effectiveness of detection. 1 tbl

Description

Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, в частности, к получению штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела, которые могут быть использованы для приготовления высокоспецифических диагностических реагентов с целью идентификации и количественного определения уровня иммуноглобулинов G класса в биологических жидкостях организма свиньи. The invention relates to the field of veterinary biotechnology, in particular, to a strain of hybrid cells producing monoclonal antibodies that can be used to prepare highly specific diagnostic reagents in order to identify and quantify the level of G class immunoglobulins in biological fluids of the pig body.

В настоящее время существует два основных иммунохимических метода для идентификации и количественного определения уровня иммуноглобулинов животных: радиальной иммунодиффузии (РИД) и иммуноферментный (ИФА). В качестве основных иммунодиагностических реагентов в них используются поликлональные антисыворотки или моноклональные антитела. Currently, there are two main immunochemical methods for the identification and quantification of the level of animal immunoglobulins: radial immunodiffusion (RID) and enzyme immunoassay (ELISA). As the main immunodiagnostic reagents, they use polyclonal antisera or monoclonal antibodies.

Известно, что штамм гибридных клеток, полученных из одного клона, является постоянным продуцентом антител строго определенной специфичности. It is known that a strain of hybrid cells derived from a single clone is a constant producer of antibodies of strictly defined specificity.

Необходимость данной работы обусловливается важной ролью иммуноглобулинов в инфекционной и неинфекционной патологии животных. При этом большое значение приобретают исследования, связанные с изучением основных иммунных механизмов и роли различных классов иммуноглобулинов при вирусных и бактериальных инфекциях животных, с определением уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови и других биологических жидкостях организма, Ig-содержащих клеток в тканях, для оценки характера иммунного ответа и иммунологического статуса. The need for this work is due to the important role of immunoglobulins in infectious and non-infectious animal pathologies. At the same time, studies related to the study of the main immune mechanisms and the role of various classes of immunoglobulins in viral and bacterial infections of animals, with the determination of the level of immunoglobulins in blood serum and other body fluids, Ig-containing cells in tissues, are of great importance for assessing the nature of the immune response and immunological status.

Известен штамм гибридных клеток, продуцирующий моноклональные антитела к IgG крупного рогатого скота [1] Моноклональные антитела данного клона относятся к изотипу IgG₁ и обладают высокой активностью и специфичностью в ИФА.A known strain of hybrid cells producing monoclonal antibodies to cattle IgG [1] Monoclonal antibodies of this clone belong to the IgG ₁ isotype and have high activity and specificity in ELISA.

Известен также штамм гибридных клеток, продуцирующий моноклональные антитела к IgG свиньи [2] Штамм был получен путем слияния спленоцитов иммунных мышей BALB/c с клетками миеломы Sp 2/0. Моноклональные антитела, продуцируемые этой гибридомой, относятся к IgG₁ изотипу, обладают высокой активностью и специфичностью в ИФА, но не обладают преципитирующей активностью.A hybrid cell strain producing monoclonal antibodies against pig IgG is also known [2]. The strain was obtained by fusion of splenocytes of BALB / c immune mice with Sp 2/0 myeloma cells. Monoclonal antibodies produced by this hybridoma belong to the IgG ₁ isotype, have high activity and specificity in ELISA, but do not possess precipitating activity.

Технический результат заключается в получении штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к иммуноглобулину класса G свиньи и обладающих преципитирующей активностью. The technical result consists in obtaining a strain of hybrid cells producing monoclonal antibodies to pig immunoglobulin class G and having precipitating activity.

Штамм гибридных клеток получен путем слияния клеток мышиной миеломы линии P3-X6 3-Ag8-653 с клетками периферических лимфатических узлов (паховых и подколенных) мышей линии BALB/c, иммунизированных двукратно (100 мкг) IgG, выделенным из сыворотки крови свиньи хроматографическими методами. Слияние клеток проводили через 3 дня после последней инъекции антитела по стандартной методике с использованием ПЭГ с М.м.1500. Клетки миеломы и лимфоциты смешивали в соотношении 1: 4-1: 10. Селекцию гибридом проводили на среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Гибридомы культивировали на 96-луночных панелях (фирма "Nunc") на среде RPMI-1640 или ДЖЕМ с 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота в атмосфере с 5% CO₂.The hybrid cell strain was obtained by fusion of mouse P3-X6 3-Ag8-653 mouse myeloma cells with cells of peripheral lymph nodes (inguinal and popliteal) BALB / c mice immunized with twice (100 μg) IgG isolated from pig serum by chromatographic methods. Cell fusion was performed 3 days after the last injection of the antibody according to the standard method using PEG with M.m. 1500. Myeloma cells and lymphocytes were mixed in a ratio of 1: 4-1: 10. Selection of hybridomas was performed on a medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine. Hybridomas were cultured in 96-well panels (Nunc) in RPMI-1640 or JEM with 10% fetal bovine serum in an atmosphere with 5% CO ₂ .

Скрининг гибридом на продукцию специфических моноклональных антител проводили методами непрямого твердофазного ИФА и РИД с использованием антивидовых иммунопероксидазоных конъюгатов, а также препарата, содержащего иммунохимически чистый IgG свиньи. Клонирование и реклонирование клеточных культур проводили на 96-луночных панелях методом предельных разведений с использованием макрофагального фидерного слоя. Hybridomas were screened for the production of specific monoclonal antibodies by indirect solid-phase ELISA and RID using antiviral immunoperoxidase conjugates, as well as a preparation containing immunochemically pure pig IgG. Cloning and cloning of cell cultures was carried out on 96-well panels by the method of limiting dilutions using a macrophage feeder layer.

В результате был отобран и размножен клон, продуцирующий моноклональные антитела к IgG свиньи, которые реагировали с IgG в ИФА и РИД, перекрестные реакции с иммуноглобулинами других классов отсутствовали. Этот клон клеток последовательно размножен в 96-, 24-луночных панелях, а затем в культуральных матрасах. Культуральная жидкость была исследована на содержание специфических антител. Титр специфических антител в ИФА составлял 1:640. Препараты моноклональных антител получали 2-х кратным осаждением раствором сульфата аммония 50% насыщения с последующим диализом. Была определена классовая принадлежность и специфичность моноклональных антител в ИФА, иммуноблоттинге, РДП, иммуноэлектрофорезе. As a result, a clone producing monoclonal antibodies to pig IgG that reacted with IgG in ELISA and RID was selected and propagated; there were no cross-reactions with immunoglobulins of other classes. This clone of cells is sequentially propagated in 96-, 24-well panels, and then in culture mattresses. The culture fluid was tested for specific antibodies. The titer of specific antibodies in ELISA was 1: 640. Monoclonal antibody preparations were obtained by 2-fold precipitation with a solution of ammonium sulfate 50% saturation followed by dialysis. The class affinity and specificity of monoclonal antibodies in ELISA, immunoblotting, RDP, immunoelectrophoresis was determined.

Предложенный штамм гибридных клеток мышей Mus.Musculus L. ВСКК(П) N 550 Д, продуцент моноклональных антител к IgG свиньи обладает следующими свойствами. The proposed strain of hybrid cells of mice Mus.Musculus L. mice. VSCK (P) N 550 D, a producer of monoclonal antibodies to pig IgG has the following properties.

Морфологические признаки. Клетки округлой формы с большим ядром, хорошо прикрепляются к субстрату, размножаются на поверхности субстрата и частично в суспензии. Morphological signs. Round-shaped cells with a large nucleus, attach well to the substrate, multiply on the surface of the substrate and partially in suspension.

Культуральные свойства. Клетки перевивают один раз в 2-3 дня с полной заменой ростовой среды с коэффициентом 1:2-1:4. Cultural properties. Cells are transplanted once every 2-3 days with a complete replacement of the growth medium with a coefficient of 1: 2-1: 4.

Характеристика культуры на животных. Клетки вызывают образование асцитов у линейных мышей BALB/c, обработанных пристаном за 7-10 дней до внутрибрюшинного введения 2-10•10⁶ клеток/мышь.Characterization of animal culture. Cells cause the formation of ascites in linear BALB / c mice treated with piers 7-10 days prior to intraperitoneal administration of 2-10 x 10 ⁶ cells / mouse.

Контаминация. Тесты на микоплазмы, бактерии, плесневые грибы и дрожжи - отрицательны. Contamination. Tests for mycoplasmas, bacteria, molds and yeast are negative.

Изотип продуцируемых моноклональных антител IgG_2b.Isotype of IgG monoclonal antibodies produced _2b .

Хранение культур. Среда для замораживания: 90%-эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 10%-диметилсульфоксида. Режим замораживания: до -70^oC 1^o/мин, далее жидкий азот (-196^oC). Восстановление после размораживания: быстрое размораживание при +37^oC, центрифугирование при 1200 об/мин 10 мин, ресуспендирование в ростовой среде до концентрации 0,3-0,5•10⁶ кл/мл. Жизнеспособность после размораживания 70-80%
Пример 1. Клетки клона пассировали на среде ДМЕМ с 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 4 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глютамина в атмосфере с 5% CO₂. Титр специфических моноклональных антител в культуральной жидкости в ИФА составил 1:640, в РДП 1:2.Storage of crops. Freezing medium: 90% fetal bovine serum, 10% dimethyl sulfoxide. Freezing mode: up to -70 ^o C 1 ^o / min, then liquid nitrogen (-196 ^o C). Recovery after thawing: rapid thawing at +37 ^o C, centrifugation at 1200 rpm for 10 min, resuspension in a growth medium to a concentration of 0.3-0.5 • 10 ⁶ cells / ml. Vitality after thawing 70-80%
Example 1. Clone cells were passaged in DMEM medium with 10% fetal bovine serum, 4 mM sodium pyruvate, 2 mM L-glutamine in an atmosphere with 5% CO ₂ . The titer of specific monoclonal antibodies in the culture fluid in ELISA was 1: 640, in RDP 1: 2.

Пример 2. Клетки клона вводили в брюшную полость линейных мышей BALB/c, предварительно за 7 суток праймированным 0,3 мл пристана по 2-10•10⁶ клеток/мышь в 0,5 мл фосфатно-солевого буфера. На 10-14 сутки получена асцитическая жидкость, титр специфических моноклональных антител в которой составлял в ИФА 1:10⁵, в РДП 1:32.Example 2. Clone cells were injected into the abdomen of linear BALB / c mice, preliminarily primed for 7 days with 0.3 ml of pristan, 2-10 x 10 ⁶ cells / mouse in 0.5 ml of phosphate-buffered saline. An ascitic fluid was obtained on days 10-14, the titer of specific monoclonal antibodies in which amounted to 1:10 ⁵ in ELISA, 1:32 in RDP.

Пример 3. Препараты моноклональных антител, полученные из асцитической жидкости двукратным осаждением раствором сульфата аммония 50% насыщения, были использованы в качестве реагентов в радиальной иммунодиффузии. Антитела, меченные пероксидазой, были использованы в качестве конъюгата в ИФА. Титр конъюгированных антител составил 1:200 в ИФА. Все препараты моноклональных антител были исследованы на специфичность с использованием различных иммунохимических методов. Example 3. Monoclonal antibody preparations obtained from ascitic fluid by double precipitation with a solution of 50% saturation of ammonium sulfate were used as reagents in radial immunodiffusion. Peroxidase-labeled antibodies were used as conjugate in ELISA. The titer of conjugated antibodies was 1: 200 in ELISA. All monoclonal antibody preparations were tested for specificity using various immunochemical methods.

Табл. 1. Определение специфичности моноклональных антител в радиальной иммунодиффузии, ИФА, иммуноэлектрофорезе и иммуноблоттинге с использованием различных антигенов. Tab. 1. Determination of the specificity of monoclonal antibodies in radial immunodiffusion, ELISA, immunoelectrophoresis and immunoblotting using various antigens.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о строгой специфической моноклональных антител полученного штамма к IgG свиньи. The results obtained allow us to conclude that there is a strict specific monoclonal antibody of the obtained strain to pig IgG.

Предложенный штамм апробирован нами с положительным результатом в лабораторных условиях с 1991 по 1994 год. The proposed strain was tested by us with a positive result in laboratory conditions from 1991 to 1994.

Штамм гибридных клеток мышей Mus.Musculus L. N ВСКК(П) 549 Д продуцент моноклональных антител к IgG свиньи хранится в Коллекции клеточных культур Института Цитологии г. Санкт-Петербурга под N ВСКК(П) 550 Д. The strain of hybrid cells of mice Mus.Musculus L. N VSCK (P) 549 D producer of monoclonal antibodies to pig IgG is stored in the Cell Culture Collection of the Institute of Cytology of St. Petersburg under N VSCK (P) 550 D.

Штамм является продуцентом моноклональных антител специфически реагирующих только с IgG свиньи и не дающих перекрестных реакций с иммуноглобулинами других классов. The strain is a producer of monoclonal antibodies that specifically react only with pig IgG and do not cross-react with other classes of immunoglobulins.

Наработку моноклональных антител можно проводить в неограниченном количестве. Моноклональные антитела являются препаратом, имеющим стандартные характеристики. The production of monoclonal antibodies can be carried out in unlimited quantities. Monoclonal antibodies are drugs that have standard characteristics.

Штамм может быть использован в научно-исследовательских институтах, проблемных лабораториях, ведущих работы в области иммунологии и биотехнологии. The strain can be used in research institutes, problem laboratories, leading work in the field of immunology and biotechnology.

Препараты моноклональных антител, полученных из асцитической жидкости, можно использовать для идентификации и количественного определения уровня IgG свиньи методом радиальной иммунодиффузии (РИД) и в иммуноферментном анализе (ИФА). Monoclonal antibody preparations obtained from ascitic fluid can be used to identify and quantify pig IgG levels by radial immunodiffusion (RID) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Источники информации. Sources of information.

1. Williams D.J.L. Newson J. and Naessens J. Quantitation of bovine immunoglobulin isotypes and allotypes using monoclonal antibodies.- Vet.Immunol.Immunopathol. 1990, 24: 267-283. 1. Williams D.J.L. Newson J. and Naessens J. Quantitation of bovine immunoglobulin isotypes and allotypes using monoclonal antibodies. - Vet. Immmunol. Immmunopathol. 1990, 24: 267-283.

2. Van Zaan D. and Hulst M.M. Monoclonal antibodies against porcine immunoglobulin isotypes. Vet. Immunol. Immunophatol. 1987, 16: 23-26. (прототип). 2. Van Zaan D. and Hulst M.M. Monoclonal antibodies against porcine immunoglobulin isotypes. Vet. Immunol. Immunophatol. 1987, 16: 23-26. (prototype).

Claims

The strain of hybrid cultured cells of Mus musculus L. VSCK (P) N 550 D used to obtain monoclonal antibodies to pig IgG.