CS255235B1

CS255235B1 - Mouse lymphocyte hybrid producing antibody against human transferrin receptor

Info

Publication number: CS255235B1
Application number: CS867010A
Authority: CS
Inventors: Ivan Hilgert; Stojan Stojanov; Hana Kristofova; Pavla Angelisova; Vaclav Horejsi
Original assignee: Ivan Hilgert; Stojan Stojanov; Hana Kristofova; Pavla Angelisova; Vaclav Horejsi
Priority date: 1986-09-30
Filing date: 1986-09-30
Publication date: 1988-02-15
Also published as: CS701086A1

Abstract

Řešení se týká myšího lymfocytárního hybridomu, produkujícího protilátku proti lidskému transferinovému receptoru, uloženého ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením IMG CZAS MEM-75. Monoklonální protilátka hybridomu MEM-75 je vhodná pro použití v enzymoimunologické analýze nebo nepřímé imunofluorescenční analýze lidského transferinového receptoru přítomného na lidských proliferujíclch buňkách.The solution concerns a mouse lymphocyte hybridoma producing an antibody against the human transferrin receptor, stored in the hybridoma collection of the Institute of Molecular Genetics of the Czechoslovak Academy of Sciences under the designation IMG CZAS MEM-75. The monoclonal antibody of the hybridoma MEM-75 is suitable for use in enzyme-immunological analysis or indirect immunofluorescence analysis of the human transferrin receptor present on human proliferating cells.

Description

Vyn41ez se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myší myelomové linie Sp2/O-Agl4 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkujícího protilátku proti lidskému transferinovému receptoru (tj. membránovému antigenu T9 přítomnému na lidských prolifeřujícich buňkách). Počet proliferujících buněk v periferní krvi se při imunodeficiencíoh a jiných patologických stavech liší od fyziologické normy.The invention relates to a novel hybridoma, i.e., a hybrid unicellular organism, constructed by fusing a mouse myeloma cell line Sp2 / O-Ag14 and a mouse spleen lymphoid cell producing an antibody against the human transferrin receptor (i.e., the T9 membrane antigen present on human proliferating cells). The number of proliferating cells in peripheral blood differs from physiological norm in immunodeficiency and other pathological conditions.

Protilátky proti antigenům přítomným na určité subpopulaci buněk se nedají připravit 'přímou imunizací zvířat buněčnou suspenzí lymfocytů nebo membránovou frakcí, tj. konvenční imunizací. Konvenční imunizace má neodstranitelnou nevýhodu v tom, že séra obsahují protilátky proti mnoha membránovým antigenům, z nichž některé jsou přítomny na více typech buněk; séra proto nelze použit k jemnému rozlišení buněčných typů a tříd. Příprava čistého antigenu bez kontaminace jinými membránovými komponentami k imunizaci je pracná a většinou neúspěšná.Antibodies against antigens present on a particular subpopulation of cells cannot be prepared by direct immunization of animals with a cell suspension of lymphocytes or membrane fraction, i.e., conventional immunization. Conventional immunization has the unavoidable disadvantage that sera contain antibodies against many membrane antigens, some of which are present on multiple cell types; sera cannot therefore be used to subtly differentiate cell types and classes. Preparation of pure antigen without contamination with other membrane components for immunization is laborious and mostly unsuccessful.

Nevýhody konvenčních sér proti membránovým antigenům v principu odstraňuje použití hybrídomové technologie. Produkt hybridomu - monoklonální protilátka - je zaměřena vždy proti jediné antigenní determinantě. Je-li konstruován dostatečně velký soubor hybridomů, je pravděpodobné, že se z něho podaří vyhledat hybridom syntetizující protilátku, která rozeznává antigenní determinantu charakterizující určitý typ nebo třídu či pod třídu lymfocytů.The disadvantages of conventional sera against membrane antigens in principle are eliminated by the use of hybridoma technology. The hybridoma product - a monoclonal antibody - is directed against a single antigenic determinant. If a sufficiently large set of hybridomas is constructed, it is likely to be able to identify an antibody-synthesizing hybridoma that recognizes an antigenic determinant characterizing a particular type or class or lymphocyte class.

Je řada antigenů na T lymfocytech, které se liší molekulární hmotností, chemickou strukturou a fyziologickou funkci. K detailní analýze antigenů na T lymfocytech je nezbytně nutné mít protilátky proti oo největšímu počtu membránových antigenů. Podle publikovaných výsledků (Kung, P. C., Talie, M. A., DeMaria, M.E., Butler, M. S., Lifter, J., Goldstein, G.: Strategies for generating monoclonal antibodies defining human T-lymphocyte differentiation antigens. Transplant. Proč. 12, Suppl. 1: 141-146, 1980) se dá soudit, že lze připravit monoklonální protilátky specificky detegující různé antigeny lymfocytů.There are a number of antigens on T lymphocytes that differ in molecular weight, chemical structure and physiological function. For detailed analysis of antigens on T lymphocytes, it is essential to have antibodies against the largest number of membrane antigens. According to published results (Kung, PC, Talie, MA, DeMaria, ME, Butler, MS, Lifter, J., Goldstein, G .: Strategies for generating monoclonal antibodies defining human T-lymphocyte differentiation antigens. Transplant. Proc. 12, Suppl 1: 141-146, 1980), it can be concluded that monoclonal antibodies specifically detecting various lymphocyte antigens can be prepared.

Podstatného pokroku v diagnostice lidských lymfocytů, projevujícího se vyšší spolehlivostí analytického výsledku, se dosáhne, je-li k dispozici hybridom, produkující monoklonální protilátku proti transferinovému receptoru přítomnému na lidských proliferujících buňkách, uložená ve Sbírce hybridomů Ostavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská č. 1 083, pod označením IMG CZAS MEM-75.Substantial progress in the diagnosis of human lymphocytes, manifested by higher reliability of the analytical result, will be achieved when a hybridoma producing a monoclonal antibody against the transferrin receptor present on human proliferating cells is available, deposited in the Collection of Hybridomas of the Institute of Molecular Genetics of the Czechoslovak Academy of Sciences. No. 1,083, under the designation IMG CZAS MEM-75.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Fazekas de St. Groth, Scheidegger, D.: Production of monoclonal antibodies: Stratégy and tactics, J. Immunol.Said hybridoma was obtained by a method known in the literature (Fazekas de St. Groth, Scheidegger, D .: Production of monoclonal antibodies: Strategies and tactics, J. Immunol.

Meth., 35:1-21, 1980; Galfré, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard,Meth., 35: 1-21 (1980); Galfré, G., Howe, S.C., Milstein, C., Butcher, G.W., Howard,

J. C.: Antibodies to major histocompatibility antigens produoed by hybrid cell lineš,J. C .: Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines,

Nátuře, 266: 550, 1977, klonováním souboru hybridních buněk, získaných· ze sleziny myší kmene BALB/c imunizovaných buňkami leukemické linie NALM-6, na jejichž membráně je exprimován transferinový receptor.Nature, 266: 550, 1977, by cloning a set of hybrid cells obtained from the spleen of BALB / c mice immunized with cells of the leukemia lineage of NALM-6 on whose membrane a transferrin receptor is expressed.

Výhodou hybridomu je, že produkuje homogenní protilátku monoklonální, která je schopna specificky reagovat s lidskými proliferujícími buňkami. Hybridom NEM-75 je možné kultivovat In vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší' kmene BALB/c. Z konzerv, uchovávaných v kapalném dusíku, je možno zahájit produkci protilátky bez dalšího antigenu. Protilátka, produkovaná hybridomem MEM-75, reaguje specificky s proliferujícími lidskými buňkami a není třeba se zbavovat protilátek balastnich.The advantage of the hybridoma is that it produces a homogeneous monoclonal antibody that is capable of specifically reacting with human proliferating cells. The NEM-75 hybridoma can be cultured in vitro in animal cell media and is adapted for growth in vivo in the peritoneal cavity of BALB / c mice. From cans stored in liquid nitrogen, antibody production can be started without additional antigen. The antibody produced by the hybridoma MEM-75 reacts specifically with proliferating human cells and does not need to be rid of ballast antibodies.

PříkladExample

Za účelem pomnoženi hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno 3 x 10^ buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 14 dní před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem (0,5 ml intraperitoneálně).To expand the hybridoma cells in vivo, 3 x 10 6 cells were injected into the peritoneal cavity of mice. To improve attachment of the cells applied, the mouse was treated with paraffin oil (0.5 ml intraperitoneally) 14 days prior to transfer of the hybridoma cells.

Po 8 dnech hybridomu v peritoneální dutině byla myš uhubena a naprodukovaná ascitická tekutina odebrána. Celkem bylo získáno 2,5 ml ascitioké tekutiny, která obsahovala 10 mg/ml imunoglobulinu. Monoklonální protilátka reagovala specificky s proliferujícími buňkami periferní krve v nepřímém enzymoimunologickém testu a testu nepřímé imunofluotescence. Proliferující buňky byly připraveny následovně: suspenze lymfocytů byla izolována gradientovou centrifugací na Ficoll-Verografinu popsanou metodou (Béyum, A.: Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand. J. Immunol. 5, Suppl. 5:9, 1976). Získané lymfocyty byly 48 hod. inkubovány v tkáňové kultuře s polyspecifickým mitogenem - lektinem concanavalinem A (Con A).After 8 days of hybridoma in the peritoneal cavity, the mouse was exterminated and the produced ascites fluid was collected. A total of 2.5 ml of ascitioca fluid containing 10 mg / ml immunoglobulin was obtained. The monoclonal antibody reacted specifically with proliferating peripheral blood cells in the indirect enzyme immunoassay and indirect immunofluotescence assay. Proliferating cells were prepared as follows: lymphocyte suspension was isolated by gradient centrifugation on Ficoll-Verografin as described (Beyum, A., Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand. J. Immunol. 5, Suppl. 5: 9, 1976). The lymphocytes obtained were incubated in tissue culture with polyspecific mitogen - lectin concanavalin A (Con A) for 48 hours.

Bylo použito 10® lymfocytů, 15 jug Con A na 1 ml tkáňového média s přídavkem 10% hovězího séra. V populaci lymfocytů z periferní krve normálních jedinců jsme detegovali 1-3 % pozitivních buněk jak s monoklonální protilátkou MEM-75, tak s monoklonální protilátkou B3/25. Kromě proliferujícich lymfocytů reaguje monoklonální protilátka MEM-75 s buňkami mnoha lidských leukemických linií,-které mají exprimovaný na své plasmatické membráně transferinový receptor. Monocyty, granulocyty a erytrocyty s protilátkou MEM-75 nereagovaly. Specifita protilátky MEM-75 je identická s monoklonální protilátkou B3/25 (popsanou v práci Omary, Μ. B., Trowbridge, I. C Minowada, J.: Human cell-surface glycoprotein with unusual properties. Nátuře 286:888-890, 1980), jak bylo prokázáno opakovanými paralelními stanoveními (viz. tabulka).10 lymf lymphocytes, 15 µg Con A per ml tissue medium were added with 10% bovine serum. In the peripheral blood lymphocyte population of normal individuals, we detected 1-3% positive cells with both the MEM-75 monoclonal antibody and the B3 / 25 monoclonal antibody. In addition to proliferating lymphocytes, the monoclonal antibody MEM-75 reacts with cells of many human leukemic lines that are expressed on their plasma membrane by a transferrin receptor. Monocytes, granulocytes and erythrocytes did not react with MEM-75. The specificity of MEM-75 is identical to monoclonal antibody B3 / 25 (described in Omary, B., Trowbridge, I.C Minowada, J .: Human cell-surface glycoprotein with unusual properties. Nature 286: 888-890, 1980) as demonstrated by repeated parallel assays (see table).

Tab. Reaktivita protilátek produkovaných hybridomem MEM-75 a B3/25 s různými populacemi buněkTab. Reactivity of antibodies produced by hybridoma MEM-75 and B3 / 25 with different cell populations

Typ použitých % pozitivních buněk buněk MEM-75 Type of% positive cells used cells MEM-75 reagujících s monoklonální protilátkou v nepřímém imunofluorescenčním testu BE/25 reacting with the monoclonal antibody in an indirect immunofluorescence assay BE / 25 lymfocyty z normál, jedinců lymphocytes from normal, individuals 1-3 1-3 1-3 1-3 monocyty monocytes <1 <1 <1 <1 granulocyty granulocytes <1 <1 < 1 <1 Con A aktivované lymfocyty Con A activated lymphocytes >90 > 90 >90 > 90

K průkazu, že protilátka MEM-75 rozpoznává transferinový receptor na povrchu proliferujících buněk, bylo použito dvou přístupů:Two approaches have been used to demonstrate that MEM-75 recognizes a transferrin receptor on the surface of proliferating cells:

a) Monoklonální protilátka MEM-75 precipitova.1 a z povrchově jodovaných [^²³I^-NaI buněk (Morrison, M.: Lactoperoxidase-catalyzed iodination as a tool for investigation of proteins. Methods Enzymol. 70:214-220, 1980) (leukemické linie· MOLT-4) antigenní frakci o mol. hmotnosti 180 kDa za neredukujících a 90 kDa za redukujících podmínek, prokázané pomocí elektroforetické analýzy v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecyl sulfátu sodného; mol. hmotnost této antigenní frakce odpovídá mol. hmotnosti transferinovébo receptoru.a) Monoclonal antibody MEM-75 precipitated from surface iodinated [ ²³ I] -NaI cells (Morrison, M .: Lactoperoxidase-catalyzed iodination as a tool for investigation of proteins. Methods Enzymol. 70: 214-220, 1980) (leukemia lines · MOLT-4) antigen fraction of mol. masses of 180 kDa under non-reducing and 90 kDa under reducing conditions, demonstrated by electrophoretic analysis in a polyacrylamide gel in the presence of sodium dodecyl sulfate; mol. the weight of this antigen fraction corresponds to mol. weight of the transferrin receptor.

b) Identita antigenů rozpoznávaných protilátkami MEM-75 a B3/25 byla prokázána tak, že antigen reagující s protilátkou MEM-75 byl nejprve přemístěn k jednomu pólu buněk MOLT-4 (leukemická linie s exprimovaným transferinovým reoeptorem), tzv. vytvoření čepiček (capping) s následným pohlcením antigenů do nitra většiny buněk a pak byla testována reaktivita takto pozměněných buněk s protilátkou B3/25. Bylo zjištěno, že po odstraněni transferinového receptoru (protilátkou MEM-75) vymizí také schopnost buněk vázat protilátku B3/25, zatímco reaktivita s protilátkou nepřibuzné specifičnosti B2M-01 (Hilgert, I., Hořejší, V., Krištofová, H.: The use of murine monoclonal antibody B2M-01 for detection and purification of human $₂-microglobulin. Fol. biol. (Praha) 30:369-376, 1984) se nezmění.b) The identity of the antigens recognized by MEM-75 and B3 / 25 was demonstrated by first moving the antigen reactive with MEM-75 to one pole of MOLT-4 cells (leukemia line with expressed transferrin reoeptor), so-called capping ) followed by uptake of the antigens into the interior of most cells, and then reactivity of the altered cells with the B3 / 25 antibody was tested. It has been found that after removal of the transferrin receptor (MEM-75 antibody), the ability of cells to bind B3 / 25 antibody also disappears, while reactivity with an antibody of unrelated specificity of B2M-01 (Hilgert, I., Hořejší, V., Krištofová, H .: The use of murine monoclonal antibody B2M-01 for the detection and purification of human $ _2- microglobulin (Fol. biol. (Prague) 30: 369-376, 1984) will not change.

Tento test byl prováděn tak, že leukemické buňky MOLT-4 byly inkubovány 30 min při 20 °C v roztoku protilátky MEM-75 a poté 60 min při 37 °C s prasečí protilátkou proti myšímu imunoglobulinu. S takto připravenými buňkami byl proveden běžný nepřímý imunofluores-i cenění test, tj. inkubace s protilátkami MEM-75, B3/25, B2M-01 a ve druhém kroku s prasečím antimyším imunoglobulínem značeným fluoresceinisothiokyanatem. Buňky byly před inkubací s následující protilátkou prómyty vždy fyziologickým roztokem.This assay was performed by incubating MOLT-4 leukemia cells for 30 min at 20 ° C in MEM-75 antibody solution and then for 60 min at 37 ° C with porcine anti-mouse immunoglobulin antibody. The cells thus prepared were subjected to a conventional indirect immunofluorescence assay, i.e. incubation with the MEM-75, B3 / 25, B2M-01 antibodies and in a second step with a fluorescein isothiocyanate-labeled anti-mouse immunoglobulin. Cells were always washed with saline prior to incubation with the following antibody.

Buňky hybridomu MEM-75 mají ultrastrukturní obraz typických myelomových buněk. In vitro rostou jako polosuspenzní kultury. Základním kultivačním médiem je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin (3mM), pyruvát sodný (1 mM). Toto médium (označované jako RPMI, Ostav molekulární genetiky ČSAV) je pro kultivaci hybridomu MEM-75 doplěno penicilinem, streptomycinem, gentamyoinem, 2-merkaptoetanolem (0,05 mM), pufrem HEPES (10 mM) a inaktivovaným hovězím sérem (Bioveta, Ivanovice na Hané, 10%) . Hybridom je kultivován při 37 °C. Střední generační čas je 16 hod. a 5 měsíců po sestrojení byl modální počet chromosomů 93.· Produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobulin podtřidy IgGl s lehkými řetězci typu kapa, její isoelektrický bod je pH 6,9-7,0.MEM-75 hybridoma cells have an ultrastructural pattern of typical myeloma cells. They grow in vitro as semi-suspension cultures. The basic culture medium is Eagle's minimum essential medium with Hanks salt mixture supplemented with non-essential amino acids, L-glutamine (3mM), sodium pyruvate (1mM). This medium (referred to as RPMI, the Institute of Molecular Genetics of the Czechoslovak Academy of Sciences) is supplemented with penicillin, streptomycin, gentamyoin, 2-mercaptoethanol (0.05 mM), HEPES buffer (10 mM) and inactivated bovine serum (Bioveta, Ivanovice) in Haná, 10%). The hybridoma is cultured at 37 ° C. The mean generation time is 16 hours and 5 months after construction, the modal number of chromosomes was 93. · The antibody produced is a monoclonal immunoglobulin of the kappa light chain subclass IgG1, its isoelectric point is pH 6.9-7.0.

Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem MEM-75 reaguje specificky s lidským transferinovým receptorem. Hybridom MEM-75 může být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky proti lidskému transferinovému receptoru v analytických metodách. Monoklonální protilátka hybridomu MEM-75 může být využita pro stanovení proliferujících buněk v periferní krvi a lymfatických orgánech při klinické diagnostice v zdravotnických zařízeních. Mezi buňky s exprimovaným transferinovým receptorem patří kmenové buňky, aktivované lymfocyty a monoho druhů nádorových buněk.The monoclonal antibody produced by the hybridoma MEM-75 reacts specifically with the human transferrin receptor. The MEM-75 hybridoma can be used industrially as a source of a monoclonal antibody against the human transferrin receptor in analytical methods. The monoclonal antibody of the hybridoma MEM-75 can be used to determine proliferating cells in peripheral blood and lymphatic organs in clinical diagnostics in healthcare facilities. Cells with the expressed transferrin receptor include stem cells, activated lymphocytes, and a variety of tumor cell types.

Claims

IMG CZAS MEM-75 mouse lymphocyte hybridoma producing a monoclonal antibody of the IgG1 subclass against the human transferrin receptor.