CS255235B1 - Myší lymfocytómí hybridem produkující protilátku proti lidskému transferinovému receptoru - Google Patents

Myší lymfocytómí hybridem produkující protilátku proti lidskému transferinovému receptoru Download PDF

Info

Publication number
CS255235B1
CS255235B1 CS867010A CS701086A CS255235B1 CS 255235 B1 CS255235 B1 CS 255235B1 CS 867010 A CS867010 A CS 867010A CS 701086 A CS701086 A CS 701086A CS 255235 B1 CS255235 B1 CS 255235B1
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
cells
mem
hybridoma
mouse
human
Prior art date
Application number
CS867010A
Other languages
English (en)
Other versions
CS701086A1 (en
Inventor
Ivan Hilgert
Stojan Stojanov
Hana Kristofova
Pavla Angelisova
Vaclav Horejsi
Original Assignee
Ivan Hilgert
Stojan Stojanov
Hana Kristofova
Pavla Angelisova
Vaclav Horejsi
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ivan Hilgert, Stojan Stojanov, Hana Kristofova, Pavla Angelisova, Vaclav Horejsi filed Critical Ivan Hilgert
Priority to CS867010A priority Critical patent/CS255235B1/cs
Publication of CS701086A1 publication Critical patent/CS701086A1/cs
Publication of CS255235B1 publication Critical patent/CS255235B1/cs

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Řešení se týká myšího lymfocytárního hybridomu, produkujícího protilátku proti lidskému transferinovému receptoru, uloženého ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením IMG CZAS MEM-75. Monoklonální protilátka hybridomu MEM-75 je vhodná pro použití v enzymoimunologické analýze nebo nepřímé imunofluorescenční analýze lidského transferinového receptoru přítomného na lidských proliferujíclch buňkách.

Description

Vyn41ez se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myší myelomové linie Sp2/O-Agl4 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkujícího protilátku proti lidskému transferinovému receptoru (tj. membránovému antigenu T9 přítomnému na lidských prolifeřujícich buňkách). Počet proliferujících buněk v periferní krvi se při imunodeficiencíoh a jiných patologických stavech liší od fyziologické normy.
Protilátky proti antigenům přítomným na určité subpopulaci buněk se nedají připravit 'přímou imunizací zvířat buněčnou suspenzí lymfocytů nebo membránovou frakcí, tj. konvenční imunizací. Konvenční imunizace má neodstranitelnou nevýhodu v tom, že séra obsahují protilátky proti mnoha membránovým antigenům, z nichž některé jsou přítomny na více typech buněk; séra proto nelze použit k jemnému rozlišení buněčných typů a tříd. Příprava čistého antigenu bez kontaminace jinými membránovými komponentami k imunizaci je pracná a většinou neúspěšná.
Nevýhody konvenčních sér proti membránovým antigenům v principu odstraňuje použití hybrídomové technologie. Produkt hybridomu - monoklonální protilátka - je zaměřena vždy proti jediné antigenní determinantě. Je-li konstruován dostatečně velký soubor hybridomů, je pravděpodobné, že se z něho podaří vyhledat hybridom syntetizující protilátku, která rozeznává antigenní determinantu charakterizující určitý typ nebo třídu či pod třídu lymfocytů.
Je řada antigenů na T lymfocytech, které se liší molekulární hmotností, chemickou strukturou a fyziologickou funkci. K detailní analýze antigenů na T lymfocytech je nezbytně nutné mít protilátky proti oo největšímu počtu membránových antigenů. Podle publikovaných výsledků (Kung, P. C., Talie, M. A., DeMaria, M.E., Butler, M. S., Lifter, J., Goldstein, G.: Strategies for generating monoclonal antibodies defining human T-lymphocyte differentiation antigens. Transplant. Proč. 12, Suppl. 1: 141-146, 1980) se dá soudit, že lze připravit monoklonální protilátky specificky detegující různé antigeny lymfocytů.
Podstatného pokroku v diagnostice lidských lymfocytů, projevujícího se vyšší spolehlivostí analytického výsledku, se dosáhne, je-li k dispozici hybridom, produkující monoklonální protilátku proti transferinovému receptoru přítomnému na lidských proliferujících buňkách, uložená ve Sbírce hybridomů Ostavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská č. 1 083, pod označením IMG CZAS MEM-75.
Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Fazekas de St. Groth, Scheidegger, D.: Production of monoclonal antibodies: Stratégy and tactics, J. Immunol.
Meth., 35:1-21, 1980; Galfré, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard,
J. C.: Antibodies to major histocompatibility antigens produoed by hybrid cell lineš,
Nátuře, 266: 550, 1977, klonováním souboru hybridních buněk, získaných· ze sleziny myší kmene BALB/c imunizovaných buňkami leukemické linie NALM-6, na jejichž membráně je exprimován transferinový receptor.
Výhodou hybridomu je, že produkuje homogenní protilátku monoklonální, která je schopna specificky reagovat s lidskými proliferujícími buňkami. Hybridom NEM-75 je možné kultivovat In vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší' kmene BALB/c. Z konzerv, uchovávaných v kapalném dusíku, je možno zahájit produkci protilátky bez dalšího antigenu. Protilátka, produkovaná hybridomem MEM-75, reaguje specificky s proliferujícími lidskými buňkami a není třeba se zbavovat protilátek balastnich.
Příklad
Za účelem pomnoženi hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno 3 x 10^ buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 14 dní před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem (0,5 ml intraperitoneálně).
Po 8 dnech hybridomu v peritoneální dutině byla myš uhubena a naprodukovaná ascitická tekutina odebrána. Celkem bylo získáno 2,5 ml ascitioké tekutiny, která obsahovala 10 mg/ml imunoglobulinu. Monoklonální protilátka reagovala specificky s proliferujícími buňkami periferní krve v nepřímém enzymoimunologickém testu a testu nepřímé imunofluotescence. Proliferující buňky byly připraveny následovně: suspenze lymfocytů byla izolována gradientovou centrifugací na Ficoll-Verografinu popsanou metodou (Béyum, A.: Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand. J. Immunol. 5, Suppl. 5:9, 1976). Získané lymfocyty byly 48 hod. inkubovány v tkáňové kultuře s polyspecifickým mitogenem - lektinem concanavalinem A (Con A).
Bylo použito 10® lymfocytů, 15 jug Con A na 1 ml tkáňového média s přídavkem 10% hovězího séra. V populaci lymfocytů z periferní krve normálních jedinců jsme detegovali 1-3 % pozitivních buněk jak s monoklonální protilátkou MEM-75, tak s monoklonální protilátkou B3/25. Kromě proliferujícich lymfocytů reaguje monoklonální protilátka MEM-75 s buňkami mnoha lidských leukemických linií,-které mají exprimovaný na své plasmatické membráně transferinový receptor. Monocyty, granulocyty a erytrocyty s protilátkou MEM-75 nereagovaly. Specifita protilátky MEM-75 je identická s monoklonální protilátkou B3/25 (popsanou v práci Omary, Μ. B., Trowbridge, I. C Minowada, J.: Human cell-surface glycoprotein with unusual properties. Nátuře 286:888-890, 1980), jak bylo prokázáno opakovanými paralelními stanoveními (viz. tabulka).
Tab. Reaktivita protilátek produkovaných hybridomem MEM-75 a B3/25 s různými populacemi buněk
Typ použitých % pozitivních buněk buněk MEM-75 reagujících s monoklonální protilátkou v nepřímém imunofluorescenčním testu BE/25
lymfocyty z normál, jedinců 1-3 1-3
monocyty <1 <1
granulocyty <1 < 1
Con A aktivované lymfocyty >90 >90
K průkazu, že protilátka MEM-75 rozpoznává transferinový receptor na povrchu proliferujících buněk, bylo použito dvou přístupů:
a) Monoklonální protilátka MEM-75 precipitova.1 a z povrchově jodovaných [^23I^-NaI buněk (Morrison, M.: Lactoperoxidase-catalyzed iodination as a tool for investigation of proteins. Methods Enzymol. 70:214-220, 1980) (leukemické linie· MOLT-4) antigenní frakci o mol. hmotnosti 180 kDa za neredukujících a 90 kDa za redukujících podmínek, prokázané pomocí elektroforetické analýzy v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecyl sulfátu sodného; mol. hmotnost této antigenní frakce odpovídá mol. hmotnosti transferinovébo receptoru.
b) Identita antigenů rozpoznávaných protilátkami MEM-75 a B3/25 byla prokázána tak, že antigen reagující s protilátkou MEM-75 byl nejprve přemístěn k jednomu pólu buněk MOLT-4 (leukemická linie s exprimovaným transferinovým reoeptorem), tzv. vytvoření čepiček (capping) s následným pohlcením antigenů do nitra většiny buněk a pak byla testována reaktivita takto pozměněných buněk s protilátkou B3/25. Bylo zjištěno, že po odstraněni transferinového receptoru (protilátkou MEM-75) vymizí také schopnost buněk vázat protilátku B3/25, zatímco reaktivita s protilátkou nepřibuzné specifičnosti B2M-01 (Hilgert, I., Hořejší, V., Krištofová, H.: The use of murine monoclonal antibody B2M-01 for detection and purification of human $2-microglobulin. Fol. biol. (Praha) 30:369-376, 1984) se nezmění.
Tento test byl prováděn tak, že leukemické buňky MOLT-4 byly inkubovány 30 min při 20 °C v roztoku protilátky MEM-75 a poté 60 min při 37 °C s prasečí protilátkou proti myšímu imunoglobulinu. S takto připravenými buňkami byl proveden běžný nepřímý imunofluores-i cenění test, tj. inkubace s protilátkami MEM-75, B3/25, B2M-01 a ve druhém kroku s prasečím antimyším imunoglobulínem značeným fluoresceinisothiokyanatem. Buňky byly před inkubací s následující protilátkou prómyty vždy fyziologickým roztokem.
Buňky hybridomu MEM-75 mají ultrastrukturní obraz typických myelomových buněk. In vitro rostou jako polosuspenzní kultury. Základním kultivačním médiem je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin (3mM), pyruvát sodný (1 mM). Toto médium (označované jako RPMI, Ostav molekulární genetiky ČSAV) je pro kultivaci hybridomu MEM-75 doplěno penicilinem, streptomycinem, gentamyoinem, 2-merkaptoetanolem (0,05 mM), pufrem HEPES (10 mM) a inaktivovaným hovězím sérem (Bioveta, Ivanovice na Hané, 10%) . Hybridom je kultivován při 37 °C. Střední generační čas je 16 hod. a 5 měsíců po sestrojení byl modální počet chromosomů 93.· Produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobulin podtřidy IgGl s lehkými řetězci typu kapa, její isoelektrický bod je pH 6,9-7,0.
Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem MEM-75 reaguje specificky s lidským transferinovým receptorem. Hybridom MEM-75 může být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky proti lidskému transferinovému receptoru v analytických metodách. Monoklonální protilátka hybridomu MEM-75 může být využita pro stanovení proliferujících buněk v periferní krvi a lymfatických orgánech při klinické diagnostice v zdravotnických zařízeních. Mezi buňky s exprimovaným transferinovým receptorem patří kmenové buňky, aktivované lymfocyty a monoho druhů nádorových buněk.

Claims (1)

  1. Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS MEM-75 produkující monoklonální protilátku podtřidy IgGl proti lidskému transferinovému receptoru.
CS867010A 1986-09-30 1986-09-30 Myší lymfocytómí hybridem produkující protilátku proti lidskému transferinovému receptoru CS255235B1 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS867010A CS255235B1 (cs) 1986-09-30 1986-09-30 Myší lymfocytómí hybridem produkující protilátku proti lidskému transferinovému receptoru

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS867010A CS255235B1 (cs) 1986-09-30 1986-09-30 Myší lymfocytómí hybridem produkující protilátku proti lidskému transferinovému receptoru

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CS701086A1 CS701086A1 (en) 1987-06-11
CS255235B1 true CS255235B1 (cs) 1988-02-15

Family

ID=5418426

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS867010A CS255235B1 (cs) 1986-09-30 1986-09-30 Myší lymfocytómí hybridem produkující protilátku proti lidskému transferinovému receptoru

Country Status (1)

Country Link
CS (1) CS255235B1 (cs)

Also Published As

Publication number Publication date
CS701086A1 (en) 1987-06-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hála et al. A monoclonal antibody reacting with a membrane determinant expressed on activated chicken T lymphocytes
CN109112113B (zh) 抗人IgG的单克隆抗体、杂交瘤细胞株、试剂盒及其应用
EP0216854A1 (en) MONOCLONAL ANTIBODIES AND TEST PROCEDURE.
CN109082413A (zh) 抗人IgG单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用
US5272058A (en) Diagnostic methods for E. histolytica
Ghebrehiwet Production and characterization of a murine monoclonal IgM antibody to human C1q receptor (C1qR).
CS255235B1 (cs) Myší lymfocytómí hybridem produkující protilátku proti lidskému transferinovému receptoru
EP1098198A1 (en) Method for the qualitative and quantitative determination of class igG human antibodies
JP5156887B2 (ja) 2−6シアリル6−スルホ糖鎖に対する抗体
Førre et al. A study of the variable heavy chain (VH) region of membrane-bound Ig on human chronic leukemic lymphocytes
Kerbel et al. [8] Detection of Fc receptors
CS253687B1 (cs) Myší lymfocytární hybridom IMG CZA3 MEM-57
CS255234B1 (cs) Myší lymfocytárnl hybridem produkující protilátku proti společnému antigenu lidských akutních lymfoblastických leukémií
CS264752B1 (cs) Myií lymfocytémf hybridem IMG CZASMEM-31
Langenscheidt et al. Quantitation of platelet antigens after chloroquine treatment
CS244396B1 (cs) Myší lymfocytární hybridom IMG + CZAS + MEM - 32
CS252450B1 (cs) Myěí lymfocytární hybrldom IMG SZAS HL-40
CS248382B1 (cs) Myší lymfocytární hybrtdom IMG CZAS MEM-18
SU1752763A1 (ru) Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS MUScULUS L. - продуцент моноклональных антител к I @ Е человека
CS244200B1 (cs) Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS MEM-12
RU1776691C (ru) Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L, - продуцент моноклональных антител против J @ Е человека
SU1454850A1 (ru) Штамм гибридных культивируемых клеток животных мUS мUSсULUS, используемый дл получени моноклональных антител к J @ G человека и высших обезь н
SU1685997A1 (ru) Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS.мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител к тиреотропному гормону человека
SU1442545A1 (ru) Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L.,используемый дл получени моноклональных антител к @ -цеп м иммуноглобулинов человека и обезь н
US5401831A (en) Monoclonal antibodies for differentiating pathogenic and nonpathogenic E. histolytica