CS253687B1 - Myší lymfocytární hybridom IMG CZA3 MEM-57 - Google Patents

Myší lymfocytární hybridom IMG CZA3 MEM-57 Download PDF

Info

Publication number
CS253687B1
CS253687B1 CS150186A CS150186A CS253687B1 CS 253687 B1 CS253687 B1 CS 253687B1 CS 150186 A CS150186 A CS 150186A CS 150186 A CS150186 A CS 150186A CS 253687 B1 CS253687 B1 CS 253687B1
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
mem
cells
antibody
hybridoma
mouse
Prior art date
Application number
CS150186A
Other languages
English (en)
Inventor
Ivan Hilgert
Vaclav Horejsi
Hana Kristofova
Original Assignee
Ivan Hilgert
Vaclav Horejsi
Hana Kristofova
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ivan Hilgert, Vaclav Horejsi, Hana Kristofova filed Critical Ivan Hilgert
Priority to CS150186A priority Critical patent/CS253687B1/cs
Publication of CS253687B1 publication Critical patent/CS253687B1/cs

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Řešení se týká myšího lymfocytárního hybridomu, produkujícího protilátku proti membránovému antigénu lidských,? buněk, uloženého ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením MEM-57. Samotná monoklonální protilátka hybridomu MEM-57 je vhodná pro použití v enzymoimunologické analýze nebo nepřímé imunofluorescenční analýze T3 antigénu T lymfocytů.

Description

Vynález se týká nového hybridomů, to je hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myší myelomové linie Sp2/O~Agl4 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti membránovému antigenu přítomnému na lidských T buňkách /tj. T lymfocytech/. T buňky mají základní důležitost v imunitním systému, počet T buněk a jejich poměr k B lymfocytům se při imunodeficiencích a jiných patologických stavech liší od fyziologické normy.
Protilátky proti antigenům přítomrlým na určité subpopulaci buněk se nedají připravit přímou imunisací zvířat buněčnou suspensí lymfocytů nebo membránovou frakcí, to je konvenční imunisací. Konvenční imunisace má neodstranítelnou nevýhodu v tom, že séra obsahují protilátky proti mnoha membránovým antigenům, z nichž některé jsou přítomny na více typech buněk; séra proto nelze použít k jemnému rozlišení buněčných typů a tříd. Příprava čistého antigenu bez kontaminace jinými membránovými komponentami k imunisací je pracná a většinou neúspěšná.
Nevýhody konvenčních sér proti membránovým antigenům v principu odstraňuje použití hybridomové technologie. Produkt hybridomů - monoklonální protilátka - je zaměřena vždy proti jediné antigenní determinantě. Je-li konstruován dostatečně velký soubor hybridomů, je pravděpodobné, že se z něho podaří vyhledat hybridom syntetizující protilátku, která rozeznává antigenní determinantu charakterizující určitý typ nebo třídu či podtřídu lymfocytů.
Je řada antigenů na T lymfocytech, které se liší molekulární hmotností, chemickou strukturou a fyziologickou funkcí.
253 687
K detailní analýze antigenů na T lymfocytech je nezbytně nutné mít protilátky proti co největšímu počtu membránových antigenů. Podle publikovaných výsleáců /Kúng, P.G., Talie, M.A., DeMaria, M.E., Butler, M.S·, Lifter, J., Goldstein, G.: Strategies for generating monoclonal antibodies defining human T-lymphocyte differentiation antigens. Transplant. Proč. 12, Suppl. 1: 141-146, 1930/ se dá soudit, že lze připravit monoklonální protilátky specificky detegující různé antigeny T lymfocytů.
Podstatného pokroku v diagnostice lidských lymfocytů, projevujícího se vyšší spolehlivostí analytického výsledku, se dosáhne, je-li k dispozici hybridom, produkující monoklonální protilátku proti T3 antigenu přítomnému na lidských T buňkách, uložený ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská č. 1083, pod označením IMG GZAS MEM-57.
Uvedený hybridom byl získán způsobem známých z odborné literatury /Pazekas de St. Groth, S., Scheidegger, D.: production of monoclonal antibodies: Stratégy and tactics, J,. Immunol Meth., 35:1-21, 1980; Galfré, G., Howe, S.C., Milstein, C., Butcher, G.W., Howard, J.C.: Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře, 266:
550, 1977/ klonováním souboru hybridních buněk, získaných ze sleziny myší kmene BALB/c imunizovaných membránovou frakcí buněk lidských thymů.
Výhodou hybridomu je, že produkuje homogenní protilátku monoklonální, která je schopna specificky reagovat s lidskými T buňkami. Hybridom MEM-57 je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. Z konserv, uchovávaných v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky bez dalšího antigenu. Protilátka, produkovaná hybridomem MEM-57» reaguje specificky s populacemi lidských T buněk a není třeba se zbavovat protilátek balastních.
Příklad
Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo apli253 687
- 5 kováno 3 x 106 buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 14 dní před pře nosem buněk hybridomu ovlivněna parafinových olejem /0,5 ml intraperitoneálně/. Po 10 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byla myš uhubena a neprodukovaná ascitická tekutina odebrána. Celkem bylo získáno 3 ml ascitická tekutiny, která obsahovala 5 wg/ml imunoglohulinu. Monoklonální protilátka reagovala specificky s T buňkami periferní krve v nepřímém enzymoimunologickém testu. Monocyty, granulocyty a erytrocyty s protilátkou nereagovaly. Při použití čištěných populací T a , B lymfocytů byla zjištěna reaktivita protilátky MEM-57 s více než 95 % T buněk a s méně než 5 % B buněk. Specifita protilátky je identická s komerční monoklonální protilátkou OKT-3, jak bylo prokázáno opakovanými paralelními stanoveními včetně použití směsí obou protilátek, a to jak v případě směsi periferních lymfocytů, tak u izolovaných T a B populací /viz tabulka/.
Tab. Reaktivita protilátek produkovaných hybridomem MEM-57 1 v a QKT-3 s buňkami periferní krve
Buňky periferní lidské krve2 % pozitivních buněk reagujících nální protilátkou v enzymoimunologickém O směs testuMEM-57
0KT3
MEM-57 + 0KT3 lymfocyty 70-80
T lymfocyty^ 95
B lymfocyty5 monocyty 1 granulocyty 1 erytrocyty 1
70-80
70-80
-'•Komerční monoklonální protilátka od firmy Ortho Pharmaceutical Corporation, Raritan, New Jersey, USA.
^Buňky lidské periferní krve byly izolovány popsanou metodou /Bo.yum, A.: Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand. J. Immunol. 5, Suppl. 5:9, 1976/ na Verografin-Eicoll gradientu.
^Byl použit postup podle práce Lansdorp, P.M., Astaldi, G.O.B., Oosterhof, F., Janssen, M.C., Zeijlemaker, W.P.: Immunoperxodase procedures to detecv monoclonal antibodies against cell
253 687 surface antigen. Quantitation of binding and staining of individual cells. J. Immunol. Meth. 59: 595-405, 1980.
lymfocyty byly izolovány průchodem směsi lymfocytů sloupečkem nylonové vaty popsanou metodou /Julius, M.H., Simpson, E., Herzenberg, L.A.: A rapid method for the isolation of functional thymus-derived murine lymphocytes. Eur. J. Immunol. 5: 145-649, 1971/.
lymfocyty byly izolovány adsorbcí na plastikové desky pokryté protilátkou proti lidskému imunoglobulinu popsanou metodou /Máge, M.G., McHugh, L.L., Rothstein, T.L.: Mouše lymphocytes with and without surface immunoglobulin: preparative scale separation in polystyrene tissue culture dishes coated with specifically purified anti-immunoglobulin. J. Immunol. Meth. 15: 47-56, 1977/.
K průkazu, že protilátka MEM-57 rozpoznává antigen T5 na povrchu T lymfocytů, bylo použito tří přístupů; a/ Monoklonální protilátka MEM-57 precipitovala z povrchově jodovaných ^^^INa buněk /Morrison, M.: Lactoperixidase-catalyzed iodination as a tool for investigation of proteine. Methods Enzymol. 70:214-220, 1980/ /T linie HPB-AL/ antigenní frakci o mol. hmotnosti 25 kDa, prokázanou pomocí elektro fóretické analýzy v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecyl sulfátu sodného; mol. hmotnost této antigenní frakce odpovídá mol. hmotnosti T5 antigenu.
b/ Protilátka MEM-57 v koncentraci 10-20 ng/ml měla mitogenní vlastnosti prokázané indukcí DNA syntézy /pomocí inkorporace thymidinu/ v lidských lvmfocytech periferní krve. U protilátky 0KT5 byly popsány shodné mitogenní účinky /Van Wauwe, J.P., DeMey, J.R., Goossens, J.G.: 0KT5: A monoclonal anti-human T lymphocyte antibody with potent mitogenic properties. J. Immunol. 124:2708-2715, 1980/.
c/ Identita antigenů rozpoznávaných protilátkami MEM-57 a 0KT5 byla prokázána tak, že antigen reagující s protilátkou MEM-57 byl nejprve přemístěn k jednomu pólu T buněk, tzv. vytvoření čepiček /capping/ s následným pohlcením antigenu do nitra většiny buněk a pak byla testována reaktivita takto pozměněných buněk s protilátkou 0KT5· Bylo zjištěno,
233 687
- 5 že po odstranění antigenu T3 /protilátkou MEM-57/ vymizí také schopnost T lymfocytů vázat protilátku 0KT3, zatímco reaktivita s protilátkou nepříbuzné specifičnosti B2M-01 /Hilgert, I., Hořejší, V., Krištofová, H.: The use of murine monoclonal antibody B2M-01 for detection and' purification of human 2“micr°·· globulin. Pol. biol. /Praha/ 30:569-376, 1984/ se nezmění. Tento test byl prováděn tak, že T lymfocyty byly inkubovány 30 min při 20 °C v roztoku protilátky MEM-57 a poté 30 min při 37 °C s prasečí protilátkou proti myšímu imunoglobulinu. S takto připravenými buňkami byl proveden běžný nepřímý imunofluorescenční test, tj. inkubace s protilátkami MEM-57, 0KT3,
B2M-01 a ve druhém kroku s prasečím antimyším imunoglobulinem značeným fluoresceinisothiokyanatem. T lymfocyty byly před inkubací s následující protilátkou promyty vždy fyziologickým roztokem.
Buňky hybridomu MEM-57 mají ultrastrukturní obraz typických myelomových buněk. In vitro rostou jako polosuspensní kultury. Základním kultivačním médiem je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin /3mM/, pyruvát sodný /IraM/. Toto médium /označované jako RPMI, Ústav molekulární genetiky ČSAV/ je pro kultivaci hybridomu MEM-57 doplněno penicilinem, streptomycinem, gentamycinem, 2-merkaptoetanolem /0,05 mM/, pufrem HEPES /10 mM/ a inaktivovaným bovinním sérem /Bioveta, Ivanovice na Hané, 10 %/. Hybridom je kultivován při 37 °C. Střední generační čas je 18 hod. a 5 měsíců po sestrojení byl modální počet chromosomů 88. Produkovaná protilátka je monoklonálhí imunoglobulin podtřídy IgG2a s lehkými řetězci typu kapa, její isoelektrický bod je pH 7.4 - 8.0.
Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem MEM-57 reaguje specificky s lidskými T buňkami. Hybridom MEM-57 může být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky proti T buňkám v analytických metodách. Monoklonální protilátka hybridomu MEM-57 může být využita pro stanovení T buněk v periferní krvi a lymfatických orgánech při klinické diagnostice v zdravotnických zařízeních, zvláště při různých imuno253 687
- 6 logických nedostatečnostech a autoimunních onemocněních a pr*o klasifikaci leukémií T buněčného původu. Monoklonální protilátka může být využita také v terapii jako imunosupresivum při odhojovacích krizích v klinické transplantaci nebo ke specifickému odstraňování T lymfocytů při transplantaci kostní dřeně.

Claims (1)

  1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU
    Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS MEM-57 produkující monoklonální protilátku podtřídy IgG2a proti membránovému antigenu T3 lidských T buněk.
CS150186A 1986-03-05 1986-03-05 Myší lymfocytární hybridom IMG CZA3 MEM-57 CS253687B1 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS150186A CS253687B1 (cs) 1986-03-05 1986-03-05 Myší lymfocytární hybridom IMG CZA3 MEM-57

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS150186A CS253687B1 (cs) 1986-03-05 1986-03-05 Myší lymfocytární hybridom IMG CZA3 MEM-57

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CS253687B1 true CS253687B1 (cs) 1987-12-17

Family

ID=5349569

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS150186A CS253687B1 (cs) 1986-03-05 1986-03-05 Myší lymfocytární hybridom IMG CZA3 MEM-57

Country Status (1)

Country Link
CS (1) CS253687B1 (cs)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Julius et al. Induction of resting B cells to DNA synthesis by soluble monoclonal anti‐immunoglobulin
Cullen et al. The distribution of alloantigenic specificities of native H-2 products
JPH04505857A (ja) C反応性蛋白質に対するモノクローナル抗体
RU2395577C1 (ru) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО Mus musculus L.- ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БЕЛКА VP40 ВИРУСА ЭБОЛА, СУБТИП ЗАИР (ШТАММ Mainga) (ВАРИАНТЫ), МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, ПРОДУЦИРУЕМОЕ ШТАММОМ (ВАРИАНТЫ), И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ФОРМАТА "СЭНДВИЧ" ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БЕЛКА VP40 ВИРУСА ЭБОЛА, СУБТИП ЗАИР (ШТАММ Mainga)
CN109112113B (zh) 抗人IgG的单克隆抗体、杂交瘤细胞株、试剂盒及其应用
EP0216854A1 (en) MONOCLONAL ANTIBODIES AND TEST PROCEDURE.
US4707442A (en) Hybrid cell line producing monoclonal antibody cytolytic to Trichomonas vaginalis
RU2395576C1 (ru) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО Mus musculus L.1B2 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ НУКЛЕОПРОТЕИНА ВИРУСА ЭБОЛА, СУБТИП ЗАИР (ШТАММ Mainga) (ВАРИАНТЫ), МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, ПРОДУЦИРУЕМОЕ ШТАММОМ (ВАРИАНТЫ), НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ФОРМАТА "СЭНДВИЧ" ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ НУКЛЕОПРОТЕИНА ВИРУСА ЭБОЛА, СУБТИП ЗАИР (ШТАММ Mainga)
CS253687B1 (cs) Myší lymfocytární hybridom IMG CZA3 MEM-57
CS255235B1 (cs) Myší lymfocytómí hybridem produkující protilátku proti lidskému transferinovému receptoru
CS244396B1 (cs) Myší lymfocytární hybridom IMG + CZAS + MEM - 32
CS252450B1 (cs) Myěí lymfocytární hybrldom IMG SZAS HL-40
CS255234B1 (cs) Myší lymfocytárnl hybridem produkující protilátku proti společnému antigenu lidských akutních lymfoblastických leukémií
CS248382B1 (cs) Myší lymfocytární hybrtdom IMG CZAS MEM-18
CS264752B1 (cs) Myií lymfocytémf hybridem IMG CZASMEM-31
CS243879B1 (cs) Myší lymfocytárni hybridem IMG-CZAS HL-38
CS244200B1 (cs) Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS MEM-12
Sanders et al. Monoclonal antibody to chicken fetal antigens on normal erythroid cells and hematopoietic-lymphoid tumor cell lines
Mohr et al. Immunosorption techniques: fundamentals and applications
RU2377299C1 (ru) ШТАММ 5А10 ПОСТОЯННОЙ ГИБРИДОМНОЙ ЛИНИИ КЛЕТОК МЫШИ Mus. musculus - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К IgG КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
JP2948594B2 (ja) モノクローナル抗体
RU2377298C1 (ru) ШТАММ 1Н8 ПОСТОЯННОЙ ГИБРИДОМНОЙ ЛИНИИ КЛЕТОК МЫШИ Mus. Musculus - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К IgG ОВЦЫ
Tsuchiya et al. Epstein-Barr virus-induced precursor B cell lines from patients with congenital agammaglobulinemia
CS248383B1 (cs) Myši lymfocytárni hybridem IMG CZAS MEM-09
SU1527260A1 (ru) Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый дл получени моноклональных антител к @ - тимозину