CS243879B1 - Myší lymfocytárni hybridem IMG-CZAS HL-38 - Google Patents

Myší lymfocytárni hybridem IMG-CZAS HL-38 Download PDF

Info

Publication number
CS243879B1
CS243879B1 CS1038984A CS1038984A CS243879B1 CS 243879 B1 CS243879 B1 CS 243879B1 CS 1038984 A CS1038984 A CS 1038984A CS 1038984 A CS1038984 A CS 1038984A CS 243879 B1 CS243879 B1 CS 243879B1
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
hla
cells
hybridoma
czas
img
Prior art date
Application number
CS1038984A
Other languages
English (en)
Inventor
Milos Nemec
Pavla Angelisova
Vaclav Horejsi
Original Assignee
Milos Nemec
Pavla Angelisova
Vaclav Horejsi
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Milos Nemec, Pavla Angelisova, Vaclav Horejsi filed Critical Milos Nemec
Priority to CS1038984A priority Critical patent/CS243879B1/cs
Publication of CS243879B1 publication Critical patent/CS243879B1/cs

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Myši lymfocytárni hybridom IMG CZAS HL-38 produkující monoklonální protilátku podtřídy Ig G2a proti membránovému antigenu lidských HLA-DR pozitivních buněk.

Description

Autor vvnáiezu
NĚMEC MILOŠ RNDr. CSc.*, ANGELISOVÁ PAVLA RNDr. CSc.,* HOŘEJŠÍ VÁCLAV RNDr. CSc., PRAHA (54) Myší lymfocytárni hybridem IMG-CZAS HL-38
Myši lymfocytárni hybridom IMG CZAS HL-38 produkující monoklonální protilátku podtřídy Ig G2a proti membránovému antigenu lidských HLA-DR pozitivních buněk.
Vynález se týká myšího lymfocytárního hybridomů, produkujícího protilátku proti membránovému antigenu lidských HLA-DR pozitivních buněk, uloženého ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením HL-38. Samotná monoklonální protilátka hybridomů HL-38 jé vhodná pro použití v enzymoimunologické a imunofluorescenční analýze lidských HLA-DR pozitivních buněk.
Vynález se týká nového hybridomů, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myší myelomové linie P3-X63-Ag8.653 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti membránovému antigenu HLA-DR přítomnému na lidských B buňkách, monocytech, makrofágách a aktivovaných T buňkách. Tyto antigeny mají zásadní význam pro regulaci různých funkcí imunitního systému. Kvantitativní stanovení HLA-DR pozitivních buněk má význam při x diagnostice některých patologických stavů.
Doposud se protilátky proti membránovým antigenům vyrábějí tak, že buněčné suspenze nebo membránové frakce jsou opakovaně injikovány produkčním zvířatům, nejčastěji králíkům. Sérum takto imunizovaných zvířat, odebírané po určité době působení antigenu, slouží jako zdroj protilátek. Takto jsou např. připravovány protilátky proti thymocytům, které jsou používány k imunosupresi při transplantaci orgánů v klinické medicíně. Tento postup, nazývaný konvenční imunizací, má neodstranítelnou nevýhodu v tom, že séra obsahují protilátky proti mnoha membránovým antigenům, z nichž některé jsou přítomny na více typech buněk? séra proto nelze použít k jemnému rozlišení buněčných typů a tříd.
Nevýhody konvenčních sér proti membránovým antigenům v principu odstraňuje použití hybridomové technologie. Produkt hybridomů - monoklonální protilátka - je zaměřena vždy proti jediné antigenní determinantě. Je-li konstruován dostatečně velký soubor hybridomů, je pravděpodobné, že se v něm podaří vyhledat hybridom syntetizující protilátku, která rozeznává antigenní determinantu charakterizující určitý typ nebo třídu či podtřídu lymfocytú.
Podle publikovaného výsledku (Brodsky, F.M., Parham, P., Bodmer, W.F.: Monoclonal antibodies to HLA-DR determinants, Tissue Antigens 16: 30, 1980) se dá soudit, že lze připravit monoklonální protilátky rozpoznávající takové determinanty, které se nacházejí na HLA-DR antigenech všech jedinců v populaci (monomorfní determinanty). Takové monoklonální protilátky jsou výhodné pro diagnostické použití.
Podstatného pokroku v diagnostice lidských lymfocytú, projevujícího se vyšší spolehlivostí analytického výsledku, se dosáhrje, je-li k dispozici hybridom, produkující monoklonální protilátku proti monomorfní determinantě lidských HLA-DR antigenů, uložený ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAv v Praze 4, Vídeňská č. 1 083, pod označením IMG CZAS HL-38.
Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Fazekas de st. Groth, S. Scheidegger, D.: Production of monoclonal antibodies: Stratégy and tactics, J. Immunol. Meth., 35: 1-21, 1980; Galfré, G., Howe, S.C., Milstein, C., Butcher, G.W., Howard, J.C.: Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře, 266: 550, 1977) klonováním souboru hybridních buněk, získaných ze sleziny myší kmene BALB/c imunizovaných buňkami lidské B lymfoblastoidní linie Ráji.
, Výhodou hybridomů je,» že produkuje homogenní protilátku monoklonální, která je schopna specificky reagovat s buňkami nesoucími HLA-DR antigeny. Hybridom HL-38 je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. Z konzerv, uchovávaných v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky bez dalšího antigenu. Protilátka, produkovaná hybridomem HL-38, reaguje specificky s populacemi lidských buněk, v jejichž membráně jsou přítomny HLA-DR antigeny a není třeba se zbavovat protilátek balastních.
Příklad
Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno 6x10® buněk do peritoneální dutiny myši. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 20 dnů před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem (0,5 ml intraperitoneálně). Po 14 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byla myš usmrcena a neprodukovaná ascitická tekutina odebrána. Celkem bylo získáno 4 ml ascitické tekutiny, která obsahovala 15 mg/ml imunoglobulinu. Monoklonální protilátka reagovala specificky v nepřímém imunofluorescenčním nebo enzymoimunologickém testu s částí lymfocytů periferní krve.
Oběma metodami bylo zjištěno 25 až 30 % pozitivních buněk v enzymoimunologickém těstu až do ředění ascitické plazmy 1 : 10® a v testu nepřímé imunofluorescence až do ředění 1: 104. Při použití čištěných populací T a B lymfocytů byla zjištěna reaktivita protilátky HL-38 s více než 95 % B lymfocytů a méně než 5 % T lymfocytů. Silně pozitivních bylo také více než 95 % monocytů, negativní byly granulocyty a erytrocyty. Specifita protilátky HL-38 je shodná s protilátkou RF-HLA-DR, jak bylo prokázáno opakovanými paralelními stanoveními včetně použití směsí protilátek, a to jak v případě směsi periferních lymfocytů, tak u izolovaných buněčných populací (viz tabulka).
Tabulka - Reaktivita protilátek produkovaných hybridomem HL-38 a RF-HLA-DR''' s buňkami periferní krve
- 2 Buňky periferní lidské krve % pozitivních buněk, reagujících s monoklonální protilátkou v enzymoimunologickém^ nebo nepřímém imunofluo- rescenčním testu^
HL-38 RF-HLA-DR HL-38+RF-HLA-DR
lymfocyty 25 až 30 25 až 30 25 až 30
T lymfocyty^ 5 až 10 5 až 10 5 až 10
B lymfocyty® 95 95 95
monocyty 95 95 . 95
granulocyty 1 1 1
erytrocyty 1 1 1
''Monoklonální protilátka RF-HLA-DR byla získána od Prof. G. Janossy z The Royal Free Hospital, Londýn.
Buňky lidské periferní krve byly izolovány popsanou metodou (Béyum, A.: Isolatin of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand. J. Immunol. 5, Suppl. 5: 9, 1976), na VerografinFicoll gradientu.
Byl použit postup podle práce Lansdorp, Ρ. M., Astaldi, G. C. B., Oosterhof, F., Janssen,
M. C., Zeijlemaker, W. P.: Immunoperoxidase procedures to detect monoclonal antibodies against cell surface antigen. Quantitation of binding and staining of individual cells.
J. Immunol. Meth. 39: 393 až 405, 1980.
Byla použita nepřímá imunofluorescenční technika s využitím prasečí protilátky proti myšímu imunoglobulinu značené fluoresceinisothiokyanatem (ÚSOL, Praha).
T lymfocyty byly izolovány průchodem směsi lymfocytů sloupečkem nylonové vaty popsanou metodou (Julius, Μ. H., Simpson, E., Herzenberg, L. A.: A rapid method for the isolation of functional thymus-derived murine lymphocytes. Europ. J. Immunol. 3: 645 až 649, 1971).
®B lymfocyty byly izolovány adsorpcí na plastikové desky pokryté protilátkou proti lidskému imunoglobulinu popsanou metodou (Máge, M. G., McHugh, L. L., Rothstein, T. L.: Mouše lymphocytes with and without surface immunoglobulin: Preparative scale separation in polystyrene tissue culture dishes coated with specifically purified anti-immunoglobulin. J. Immunol.
Meth. 15: 47 až 56, 1977) .
Identita antigenů rozeznávaných protilátkami HL-38 a RF-HLA-DR byla prokázána izolací příslušného antigenu imunoafinitní chromatografií na imobilizované protilátce HL-38 a prokázáním silné reaktivity tohoto antigenu s protilátkou RF-HLA-DR. Antigen získaný imunoafinitní chromatografií na Sepharose 4B s kovalentně navázanou monoklonální protilátkou HL-38 poskytoval po elektroforéze v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného za neredukujících podmínek bud silnou zónu odpovídající m. h. 65 000 a slabé zóny o m. h. 29 000 a 33 000 (vzorek nebyl zahříván), nebo pouze 2 zóny odpovídající m. h. 29 000 a 33 000 (vzorek předem 2 min zahřát na 100 °C), což je výsledek typický pro HLA-DR antigeny (Shackleford,
D. A., Kaufman, J. F., Korman, A. J., Strominger, J. L.: HLA-DR antigens: Structure, separatíon of subpopulation, gene cloning and function. Immunol. Rev. 66: 133 až 187, 1982).
Po elektroforetickém přenosu separovaných proteinů na nitrocelulosovou membránu a specifické detekci nepřímým enzymoimunologickým testem s využitím příslušné protilátky a prasečí protilátky proti myším imunoglobulinům konjugované s peroxidázou OSOL, Praha obě protilátky (HL-38 i RF-HLA-DR) reagovaly silně s antigenem v dimerní formě (m. h. 65 000) i s podjednotkou o m. h. 29 000 izolovaného antigenu.
Buňky hybridomu HL-38 mají ultrastrukturní obraz typických myelomovýoh buněk. Cytoplazma obsahuje velké množství polyribosomů,>mitochondrie a slabě vyvinuté andoplazmatické retikulum. In vitro rostou jako polosuspenzní kultury. Základním kultivačním médiem je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin (3 mM), pyruvát sodný (1 mM). Toto médium (označované jakp H-MEMd, Ostav molekulární genetiky ČSAV) je pro kultivaci hybridomu HL-38 doplněno penicilinem, streptomycinem, gentamyclnem, 2-merkaptoetanolem (0,05 mM) , pufrem HEPES (10 mM) a inaktivovaným bovinním sérem (Bioveta, Ivanovice na Hané 10 %). Hybridom je kultivován při 37 °C. Střední generační čas je 16.2 hod. a 9 měsíců po sestrojení byl modální počet chromozomů 85. Produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobulin podtřídy IgG2a s lehkými řetězci typu kapa, její izoelektrický bod je pH 5,9 až 6,5.
Monoklonální protilátka, produkovaná hybridomem HL-38, reaguje specificky s normálními lidskými B buňkami, monocyty, makrofágy a aktivovanými T buňkami. Hybridom HL-38 může být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky proti HLA-DR pozitivním buňkám v analytických metodách. Monoklonální protilátka hybridomu HL-38 může být využita pro stanovení HLA-DR pozitivních buněk v periferní krvi a lymfatických orgánech při klinické diagnostice ve zdravotnických zařízeních, zvláště při různých imunologických nedostatečnostech a autoimunních onemocněních a pro klasifikaci leukémií a maligních lymfomů.
PŘEDMĚT VYNALEZU

Claims (1)

  1. Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS HL-38 produkující monoklonální protilátku podtřídy Ig G2a proti membránovému antigenu lidských HLA-DR pozitivních buněk.
    Severografia, n. p., MOST
CS1038984A 1984-12-27 1984-12-27 Myší lymfocytárni hybridem IMG-CZAS HL-38 CS243879B1 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS1038984A CS243879B1 (cs) 1984-12-27 1984-12-27 Myší lymfocytárni hybridem IMG-CZAS HL-38

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS1038984A CS243879B1 (cs) 1984-12-27 1984-12-27 Myší lymfocytárni hybridem IMG-CZAS HL-38

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CS243879B1 true CS243879B1 (cs) 1986-07-17

Family

ID=5448671

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS1038984A CS243879B1 (cs) 1984-12-27 1984-12-27 Myší lymfocytárni hybridem IMG-CZAS HL-38

Country Status (1)

Country Link
CS (1) CS243879B1 (cs)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Katz Lymphocyte differentiation, recognition, and regulation
Flajnik et al. Major histocompatibility complex-encoded class I molecules are absent in immunologically competent Xenopus before metamorphosis.
Rabellino et al. Immunoglobulins on the surface of lymphocytes: I. Distribution and quantitation
Ran et al. Tumor‐associated immunogolobulins. The elution of IgG2 from mouse tumors
Hála et al. A monoclonal antibody reacting with a membrane determinant expressed on activated chicken T lymphocytes
Cullen et al. The distribution of alloantigenic specificities of native H-2 products
Larsen et al. Identification and characterization of monoclonal antibodies reactive with bovine, caprine and ovine T-lymphocyte determinants by flow microfluorimetry
Landreth et al. Regulation of human B lymphopoiesis: effect of a urinary activity associated with cyclic neutropenia.
Jørgensen et al. H–2-linked genes control immune response to V-domains of myeloma protein 315
EP0216854A1 (en) MONOCLONAL ANTIBODIES AND TEST PROCEDURE.
US4707442A (en) Hybrid cell line producing monoclonal antibody cytolytic to Trichomonas vaginalis
Epstein et al. Idiotypes of anti-Ia antibodies. II. Effects of in vivo treatment with xenogeneic anti-idiotype.
CS243879B1 (cs) Myší lymfocytárni hybridem IMG-CZAS HL-38
Aarli Binding of γ-globulin fragments to muscle tissue
Staines et al. Whither monoclonal antibodies?
Ledbetter et al. Murine T-cell differentiation antigens detected by monoclonal antibodies
CS244200B1 (cs) Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS MEM-12
Tschetter et al. CD8 dimer usage on αβ and γδ T lymphocytes from equine lymphoid tissues
CS244396B1 (cs) Myší lymfocytární hybridom IMG + CZAS + MEM - 32
CS252450B1 (cs) Myěí lymfocytární hybrldom IMG SZAS HL-40
Bankhurst et al. Surface immunoglobulins on bursa-derived chicken lymphoid cells
Wolf et al. MHC‐and non‐MHC‐encoded surface antigens of chicken lymphoid cells and erythrocytes recognized by polyclonal xeno‐, allo‐and monoclonal antibodies
CS264752B1 (cs) Myií lymfocytémf hybridem IMG CZASMEM-31
CS248382B1 (cs) Myší lymfocytární hybrtdom IMG CZAS MEM-18
CS253687B1 (cs) Myší lymfocytární hybridom IMG CZA3 MEM-57