CS244396B1 - Myší lymfocytární hybridom IMG + CZAS + MEM - 32 - Google Patents

Abstract

Řešení se týká iqyšího lymfocytámího hybridomu, produkujícího protilátku proti membránovému antigenu lidských T buněk, uloženého ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením MEM - 32. Samotná monoklonální protilátka hybridomu MEM-32 je vhodná pro použití v enzymoimunologické analýze lidských T buněk.

Description

(54)

HILGERT IVAN RNDr., CSc.,* HOŘEJŠÍ VÁCLAV,RNDr., CSc.) KRIStOFOVA HANA RNDr., PRAHA ^*

Myší lymfocytámí hybridom IMG + CZAS + MEM - 32

Řešení se týká iqyšího lymfocytámího hybridomu, produkujícího protilátku proti membránovému antigenu lidských T buněk, uloženého ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením MEM - 32. Samotná monoklonální protilátka hybridomu MEM-32 je vhodná pro použití v enzymoimunologické analýze lidských T buněk.

244 396

- 1 244 396

Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myší myelomové linie Sp2/O-Ag14 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti membránovému antigenu přítomnému ha lidských T buňkách (tj. T lymfocytech). T buňky mají základní důležitost v imunitním systému. Počet T buněk a jejich poměr k B lymfocytům se při imunodeficiencích a jiných patologických stavech liší od fyziologické normy.

Doposud se protilátky proti membránovým antigenům vyrábějí tak, že buněčné suspenze nebo membránové frakce jsou opakovaně injikovány produkčním zvířatům, nejčastěji králíkům. Sérum takto imunizovaných zvířat, odebírané po určité době působení antigenu, slouží jako zdroj protilátek. Takto jsou například připravovány protilátky proti thymocytům, které jsou používány k imunosupresi při transplantaci orgánů v . klinické medicíně. T«nto postup, nazývaný konvenční imunisací, má neodstranitelnou nevýhodu v tom, že séra obsahují protilátky proti mnoha membránovým antigenům, z nichž některé jsou přítomny na více typech buněk; séra proto nelze použít k jemnému rozlišení buněčných typů a tříd.

Nevýhody konvenčních sér proti membránovým antigenům v principu odstraňuje použití hybridomové technologie. Produkt hybridomu -monoklonální protilátka - je zaměřena vždy proti jediné antigenní determinantě. Je-li konstruován dostatečně velký soubor hybridomů, je pravděpodobné, že se z něho podaří vyhledat hybridom syntetizující protilátku, která rozeznává antigenní determinantu charakterizující určitý typ nebo třídu či podtřídu lymfocytů.

Dosud se obvykle počet T buněk zjišťoval tzv. rosetovým testem s ovčími erythrocyty. Podle publikovaných výsledků (Kung, P.C., Talie, M„A., DeMaria, M.E., Butler, M.S., Lifter, J., Goldstein, G.: Strategies for generating monoclonal anti- 2-. 244 396 bodies defining human T-lymphocyte differentiation antigens. Transplant. Proč. 12, Suppl..1:141-146, 1980) ee dá soudit, že lze připravit monoklonální protilátky specificky detegující T lymfocyty, které by mohly nahradit dosud používaný rosetový test.

Podstatného pokroku v diagnostice lidských lymfocytů, projevujícího se vyšéí spolehlivosti analytického výsledku, se dosáhne, je-li k dispozici hybridom, produkující monoklonální protilátku proti antigenů přítomnému na lidských T buňkách, uložený ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňské č. 1083, pod označením IMG CZAS MEM-32.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Fazekas de St. Groth, S., Scheidegger, D.: Production of monoclonal antibodies: Stratégy and tacties, J. Immunol. Meth., 35:1-21, 1980; Galfré, G., Howe, S.C., Milstein, C., Butcher, G.W., Howard, J.C.: Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře, 266:550, 1977) klonováním souboru hybridních buněk, získaných ze sleziny myší kmene BALE/c imunizovaných membránovou frakcí buněk lidských thymů.

Výhodou hybridomů je, Že produkuje homogenní protilátku monoklonální, která je schopna specificky reagovat s lidskými T buňkami. Hybridom MEM-32 je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneélní dutině myší kmene BALE/c. Z konserv, uchovávaných v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky bez doJLšího antigenů. Protilátka, produkovaná hybri domem MEM-32, reaguje specificky s populacemi lidských T buněk a není třeba se zbavovat protilátek balastních.

- 3 Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno 4 x 10$ buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 14 dní před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem (0,5 ml intreperitoneálně). Po 10 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byla myš uhubena a neprodukovaná ascitická tekutina odebrána. Celkem bylo získáno 3 ml ascitické tekutiny, které obsahovala^ mg/mJL imunoglobulinu. Monoklonální protilátka reagovala specificky β T buňkami periferní krve v nepřímém enzymoimunologickém testu. Monocyty, granulocyty a erythrocyty s protilátkou nereagovaly. Při použití čištěných populací T a B lymfocytů byla zjištěna reaktivita protilátky MEM-32 s více než 95% T buněk a s méně než 5% B buněk. Specificita protilátky je identická s komerční monoklonální protilátkou OKT-1, jak bylo prokázáno opakovanými paralelními stanoveními včetně použití směsí obou protilátek, a to jak v případě směsi periferních lymfocytů, tak u izolovaných T a B populací (viz tabulka).

Tab. Reaktivita protilátek produkovaných hybridomem MEM-32 a OKT-11 s buňkami periferní krve __ _ _ _# ___ ____

Buňky periferní lidské krve^ % pozitivních buněk reagujících s monoklonální protilátkou v enzymoimunologickém testu³ _gmgs

MEM-32 0KT1 MEM-32 + 0KT1

lymfocyty	70-80	70-80	70-80
T lymfocyty	>95	>95	>95
B lymfocyty5	<5	<5	<5
monocyty	<1		<1
granulocyty	<1	<1	<1
erythrocyty	<1	cl	<1

1Komerční monoklonální protilátka od firmy Ortho Pharmaceutical Corporation, Raritan, New Jersey, USA.

*

Buňky lidské periferní krve byly izolovány popsanou metodou

244 39Β (Béyum, A. i Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand.J.Immunol. 5, Suppl. 5:9, 1976) na Verografin-Ficoll gradientu.

^Byl použit mírně modifikovaný postup podle práce Lansdorp, P.M., Astaldi, G.C.B., Oosterhof, F., Janssen, M.C., Zeijlemaker, W.P.: Immunoperoxidase procedures to detect monoclonal antibodies against cell surface antigen. Quantitation of binding and staining of individual cella. J. Immunol.Meth. 39:393-405, 1980.

lymfocyty byly izolovány průchodem směsi lymfocytů sloupečkem nylonové vaty popsanou metodou (Julius, M.H., Simpson, E., Herzenberg, L.A.: A rapid method for the isolation of functional thymus-derived murine lymphocytes. Europ.J. Immunol. 3:645-649, 1971).

lymfocyty byly izolovány specifickou adsorbcí na plastikové desky pokryté protilátkou proti lidskému imunoglobulinu popsanou metodou (Máge, M.G., McHugh, L.L., Rothstein, T.L.: Mouše lymphocytes with and without surface immunoglobulin: Preparative scale separation in polystyrene tissue culture dishes coated with specifically purified anti-immunoglobulin. J.Immunol.Meth. 15:47-56, 1977).

Identita antigenů rozeznávaných protilátkami MEM32 a OKT-1 byla prokázána izolací příslušného antigenů imunoafinitní chromatografií na zmobilizované protilátce MEM-32 a demonstrací silné reaktivity tohoto antigenů s protilátkou OKT-1· Tento průkaz byl proveden následovně: Částečně vyčištěná protilátka MEM-32 byla navázána na CNBr-Sepharosu 4B (Pharmacia, Uppsala, Švédsko) (5 mg/ml). Hrubá membránová frakce z lidských thymocytů byla solubilizována v roztoku obsahujícím 1% detergent NP-40 a získaný extrakt byl nanesen na kolonku Sepharosy 4B s kovalentně navázanou protilátkou MEM-32 Po důkladném promytí byl specificky adsorbovaný antigen vymyt roztokem 2% dodecylsulfátu sodného a 2Zskaný vzorek analyzován elektroforézou v polyakrylamidovém gelu v přitom244 396 nosti SDS. Po skončení elektroforézy byly separované proteiny elektroforeticky převedeny na nitrocelulosovou membránu (Towbin, H., Stachelin, T., Gordon, J.: Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: proceduře and some applications. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S. 76: 4350-4354, 1979) a detegovány nepřímým enzymoimunologickým testem s využitím příslušné monoklonální protilátky a prasečí antimyší protilátky konjugované s peroxidázou (ÚSQL, Praha). Jak protilátka MEM-32, tak 0KT-1 reagovaly silně s izolovaným antigenem (m.h. 67 000).

Buňky hybridomu MEM-32 mají ultrastrukturní obraz typických myelomových buněk. Cytoplazma obsahuje velké množství polyribosomů, mitochondrie a slabě vyvinuté endoplasmatické retikulum. In vitro rostou jako polosuspenzní kultury. Základním kultivačním médiem je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin (3mM), pyruvát sodný (1mM). Toto médium (označované jako H-MEMd, Ústav molekulární genetiky ČSAV) je pro kultivaci hybridomu MEM-32 doplněno penicilinem, streptomycinem, gentamycinem, 2-merkaptoetanolem (0,05 mM), pufrem HEPES (10 mM) a inaktivovaným bovinním sérem (Bioveta, Ivanovice na Hané, 10%). Hybridom je kultivován při 37°C. Střední generační čas je 21 hod. a 5 měsíců po sestrojení byl modální počet chromozomů 92. Produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobulin podtřídy IgGI s lehkými řetězci typu kapa, její isoelektrický bod je pH 6.0 - 6.4.

Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem MEM-32 reaguje specificky s lidskými T buňkami. Hybridom MEM-32 může být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky proti T buňkám v analytických metodách. Monoklonální protilátka hybridomu MEM-32 může být využita pro stanovení T buněk v periferní krvi a lymfatických orgánech při klinické diagnostice v zdravotnických zařízeních, zvláště při různých imunologických nedostatečnostech a autoimunních onemocněních a pro klasifikaci leukémií T buněčného původu.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNALEZU

   Myší lymfocytární hybridom ÍMG CZAS MEM-32 produkující monoklonální protilátku podtřídy IgG1 proti membránovému antigenu lidských T buněk.

   Vytiskly Moravské tiskařské závody,