CS244396B1 - Myší lymfocytární hybridom IMG + CZAS + MEM - 32 - Google Patents

Myší lymfocytární hybridom IMG + CZAS + MEM - 32 Download PDF

Info

Publication number
CS244396B1
CS244396B1 CS843684A CS843684A CS244396B1 CS 244396 B1 CS244396 B1 CS 244396B1 CS 843684 A CS843684 A CS 843684A CS 843684 A CS843684 A CS 843684A CS 244396 B1 CS244396 B1 CS 244396B1
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
hybridoma
cells
mem
human
antibody
Prior art date
Application number
CS843684A
Other languages
English (en)
Inventor
Ivan Hilgert
Vaclav Horejsi
Hana Kristofova
Original Assignee
Ivan Hilgert
Vaclav Horejsi
Hana Kristofova
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ivan Hilgert, Vaclav Horejsi, Hana Kristofova filed Critical Ivan Hilgert
Priority to CS843684A priority Critical patent/CS244396B1/cs
Publication of CS244396B1 publication Critical patent/CS244396B1/cs

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Řešení se týká iqyšího lymfocytámího hybridomu, produkujícího protilátku proti membránovému antigenu lidských T buněk, uloženého ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením MEM - 32. Samotná monoklonální protilátka hybridomu MEM-32 je vhodná pro použití v enzymoimunologické analýze lidských T buněk.

Description

(54)
HILGERT IVAN RNDr., CSc.,* HOŘEJŠÍ VÁCLAV,RNDr., CSc.) KRIStOFOVA HANA RNDr., PRAHA *
Myší lymfocytámí hybridom IMG + CZAS + MEM - 32
Řešení se týká iqyšího lymfocytámího hybridomu, produkujícího protilátku proti membránovému antigenu lidských T buněk, uloženého ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením MEM - 32. Samotná monoklonální protilátka hybridomu MEM-32 je vhodná pro použití v enzymoimunologické analýze lidských T buněk.
244 396
- 1 244 396
Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myší myelomové linie Sp2/O-Ag14 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti membránovému antigenu přítomnému ha lidských T buňkách (tj. T lymfocytech). T buňky mají základní důležitost v imunitním systému. Počet T buněk a jejich poměr k B lymfocytům se při imunodeficiencích a jiných patologických stavech liší od fyziologické normy.
Doposud se protilátky proti membránovým antigenům vyrábějí tak, že buněčné suspenze nebo membránové frakce jsou opakovaně injikovány produkčním zvířatům, nejčastěji králíkům. Sérum takto imunizovaných zvířat, odebírané po určité době působení antigenu, slouží jako zdroj protilátek. Takto jsou například připravovány protilátky proti thymocytům, které jsou používány k imunosupresi při transplantaci orgánů v . klinické medicíně. T«nto postup, nazývaný konvenční imunisací, má neodstranitelnou nevýhodu v tom, že séra obsahují protilátky proti mnoha membránovým antigenům, z nichž některé jsou přítomny na více typech buněk; séra proto nelze použít k jemnému rozlišení buněčných typů a tříd.
Nevýhody konvenčních sér proti membránovým antigenům v principu odstraňuje použití hybridomové technologie. Produkt hybridomu -monoklonální protilátka - je zaměřena vždy proti jediné antigenní determinantě. Je-li konstruován dostatečně velký soubor hybridomů, je pravděpodobné, že se z něho podaří vyhledat hybridom syntetizující protilátku, která rozeznává antigenní determinantu charakterizující určitý typ nebo třídu či podtřídu lymfocytů.
Dosud se obvykle počet T buněk zjišťoval tzv. rosetovým testem s ovčími erythrocyty. Podle publikovaných výsledků (Kung, P.C., Talie, M„A., DeMaria, M.E., Butler, M.S., Lifter, J., Goldstein, G.: Strategies for generating monoclonal anti- 2-. 244 396 bodies defining human T-lymphocyte differentiation antigens. Transplant. Proč. 12, Suppl..1:141-146, 1980) ee dá soudit, že lze připravit monoklonální protilátky specificky detegující T lymfocyty, které by mohly nahradit dosud používaný rosetový test.
Podstatného pokroku v diagnostice lidských lymfocytů, projevujícího se vyšéí spolehlivosti analytického výsledku, se dosáhne, je-li k dispozici hybridom, produkující monoklonální protilátku proti antigenů přítomnému na lidských T buňkách, uložený ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňské č. 1083, pod označením IMG CZAS MEM-32.
Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Fazekas de St. Groth, S., Scheidegger, D.: Production of monoclonal antibodies: Stratégy and tacties, J. Immunol. Meth., 35:1-21, 1980; Galfré, G., Howe, S.C., Milstein, C., Butcher, G.W., Howard, J.C.: Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře, 266:550, 1977) klonováním souboru hybridních buněk, získaných ze sleziny myší kmene BALE/c imunizovaných membránovou frakcí buněk lidských thymů.
Výhodou hybridomů je, Že produkuje homogenní protilátku monoklonální, která je schopna specificky reagovat s lidskými T buňkami. Hybridom MEM-32 je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneélní dutině myší kmene BALE/c. Z konserv, uchovávaných v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky bez doJLšího antigenů. Protilátka, produkovaná hybri domem MEM-32, reaguje specificky s populacemi lidských T buněk a není třeba se zbavovat protilátek balastních.
- 3 Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno 4 x 10$ buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 14 dní před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem (0,5 ml intreperitoneálně). Po 10 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byla myš uhubena a neprodukovaná ascitická tekutina odebrána. Celkem bylo získáno 3 ml ascitické tekutiny, které obsahovala^ mg/mJL imunoglobulinu. Monoklonální protilátka reagovala specificky β T buňkami periferní krve v nepřímém enzymoimunologickém testu. Monocyty, granulocyty a erythrocyty s protilátkou nereagovaly. Při použití čištěných populací T a B lymfocytů byla zjištěna reaktivita protilátky MEM-32 s více než 95% T buněk a s méně než 5% B buněk. Specificita protilátky je identická s komerční monoklonální protilátkou OKT-1, jak bylo prokázáno opakovanými paralelními stanoveními včetně použití směsí obou protilátek, a to jak v případě směsi periferních lymfocytů, tak u izolovaných T a B populací (viz tabulka).
Tab. Reaktivita protilátek produkovaných hybridomem MEM-32 a OKT-11 s buňkami periferní krve __ _ _ _# ___ ____
Buňky periferní lidské krve^ % pozitivních buněk reagujících s monoklonální protilátkou v enzymoimunologickém testu3 gmgs
MEM-32 0KT1 MEM-32 + 0KT1
lymfocyty 70-80 70-80 70-80
T lymfocyty >95 >95 >95
B lymfocyty5 <5 <5 <5
monocyty <1 <1
granulocyty <1 <1 <1
erythrocyty <1 cl <1
1Komerční monoklonální protilátka od firmy Ortho Pharmaceutical Corporation, Raritan, New Jersey, USA.
*
Buňky lidské periferní krve byly izolovány popsanou metodou
244 39Β (Béyum, A. i Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand.J.Immunol. 5, Suppl. 5:9, 1976) na Verografin-Ficoll gradientu.
^Byl použit mírně modifikovaný postup podle práce Lansdorp, P.M., Astaldi, G.C.B., Oosterhof, F., Janssen, M.C., Zeijlemaker, W.P.: Immunoperoxidase procedures to detect monoclonal antibodies against cell surface antigen. Quantitation of binding and staining of individual cella. J. Immunol.Meth. 39:393-405, 1980.
lymfocyty byly izolovány průchodem směsi lymfocytů sloupečkem nylonové vaty popsanou metodou (Julius, M.H., Simpson, E., Herzenberg, L.A.: A rapid method for the isolation of functional thymus-derived murine lymphocytes. Europ.J. Immunol. 3:645-649, 1971).
lymfocyty byly izolovány specifickou adsorbcí na plastikové desky pokryté protilátkou proti lidskému imunoglobulinu popsanou metodou (Máge, M.G., McHugh, L.L., Rothstein, T.L.: Mouše lymphocytes with and without surface immunoglobulin: Preparative scale separation in polystyrene tissue culture dishes coated with specifically purified anti-immunoglobulin. J.Immunol.Meth. 15:47-56, 1977).
Identita antigenů rozeznávaných protilátkami MEM32 a OKT-1 byla prokázána izolací příslušného antigenů imunoafinitní chromatografií na zmobilizované protilátce MEM-32 a demonstrací silné reaktivity tohoto antigenů s protilátkou OKT-1· Tento průkaz byl proveden následovně: Částečně vyčištěná protilátka MEM-32 byla navázána na CNBr-Sepharosu 4B (Pharmacia, Uppsala, Švédsko) (5 mg/ml). Hrubá membránová frakce z lidských thymocytů byla solubilizována v roztoku obsahujícím 1% detergent NP-40 a získaný extrakt byl nanesen na kolonku Sepharosy 4B s kovalentně navázanou protilátkou MEM-32 Po důkladném promytí byl specificky adsorbovaný antigen vymyt roztokem 2% dodecylsulfátu sodného a 2Zskaný vzorek analyzován elektroforézou v polyakrylamidovém gelu v přitom244 396 nosti SDS. Po skončení elektroforézy byly separované proteiny elektroforeticky převedeny na nitrocelulosovou membránu (Towbin, H., Stachelin, T., Gordon, J.: Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: proceduře and some applications. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S. 76: 4350-4354, 1979) a detegovány nepřímým enzymoimunologickým testem s využitím příslušné monoklonální protilátky a prasečí antimyší protilátky konjugované s peroxidázou (ÚSQL, Praha). Jak protilátka MEM-32, tak 0KT-1 reagovaly silně s izolovaným antigenem (m.h. 67 000).
Buňky hybridomu MEM-32 mají ultrastrukturní obraz typických myelomových buněk. Cytoplazma obsahuje velké množství polyribosomů, mitochondrie a slabě vyvinuté endoplasmatické retikulum. In vitro rostou jako polosuspenzní kultury. Základním kultivačním médiem je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin (3mM), pyruvát sodný (1mM). Toto médium (označované jako H-MEMd, Ústav molekulární genetiky ČSAV) je pro kultivaci hybridomu MEM-32 doplněno penicilinem, streptomycinem, gentamycinem, 2-merkaptoetanolem (0,05 mM), pufrem HEPES (10 mM) a inaktivovaným bovinním sérem (Bioveta, Ivanovice na Hané, 10%). Hybridom je kultivován při 37°C. Střední generační čas je 21 hod. a 5 měsíců po sestrojení byl modální počet chromozomů 92. Produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobulin podtřídy IgGI s lehkými řetězci typu kapa, její isoelektrický bod je pH 6.0 - 6.4.
Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem MEM-32 reaguje specificky s lidskými T buňkami. Hybridom MEM-32 může být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky proti T buňkám v analytických metodách. Monoklonální protilátka hybridomu MEM-32 může být využita pro stanovení T buněk v periferní krvi a lymfatických orgánech při klinické diagnostice v zdravotnických zařízeních, zvláště při různých imunologických nedostatečnostech a autoimunních onemocněních a pro klasifikaci leukémií T buněčného původu.

Claims (1)

  1. PŘEDMĚT VYNALEZU
    Myší lymfocytární hybridom ÍMG CZAS MEM-32 produkující monoklonální protilátku podtřídy IgG1 proti membránovému antigenu lidských T buněk.
    Vytiskly Moravské tiskařské závody,
CS843684A 1984-11-06 1984-11-06 Myší lymfocytární hybridom IMG + CZAS + MEM - 32 CS244396B1 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS843684A CS244396B1 (cs) 1984-11-06 1984-11-06 Myší lymfocytární hybridom IMG + CZAS + MEM - 32

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS843684A CS244396B1 (cs) 1984-11-06 1984-11-06 Myší lymfocytární hybridom IMG + CZAS + MEM - 32

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CS244396B1 true CS244396B1 (cs) 1986-07-17

Family

ID=5434865

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS843684A CS244396B1 (cs) 1984-11-06 1984-11-06 Myší lymfocytární hybridom IMG + CZAS + MEM - 32

Country Status (1)

Country Link
CS (1) CS244396B1 (cs)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Landay et al. Characterization of a phenotypically distinct subpopulation of Leu-2+ cells that suppresses T cell proliferative responses.
Rabellino et al. Immunoglobulins on the surface of lymphocytes: I. Distribution and quantitation
Pink et al. Monoclonal antibodies against chicken lymphocyte surface antigens
KR100214759B1 (ko) 인간 인터로이킨-6 수용체에 대한 항체
Linsenmayer et al. Production and characterization of a monoclonal antibody to chicken type I collagen.
MÖLLER Mechanism of mercury‐induced autoimmunity: both T helper 1‐and T helper 2‐type responses are involved
Hála et al. A monoclonal antibody reacting with a membrane determinant expressed on activated chicken T lymphocytes
Cullen et al. The distribution of alloantigenic specificities of native H-2 products
Landreth et al. Regulation of human B lymphopoiesis: effect of a urinary activity associated with cyclic neutropenia.
US4707442A (en) Hybrid cell line producing monoclonal antibody cytolytic to Trichomonas vaginalis
RU2395576C1 (ru) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО Mus musculus L.1B2 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ НУКЛЕОПРОТЕИНА ВИРУСА ЭБОЛА, СУБТИП ЗАИР (ШТАММ Mainga) (ВАРИАНТЫ), МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, ПРОДУЦИРУЕМОЕ ШТАММОМ (ВАРИАНТЫ), НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ФОРМАТА &#34;СЭНДВИЧ&#34; ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ НУКЛЕОПРОТЕИНА ВИРУСА ЭБОЛА, СУБТИП ЗАИР (ШТАММ Mainga)
CS244396B1 (cs) Myší lymfocytární hybridom IMG + CZAS + MEM - 32
US5430129A (en) Purified, native dystrophin
CS252450B1 (cs) Myěí lymfocytární hybrldom IMG SZAS HL-40
Ledbetter et al. Murine T-cell differentiation antigens detected by monoclonal antibodies
CS244200B1 (cs) Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS MEM-12
CS243879B1 (cs) Myší lymfocytárni hybridem IMG-CZAS HL-38
CS253687B1 (cs) Myší lymfocytární hybridom IMG CZA3 MEM-57
CS248382B1 (cs) Myší lymfocytární hybrtdom IMG CZAS MEM-18
CS264752B1 (cs) Myií lymfocytémf hybridem IMG CZASMEM-31
CS255234B1 (cs) Myší lymfocytárnl hybridem produkující protilátku proti společnému antigenu lidských akutních lymfoblastických leukémií
CS255235B1 (cs) Myší lymfocytómí hybridem produkující protilátku proti lidskému transferinovému receptoru
RU2070926C1 (ru) Штамм гибридных культивируемых клеток mus musculus l., используемый для получения моноклональных антител к с-концевой части белка р 24 вируса иммунодефицита человека типа i
RU2377299C1 (ru) ШТАММ 5А10 ПОСТОЯННОЙ ГИБРИДОМНОЙ ЛИНИИ КЛЕТОК МЫШИ Mus. musculus - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К IgG КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
JP2948594B2 (ja) モノクローナル抗体