CS234935B1 - Myší lymfocytární hybridem IMG CZAS B2M-01 - Google Patents

Abstract

Vynález se týká myšího lymfocytárního hybridomu, produkujícího protilátku proti lidskému beta 2 mikroglobulinu, uloženého -ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením B2M-01. Samotná monoklonální protilátka hybridomu B2M-01 je vhodná pro použití v enzymoimunologické a radioimunologické analýze a pro čištění beta 2 mikroglobulinu afi-nitní chromatografií.

Description

Vynález se týká myšího lymfocytárního hybridomu, produkujícího protilátku proti lidskému beta 2 mikroglobulinu, uloženého -ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením B2M-01. Samotná monoklonální protilátka hybridomu B2M-01 je vhodná pro použití v enzymoimunologické a radioimunologické analýze a pro čištění beta 2 mikroglobulinu afi-nitní chromatografií.

234335

Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myší myelomové linie Sp2/O-Agl4 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti lidskému beta 2 mikroglobulinu.

Doposud se protilátky proti beta 2 mikroglobulinu vyrábějí tak, že beta 2 mikroglobulin je opakovaně injikován jako antigen pokusným zvířatům, nejčastěji králíkům. Sérum takto· imunizovaných zvířat, odebírané po· určité době působení antigenu, slouží jako zdroj protilátek, užívaných zejména pro kvantitativní stanovení beta 2 mikroglobulinu v- séru nebo v moči metodou radioimunologické analýzy. Tento postup, nazývaný konvenční imunizací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednolivém organismu různé a neopakovatelné. Organismus zpravidla vytvoří kromě protilátek vůči žádanému antigenu i protilátky proti nečistotám antigenního preparátu. Výrobní šarže konvenčních sér se proto dají těžko standardizovat a vycházejí z výroby, v širokém rozmezí kvality. Pro výrobu každé šarže je třeba připravit čistý imunizační antigen a další antigeny pro vysycení balastních protilátek proti nečistotám.

Uvedené nedostatky výše zmíněného a dosud používaného postupu odpadnou, je-li k dispozici hybridom, produkující monoklonální urotilátku proti beta 2 mikroglobulinu, uložený ve Sbírce hybridoinů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská č. 1083, pod označením IMG CZAS B2M-01.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Fazekas de St. Groth, S., Scheidigger, D.: Production of monoclonal antibodies: Stratégy and tactics, J. Immunol. Meth., 35:1—21, 1980; Galfré, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Ho-ward, J. C.: Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře 266:550, 1977) klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí buněk myší myelomové linie Sp2/0-Agl4 a buněk, získaných ze sleziny myší kmene Balb/c imunizovaných lidským beta 2 mikroglobulinem.

Výhodou hybridomu je, že produkuje homogenní protilátku, tzv. protilátku momoklonální, která je schopna specificky reagovat s lidským beta 2 mikroglobulinem. Hybridom B2M-01 je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene B,alb/c. Z konzerv·, uchovávaných v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky, bez dalšího· antigenu. Protilátka, produkovaná hybridomem B2M-01, reaguje specificky jak s lidským beta 2 mikroglobulinem, tak s populacemi lidských buněk nesoucích jako Složku buněčné membrány beta 2 mikroglo4 bulin a není třeba se zbavovat protilátek balastních.

Příklad 1

Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo, aplikováno 5xl0⁸ buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla * myš 14 dní před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem (0,5 ml intraperitoneálně). Po 12 dnech růstu hyb- r ridomu v peritoneální dutině byla myš zabita a naprodukovaná ascitická tekutina odebrána. Celkem bylo získáno 5 ml ascitické tekutiny, která obsahovala 2 mg/ml imunoglobulinu. Protilátka reagovala se specifickým antigenem (lidským beta 2 mikroglobulinem nebo lidskými lymfocyty z periferní krve] v enzymo,imunologickém testu (při použití prasečí antimyší protilátky značené křenovou peroxidázou) až do ředění 1 : 10⁶.

Příklad 2

Z 8 ml ascitické tekutiny obsahující protilátku B2M-01 byla připravena globullnová frakce precipitací síranem amonným a navázána na 2 ml CNBr-aktivované Sepharosy 4B. 1 ml tohoto imunosorbentu byl třepán 2 hodiny s 10 ml surového roztoku zahuštěných lidských močových proteinů (získaných precipitací nasyceným roztokem síranu amonného ze 100 ml patologické moči). Poté byl imunosorbent přenesen na kolonku, pro,myt 20 ml fyziologického roztoku a specificky adsorbovaný beta 2 mikroglobulin byl vymyt celkem 5 ml 0,1 M glycin-HCl pufru pH 2,2 a eluát byl ihned neutralizován 1 M fosfátovým pufrem pH 7,2. Celkový výtěžek byl 2,2 mg beta 2 mikroglobulinu, jehož čistota byla nejméně 80 %.

Buňky hybridomu B2M-01 mají ultrastrukturní obraz typických myelomových buněk. Cytoplazma obsahuje velké množství polyribosomů, mitochondrie a slabě vyvinuté endoplasmatické retikulum. In vitro rostou jako polosuspenzní kultury. Základním kultivačním médiem je Eaglovo· minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin (3 mM), pyruvát sodný (1 mM). Toto médium (označované jako H-MEMd, 0stav molekulární genetiky ČSAV) je pro kultivaci hybridomu B2M-01 doplněno· penicilinem, streptomycinem, gentamycinem, 2-merkaptoetanolem (0,05 mM) pufrem HEPES (10 mM) a inaktivovaným bovinním sérem (Bioveta, Ivanovice na Hané, 10%). Hybridom je kultivován při 37 °C. Střední generační čas je 16,2 hod. ,a 10 měsíců po, sestrojení byl modální počet chrOmosomů 92. Produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobulin podtřídy IgG2a s lehkými řetězci typu kapa, její isoelektrický bod je pH 7,0.

Monoklonálmí protilátka produkovaná hybridomem B2M-01 reaguje specificky s lidským beta 2 mikroglobulinem.

Hybridom B2M-01 může být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky proti beta 2 mikroglobulinu v metodách analytických nebo preparativních.

Monoklonální protilátka hybridomu B2M-

Claims (1)

1. PREDMET

   Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS B2M-01 produkující monoklonální protilátku

   -01 může být využita pro analytické stanovení beta 2 mikroglobulinu (v moči, séru nebo jiných tělních tekutinách] při klinické diagnostice v zdravotnických zařízeních, zvláště při poruchách ledvin. Imobilizované monoklonální protilátky může být použito k čištění beta 2 mikroglobulinu pomocí afinitní chromatoigrafie.

   vynalezu podtřídy IgG2a proti lidskému beta 2 mikroglobulinu.