CS264752B1 - Myií lymfocytémf hybridem IMG CZASMEM-31 - Google Patents

Abstract

Myší lymfocytární hybridom, produkující protilátku proti membránovému antigenu lidských supresorových a cytotoxických T buněk, uložený ve sbírce hybridomů Ostavu molekulární genetiky ČSAV pod označením MEM-31. Samotná monoklonální protilátka hybridomů MEM-31 je vhodná pro použití v enzymoimunologické a imunofluorescenční analýze lidských supresorových a cytotoxických T buněk.

Description

Vynález se týká nového hybridomu, t j. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myší myelomové linie Sp2/0-Agl4 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti membránovému antigenu přítomnému na lidských supresorových a cytotoxických T buňkách. Funkční studie ukázaly, že supresorové a cytotoxlcké T buňky mají společný membránový antigen a tvoři podtřídu lymfocytú s důležitými regulačními funkcemi, jejichž zastoupeni v periferní krvi a lymfoidnich tkáních se při imunodeficiencíchlliší od fysiologické normy.

Doposud se protilátky proti membránovým antigenům vyrábějí tak, že buněčné suspenze nebo membránové frakce jsou opakovaně injikovány produkčním zvířatům, nejčastěji králíkům.

Sérum takto imunisovaných zvířat, odebírané po určité době působení antigenu, slouží jako zdroj protilátek. Takto jsou například připravovány protilátky proti thymocytům, které jsou používány k imunosupresi při transplantaci orgánů v klinické medicíně. Tento postup, nazývaný konvenční imunisací, má neodstranitelnou nevýhodu v tom, že séra obsahují protilátky proti mnoha membránovým antigenům, z nichž některé jsou přítomny na více typech buněk; séra proto nelze použit k jemnému rozlišení buněčných typů a tříd.

Nevýhody konvenčních sér proti membránovým antigenům v principu odstraňuje použiti hybridomové technologie. Produkt hybridomu - monoklonální protilátka - je zaměřena vždy proti jediné antigenní determinantě. Je-li konstruován dostatečně velký soubor hybridomů, je pravděpodobné, že se z něho podaří vyhledat hybridom syntetizující protilátku, která rozeznává antigenní determinantu charakterizující určitý typ nebo třídu či podtřídu lymfocytú.

Podle publikovaného výsledku (Thomas, Y., Sosman, J., Irigoyen, O., Friedman, S. M.,

Kung, P, C., Goldstein, G., Chess, L.: Functional analysis of human T cell subsets defined by monoclonal antibodies. I. Collaborative T-T int.eractions in the immunoregulation of B cell differentiation. J. Immunol., 125:2 401 až 2 408, 1980) se dá soudit, že lze‘ připravit monoklonální protilátku specificky detegujicí podtřídu supresorových/cytotoxických lidských T buněk vhodnou pro diganostické použiti.

Podstatného pokroku v diagnostice lidských lymfocytú, projevujícího se vyšší spolehlivostí analytického výsledku, se dosáhne, je-li k disposici hybridom, produkující monoklonální protilátku proti antigenu přítomnému na lidských supresorových/cytotoxických T buňkách, uložený ve Sbírce hybridomů Ostavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská č. 1 083, pod označením IMG CZAS MEM-31.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Fazekas de St. Groth,

S., Scheidegger, D.: Production of monoclonal antibodies: Stratégy and tactics, J. Immunol. Meth.., 35:1 až 21, 1980; Galfré, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard,

J. C.: Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře, 266:550, 1977) klonováním souboru hybridních buněk, získaných ze sleziny myší kmene BALB/c imunizovaných membránovou frakcí buněk lidských thymů.

Výhodou hybridomů je, že produkuje homogenní protilátku monoklonální, která je schopna specificky reagovat s lidskými supresorovými/cytotoxickými T buňkami. Hybridom MEM-31 je raožnékultivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. Z konserv, uchovávaných v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky bez dalšího antigenu. Protilátka, produkovaná hybridomem MEM-31, reaguje specificky s populacemi lidských supresorových/cytotoxických T buněk a není třeba se zbavovat protilátek balastních.

Přiklad

Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno 4xl0⁵ buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 14 dní před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem (0,5 ml intraperitoneálně). Po 9 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byla myš zahubena a naprodukovaná ascitická tekutina odebrána.

Celkem bylo získáno 3,5 ml ascítické tekutiny, která obsahovala 5 mg/ml imunoglobulinu.

Monoklonální protilátkareagovala specificky v nepřímém Imunofluorescenčním nebo enzymoimunologickém testu se supresorovými/cytotoxickými T buňkami periferní krve. Oběma metodami bylo zjištěno 25 až 35 i positivních buněk v enzymoimunologickém testu až do ředění ascitické 4 3 plasmy 1:10 a v testu nepřímé imunofluorescence až do ředění 1:10 . Specificita MEM-31 je identická s komerční monoklonální protilátkou OKT-8, jak bylo prokázáno opakovanými paralelními stanoveními včetně použití směsí dvou protilátek (viz tabulka).

Tabulka

Reaktivita protilátek produkovaných hybridomem MEM-31 a ΟΚΤβ' s buňkami periferní krve

Buňky periferní % positivních buněk reagujících s monoklonální

3 lidské krve protilátkou v imunofluorescenčním testu'

	MEM-31	OKT8	MEM-31 + 0KT8
lymfocyty	23 až 33	25 až 34	25 až 35
monocyty	4 1	4 1	4 1
granulocyty	4 1	4 1	41
erytrocyty	< 1	41	<1

¹Komerční monoklonální protilátka od firmy Ortho Pharmaceutical Corporation-Raritan,

New Jersey USA.

Buňky lidské periferní krve byly isolovány popsanou metodou (Boyum, A.: Isolation of lymphocytes, granulocytes nad macrophages. Scand. J. Immunol. 5, Suppl. 5:9, 1976) na Verografin-Ficoll gradientu.

Byla použita nepřímá imunofluoresoenční technika s využitím prasečí antimyší protilátky značené fluoresceinisothiokyanatem.

Buňky hybridomu MEM-31 mají ultrastrukturní obraz typických rayelomových buněk. Cytoplasma obsahuje velké množství polyribosomů, mitochondrie a slabě vyvinuté endoplasmatické retikulum. In vitro rostou jako polosuspensní kultury. Základním kultivačním médiem je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin (3 mM), pyruvát sodný (1 mM). Toto médium (označované jako H-MEMd) je pro kultivaci hybridomu MEM-31 doplněno penicilinem, streptomycinem, gentamycinem, 2-merkaptoetanolem (0,05 mM), pufrem HEPES (10 mM) a inaktivovaným bovinním sérem (10%). Hybridom je kultivován při 37 °C. Střední generační čas je 18,4 h a 5 měsíců po sestrojení byl modální počet chromosomů 89. Produkovaná protilátka je monoklonální. imunoglobulin podtřídy IgG2a s lehkými řetězci typu kapa, její isoelektrický bod je pl 7,4 až 7,6.

Monoklonální. protilátka produkovaná hybridomem MEM-31 reaguje specificky s lidskými supresorovými/cytotoxickými T buňkami. Hybridom MEM-31 může být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky proti supresorovým/cytotoxickým T buňkám v analytických metodách. Monoklonální protilátka hybridomu MEM-31 může být využita pro stanovení supresorových/cytotoxických T buněk v periferní krvi a lymfatickýoh orgánech při klinické diagnostice v zdravotnických zařízeních, zvláště při sledování odhojovacíoh krizí po transplantaci orgánů, při různých imunologických nedostatečnostech a autoimunních onemocněních a pro klasifikaci leukémii T buněčného původu.

Claims (1)

1. Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS MEM-31 produkující monoklonální protilátku imunoglobulin podtřídy IgG2a proti membránovému antigenu lidských supresorových a cytotoxických T buněk.