CS244200B1 - Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS MEM-12 - Google Patents

Abstract

Řešení se týká myšího lymfocytární- ho hybridomu, produkujícího protilátku proti membránovému antigenu lidských HLA-DR pozitivních buněk, uloženého ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením MEM-12. Samotná monoklonální protilátka hybridomu MEM-12 je vhodná pro použití v enzymoimunologické a imunofluorescenční analýze lidských HLA-DR pozitivních buněk.

Description

Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myší myelomové linie Sp2/O-Ag14 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti membránovému antigenu HLA-DR přítomnému na lidských B buňkách, monocytech, makrofágách a aktivovaných T buňkách. Tyto antigeny mají zásadní význam pro regulaci různých funkcí imunitního systému. Kvantitativní stanovení HLA-DR positivních buněk.má význam při diagnostice některých patologických stavů.

Doposud se protilátky proti membránovým antigenům vyrábějí tak, že buněčné suspenze nebo membránové frakce jsou opakoyáně injikovány produkčním zvířatům, nejčastěji králíkům. Sérum takto imunizovaných zvířat, odebírané po určité době působení antigenu, slouží jako zdroj protilátek. Takto jsou například připravovány protilátky proti thymocytům, které jsou používány k imunosupresi při transplantaci orgánů v klinické medicíně. Tento postup, nazývaný konvenční imunizací, má neodstranitelnou nevýhodu v tom, že séra obsahují protilátky proti mnoha membránovým antigenům, z nichž některé jsou přítomny na více typech buněkj séra proto nelze použít k jemnému rozlišení buněčných typů a tříd.

Nevýhody konvenčních sér proti membránovým antigenům v principu odstraňuje použití hybridomové technologie. Produkt hybridomu - monoklonální protilátka - je zaměřena vždy proti jediné antigenní determinantě. Je-li konstruován dostatečně velký soubor hybridomů, je pravděpodobné, že se z něho podaří vyhledat hybridom syntetizující protilátku, která rozeznává antigenní determinantu charakterizující určitý typ nebo třídu či podtřídu lymfocytů.

Podle publikovaného výsledku (Brodsky, F.IÍ., Parham, P., Bodmer, W.F.: Monoclonal antibodies to HLA-DRw determinante, Tissue Antigens 16:30, 1930) se dá soudit, že lze připravit

244 200

-λmonoklonální protilátky specificky detegující monomorfní determinanty na HLA-DR antigenech, výhodné pro diagnostické použiti. Monomorfními rozumíme takové determinanty, které jsou přítomny ve všech formách HLA-DR antigenu v lidské populaci.

Podstatného pokroku v diagnostice lidských lymfocytú, projevujícího se vyšší spolehlivostí analytického výsledku, se dosáhne, je-li k disposici hybridom, produkující monoklonální protilátku proti monomorfní determinantě lidských HLA-DR antigenů, uložený ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňské £· 1083, pod označením IMG CZAS MEM-12.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Fazekas de St. Groth, S. Scheidegger, D.: Production of monoclonal antibodies: Stratégy and tactics, J. Immunol. Meth., 35:1-21, 1980; Galfré, G., Howe, S.C., Milstein, C., Butcher, G.W., Howard, J.C.: Antibodies to major histocompatibility antigens producéd by hybrid cell lineš, Nátuře, 266:550, 1977) klonováním souboru hybridních buněk, získaných ze sleziny myěi kmene BALQ/c imunizovaných membránovou frakcí buněk lidských thymů.

Výhodou hybridomů je, že produkuje homogenní protilátku monoklonální, které je schopna specificky reagovat s buňkami nesoucími DR antigeny. Hybridom KEM-12 je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných pro živoěiěné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myěí kmene BALE/c. Z konserv, uchovávaných v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky bez dalšího antigenu. Protilátka, produkovaná hybridomem MEM-12, reaguje specificky s populacemi lidských buněk exprimujících DR antigeny a není třeba se zbavovat protilátek balastních.

Příklad

Za účelem pomnožení hybridoraových buněk in vivo bylo apli244 200 g

kováno 4 x 10 buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných'buněk, byla myš 14 dní před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem (0,5 ml intraperitoneálně). Po 11 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byla myš uhubena a neprodukovaná ascitická tekutina odebrána. Celkem bylo získáno 2,5ml ascitická tekutiny, která obsahovala 5 mg/ml imunoglobulinu. Monoklonální protilátka reagovala specificky v nepřímém imunofluorescenčním nebo enzymoimunologickém testu s Částí lymfocytů periferní krve. Oběma metodami bylo zjištěno 25<g 30% positivních buněk v enzymoimunologickém testu až do ředění ascitické plasmy 1:10^ a v testu nepřímé imunofluorescence až do ředění 1:1θ\ Při použití čištěných populaci T a B lymfocytů byla zjištěna reaktivita protilátky MEM-12 s víoe než 95% B lymfocytů a 5-10% T lymfocytů. Silně positivních bylo také více než 95% monocytů, negativní byly granulocyty a erytrocyty. Specifita protilátky MEM-12 je shodná s protilátkou RF-KLA-DR, jak bylo prokázáno opakovanými paralelními stanoveními včetně použití směsí protilátek, a to jak v případě směsi periferních lymfocytů, tak u izolovaných buněčných populací (viz tabulka).

Tab. Reaktivita protilátek produkovaných hybridomem MEK-12 a 1 *

RF-HLA-DR s buňkami periferní krve

Buňky periferní % positivních buněk reagujících s monolidské krve klonální protilátkou v enzymoimunologickém nebo nepřímém imunofluorescenčním 4 testu

	KEM-12	RF-HLA-DR	MEM-12+RP-:
lymfocyty	25-30	25-30	25-30
T lymfocyty^	5-10	5-10	5-10
B lymfocyty^	>95	>95	>95
monocyty	>95	>95	>95
granulocyty	<1	< 1	< 1
erytrocyty	<1	1	<1

- ϊ244 200 ¹ Monoklonální protilátka RF-HLA-DR byl® získána od Prof. G.

Janossy z The Royal Free Hospital, Londýn.

²Buňky lidská periferní krve byly izolovány popsanou metodou (Béyum, A.: Isolation of lymphocytes, granulocytee and macrophages. Scand.J.Immunol. 5, Suppl. 5:9, 1976) na VerografinFicoll gradientu.

^Byl použit postup podle práce Lansdorp, P.M., Astaldi, G.C.B., Oosterhof, F., Janssen, M.C., Zeijlemaker, W.P.: Immunoperoxidase procedures to detect monoclonal antibodies against cell surface antigen. Quantitation of binding and staining of individual cells. J.Immunol.Meth. 39:393-405, 1980.

^Byla použita nepřímá imunofluorescenční technika s využitím prasečího antimyšího imunoglobulinu značeného fluoresceinisothiokyanatem (ÚSOL, Praha).

^T lymfocyty byly izolovány průchodem směsi lymfocytů sloupečkem nylonové vaty popsanou metodou (Julius, M.H., Simpson, E·, Herzenberg, L.A.: A rapid method for the isolation of functional thymue-derived murine lymphocytes. Eur.J.Immunol. 3:645-649, 1971).

lymfocyty byly izolovány adsorbcí na plastikové desky pokryté protilátkou proti lidskému imunoglobulinu popsanou metodou (Máge, M.G., MoHugh, L.L., Rothstein, T.L.:

Mouše lymphocytes with and without surface immunoglobulin: Preparative scale separation in polystyrene tissue culture dishes coated with specifically purified anti-immunoglobulin. J.Immunol.Meth. 15:47-56, 1977).

Identita antigenů rozeznávaných protilátkami MEM-12 a RF-HLA-DR byla prokázána izolací příslušného antigenů imunoafinitní chromatografií na imobilizované protilátce MEM-12 a demonstrací reaktivity tohoto antigenů s protilátkou RF-HLA-DR. Antigen získaný imunoafinitní chromatografií na Sepharose 4B s kovalentnš navázanou protilátkou MEM-12 poskytoval po elektroforéze v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného bu3 1-zónu odpovídající m.h. dM65 000

244 200

- £ (vzorek nezahříván), nebo 2 zóny odpovídající m.h. 29 000 a 33 000 (vzorek předem 2 min. zahřát na 100°C), což je výsledek typický pro DR antigeny (Shackleford, D.A., Kaufman, J.F., Korman, A.J., Strominger, J.L.; HLA-DR antigene:

Structure, separation of subpopulation, gene cloning and functioh. Immunol.Rev. 66:133-187, 1982). Po elektroforetickém přenosu separovaných proteinů na nitrocelulozovou membránu a specifické detekci nepřímým enzymoimunologickým testem (s využitím příslužné monoklonální protilátky a prasečího antimySího imunoglobulinu konjugovaného.β peroxidázou (ÚSOL, Praha)). Obě protilátky (MEM-12 a KF-HLA-DR) reagovaly silně 8 antigenem v dimerní formě (m.h.$0<&65 000), protilátka RF-HLA-DR reagovala s podjednotkou o m.h. 29 000 izolovaného antigenu.

Buňky hybridomu MEM-12 mají ultrastrukturní obraz typických myelomových buněk. Cytoplaama obsahuje velké množství polyribosomů, mitochondrie a slabě vyvinuté endoplaamatické retikulum. In vitro rostou jako polosuspenaní kultury. Základním kultivačním médiem je Eaglovo minimální esenciální médium 8 Hanksovou solnou směsí doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin (3mM), pyruvát sodný (1mM). Toto médium (označované jako H-MEMd, Ústav molekulární genetiky ČSAV) je pro kultivaci hybridomu MEM-12 doplněno penicilinem, streptomycinem, gentamyciném, 2-merkaptoetanolea (0,05 mM), pufrem HEPES (10 mM) a inaktivovaným bovinním sérem (Bioveta, Ivanovice na Hané, 10%.)· Hybridom je kultivován při 37°Ci Střední generační čas je 16.8 hod. a 5 měsíců po sestrojení byl modální počet chromoaromů 96. Produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobulin podtřídy IgGI s lehkými řetězci typu kapa, její izoelektrický bod je pH 6.8 - 7.0.

Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem MEM-12 reaguje specificky s lidskými B buňkami, monocyty, makrofágy a aktivovanými T buňkami. Hybridom MEM-12 můče být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky proti DR pozitiv244 200 nía buňkám v analytických metodách, Monoklonální protilátka liybridomu MEM-12 může být využita pro stanovení DR positivních buněk v periferní krvi a lymfatických orgánech při klinické diagnostice v zdravotnických zařízeních,zvláště při různých imunologických nedostatečnostech a autoimunních onemocněních a pro klasifikaci leukémií a maligních lymfomů.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS MEM-12 produkující monoklonální protilátku podtřídy IgG1 proti membránovému an tigenu lidských HLA-DR pozitivních buněk.

   Vytiskly Moravské tiskařské závody, střed. 11 100, tř.Lidových milicí 3, Olomouc

   Cena: 2,40 Kčs