CS252450B1 - Myěí lymfocytární hybrldom IMG SZAS HL-40 - Google Patents

Abstract

Reěení ee týká mySího lymfocytámího hybridomu, produkujícího protilátku proti membránovým HLA antigenům II. třídy /HLA-DR, HLA-DP/ lidských buněk, uloženého ve sbírcevhybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením IMG CZAS HL-40. Monoklonální protilátka hybridomu HL-40 je vhodná pro použití v enzymolmunolo^icke a iraunofluoresoenční analýze lidských buněks membránovými HLA antigény II. třídyj její předností je velmi výrazné značepí terčových buněk V suspenzích i na tkáňových řezech.

Description

Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myší myelomové linie P3-X63-Ag0.653 a myší slezinné lymfoidní buňky produkující protilátku proti monomorfní determinantě membránových HLA antigenů II. třídy, ZHLA-OR, HLA-DP/ přítomných na lidských B buňkách, monocytech, makrofázích a aktivovaných T buňkách. Tyto antigény mají zásadní význam pro regulaci různých funkcí imunitního systému. Kvantitativní stanovení buněk s membránovými HLA antigény II. třídy má význam při diagnostice některých patologických stavů a klasifikaci lidských hematologických nádorových onemocnění.

Doposud se protilátky proti membránovým antigenům lidských buněk vyrábějí tak, že buněčné suspenze nebo membránové frakce jsou opakovaně injikovány produkčním zvířatům, nejčastěji krá- líkům. Sérum takto imunizovaných zvířat, odebírané po určité době působení antigenů, slouží jako zdroj protilátek. Takto jsou např. připravovány protilátky proti lidským thymocytům, které jsou používány k útlumu alotransplantačních reakcí při transplantaci orgánů v klinické medicíně. Tento postup, nazývaný konvenčni imunizací, má neodstranitelnou nevýhodu v tom, že séra obsahují heterogenní směs protilátek proti mnoha různým membránovým antigenům, z nichž některé jsou přítomny na více typech buněk; séra proto nelze použít k jemnému rozlišení buněčných typů a tříd.

Nevýhody konvenčních sér proti membránovým antigenům v prin cípu odstraňuje použití hybridomové technologie. Produkt hybrio domu - monoklonální protilátka - je zaměřen vždy proti jediné antigenní determinantě. Je-li konstruován dostatečně Velký soubor hybridomů, je pravděpodobné, že se v něm podaří vyhledat hybridem syntetizující protilátku, která rozeznává antigenní determinantu charakterizující určitý typ,nebo třídu či podtřídu lymfocytů.

Podle publikovaného výsledku /Brodsky, F.M., Parham, P.,

Bodmer, W.F.: Monoclonal antibodies to HLA-DR determinants,

-1.Tissue Antigens 16:30, 1980/ se dá soudit, že lze připravit monoklonální protilátky rozpoznávající takové determinanty, které se nacházejí na HLA antigenech II, třídy všech jedinců v populaci /monomorfní determinanty/. Takové monoklonální protilátky jsou výhodné pro diagnostické použití.

Podstatného pokroku v diagnostice lidských leukocytů a z nich odvozených chorob, projevujícího se vyšší spole/iti.\/ostí analytického výsledku, se dosáhne, je-li k dispozici hybridem,* produkující monoklonální protilátku proti monomorfní determinantě lidských HLA antigenů II. třídy, uložený ve Sbírce hy- _t bridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská č. 1083, pod označením IMG CZAS HL-40,

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborně literatury /Fazekas de St. Groth, S. Scheidegger, D.: Production of monoclonal antibodies: Stratégy and tactics, 3. Immunol. Meth., 35: 1-21, 1980; Galfré, G., Howe, S.C., Milstein, C., Butcher, G.W., Howard, 3.C.: Antibodies to major histocompati- ; bility antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře, 266: 550, 1977/ klonováním souboru hybridních buněk, získaných ze sleziny myší kmene BALB/c imunizovaných buňkami lidské B lymfoblastoid- i ní linie Ráji.

Výhodou hybridomu je, že produkuje homogenní protilátku monoklonální, která je schopna specificky reagovat- s buňkami nesoucími HLA antigeny II. třídy. Hybridom HL-40 je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. Z konzerv uchovávaných V kapalném dusíku je možné zahájit produkci protilátky bez dalšího antigenů. Protilátka, produkovaná hybridomem HL-40, reaguje specificky s populacemi lidských buněk, v jejichž membráně jsou přítomny HLA antigeny

II. třídy /HLA-DR, HLA-DP/ a není třeba se zbavovat protilátek • » balastních.

- 3 Příklad

Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo apli6 kováno 3 x 10 buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 14 dnů před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem /0,5 ml intraperitoneálně/. Po 11 dnech růstu hybridomu v peri toneáln-í dutině byla myš usmrcena a neprodukovaná ascitická tekutina odebrána, Celkem bylo získáno 5,5 ml ascitické tekutiny, která obsahovala 16 mg/ml imunoglobulinu. Monoklonální protilátka reagovala specificky v nepřímém imunofluorescenčním nebo enzymoitnunologickém testu s částí lymfocytů periferní krve. Oběma metodami bylo zjištěno 25-30% pozitivních buněk v enzymoimunologickém

- , 5 testu až do ředění ascitické plasmy 1 j 10 a v testu nepřímé, imu4 nofluorescence až do ředění 1,:10,. Při použití čištěných populací T a B lymfocytů byla zjištěna reaktivita protilátky HL-40 s více než 95% B lymfocytů a méně než 5% T lymfocytů. Silně pozitivních bylo také více než 95% monocytů, negativní byly granulocyty a • v erytrocyty. Specifičností protilátka HL-40 odpovídá standardní zahraniční monoklonální protilátce RF-HLA-DR, jak bylo prokázáno opakovanými paralelními stanoveními, včetně použití směsí protilátek, a to jak v případě směsi periferních lymfocytů, tak u izolovaných buněčných populací /viz tabulka/ a stabilizovaných lidských lymfoidních a nelymfoidních linií.

Tab. Reaktivita protilátek produkovaných hybridomem HL-40 a 1 RF-HLA-DR s buňkami periferní krve

Buňky periferní % pozitivních buněk reagujících s monoklo * 2 · 3 lidské krve nální protilátkou v enzymoimunologickém nebo nepřímém imunofluorescenčním testu HL-40 RF-HLA-DR HL-40+RF-HLA-DR

lymfocyty	25d£30
5 T lymfocyty	5rf10
B lymfocyty^	95
monocyty	95
granulocyty	1
erytřocyty	1

25tf30 i	25£30
5®10	5rf10
95	95
95	95
1	1
1	1

Monoklonální protilátka RF-HLA-DR byla získána od Prof. G. Janossyho z The Royal Free Hospital, Londýn.

Buňky lidské periferní krve byly izolovány popsanou metodou /B/yum, A.s Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand. 0. Immunol. 5, Suppl. 5:9, 1976/ na VerografinFiCůll gradientu.

Byl použit postup podle práce Lansdorp, P.M., Astaldi, G.C.B., □osterhof, F., Janssen, M.C., Zeíjlemaker, W.P.s Immunopero_vxi- ; dase procedures to detect monoclonal antibodies against cell surface antigen. Quantitation of binding and staining of individual cells. J. Immunol. Metb. 39: 393-405, 1980,

Byla použita nepřímá imunofluorescenční technika s využitím prasečí protilátky proti myšímu imunoglobulinu značená fluoresceinisothiokyana^em /OSOL, Praha/,'

Tlymfocyty byly izolovány průchodem směsi lymfocytů sloupečkem nylonové vaty popsanou metodou /Julius, M.H., Simpson, E,, Herzenberg, L.A.: A rapid method for the isolation of functional thymus-derived murine lymphocytes, Europ. 3. Immunol, 3:645-649, 1973/.

B lymfocyty byly izolovány adsorbcí na plastikové desky pokryté protilátkou proti lidskému imunoglobulinu popsanou metodou /Máge, M.G., McHugh, L.L., Rothstein, T.L.: Mouše lymphocytes with and without surface immunoglobulin: Preparative scale separation in polystyrene tissue culture dishes coated with specifically purified anti-ímmunoglobulin. 3. Immunol. Meth. 15: 47.-56, 1977/.

Identita antigenů rozeznávaných protilátkami HL-4Q a RF-HLA-DR byla prokázána izolací příslušného antigenů imunoafšnitní chromatografii na imobilizované protilátce HL-40 a prokázáním silné reaktivity tohoto antigenů s protilátkou RF-HLA-DR. Antigen získaný imunafinitní chromatografii na Sepharose 4B s kovalentně navázanou monoklonální protilátkou HL-40 poskytoval po elektroforéze v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecyl» . sulfátu sodného za neredukujících podmínek buS silnou zónu odpovídající m.h. 65· 000 a slabé zóny o m.h. 29 000 a 33 000 /vzorek nebyl zahříván/, nebo pouze 2 zóny odpovídající m.h.

000 a 33 000 /vzorek předem 2 min. zahřát na 100°C/, Což je výsledek typický pro HLA antigény II. třídy /Shackleford, D.A., Kaufnan, 3.,6,-. Korman, A.J., Strominger, J.L.: HLA-DR antigensj Structure, šeparation of subpopulation, gene cloning and function Immunol. Rev. B6: 133-187, 1982/. Po elektroforetickém přenosu separovaných proteinů na nitrocelulózovou membránu a specifické detekci nepřímým enzymoimunologickým testem /s využitím příslušné protilátky a prasečí protilátky proti myším imunoglobulinům konjugované s peroxidázou//ÚS0L, Praha/ obě protilátky /HL-40 i RF-HLA-DR/ reagovaly silně s ant-igenem v dimerní formě /m.h.

000/ i s podjednotkou o m.h. 29 000 izolovaného antigenu.

Buňky hybridomu HL-40 mají ultrastrukturhí obraz typických myelomových buněk. Cytoplasma obsahuje velké množství polyribosomů, mitochondriea slabě vyvinuté endoplasmatické retikulum,

In vitro rostou jako poJosuspen^ní kultury. Základním kultivačním médiem je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin /3 mM/, pyruvát sodný /1 mM/. Toto médium /označované jako H-MEMd Qstav molekulární genetiky ČSAV/ je pro kultivaci hybridomu HL-40 doplněno penicilinem, streptomýcinem, gentamycinem, 2-měrkaptoetanolem /0,05 mM/, pufrem HEPES /10 mM/ a inaktivovaným bovinním sérem /Bioveta, Ivanovice na Hané .10%/. Hybridom je kultivován při 37°C. Střední generační čas je 17,1 hod. a 1B měsíců po sestrojení byl modální počet chromosomů 78. Produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobulin podtřídy IgG2a s lehkými řetězci typu kappa, její isoelektrický bod je pH 7,8 4Í 8,4.

Monoklonální · protilátka produkovaná hybridomem HL-40 i , * reaguje specificky s normálními lidskými B buňkami, monocyty, makrofágy a aktivovanými T buňkami. Hybridom HL-40 můŽB být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky proti buňkám s membránovými HLA antigeny II. třídy v analytických metodách. Monoklonální protilátka hybridomu HL-40 může být využita pro stanovení těchto buněk v periferní krvi a lymfatických orgánech při klinické diagnostice ve zdravotnických zařízeních, zvláště při různých imunologických nedostatečnostech a autoimunních onemocněních a pro klasifikaci leukémií a maligních lymfomů. Předností monoklonální protilátky HL-40 je velmi výrazné značení tepových buněk nesoucích HLA anti- geny II. třídy /HLA-DR, HLA-DP/ v imunofluorescenčních i enžý moimunologických testech buněčných suspenzí i tkáňových řezů.

Claims (1)

1. pReomE.t vynAlezu

   Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS HL-40 produkující monoklonální protilátku podtřídy IgG2a proti membránovým HLA antigenům II. třídy lidských buněk.