CS247450B1 - Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS MA-01 - Google Patents

Abstract

Řešení se týká myšího lymfocytárního hybridomu, produkujícího protilátku proti proteinům asociovaným s mikrotubuly (MAP 2A a MAP 2B), uloženého ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením MA-01. Samotná monoklonální protilátka hybridomu MA-01 je vhodná pro použití v enzymoimunologické a radioimunologické analýze, při vizualizaci MAP-2 proteinů v buňkách na úrovni optického a elektronového mikroskopu a k biochemické a biologické analýze cílové antigenní struktury.

Description

Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného buněčnou fúzí myší myelomové linie P3-X63-Ag8.653 a myší slezinné lymfoidnl buňky, produkující protilátku proti proteinům asociovaným s mikrotubuly MAP-2.

Doposud se protilátky proti proteinům asociovaným s mikrotubuly (MAP) vyrábějí tak, že jsou MPA izolovány z mozkové tkáně a opakovaně injikovány jako antigen pokusným zvířatům, nejčastěji králíkům. Sérum takto imunizovaných zvířat, odebírané po určité době působením antigenu, slouží jako zdroj protilátek, užívaných pro identifikaci buněčných struktur, obsahujících MAP.

Tento poBtup, nazývaný konvenční imunizací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné.

Organismus zpravidla vytvoří kromě protilátek vůči žádanému antigenu i protilátky proti nečistotám antigennlho preparátu; ty je nutné ze sér odstraňovat složitým způsobem, zvaným vysycováni. Výrobní šarže konvenčních sér se proto dají těžko standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvality.

ji

Pro výrobu každé šarže je třeba připravit značně čistý imunizační antigen a další antigeny pro vysycení balastních protilátek proti nečistotám.

Uvedené nedostatky výše zmíněného a dosud používaného postupu odpadnou, je-li k dispozici hybridom, produkující monoklonální protilátku proti MAP-2, uložený ve Sbírce hybridomů Ostavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská ul. č. 1083, pod označením IMG CZAS MA-01.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Fazekas de, St., Groth, S., Schneidigger, D.: Production of monoclonal antibodies: Stratégy and tactics, 3. Immunol. Meth., 35: 1-21, 1980; Galfré, G., Howe, S.C., Milstein, C., Butcher, G.W., Howard, J.C.: Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře 266-550, 1977) klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí myší myelomové linie P3-X63-Ag8.653 a buněk, získaných ze sleziny myší kmene Balb/c, imunizovaných mikrotubulárními proteiny (obsahují tubulin a proteiny asociované s mikrotubuly) připravenými z mozku prasat.

Výhodou hybridomu je, že produkuje homogenní protilátku, tzv. protilátku monoklonální, která je schopna specificky reagovat s proteiny asociovanými s mikrotubuly MAP-2. Reaktivita monoklonální protilátky MA-01 s MAP-2 proteiny byla prokázána v imunoblotingů (separace proteinů elektroforézou v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného za redukujících podmínek, následný elektroforetický přenos proteinů na nitrocelolózovou membránu, specifická detekce nepřímým imunologickým testem s použitím MA-01 protilátky a komplexu peroxidáza/myší monoklonální protilátka proti peroxidáze (Viklický V., Dráber P., Macků B., Dráberová E., Rozprimová L. 1984 Fol. biol. Praha 30, 377-382). Monoklonální protilátka MA-01 se vázala na dvojici vysokomolekulárních proteinů nacházejících se v poloze reaktivních molekulových hmotností odpovídajících proteinů MAP-2A a MAP-2B (tj. kolem 280 000) ve vzorcích: '

- celých homogenátů mozkové tkáně různých druhů (prase, tur, králík, krysa, myš)

- mikrotubulů připravených z těchto tkání opakovanými cykly polymerace a depolymerace. Charakteristickým znakem MAP je společná polymerace s tubulinem za vzniku mikrotubulů

- termostabilních frakcí mikrotubulů. Ze stavebních komponent mikrotubulů jsou pouze MPA-2 proteiny rezistentní k tepelné denaturaci.

V žádném případě nedocházelo k vazbě na proteiny v poloze tubulibu a dalších MAP f-proteiny,

MAP-1 proteiny).

Asociace antigenní determinanty rozpoznávané MA-01 protilátkou s mikrotubuly byla prokázána v nepřímé imunofluorescenci u buněk různého druhového a tkáňového původu. MA-01 se vázala pouze na struktury mikrotubulů (interfázní, mitotické mikrotubuly) a nebyla pozorována vazba na žádné další cytoskeletální struktury.

Hybridom MA-01 je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene Balb/c. Z konzerv, uchovávaných v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky bez dalšího antigénu. Protilátka, produkovaná hybridomem MA-01 jé specifická pro neuronální MAP 2A a MAP 2B proteiny a není třeba se zbavovat protilátek balastních.

Příklad

Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno 6x10® buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 14 dní před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem (0,5 ml intraperitoneálně). Po 13 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byla myš zabita a naprodukovaná ascitická tekutina odebrána. Celkem bylo získáno 3,2 ml ascitické tekutiny, která obsahovala 10 mg/ml imunoglobinu. Protilátka reagovala se specifickým antigenem v enzymolmunologickém testu (při použití prasečí antimyší protilátky značené křenovou peroxidázou) až do ředění l:10⁴. Za pomoci nepřímé imunofluorescenční techniky byl takto získanou protilátkou zobrazen mikrotubulární komplex v buňkách myší fibroblastoidní linie C^H původu (až do ředění 1:10 ).

Buňky hybridomu MA-01 mají ultrastrukturální obraz typických myelomových buněk, kde převažující organelou jsou volné a na membrány vázané polyribosomy. In vitro rostou jako polosuspenzní kultury. Základním kultivačním médiem je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí a doplněné o neesenciální imunokyseliny, L-glutamin (3mM), pyruvát sodný (lmM). Toto médium (označované jako H-MEMd, Ústav molekulární genetiky ČSAV), je pro kultivace hybridomu MA-01 doplněno penicilinem, streptomycinem, gentamycinem, 2-merkaptoetanolem (0,05 mM) , pufrem HEPES (10 mM) a inaktivovaných bovínním sérem (Bioveta, Ivanovice na Hané, 10%). Hybridom je kultivován při 37 °C. Střední generační čas je 13,6 hod. a 6 měsíců pro sestrojení byl modální počet chromosomů 79. Produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobin třídy IgG^ kappa, namířená proti epitopu přítomném na MAP 2A a MAP 2B.

Monoklonální protilátka, produkovaná hybridomem MA-01 analogicky s konvenčními protilátkami reaguje s MAP-2 proteiny řady druhů. Je proto využitelná k detekci buněčných cytoskeletálních struktur většiny druhů obsahujících MAP-2 proteiny.

Hybridom MA-01 může být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky proti MAP-2 proteinům v metodách analytických nebo preparativních.

Claims (1)

1. Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS MA-01, produkující monoklonální protilátku třídy IgGj kappa lehký řetězec, proti mozkovým MPA-2 proteinům.