CS240807B1 - Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS TEC - 01 - Google Patents

Abstract

fiešení se týká myšího lymfocytárního hybridomu. produkujícího protilátku proti membránovému antigenu lidských granulocytů, uloženého ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením TEC-01. Monoklonální protilátka hybridomu TEC-01 je vhodné pro identifikaci granulocytů lidské periferní krve a myeloidnícn leukemickych buněk, jejich eliminaci z buněčných suspenzi a analýzu cílové antigenní struktury.

Description

Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myší myelomové linie P3-X63-Ag8.653 a myší slezinné buňky produkující protilátku proti membránovému antigenu lidských granulocytů.

Doposud se protilátky proti membránovým antigenům lidských granulocytů vyrábějí tak, že granulocyty izolované z lidské krve jsou opakovaně injikovány jako antigen lidským dobrovolníkům nebo pokusným zvířatům (nejčastěji myš, potkan, králík). Sérum takto imunizovaných lidí nebo zvířat, odebírané po určité době působení antigenu, slouží jako zdroj protilátek užívaných zejména pro identifikaci a typizaci granulocytů periferní krve. Tento postup, nazývaný konvenční imunizací, má řadu nevýhod.

Pro každou imunizaci a testování protilátkové aktivity v sérech je nutné izolovat granulocyty z periferní krve.

V séru imunizovaných lidí i zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém organismu různé a neopakovatelné. Organismus vytváří protilátky proti celé řadě membránových antigenů a specifita sér závisí na způsobu jejich absorbce a testování. Výrobní šarže sér připravených konvenční imunizací je proto obtížné standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvality.

Uvedené nedostatky výše zmíněného a dosud užívaného postupu odpadnou, je-li k dispozici hybridom produkující protilátku proti membránovému antigenu lidských granulocytů, uložený ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská 1083, pod označením IMG CZAS TEC-01.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Kohler, G., Milstein, C.: Gontinuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nátuře, 256:495-497, 1975; Kennett, R.H., McKearn, T.J., Bechtol, K.B. (eds.): Monoclonal antibodies, hybridomas:

240 807 a new dimension in biological analysis, Plenům Press,

New York and London, 1980). Pro fúzi byly použity buňky myší myelomové linie P3-X63~Ag8.653 a buňky získané ze slezin myší kmene BALE/c imunizovaných buňkami teratokarcinomové linie F9.

Lymfocytární hybridom TEC-01 produkuje homogenní protilátku, tzv. protilátku monoklonální, která reaguje s lidskými granulocyty a nereaguje s dalšími typy buněk lidské periferní krve (monocyty, lymfocyty, erytrocyty). Hybridom TEC-01 je možno kultivovat in vitro v médiích určených pro savčí buňky a je adaptován pro růst v peritoneální dutině myší BALE/c. Z konserv uchovávaných v kapalném dusíku je možné zahájit produkci protilátek, aniž by bylo nutné provádět imunizace a absorbce sér. Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem TEC-01 je specifická pro membránový antigen lidských granulocytů a je prosta jakýchkoliv balastních protilátek.

Příklad:

Za účelem pomnožení buněk hybridomu TEC-01 in vivo bylo aplikováno 10' buněk do peritoneální dutiny BALE/c myši. Aby došlo k větší produkci ascitické tekutiny, byla myš 14 dnů před aplikací hybridomových buněk ovlivněna olejem 2,6,10,14-tetramethylpentadecan (0.5 ml intraperitoneálně). Po 14 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byla myš zabita a neprodukovaná ascitická tekutina odebrána. Celkově bylo získáno 4 ml ascitické tekutiny, která obsahovala 12 mg/ml imunoglobulinu třídy IgM.

Monoklonální protilátka reagovala v nepřímém radioimunologickém testu s granulocyty periferní krve až do ředění ascitické tekutiny 1:10^ a nereagovala s lymfocyty ani v ředění 1:10. Výsledky přímého radioimunologického testu a nepřímého imunofluorescenčního testu prokázaly, že z buněk lidské periferní krve pouze granulocyty nesou antigen rozpoznávaný uvedenou protilátkou (viz tabulka).

- 3' 240 807

Tab. Reaktivita protilátek produkovaných hybridomem TEC-01 s buňkami periferní krve

Buňky1

Test použity pro detekci reaktivity

3 radioimunologický imunofluorescenční (imp. min.^) % svítících buněk

Lymfocyty, monocyty 300 <2

Granulocyty 12 400 98

Erytrocyty 100 <0.1 *

Buňky lidské periferní krve byly rozděleny podle hustoty na gradientu Percoll

125 Byl použit přímý radioimunologický test, ve kterém ^1značená monoklonální protilátka (50 000 imp. min.^) byla inkubována 1 h s 0.25 x 10^ buněk a měřena radioaktivita vázaná na buňky

Byl použit nepřímý imunofluorescenční test, ve kterém buňky byly inkubovány s 0.1 mg monoklonální protilátky; nenavázaná protilátka byla odmyta a buňky inkubovány s FlTC-značeným prasečím anti-myším IgM. Po odstranění nenavázané protilátky byly buňky prohlíženy ve fluorescenčním mikroskopu.

Při testování na liniích lidských myeloidních a lymfoidních leukemických buněk, TEC-01 protilátka se vázala pouze na myeloidní leukemické buňky.

Buňky hybridomů TEC-01 mají ultrastrukturní obraz typických myelomových buněk, kde převažující organelou jsou volné a na membrány vázané polyribosomy. In vitro rostou jako polosuspenzní kultury. Základním kultivačním médiem je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin (3mM) a pyruvát sodný (1mM).

- 4 240 807

Toto médium (označované jako H-MEMd, Ústav molekulární genetiky ČSAV) je pro kultivaci hybridomu TEC-01 doplněno penicilinem, streptomycinem a teplotně inaktivovaným (56°C, 30 min) bovinním sérem (Bioveta, Ivanovice na Hané, 10%). Hybridom je kultivován při 37°G. Střední generační čas je 14.6 h; za 6 měsíců po sestrojení byl modální počet chromosomů 76. Produkovaná monoklonální protilátka je imunoglobulin třídy IgM, kappa.

Monoklonální protilátka produkovaná myším lymfocytárním hybridomem TEC-01 může být využita ve zdravotnictví k bezpečné identifikaci granulocytů periferní krve, k odliše ní myeloidních leukemických buněk od lymfoidních leukemických buněk, k eliminaci myeloidních leukemických buněk z buněčných suspensí in vitro a k biochemické a biologické analýze cílové antigenní struktury .

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS TEC-01, produkující monoklonální protilátku třídy IgM proti membránovému antigenu lidských granulocytů.