CS245849B1 - Myší lymfocytární hydridom IMG CZAS VI-01 - Google Patents

Abstract

Řešení se týká myšího lymfocytárního hybridomu, produkujícího protilátku proti vimentinu a desminu řady druhů, uloženého ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením VI-01. Samotná monoklonální protilátka hybridomů VI-01 je vhodná pro použití v enzymoimunologické a radioimunologické analýze testovaných tkání a buněk a při vizualizaci středních filament v buňkách na úrovni optického a elektronového mikroskopu.

Description

(54) Myší lymfocytární hydridom IMG CZAS VI-01

2

Řešení se týká myšího lymfocytárního hybridomu, produkujícího protilátku proti vimentinu a desminu řady druhů, uloženého ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením VI-01. Samotná monoklonální protilátka hybridomů VI-01 je vhodná pro použití v enzymoimunologické a radioimunologické analýze testovaných tkání a buněk a při vizualizaci středních filament v buňkách na úrovni optického a elektronového mikroskopu.

Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného buněčnou fúzí myší myelomové linie P3-X63-Ag8.653 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti prasečímu vimentinu a desminu.

Doposud se protilátky proti vimentinu a desminu vyrábějí tak, že je vimentin nebo desmin opakovaně injikován jako antigen pokusným zvířatům, nejčastěji králíkům. Sérum takto imunizovaných zvířat, odebírané po určité době působení antigenu, slouží jaka zdroj protilátek, užívaných zejména pro identifikaci buněčných struktur, obsahujících vimentin a desmin. Tento postup, nazývaný konvenční imunizací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. Organismus zpravidla vytvoří kromě protilátek vůči žádanému autigenu i protilátky proti nečistotám antigenního preparátu; ty je nutné ze sér odstraňovat složitým způsobem, zvaným vysycování. Výrobní šarže konvenčních sér se proto dají těžko standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvality.

Pro výrobu každé šarže je třeba připravit značně čistý imunizační antigen a další antigeny pro vysycení balastních protilátek, proti nečistotám.

Uvedené nedostatky výše zmíněného a dosud používaného postupu odpadnou, je-li k dispozici hybridom, produkující monoklonální protilátku proti vimentinu a desminu, uložený ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská ul. č. 1083, pod označením IMG CZAS VI-01.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Fazekas de, St., Groth, S., S. Scheidegger, O.: Productjon of monoclonal antibodies: Stratégy and tactics, J. Immunol. Meth., 35: 1 — 21, 1980; Galfré, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, J. C.: Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře 266 — 550, 1977) klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí myší myelomové linie P3-X63-Ag8. .653 a buněk, získaných ze sleziny myší kmene B10.A, imunizovaných částečně purifikovaným extraktem prasečího mozku.

Výhodou hybridomu je, že produkuje homogenní protilátku, tzv. protilátku monoklonální, která je schopna specificky reagovat s vimentinem a desminem řady druhů. Hybridom VI-01 je možné kultivovat in vltro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší první filiální generace mezi kmeny BALB/c a B10.A. Z konzerv, uchovaných v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky bez dalšího antigenu. Protilátka, produkovaná hybridomem VI-01 je specifická výhradně pro vimentin a desmin a nereaguje s žádným dalším proteinem středních filament a dalšími cytoskeletálními proteiny, jak bylo zjištěno imunoblotingem, Imunoradiometrickým testem a nepřímou imunofluorescencí. Průkaz byl získán p,o elektroforetickém přenosu různých buněčných lysátů a preparátů izlovaného cytoskeletonu z mozku získaných separací na elektroforéze v polyakrylamidovém gelu v prostředí dodecylsulfátu za redukujících podmínek. Po přenosu na nitrocelulózovou membránu byl vimentin a desmin specificky detegován s použitím VI-01 protilátky, prasečí protilátky proti myším imunoglobulinům a peroxidáza-antiperoxidázového komplexu (PAP) využívajícího monoklonální protilátku proti křenové peroxidáze. Výsledek byl dále potvrzen v imunoradiometrickém testu, kde byla prokázána vazba protilátky VI-01 na desmin a vimentin a nereaktivita s tubulinem a hovězím sérovým albuminem. V nepřímé imunofluorescencí ve světelném mikroskopu při použití prasečí protilátky proti myším imunoglobulinům značené fluorescein-iso-thiocyanátem (Ostav sér a očkovacích látek, Praha), docházelo u testovaných buněčných typů k vazbě pouze na intermediální filamenta. Po působení kolcemidem docházelo k typickému shluku filament k jádru.

Příklad

Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno 1 x 10⁶ buněk do peritoneální dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 13 dní před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem (0,5 ml intraperitoneálně). Po 20 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byla myš zabita a neprodukovaná ascitická tekutina odebrána. Celkem bylo získáno 3,0 ml a scitické tekutiny, která obsahovala 10 mg/ml (vimentinem) v enzymoimunologickém testu (při použití prasečí antimyší protilátky značené křenovou peroxidázou) až do ředění 1: 10^B. Specificita získané protilátky byla testována na panelu buněk z tkáňových kultur, a to jak v nepřímé imunofluorescencí (při použití prasečí protilátky proti myšímu imunoglobulinu značené fluorescein-iso-thiocyanátem, Ostav sér a očkovacích látek, Praha], tak i po elektroforetickém přenosu buněčných lyzátů na nitrocelulózovou membránu a specifické detekci nepřímým imunologickým testem (viz výše). Výsledky jsou shrnuty v tabulce č. 1.

Tabulka č. 1

Reaktivita VI-01 protiláky s buňkami různých linií ( + silná pozitivita, — negativní výsledek, IF — imunofluorescence, IB — imunobloting, V — vimentin, K — keratin, G — gliový kyselý protein, D — desmin).

Druh	Tkáňový původ,	Název linie	Typ střed-	Reaktivita
	buněčný typ		nich fila-
			ment IF	IB
Člověk	plicní fibroblasty	LEP	V +	+
	| adenokarcinom	HELA	V + K +	+
	karcinom močového měchýře	T-24	K —	—
	T-lymfoblastoidní
	linie	MOLT-3	v +	+
Krysa	gliom	C 6	V + G +	+
Myš	fibroblast	3T3	V +	+
	primární kultura	Leydigovy	V +	+
		buňky
Křeček	buňky ovaria	CHO	v +	+
	buňky ledvin	BHK-21	V + D +	+
Z výsledků	je zřejmé, že protilátka zo-	a na membrány vázané polyribosomy.

brazuje vimentinový typ středních filament (Hela buňky obsahují i keratinový typ, který není zobrazen), řady druhů. Specificita byla dále upřesněna v imunoblotingu po přenosu purifikovaných materiálů na nitrocelulózu (tabulka č. 2).

Tabulka č. 2

Specificita VI-01 protilátky v imunoblotingu po přenosu purifikovaných a částečně purifikovaných materiálů na nitrocelulózovou membránu. (+ pozitivní reakce, — negativní reakce) (+ pozitivní reakce, — negativní reakce)

Materiál Výsledek

Vimentin +

Desmin +

Cytokeratiny —

Cytoskeletální proteiny izolované z myšího mozku —

Opět byla potvrzena reakce pouze s vimentinem a desminem a nereaktlvita s cytokeratiny (izolovanými z lidské kůže), proteiny neurofilament a gliálním fibrilárním kyselým proteinem.

Buňky hybridomů VI-01 mají ultrastrukturální obraz typických myelomových buněk, kde převažující organelou jsou volné ro rostou jako polosuspenzní kultury. Základním kultivačním médiem je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí, doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin (3mM), pyruvát sodný (lmM). Toto médium (označené jako H-MEMd, Ostav molekulární genetiky ČSAV), je pro kultivace hybridomů VI-01 doplněno penicilinem, streptomycinem, gentamycinem, 2-merkaptoetanolem (0,05mM), pufrem HEPES (10 mM) a inaktivovaným bovinním šerem (Bioveta, Ivanovice na Hané, 10 %). Hybridom je kultivován při 37 °C; Střední generační čas je 15,6 hod. a 6 měsíců, po sestrojení byl modální počet chromosomů 84. Produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobulin třídy IgM kappa, namířená proti epitolu nacházejícímu se na vimentinu a desminu.

Monoklonální protilátka, produkovaná hybridomem VI-01 analogicky s konvenčními protilátkami reaguje s vimentinem a desminem řady druhů. Je proto využitelná k detekci buněčných cytoskeletálních struktur většiny druhů obsahujících vimentin a desmin. Najde uplatnění zejména v každodenní práci na všech pracovištích patologické anatomie a onkologie, jako důležitá pomůcka při stanovení diagnózy. Je použitelná k diferenciální diagnóze mezi nádory epitheliálního (karcinomy) a mesenchymálního (sarkomy) původu.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS VI-01, produkující monoklonální protilátku třídy IgM proti vymentinu a desminu řady druhů.