CS263087B1 - Myší lymfocytárni hybridom produkující protilátku proti lidskému keratinu 18 - Google Patents

Abstract

Řečení ne týká myšího lymfocytárního hybridomu, produkujícího protilátky proti lidskému keratinu 18, uloženého ve abírce hydridomů Výzkumného úntavu klinické a experimentální onkologie v Brně pod označením RICEO-DA-7. Samotná monoklonální protilátka hybridomu DA-7 je vhodná pro použití v enzymoimunologické a radioi/nunologické analýze testovuných tkání, buněk a tělních tekutin, jakož! pro vizualizaci keratinu v buňkách na úrovni optického a elektronového mikroskopu a i imunohigtochemického průkazu keratinu 18 na tkáňových řezech.

Description

Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, připraveného procesem biotechnologie, tj, buněčnou fúzí myši myelomové linie P3-X63-Ag8,653 a myší slezinné lymfoidní buňky produkující protilátku proti lidskému keratinů 18.

Doposud se protilátky obecně vyrábějí imunizací zvířat tak, že je antigen opakovaně aplikován zpravidla spolu s adjuvans pokusným zvířatům, nejčastěji králíkům, morčatům, prasatům či kozám. Sérum takto imunizovaných zvířat se odebírá po určité době působeni antigenu á slouží jako zdroj protilátek, které se používají pro diagnostiku a léčbu řady onemocnění, ale i pro studium výskytu a funkce těchto antigenů v buněčné patofyziologii. Tento postup, nazývaný konvenčni imunizací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. Organismus zpravidla vytvoří kromě protilátek vůči žádanému antigenu i protilátky proti nečistotám sntigenního preparátu, které je nutné ze sér odstraňovat složitým způsobem, zvaným vysycování. V případě antisér proti jedinému ze skupiny 19 známých keratinů lidského cytoskeletu (Moll 2., Franke W.1V,, Schiller D.L., Geiger 5,, Krepler R.: The cstalog of human cytokefatin polypeptides : patterns of expression of specific cytokeratins in normál epithelio, tumors and cultured cells. Cell 31: 11 - 24, 1982) je situace ještě komplikováno značnou vzájemnou podobností jednotlivých keratinů, takže připravit konvenčni antisérum proti jedinému keratinů vysycováním je nesmírně pracné a jen zřídka vede k získání žádané monospecifické protilátky. Výrobní šarže konvenčních antisér se proto dají jen velmi nesnadno standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvality.

263 087

Pro výrobu každé šarže je třeba připravit značné čistý imunizačnl antigen a další antigeny pro vysyceni balastnich protilátek proti nečistotám či proti podobným molekulám, jako je např. vimentin, desmin nebo laminy.

Uvedené nedostatky výše zmíněného a dosud používaného postupu odpadnou, je-li k dispozici hybridom produkující zcela homogenní protilátku, tzv. protilátku monoklonální proti kterékoliv třídě z 19 známých lidských keratinů, v našem případě proti keratinu 18. Takový/ hybridom je uložený ve sbírce hybridomů Výzkumného ústavu klinické a experimentální onkologie v Brně, Žlutý kopec 7, pod označením RICEO-DA-7,

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Kohler G., Milstein C,: Conťinuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.

Nátuře 256: 495- , 1975, Galfré G.. Howe S.C., Milstein C,, Butcher G.W,, Howard 3.C.: Antibodies to major histocompatibility antigen produced by hybrid cell lineš. Nátuře 266:

550- , 1977, Fazekas de St. Groth S., Scheidigger D.; Production of monoclonal antibodies: Stratégy and tactics. □.Immunol.Meth. 35: 1-21, 1980) klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí buněk myší myelomové linie P3-X63-Ag8.653 a buněk, získaných ze sleziny myší kmene BALB/c, imunizovaných izolovaným cytoskeletálním preparátem lidských buněk epiteliálniho původu.

Hybridom DA-7 je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných pro pěstování živočišných buněk nebo v podmínkách in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. Hybridom DA-7 je vhodný k dlouhodobému uchovávání v konzervách uložených v kapalném dusíku. Produkci monoklonální protilátky je možno zahájit po rozmražení buněčné konzervy, aniž by bylo třeba dalšího antigenu. Monoklonální protilátka, produkovaná hybridomem DA-7, je specifická výhradně pro lidský keratin o molekulové hmotnosti přibližně 45 000-označovaný jako keratin 18, a nereaguje s žádným dalším proteinem středních filament ani s dalšími buněčnými bílkovinami, jak bylo zjištěno imunoblotingem, enzymoimunologickým testem, nepřímou imunoperoxidázovou a nepřímou imunofluorescenční metodou. Průkaz byl získán

263 087 po elektroforetickém přenosu rozsáhlého spektra buněčných a tkáňových lysátů a preparátů izolovaného cytoskeletu různých lidských i zvířecích tkání a buněčných linií, a to po separaci bílkovinných komponent v polyakrylamidovém gelu v prostředí dodecylsulfátu sodného za redukujících podmínek. Ke zjištění izoelektrického bodu charakteristického pro cílový keratin rozpoznávaný protilátkou DA-7 byly bílkoviny výše zmíněných lysátů a cytoskeletálních izolátů nejdříve podrobeny izoelektrické fokusaci, po níž následovala již uvedená e lektroforéza v polyakrylamidovém gelu. Po přenosu rozdělených bílkovin na nit rocelulózovou membránu byl keratin 18 specificky vizualizován (detekován) s použitím protilátky DA-7 a následně králičího antiséra proti myším imunoglobulinům konjugovaného s křenovou peroxidázou. Výsledek byl rovněž potvrzen enzymoimunologickým testem, kde byla prokázáno vazba protilátky DA-7 no keratin 10, ale nikoliv na vimentin, sérové bílkoviny či keratiny jiných tříd.

Pomocí imunoperoxidázové reakce na tkáňových řezech (potvrzené i výsledky nepřímé imunofluorescenční metody - viz níže) lidských a zvířecích tkání byla u protilátky DA-7 zjištěno reaktivito s epiteliálními tkáněmi, obsahujícími keratin 18 o nereaktivita s tkáněmi ostatními. V nepřímé imunofluorescsnci využívající protilátky DA-7 a následné inkubace s králičím nebo prasečím antisérem proti myším imunoglobulinům označeným fluorescein-izo-thiocyanátem , docházelo u testovaných buněčných typů in vitro k vazbě pouze no intermediární filamenta keratinového typu. Mikrotubuly ani mikrofilamenta odlišitelná od keratinů po působení kolcemidu a cytochalazinu B s protilátkou DA-7 nereagovaly, rovněž ostatní struktury testovaných buněk, s výjimkou keratinových filament byly negativní.

Výhodou lymfocytárního hybridomu DA-7 je, že produkuje protilátku reagující pouze s lidským keratinem 18. Předností této úzké specificity je možnost'identi fíkovát a studovat lidské karcinomy rostoucí jako transplantáty v bezthymových myších (kmen nu/nu), nebo jiných imunosuprimovaných zvířatech, kdy nelze použít protilátky reagující i s keratiny jiných

I

263 087 zvířecích druhů, např. protilátka RICE0-C-04,

Další její výhodou je, že se váže na cílovou strukturu keratinu 18, která je stabilní i při relativně drastické fixaci lidského materiálu formaldehydem a následném zalití do parafinu, což je rutinně používaná fixace histologického materiálu ve všech histologických laboratočích , Dine známé monoklonální protilátky reagují pouze na zmražených tkáňových řezech, anebo vyžadují šetrnější speciální fixaci metakarnem.

Tabulka 1 ukazuje sílu reakce protilátky při použití různých fixačních metod.

Tabulka 1

Intenzita reakce protilátky DA-7 na tkáňových řezech fixovaných třemi různými způsoby (slabá reakce +, středně silná reakce ++, silná reakce + + +)

Použitá fixace: metanol/aceton metakarn formaldehyd

Řezy zmražené parafinové parafinové

Reakce + + -)· + + τ- +

Tato protilátka můža být využita ne všech patologických odděleních pro rutinní diferenciální diagnostiku !< odlišení karcinomů od jiných typů nádorů, např. sarkomů, melanomů či. lymfomů, ale i k odlišení a denokc rcinomů od karcinomů z vícevrstevného dlaždicového epitelu. Pokud je nám známo, hybridorn těchto vlastností není komerčně dostupný v žádné zemi, ani nebyl v odborné literatuře popsán hybridem podobných vlastností.

Příklad 1

Za účelem pomnožení buněk hybridomů RICEO-DA-7 v podmínkách in vitro bylo vpraveno 1 x 10“' hybr idomových buněk do kultivační lahve Legroux, obsahující 20 ml kultivačního média DMEM s 10/. fetálního telecího séra a antibiotiky (viz níže). Po čtyřech dnech růstu kultury hybridomových buněk bylo z lahve získáno kultivační médium obohacené o monoklenelni protilátku DAg¹? uvolňovanou do médie hybridomovými

263 08?

buňkami. Specificita získané protilátky byla testována na panelu buněk z tkáňových kultur, a to jak v nepřímé imunofluorescenci s využitím prasečí nebo králičí protilátky proti myšímu imunoglobulinu, značené fluorescein-iso-thiocyanátem, tak i po elektroforetickém přenosu buněčných lysá* tů a preparátů cytoskeletu na nitrocelulózovou membránu s následnou detekcí nepřímým imunoperoxidázovým testem (viz výše). Výsledky jsou shrnuty v tabulce č.2.

Tabulka 2

Reaktivita protilátky DA-7 s buňkami různých lidských linii (+ silná pozitivita, - negativita,

XF itnunofluorescence , IB imunoblotting , V vimentin, l< keratiny označené číselnými indexy katalogu keratinů, G gliový kyselý protein, D desmin)

Druh	Tkáňový původ, buněčný typ	Název linie	Typ středních filament	Reakce
IF	IB
Člověk	Rhabdomyosa rkom	RD	D + V	-	-
	Gliom	U 118 MG	G + V	-	-
	Fibroblas ty	Primokultur	3 V	-
	T-lymfoblsstoidní linie MOLT-3	V	-	-
	Karcinom prsu	MCF-7	K8,18,19	+	+
	Karcinom moč,měchýře	T 24	K7,8,18,19	+	+
	Karcinom střeva	HT-29	K8,18,19	4	4
	Epidermoidní karcinom	A 431	K5,6,7,8/13, 14,15,16.17,18	4	4
	Karcinom daložního čípku Hela	K7,8.17,18	4	4
Kráva	Epitel mléčné žlázy	BMGE-H	K7,8,18,19	-
Krysa	Morisův hepatom	MH	K8,18	-	-
Myš	Firoblast	3T3	V	-	-
Z	výsledků, uvedených v	Tabulce č.ž	je zřejmé, že proti-

látka DA-7 reaguje výhradně s lidským keratinem 18. Úzká specificita pro keratin 18 byla upřesněna v imunoblotingu, kde byle nalezena silná reakce s keratinem 18, přičemž ostatní přítomné keratiny byly negativní (viz též Příklad 2: tkáňová

263 08?

Příklad 2\

Kultivační médium obohacené o monoklonální protilátku DA-7 bylo získáno kultivací hybridomových buněk RICEO-DA-7 jako u Příkladu 1. Tkáňová specificita reakce protilátky byla testována nepřímým imunofluorescenčnim testem a potvrzena rovněž nepřímou imunoperoxidázovou reakci, v obou případech na zmrazených i parafinovaných tkáňových řezech. Vzorky tkání uvedených v Tabulce č,5 byly odebrány z operačního nebo pitevního materiálu. Zmražené řezy tkání byly fixovány po zaschnutí na vzduchu směsí metanol-aceton (1 : i) předchlazenou na -15°C a opakovaně promyty fosfátovým pufrem ve fyziologickém roztoku při pH 7,4 (PBS). Parafinové řezy byly odparafinovány a rehydratovány postupně xylenem, alkoholem a destilovanou vodou. Nyní byl postup společný pro řezy zmražené i parafinové. Na řezy byla aplikována monoklonální protilátka DA-7, která byla po 1 hodinové inkubaci z řezu odstraněna opakovaným promytím (3 x po 5 minutách) v PBS a na řez byla nanesena králičí nebo prasečí protilátka s fluorescein-iso-thiocyanátem. Inkubace (40 - 60 minut) byla ukončena trojím promytím v PBS po 5 minutách, řezy byly ponechány při pokojové teplotě až do zaschnutí a preparáty montovány např. do média s glycerinem. Výsledky hodnocení reakce protilátky DA-7 s vybranými tkáněmi jsou uvedeny v Tabulce č.3; mezi výsledky získanými nepřímou imunofluorescencí a nepřímou imunoperoxidázovou reakcí nebyly zjištěny žádné rozdíly, proto nejsou tyto metody v tabulce č.3 uváděny odděleně.

Tabulka 3

Reaktivita protilátky DA-7 s normálními tkáněmi (+ silná pozitivita, - negativita, V vimentin,

D desmin, G gliový kyselý protein, N neurofilamenta , l< keratin s příslušným číselným indexem)

Druh	Tkáň
Člověk	Vazivo Sva 1 Mozek Cévy □átra - hepatocyty - žlučovody Moč,měchýř - epitel Endomet rium St řevní epitel Epitel dýchacích cest Mezotal Epitel mléčné žlázy Epitel žlučníku Epiderrnis (vč.spid.pla
Kráva	Vazivo Sva 1 Cévy Epíde rmis Dátrc - hepatocyty - žlučovody Střevní epitel Epitel mléčné žlázy Epitel močového máchý Epitel patních žláz E o i t o 1 z a n k r a t u

Typ stř.filament Reakce

V

D

N + G

V+D ^K8,18 ^{+ !<}7,8,18,19 ⁺ ^4,5,7,8,13,18,19 ^{+ K}7,8,1.8,19 ⁺ ^8,18,19 ^{+ K}7,8,13,19 ^7,8,18,19 ^{+ K}5,7,8,14,16,17,18,19 ^{+ !<}7,8,18,19 ⁺

Λ Ώ r! 1 C ' j f ^K1 ,2,5,5,9,10.11. 14,15,16 '

V

D

D+V

K (ala nikoliv Κ^θ) ^K8,18 '<7,8,18,19 '<8,18,19

K, ívČ5tn^?· K_1n) o

_ i< - ~

I

263 087

Tabulka 3 - pokračování

Druh Tkáň

Křeček Vazivo Sva 1 Cévy

Lymfoidní tkáň Epide rmis □ átra - hepatocyty

- žlučovody Střevní epitel

Krysa Vazivo Sva 1 Cévy □ átra - hepatocyty

- žlučovody Střevní epitel Epitel mléčné žlázy Epitel moč.měchýře

Hys Vazivo Sva 1 Cévy □átra - hepatocyty

- žlučovody Epitel mléčné žlázy

Typ stř.filament

Reakce

V

D

D+V

V

K (ale nikoliv Κ-^θ) K včetné K_n K -

K - ”

V

D

D + V

K v č e t n ě i<

K -

K -

K - ” « - ”

V

D

D + V '18

K včetně Κ^θ K - K - Ze spektra tkání (viz Tabulka 3) reagujících s protilátkou DA-7 je zřejmé, že všechny tkáně obsahující keratin 18 jsou pozitivní, kdežto všechny tkáně postrádající tento keratin jsou negativní. Z tabulky je rovněž patrné, že protilátka nereaguje s keratiny testovaných zvířecích druhů, což lze považovat za její přednost, zejména z hlediska klinického využití. Analýza metodou imunoblotingu po elektroforetickém rozdělení bílkovin tkáňových lyzótů či cytoskeletálních preparátů potvrdila, že jediným keratinem rozpoznávaným

263 087 protilátkou DA-7 u epiteliálních tkání obsahujících více keratinů je keratin 18.

Příklad 3/

S ohledem na možnost praktického využití v diferenciální diagnostice nádorů byla imunofluoreacenčni a imunoperoxidázovou metodou (viz popis metody u/příkladu 2) testována reaktivita protilátky DA-7 na tkáňových řezech připravených z různých lidských nádorů. Získané výsledky shrnuje tabulka č.-4.Tabulka 4

Reaktivita protilátky DA-7 na tkáňových řezech lidských nádorů (+ pozitivní reakce, - negativita, V vimentin, D desmin, G gliový kyselý protein.

K keratin s přís

Typ nádoru

Sa rkomy

Melanomy

Lymfomy

Gliomy

Karcinomy střeva p rsu plic žaludku ovs ris močového měchýře

Hepa t omy ušným číselným indexem)

Typ středních filament Reakce

V (nebo V+D)

V

V G ^K8,18,19 ^{+ K}7,8.18,19 ^{+ K}7,8,18,19 .. ^{+ K}8,18,19 ' ^{+ K}7,8,18,19 ^{+ K}4,7,8,13,17,18,19 ^{+ K}8,18 ⁺

Výsledky stanovení reaktivity protilátky DA-7 s různými lidskými nádory potvrzují specificitu této protilátky pro nádory epiteliálního původu, které obsahují keratin 18. Spolu s negativními výsledky u jiných typů nádorů to svědčí o klinické hodnotě této protilátky pro diagnózu primárních karcinomů a jejich metastáz.

—

63? 087, h Ί O <·,

VJ> ? ,i 1 ·? . $ /

•Ϊ

Buňky hybridomů RICEO-DA-7 mají morfologický obraz typických myelomovýcb buněk. V podmínkách in vitro rostou v podobá polosuspensnich kultur. Základním kultivačním médiem je Dulbeccova modifikace minimálního esenciálního média (DMEM) doplnšná L-glutaminem (3mM), penicilinem, streptomycinem a inaktivovaným fetálním telecím eérem (10%) z JZD Sokolnice u Brna. Hybridom je kultivován při 37°C, střední generační čas je 18 hod. a modální počet chromozomů 6 měsíců po sestrojeni hybridomů byl 72. Produkovaná protilátka je myší monoklonální imunoglobin třídy IgGl, specificky vážící epitop lidského keratinu 18.

Monoklonální protilátka produkovaná hybřidomem RICEO-DA-7 reaguje s lidským keratinem 18 i ns formaldehydem fixovaných histologických řezech zalitých parafinem a je tedy využitelná ve všech histologických laboratořích za použití různých testů (imunohistochemických, enzymoimunologických, radioimunologických imunofluorescenčních, imunoblotingu). Kromě lékařské praxe je pro svou vlastnost specificky reagovat pouze s lidským keratinem využitelná v oblasti teoretického výzkumu lidských karcinomů na xenotransplantátech, kde nelze použít protilátku reagující s cílovou strukturou přítomnou i na zvířecích keratinech, jakou je např, protilátka RICE0-C-04.

Claims (1)

1. Myší lymfocytární hybridom RICEO-DA-7 produkující mono klonálni protilátku třídy IgGl proti lidskému keratinu 18.