CS262046B1

CS262046B1 - Myší lymfocytární hybrldom 3-04 produkující protilátku proti keratinu 18

Info

Publication number: CS262046B1
Application number: CS875575A
Authority: CS
Inventors: Jiri Mudr Csc Bartek; Jan Rndr Phmr Csc Kovarik; Borivoj Rndr Vojtesek
Original assignee: Bartek Jiri; Jan Rndr Phmr Csc Kovarik; Vojtesek Borivoj
Priority date: 1987-07-24
Filing date: 1987-07-24
Publication date: 1989-02-10
Also published as: CS557587A1

Abstract

Řešení se týká myšího lymfocytárního hybridomu, produkujícího protilátku proti keratinu 13 řady živočišných druhů, uloženého ve sbírce hybridomů Výzkumného ústavu klinické a experimentální onkologie v Brně pod označením RICEO-C-04. Saaotna monoklonální protilátka hybridomu RICEO-C-Ol Je vhodná pro použití v eQzymoimunolo^ick- a radioimunoloxické analýze testovaných tkání, buněk a tělních tekutin, jakož i pro vizualizaci keratinu v buňkách na úrovni optického a elektronového mikroskopu a k imuno- ^istochemickému průkazu keratinu 18 na tkáňových řezech.

Description

Vynález se týká nového hybridomu, t.j. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného buněčnou fúzí myší myelomové linie P3-X63-Ag8>653 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti lidskému keratinu 18·

Doposud se protilátky proti keratinu vyrábějí tak, že je keratin opakovaně injikován jako antigen pokusným zvířatům. Sérum takto imunizaváných zvířat, odebírané po určité době působení antigenu, slouží jako zdroj protilátek, užívaných zejména pro identifikaci buněčných struktur obsahujících keratiny· Tento postup, nazývaný konvenční imunizací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. Organismus zpravidla vytvoří kromě protilátek vůči žádanému antigenu i protilátky proti nečistotám antigenního preparátu, které je nutné ze sér odstraňovat složitým způsobem, zvaným vysycování. V případě antisér proti jedinému ze skupiny známých keratinů, jichž bylo u člověka dosed popsáno 19/ je situace ještě komplikována značnou vzájemnou podobností jednotlivých keratinů, takže připravit konvenční antisérum proti jedinému keratinu vysycováním je nesmírně pracné a j en zřídka vede k uspokojivému výsledku· Výrobní šarže konvenčních antisér se proto dají jen velmi nesnadno standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvality·

Pro výrobu každé šarže je třeba připravit značně čistý imunizačni antigen a další antigeny pro vysycení balastních protilátek proti nečistotám či proti podobným molekulám jako např. vimentin, desmin nebo laminy.

Lymfocytární hybridomy produkující protilátky proti keratinům byly již připraveny v několika zemích a v některých z nich jsou též komerčně dostupné a začínají se používat v klinické praxi.

Protilátky nabízené v zahraničí však postrádají jedinečnou kombinaci výhodných vlastností charakteristických pro protilátku C-04, t.j· nespojují úzkou specifičnost pro keratin 18 s širokým spektrem reaktivity s různými živočišnými druhy, jakož i využitel- 2 npstí v různých metodách aplikace včetně imunoblotingu a imunT- ** hiatochemie na metacarnem fixovaných parafinových tkáňových řezech /tedy metodách, v nichž mnohé monoklonélní protilátky nabízená v zahraničí nelze vůbec použít/·

Uvedené nedostatky výěe zmíněného a doeud používaného postupu odpadnou, je-li k dispozici hybridom, produkující monoklonální protilátku proti keratinu 18, uložený ve sbírce hybridomů Výzkumného ústavu klinické a experimentální onkologie v Brně, Žlutý kopec 7, pod označením RICE0-C-04·

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury /Fazekas de St· Groth S·, Scheidigger D. : Production of monoclonal antibodiee: Stratégy and tactics, J.Immunol. Meth. 35: 1 “21, 1980; Galfré G·, Howe S· C·, Milstein C·, Butcher G.W., Howard U.C·: Antibodiee to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře 266:

550 — , 1977 / klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí buněk myší myelomové linie P3-X63-Ag8.653 a buněk, získaných ze sleziny myší kmene BALB/c, imunizovaných izolovaným cytoskeletárním preparátem lidských buněk epiteliálního původu·

Výhodou lymfocytárního hybridomů C-04 je, že produkuje zcela homogenní protilátku, t.zv, protilátku monoklonální, která je schopna specificky reagovat s lidským keratinem 18, jakož i s ekvivalentními keratiny řady živočišných druhů· Hybridom C-04 je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných pro pěstování živočišných buněk nebo v podmínkách in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. hybridom C-04 je vhodný k dlouhodobému uchováváni v konzervách uložených v kapalném dusíku· Produkci monoklonélní protilátky je možno zahájit po rozmražení buněčné konzervy, aniž by bylo třeba dalšího antigenu· Monoklonální protilátka, produkovaná hybřidomem C-04 je specifické výhradně pro keratin o relativní molekulové hmotnosti přibližně 45 000 označovaný jako keratin 18 a nereaguje s žádným dalším proteinem středních filament ani dalšími bílkovinami cytoskeletu, jak bylo zjištěno imunoblotingem, enzymoimunologickým testem, nepřímou imunoperoxidázovou a nepřímou imunofluoreacenční metodou. Průkaz byl získán po elektro*

- 3 262 048 íoretickém přenosu rozsáhlého spektra buněčných a tkáňových lysátú a preparátů Izolovaného cytoskeletu různých lidských i zvířecích tkání a buněčných linií, a to po aeparacl bílkovinných komponent v polyakrylamidovám gelu v prostředí dodecylsulfátu sodného za redukujících podmínek. Ke zjištění izoelektrického bodu>charakteristického pro cílový keratln rozpoznávaný protilátkou C-04/byly bílkoviny výše zmíněných lysétů a cytoskeletálních Izolátů nejdříve podrobeny izoelektrické fokusaci, po níž následovala již uvedené elektroforéza v polyakrylamidovém gelu. Po přenosu rozdělených bílkovin na nitrocelulózovou membránu byl keratin 18 specificky vizualizován (detekován) s použitím protilátky C-04 a následně králičího antiséra proti myším imunoglobulinům konjugovaného s křenovou peroxidázou. Výsledek byl rovněž potvrzen emzymoiaunologickým testem, kde byla prokázána vazba protilátky C-04 na keratin 18, ale nikoliv na vimentin, sérové bílkoviny či keratiny 7, 8, 19 a další. Pomocí iraunoperoxidázové reakce na tkáňových řezech (potvrzené i výsledky nepřímé imunofluorescenční metody - viz níže) lidských a zvířecích tkání byla u protilátky C-04 zjištěna reaktivita s epiteliálními tkáněmi obsahujícími keratin 18 a nereaktivita s tkáněmi ostatními.

V nepřímé imunofluorescenci využívající protilátky C-04 a následné inkubace s králičím nebo prasečím antisérera proti myším imunoglobulinům označeným fluorescein-izo-thiocyanátera, docházelo u testovaných buněčných typů in vitro k vazbě pouze na intermediární filamenta keratinového typu. Mikrotubuly ani mikrofilamenta odlišitelná od keratinů po působení kolcemidu a cytochalazinu B s protilátkou C-04 nereagovaly, rovněž ostatní struktury testovaných buněk s výjimkou keratinových filaraent byly negativní.

Příklad 1:

Za účelem pomnožení buněk hybridomu RICE0-C-04 v podmínkách in vitro bylo vpraveno 1x10^ hybridomových buněk do kultivační lahve Legroux obsahující 20 ml kultivačního média DEEM s 10% fetálního telecího séra a antibiotiky (viz níže). Po čtyřech dnech růstu kultury hybridomových buněk bylo z lahve získáno kultivační médium obohacené o raonoklonální protilátku C-04 uvolňovanou do média hybridomovými buňkami. Účinnost monoklonální protilátky byla testována postupným dvojnásobným ředěním

- 4 2B2 04β kultivačního média obsahujícího monoklonélní protilátku v prostředí fyziologického roztoku s fosfátovým pufrem (BBS) pH 7,4 a β 10% hovězího séra· Protilátka reagovala se specifickým antigenem (izolovaným keratinem 18) v radloimunologickém testu využívajícím králičí protilátku proti myěímu imunoglobulinu označenou izotopem až do ředění 1t512. Specifičnost získané protilátky byla testována na panelu buněk z tkáňových kultur, e to jek v nepřímé imunofluorescenci s využitím prasečí nebo králičí protilátky proti myšímu imunoglobulinu značené fluorescein-iso-thiocyanátem, tak 1 po elektroforetickém přenosu buněčných lysátů a preparátů cytoskeletu na nitrocelulózovou membránu s následnou detekcí nepřímým imunoperoxidázovým testem (viz výše). Výsledky jsou shrnuty v Tabulce č.1.

zabulka č. 1. Reaktivita protilátky C-04 s buňkami různých linií (+ silná pozitivita, - negativita, IP - imunofluorescence, IB - imunobloting, V - viraentin, K - keratiny označené číselnými indexy katalogu keratinů, G - gliový

	kyselý protein, D -	desrain)·
Druh	Tkáňový původ,	Název linie	Typ středních	Reakci
	buněčný typ		filament	IF	IB
člověk	Rhabdomyo sarkom	RD	D + V	-	I i
	Gllom	U 118 MG	G + V	-	-
	Pibroblasty	Primokultura	V	-	-
	T-lymfoblastoidní linie	MOLT-3	V	-	- ;
	Karcinom prsu	MCF-7	^K8,18,19	+	i + i
	Karcinom moč. měchýře	T 24	*4,8,18,19	+	+
	Karcinom faryngu	Detroit 562	^K4,5,6,7,8,
			17,18,19	+	+
	Epidertnoidní karcinom	A431	^K5,6,7,8,13,
		14,	15,16,17,18,	+	+
Kráva	Epitel mléčné žlázy	BMGE-H	^K7,8,18,19	+	+
Krysa	Mořisův hepatom	MH	^K8,18	+	+
Myš	Fibroblast	3T3	V	-	-
	Z výsledků uvedených v Tabulce č.1. je zřejmé, že protilátka
C-04	zobrazuje keratinový typ	středních (lntermediárních) filament

různých živočišných druhů, zatímco je negativní na ostetních typech filament. Úzká specifičnost pro keratin 18 byla upřesněna

- 5 282 048 v imunoblotingu, kde byla nalezena silná reakce s keratinem 18, přičemž ostatní přítomná keratiny byly negativní (viz· táž Příklad 2: tkáňová specifičnost).

Příklad 2:

Kultivační médium obohacené o monoklonální protilátku C-04 bylo získáno kultivací hybridomových buněk RICE0-C-04 jako u Příkladu 1. Tkáňová specifičnost reakce protilátky byla testována nepřímým iraunofluorescenčním testem a potvrzena rovněž nepřímou imunoperoxidázovou reakcí, v obou případech na tkáňových řezech· Vzorky tkání uvedených v Tabulce č.2 byly odebrány z operačního nebo pitevního materiálu, tkáňové bločky o velikosti 0,5 x 0,5 x 1 cm byly zmraženy v kapalném dusíku a uchovávány při teplotě -70°C· Pro vlastní testování byly zmražené bločky adaptovány (ohřátý) na teplotu -25 až -30°C a na kryostatovéro přístroji byly z každého z nich připraveny řezy o tlouštce 5-7 mikrometrů. Tkáňové řezy byly pak přeneseny na podložní histologická skla, po zaschnutí ne vzduchu byly pak řezy fixovány 10 minut směsí metanolu s acetonem (1:1) předchlazenou na -15°C a po vymytí zbylého fixativa 2 x 10 min. ve fyziologickém roztoku s fosfátovým ústojem o pH 7,4 (PBS) byla na řezy aplikována monoklonální protilátka C-04. Po inkubační době 1 hodiny byla nenavázaná protilátka z řezu odstra. něna opakovaným proraytím (3 x po 5 minutách) v PBS a na řez byla nanesena králičí nebo prasečí protilátka s fluorescein-isothiocyanátem· Inkubace (40 - 60 min.) byla ukončena trojím promytím v PBS po 5 minutách, řezy byly ponechány při pokojové teplotě až do zaschnutí a preparáty montovány např. do média s glycerinem. Výsledky hodnocení reakce protilátky C-04 s vybranými tkáněmi jsou uvedeny v Tabulce č.2j mezi výsledky získanými nepřímou imunofluorescencí a nepřímou imunoperoxidázovou reakcí nebyly zjištěny žádné rozdíly, proto nejsou tyto metody v Tab. č.2 uváděny odděleně.

Tabulka č.2. Reaktivita protilátky C-04 s normálními tkáněmi různých species (+ silná pozitivita, - negativita, V- vimentin, D - desrain, G - gliový kyselý protein, N - neurofilamenta, K - keratin s příslušným číselným indexem)

Tabulka č.2

Druh Tkáň člověk Vazivo

Chrupavka

Sval

Mozek

Mozeček

Cévy

Játra - hepatocyty

- žlučovody Moč. měchýř - epitel

Endoraetriům Střevní epitel Epitel dýchacích cest

Mezotel

Epitel mléčné žlázy

Epitel žlučníku Eidermis (včetně epid. planta

Epitel jazyka, jícnu

Kráva Vazivo Sval Cévy

Epidermis

Játra - hepatocyty

- žlučovody

Střevní epitel

Epitel mléčné žlázy

Epitel močového měchýře ; Epitel potních žláz Epitel pankreatu

282 048

Typ stř. filaraent Reakce

V

V D

N + G N + G

V + D ^K8,18 ⁺ ^K7,8,18,19 ⁺ ^K4,5,7,8,13,18,19 ⁺ ^K7,8,18,19 ⁺ ^K8,18,19 ⁺ ^7,8,18,19 ⁺ ^7,8,18,19 ⁺ *5,7,8,14,16,17,18,19 ⁺ ^K7,8,18,19 ⁺ pedis) K_{1t2>5f6>9ř10>11f14t}

15,16 ^K4,5,6,13,14,15,16,17,19 V D

D + V

K (ale nikoliv K₁₈) ^K8,18 ⁺ ^K7,8,18,19 ⁺ ^K8,18,19 ⁺

K (včetně Κ_1θ) +

K - - +

K - - ' ¹ +

K — ” — +

- 7 Tabulka δ. 2 - pokračování

Druh	Tkán	Typ stř. filament	262 046 Reakce
Křeček	Vazivo	V
	Sval	D
	Cévy	D	+ V
	Lymfoidní tkáň	V
	Epidermia	K	(ale nikoliv Κ,,θ:	> -
	Játra - hepatocyty	K	včetně Κ^θ	+
	- žlučovody	K	_ n _	+
	Střevní epítel	K	__ n _	+
Krysa	Vazivo	v
	Sval	D
	Cévy	D	+ v
	Játra - hepatocyty	K	(včetně Κ_1θ)	+
	- žlučovody	K	_ M _	+
	Střevní epitel	K	o. « _	+
	Epitel mléčné žlázy	K		+
	Epitel moč. měchýře	K	tt _	+
Myě	Vazivo	v		— ,
	Sval	D		-
	Cévy	D	+ V	-
	Játra - hepatocyty	K	(včetně K₁₈)	+
	- žlučovody	K	_ M __	+
	Epitel mléčné žlázy	K		+

Ze spektra tkání (viz Tabulka č,2) reagujících s protilátkou C-04 je zřejmé, že všechny tkáně obsahující keratin 18 jsou pozitivní, kdežto všechny tkáně postrádající tento keratin jsou negativní, a to jak u tkání lidských, tak i u dalších testovaných druhů· Analýza metodou imunoblotingu po elektroforetickém rozdělení bílkovin tkáňových lyzátů či cytoskeletálních preparátů potvrdila, že jediným keratinem rozpoznávaným protilátkou C-04 u epiteliálních tkání obsahujících více keratinů je keratin 18. Z tabulky č. 2 je rovněž patrná reaktivita protilátky C-04 s keratinem 18 u různých zvířecích druhů, což je u monoklonálnícfc protilátek proti keratinům vlastnost poměrně vzácná a výhodná.

- 8 Příklad 3: 262 04β

S ohledem na možnost praktického využití v diferenciální diagnostice nádorů byla imunofluorescenční a imunoperoxidázovou metodou (viz popis metody u Příkladu 2) testována reaktivita protilátky C-C4 na tkáňových řezech připravených z různých lidských nádorů· Získané výsledky shrnuje Tabulka č. 3·

Tabulka č· 3· Reaktivita protilátky C-04 na tkáňových řezech lidských nádorů (+ pozitivní reakce, - negativita,

V - vimentin, D - desmin, G - gliový kyselý protein, K - keratin s příslušným číselným indexem).

Typ nádoru Typ středních filament Reakce

Sarkomy		V (nebo V + D)	-
Melanomy		V	-
Lymfomy		V	-
Gliomy		G	-
Karcinomy	střeva	^K8,18,19	+
	prsu	^K7,8,18,19	+
	plic	^,8,18,19	+
	žaludku	^K8,18,19	+
	ovaria	^K7,8,18,19	+
	močového měchýře	^4,7,8,13,17,18,19	+
Hepatomy		^K8,18	+

Výsledky stanovení reaktivity protilátky C-04 s různými lidskými nádory potvrzují specifičnost této protilátky pro nádory epiteliálního původu, které obsahují keratin 18. Spolu s negativními výsledky u jiných typů nádorů to svědčí pro diagnostickou cenu testované protilátky při rozlišení různých nádorových lézí.

Buňky hybridomu RICEO-C-O4 mají morfologický obraz typických myelomových buněk. V podmínkách in vitro rostou v podobě polosuspensních kultur. Základním kultivačním médiem je Dulbeccova modifikace minimálního esenciálního média (DMEM) dopl- 9 262 046 něná L-glutaminem (3mM), penicilinem, streptomycinem a inaktivovaným fatálním telecím Bérem (10%) z JZD Sokolnice u Brna. Hybridom je kultivován při 37°C, střední generační čas je 20,3 hod· a modální počet chromozomů 6 měsíců po sestrojení hybridomu byl 86. Produkovaná protilátka je myší monoklonální imunoglobulin třídy IgG1, specificky vážící epitop keratinu 18.

Monoklonální protilátka, produkovaná hybridomem RICE0-C-04_freaguje s keratinem řady živočišných druhů a je použitelná v různých testech včetně imunohistochemie na tkáňových řezech, imunoblotingu, enzymoimunologických a radioimunologických stanovení a imunofluorescence např. na kultivovaných buňkách. Protilátka C-04 je tedy využitelná k detekci buněčných cytoskeletálních struktur obsahujících keratin 18 u člověka, ale i u různých hospodářských a experimentálních zvířat. Nalezne uplatněni zejména v rutinní diferenciální diagnostice na odděleních patologické anatomie a onkologie, jako důležitá pomůcka k odlišení pozitivně reagujících adenokarcinomů od jiných typů nádorů, jako např. sarkomů, melanoraů či lymfomů. Skýtá rovněž možnost odlišit adenokarcinomy od karcinomů z vícevrstevného dlaždicového epitelu, který neobsahuje keratin 18 (např. epidermis). Krčmě lékařské praxe humánní je pro své vlastnosti využitelná i v diagnostice v oblasti veterinární medicíny, jakož i v řadě aplikací ve výzkumu biologie živočišné buňky, a to v resortech zdravotnictví, školství i ČSAV a SAV, příp. zemědělství.

Claims

Myší lyrafocytérní hybridora RICEO-C-04 produkující monoklonální protilátku třídy IgG1 proti keratinu 18 řady živočišných druhů.