CN1009055B - 生产人类肿瘤相关抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞系的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种对人类癌细胞或组织之表面上或胞浆内特异的抗原决定簇特异的小鼠单克隆抗体。一种制造所说的单克隆抗体的方法。一种用于产生对人类癌组织KC-4抗原特异的特异性单克隆抗体的细胞系以及检验或测定所说的抗原的方法。一种通过选择标记所说的单克隆抗体以检查和诊断人类之癌肿的方法。

Description

本文是关于单克隆抗体，特别是小鼠的单克隆抗体，其对于人类癌细胞和组织的表面及胞浆中特异性抗原具有反应活性的能力。

人类免疫系统包括由淋巴细胞产生血清蛋白，即抗体，淋巴细胞能够与激发其生成的抗原决定族反应。因为免疫系统对一种具有许多抗原决定族的 通常反应是产生各个决定族的抗体，所以天然产生的抗血清是异质性的或多克隆的，或者说抗血清是由各对一种特异决定族产生抗体的多种不同的细胞产生的。当在一个单一分子上出现一个以上的抗原决定族或特别是各引起一种抗体产生或免疫反应时，即可将抗原决定族看作是抗原决定部位。某单一抗体分子只对一个抗原决定族或抗原决定部位是特异的。

单克隆抗体是针对抗原分子上单一抗原决定族或决定部位的单一抗体，而决定族或抗原决定部位可在分子的几个部位重复。显然，欲在体外制取这种单克隆抗体，便需要由通常多克隆免疫反应诱生的大量抗体中筛选具有所要求之特征的单一抗体。体外制取单一的，高度特异性的单克隆抗体的基本技术是由Kohler，G.和Milsfein    C.建立的（Nature256∶495-497，1975），即所谓杂交细胞瘤技术。该方法包括用抗原免疫小鼠和从动物体内收获抗体，并将这些抗体生成细胞与一种不产生抗体的骨髓瘤细胞株即浆细胞肿瘤细胞相融合，以产生杂交瘤细胞。这些杂交瘤细胞在体外具有骨髓瘤细胞系所有的存活和生长的能力，并具有与之融合的B淋巴细胞的大量生产抗体的能力。此产生单克隆抗体的杂交瘤细胞可于体外进行培养或作为肿瘤在宿主动物体内生长。因为每个抗体生成细胞产生唯一的一种抗体，所以杂交瘤的单克隆培养细胞可各产生一种单一的抗体，这种单一抗体可由体外培养杂交瘤细胞的培养基中获得，或可由腹腔内注射了这种细胞的小鼠腹水中获得，亦可由带杂交瘤之宿主动物的血清中得到。

虽然目前对产生杂交瘤和单克隆的一般方法已很清楚，但更应加深研究的还是如何分离和保留培养的杂交瘤细胞。因为由不同的细胞所产生的抗体只与同一分子上的不同抗原决定族反应，故可知针对一种主要抗原产生抗体的分离克隆在克隆与克隆之间是不同的。对所得到的抗体或含抗体的培养基、血清或腹水进行足够的试验是必要的。鉴于每个克隆对产生单克隆抗体造成的复杂性，而这些抗体又被应用于诊断和治疗，故有必要对各克隆的抗体进行定性。

欲得到所需要的单克隆抗体，就必须对那些将诱生某种特异抗体的抗原决定族作出鉴定和定位。或者由已完全融合的细胞建立几百个杂交瘤克隆，并针对正常或非正常组织以及在鉴别和限定那种产生具有需要的结合特异性的抗体的克隆中的不同抗原进行彻底筛选。根据其所产生的抗体，决定了细胞表面上与腺癌和鳞状细胞癌-这两种基本类型的癌之细胞表面标志上的结构差异。本文首要目的是产生并维持能与这一特殊的抗原决定族相结合的单克隆抗体的杂交瘤，以达到所需要的功能特异性。

已知单克隆抗体可被各种不同标记物所标记，以备检测、珍断性分析或治疗应用。在上述各种情况下，标记的单克隆抗体与抗原决定族部位的结合将成为一种特殊治疗剂的检定或传送到非正常细胞上抗原决定族的信号。本文的再一个目的是提供适当标记的特异性单克隆抗体，借以完成筛选和应用。

本发明特别应用于鉴别出现于腺瘤和鳞状细胞癌这两种特定疾病中的癌细胞。

对人类新生物组织之细胞表面和胞浆中特有抗原决定族特异的鼠之单克隆抗体已经制得。这种特有的抗原决定族被定名为“KC-4抗原”，它诱生只与新生物细胞结合而不与正常人体组织细胞结合的抗体。这种特殊的抗原在比较小的癌瘤细胞膜上表现有两种形式。第一种是较大形式的且只出现于胞浆中的，其分子量约为490，000道尔顿（范围480，000～510，000）。第二种是以高密度形式表达的，出现于癌细胞的胞浆内和胞膜上，用电泳方法测定并以其移动与已知分子量的商品蛋白质分子进行比较，其分子量约为438，000道尔顿（范围390，000～450，000之间）。（Towdin，et    al    proc.Natl.Acad.Sci.76∶4350-4354，1979    and    Laemmli，U.K.Nature，227∶680，1970），被称为“KC-4”的单克隆抗体通过标记，主要应用于癌症的诊断和治疗。KC-4单克隆抗体特别适用于与人类患有任何器官原发腺癌和鳞状细胞癌时出现的癌细胞上或癌细胞内的抗原决定族相结合。

作者提供了对腺癌和鳞状上皮癌等人类癌组织之表面或胞浆内特殊抗原特异的小鼠的单克隆抗体。这种特有的抗原，定名为“KC-4抗原”，是由包括前列腺癌的人类癌组织产生的。所有对限定的“KC-4抗原”具有这种特异性的单克隆抗体均可看作是“KC-4”。

Balb/c小鼠经两周时间予以腹腔内接种前列 腺腺癌细胞。以获得同样肿瘤组织的粗制肿瘤匀浆作为免疫原经两次强化和再注射后，切除动物脾脏，灌注四天以便分离单个细胞。用改良的Kohler和Milstein方法（Nature256∶495-497，1975），将小鼠浆细胞瘤细胞系Sp2/0-Ag14的细胞与小鼠脾细胞融合。之后在HAT培养其中将融合的细胞培养10-14天，使其在培养基中产生并增殖细胞克隆。除去含有由各克隆分泌的抗体的条件培养基并由其作特异活性之筛选。将培养基加入正常的和前列腺腺癌组织，将表现出有所要求之反应活性的融合细胞克隆产生单一克隆化，并进一步以其对包括癌细胞在内的各种正常和恶性组织进行试验。

筛选融合之细胞克隆-KC-4生成克隆的过程是在软凝胶中完成的。将细胞与液化的琼脂糖混合，以该混合物在平板上铺板并使之固化。之后温育平板并监测之，在第10-14天收获个别克隆。通过免疫过氧化物酶和免疫荧光染色的人类组织或细胞系分别筛选克隆。分离出产生所要之抗体的克隆并于琼脂糖中再次克隆化以进一步保障其稳定性和单克隆性质。

“KC-4”单克隆抗体试验证明在癌细胞上有很明显的膜和胞浆抗原分布，而在正常人组织则没有特异的或阳性的染色谱。

KC-4单克隆抗体对正常和人新生物组织的反应活性是通过包括生物素/抗生物素蛋白免疫过氧化物酶和免疫荧光染色的这两种方法测定的。将固定的和石蜡包埋的组织、冷冻切片、新鲜肿瘤细胞和细胞系用于证明被鉴定之特殊抗原的组织分布。将大部分肿瘤细胞具有明显的膜和/或胞浆阳性染色视为用KC-4所作试验的阳性结果。整个筛选分析过程未见有正常组织标本或正常细胞的特异反应活性。

用KC-4抗体试验了104例实体瘤或肺、结肠、肾、乳腺、胃、前列腺、胰、淋巴结、以及淋巴瘤等肿瘤组织。所有这些都是经过加热处理并石蜡包埋的组织。其中94%（98/104）为阳性。所有阳性染色均只出现于瘤细胞上、而所有正常组织则不受影响。有6%呈假阴性，这是由于组织标品制备不好，组织被破坏而不是因为KC-4真正的存在于细胞上。

用KC-4抗体试验了92例石蜡包埋的不同正常组织，包括脊髓、乳腺、子宫、甲状腺、舌、前列腺、脾、肾上腺、肺、肾、胆囊、心脏、淋巴结、胃、结肠、肝、脑、睾丸、胸腺及胎盘。所有92例均为加热处理，石蜡制备的组织。证明只有15.2%（14/92）有一定程度的染色。所有这些阳性例中，其染色均见于这些组织的正常的人为现象。正常组织的大量非特异性染色的是在乳腺、肾和胃组织。乳腺的染色见于腺体的腺细胞，这是通常可见的，是对抗体非特异的作用结果。在肾脏的远曲小管偶见有若干染色。这几乎用所有抗体均能看到，乃是器官非特异性所致。大多数抗体均可见有粘膜染色，正常胃组织和KC-4所作试验即属于这种情况。这种染色被认为是非特异性和人为造成的。

将取自前列腺、肺、肾、肝、淋巴结、脾、结肠、胸腺、乳腺、胆囊和胃的33份不同的正常组织制成新鲜冷冻切片并用KC-4抗体进行试验。在处理这些标本中没有使用加热方法。结果证明只有3%（1/33）有少许的阳性染色。值得注意的是，冷冻组织切片要比加热处理的、福尔马林固定的以及石蜡包埋的组织更接近新鲜组织。因此，KC-4在正常冷冻组织上的阳性染色的百分率（3%）与正常固定的/包埋的组织上的阳性染色百分率（15%）之差异，是由于组织制备中人为造成的。

进一步分析是用KC-4抗体染色法对冷冻的结肠、前列腺、肺和乳腺癌的人类肿瘤组织进行试验。结果100%的恶性癌肿组织与KC-4呈阳性反应，即观察到深度胞浆和细胞表面的特异染色。

分离并鉴定了KC-4抗原分子，证实其具有两种分子形式。较大的其分子量约为490，000道尔顿（范围在480，000～510，000），只出现于癌细胞的胞浆中。较小的分子量约为438，000道尔顿（范围在390，000～450，000），出现于癌细胞的胞浆中和胞膜上。分离是通过人乳腺癌的HT-17细胞系之细胞溶解素完成的，以1×108细胞/ml的浓度在蒸馏水中反复冻融。以100，000×g离心分离出溶解产物，以制备膜碎片和胞浆上清液。将胞浆在SDS-PAGE样品缓冲液中作1∶1稀释。将膜溶解于SDS-PAGE样品缓冲液中。两种样品均于90°加热5分钟，然后，将相当于23×10细胞的各样品根据改良的Laemmil    U.K.方 法（Nature227，680，1980），在不连续垂直平板凝胶上进行上SDS聚丙烯酰胺（3.5～10%梯度）电泳分析。内部分子量标志物是血纤维蛋白原（340，000）、粘连蛋白（440，000）、肌球蛋白（200，000）、β-半乳糖苷酶（116，000）、磷酸化酶B（92，500）、牛血清蛋白（66，000）、卵白蛋白（43，000）、碳酸酐酶（30，000）、胰蛋白酶抑制剂（20，100）和α-乳清蛋白（14，000）。电泳完成后，依据改良的Towbin方法（Pro.Natl.Acad.Sci，76，4350，1979（将丙烯酰胺平板中的蛋白电吸印到硝酸纤维素薄膜上。在含有牛血清白蛋白缓冲液中封闭硝酸纤维素。然后将单克隆抗体与硝酸纤维素反应，使其与硝酸纤维素上的特异抗原结合。洗去未结合的KC-4抗体后，以抗鼠免疫球蛋白-酶结合物与结合在硝石纤维素上的KC-4抗体反应。洗去未结合的结合物，加入酶底物，在抗原泳动到的地方即可显示出有颜色的带。

与KC-4抗原产生特异反应的KC-4单克隆抗体有两种形式。根据其与羊抗鼠IgG和IgM抗体有反应性而与其它的羊和/或兔抗鼠免疫球蛋白同型物特异抗体无反应性，证明其为小鼠IgG和IgM同型物。

两种能够产生对KC-4抗原特异性的单克隆抗体杂交细胞系寄存于美国标准培养物保藏中心（Amcrican    Typc    Culrure    Collection），并定名为HB8709（IgG）和HB8710（IgM）。能够产生对KC-4抗原特异的单克隆抗体的杂交细胞系样品也寄存于中国典型培养物保藏中心（中国，武汉大学），保藏日期为1985年11月19日，保藏号为85-C01（IgG3）和85-C02（IgM）。

单一的，具有高度特异性的单克隆抗体在检查和治疗人类癌肿中成为诊断和治疗的一种特别有价值的工具。

作为诊断工具，可将KC-4单克隆抗体与人类癌细胞的生物学样品相接触，可检测出生物学样品中由单克隆抗体和癌细胞之间形成的免疫复合物，所谓的复合细胞（omplexed    cells）即单克隆抗体与人类肿瘤细胞。

该方法学亦可以用于检测疑似癌症和相关肿瘤之病人的血清或其它液体生物样品中的KC-4抗原。

所谓复合物可通过以人类癌肿瘤的那种生物学样品与能够结合KC-4单克隆抗体的第二抗体接触得以检测。所说的第二抗体是用经选择的可检测化合物（指示族，deteector    group）标记的。

第二抗体与对KC-4抗原特异性的单克隆抗体结合时，即可使结合的复合物被检测为带标记的。为了诊断上的应用，所谓的指示基团可选自荧光化合物，酶（当其与特异的底物反应时可产生吸收或荧光指示基团）、放射性元素，或电子密集化合物。（Goldman，Morris，Fluorescent    Antibody    Methods，Academie    Press，New    York，1968;Yoshitake，S.etal.Scand.J.Immunol.10∶1-6，1979;Hunter，W.M.&.Greenwood，F.C.Preparation    of    iodine    131    labeled    growth    hormone    of    high    specific    activity，Nature    194，495，1962）。

适于这种功能的探测物质包括荧光化合物如荧光素、罗丹明、藻红素、氨腈染料、以及任何其它能发射荧光的化合物。另一类探测物质包括可形成荧光化合物的酶底物产物如N-甲基繖酮-B-D-半乳糖苷酶，或吸收化合物如DAB（二氨基联苯胺）。这一类中尚有许多其它化合物。适于作探测物质的放射性元素包括碘-125、碘-131、铟-11、铋-210，以及其它几种目前最常使用的化合物。电子密集指示族，目前已知的包括金和铁氯化物。虽然这项研究主要用于体外癌症诊断方面，但是也不排除将类似的标记之KC-4抗体用于体内诊断和治疗。

KC-4单克隆抗体可用于检测人类癌肿瘤。在这项应用中，是处理KC-4单克隆抗体进行标记使其能产生可检测信号标记的单克隆抗体以注入病人体内，当单克隆抗体与其抗原决定族结合时便可标记肿瘤。这种可检测的标记包括放射性元素、荧光化合物或其它适宜的可检测标记物或化合物。这一研究方法同样地适合于对冷冻的、固定的、或固定并加热处理（石蜡包埋）的组织上的癌细胞进行体外诊断性检测。另外的体外应用包括对血清、血浆、或其它液体生物学样品如脑脊液、尿和痰中的KC-4抗原，进行放射免疫分析、放射免疫定量测定、酶免疫分析或比浊测定。

在治疗疑似肿瘤的病人方面，可用以抑制或消除人类肿瘤，是将与适当之毒性剂连接的KC-4单克隆抗体，以控制的给药程序注射到病人体内，使所说的单克隆抗体或单克隆抗体-毒性剂结合物 与肿瘤细胞结合，以杀伤之。这样的毒性剂可以是化学治疗剂、光激活的毒性剂或放射活性剂。放射活性剂的例子有碘-125，或铋-210。化学治疗剂可包括α-链或A链蓖麻蛋白，白喉毒素，或整个分子、细胞毒性亚德里亚霉素、甲基茧质（mrthyltrexane），以及铂化合物如顺氯氨铂。光激活的毒性剂包括有红外染料，如氰兰染料类。

Claims (8)

1、一种生产杂交瘤细胞系的方法，该细胞系具有于1985年11朋19日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的样品的鉴定特征，该样品的CCTCC保藏号为85-C01(能产生抗KC-4抗原的小鼠IgG3同型抗体)及85-C02(能产生抗KC-4抗原的小鼠IgM同型抗体)，该方法的特征在于所述杂交瘤细胞系可产生对人类癌细胞的KC-4抗原具有结合特异性的单克隆抗体，该方法包括：

(1)给小鼠接种得自人类实体瘤的腺瘤细胞，并收集得自接种小鼠的脾细胞。

(2)使小鼠浆细胞瘤细胞系与所收集的脾细胞融合生成杂交瘤细胞。

(3)分离通过在选择性培养基中培养所产生的杂交瘤细胞而除去所收集的其它细胞。

(4)分离及鉴定位于所述人类癌细胞的表面上或胞浆中的KC-4抗原，该抗原的特征在于，通过电泳方法测定并以该抗原的泳动率与具有已知分子量的已知标志蛋白相比较发现以较小形式存在者的分子量为390，000～450，000道尔顿，而以较大形式表达者仅见于胞浆中且分子量为480，000～510，000道尔顿。

(5)筛选所分离的杂交瘤细胞以鉴定并收集能产生可与所述KC-4抗原特异性结合的单克隆抗体。

2、如根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述小鼠浆细胞瘤细胞系为SP2/0-Ag14。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述脾细胞得自Balb/c小鼠。

4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述较大形式的抗原分子量约为490，000道尔顿。

5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述较小形式的抗原分子量约为438，000道尔顿。

6、一种生产小鼠单克隆抗体的方法，其特征在于所述单克隆抗体可与位于人类癌细胞表面上或胞浆中被命名为KC-4抗原的抗原特异性结合，所述抗原的进一步特征在于通过对该抗原的电泳测定并以其泳动率与具有已知分子量的标志蛋白的泳动率相比较测得，其以较小形式存在时分子量为390，000～450，000道尔顿，其以稍大形式被表达者仅见于胞浆中且分子量为480，000～510，000道尔顿，并且其在正常人组织中基本上是无法检测的，该方法包括：

（1）给小鼠接种得自人类实体瘤的腺癌细胞并收集得自接种小鼠的脾细胞;

（2）使小鼠浆细胞瘤细胞系Sp210-Ag14与所收集的脾细胞融合，并将融合细胞在一种选择性培养基如HAT培养基中培养适当长的时间，以形成杂交瘤细胞;

（3）分离通过在选择性培养基如HAT培养基中培养所产生的杂交瘤细胞而除去所收集的其它细胞;

（4）利用常规的实验室方法分离和鉴定KC-4抗原;

（5）筛选所分离的杂交瘤细胞以鉴定并收集可产生与所述KC-4抗原特异性结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞具有于1985年11月19日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC）的细胞系（其CCTCC保藏藏号分别为85-C01及85-C02）的特征。

（6）按照步骤（3）的方法再次克隆杂交瘤细胞，按步骤（4）分离和鉴定KC-4抗原，且按照步骤（5）再次筛选重新克隆的杂交瘤细胞以保证克隆的纯化。

（7）按照常规的培养方法将步骤（6）所得到的杂交瘤细胞在合适的培养基中培养足够时间，以产生抗体;

（8）从再次克隆的杂交瘤细胞培养物中取出含有克隆抗体的上清液，通过分离、纯化得到单克隆抗体。

7、根据权利要求6的方法，其特征在于所述较大形式的抗原分子量约为490，000道尔顿。

8、根据权利要求6的方法，其特征在于所述较小形式的抗原分子量约为438，000道尔顿。