JP2007504244A - アテローム硬化症および／または心血管性疾患の処置および予防のためのコレステロールのオゾン化産物 - Google Patents

アテローム硬化症および／または心血管性疾患の処置および予防のためのコレステロールのオゾン化産物 Download PDF

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Abstract

本発明は、アテローム硬化病変において産生されるコレステロールのオゾン化産物の作用に妨げることによって、アテローム硬化症および／または循環器病を治療および予防するための組成物および方法に関する。本出願中に説明される通り、コレステロールは、アテローム硬化プラーク中に存在する際、酸化される。この反応により細胞傷害性のコレステロール酸化またはオゾン化産物が生成される。本出願は、コレステロールオゾン化産物、その産物に対して指向性を有する結合性実体、および、各種疾病の治療のためにそれら結合性実体および細胞傷害性物質を用いる方法に向けられる。

Description

（関連出願）
本出願は、２００３年９月５日出願の仮出願第６０／５００，８４５号、２００３年１１月６日出願の仮出願第６０／５１７，９４０号に対する優先権を主張する。なお、上記仮出願の開示の全体を本出願に含める。
（政府権利の宣言）
本出願に記載される発明は、国立衛生研究所によって賦与される研究助成金番号ＰＯＣＡ２７４８９の下に米国政府の支援によって為された。本発明において米国政府もいくつかの権利を有する。
（発明の分野）
本発明は、アテローム硬化病変において産生されるコレステロールのオゾン化産物の作用に妨げることによって、アテローム硬化症および／または循環器病を治療および予防するための組成物および方法に関する。本発明によれば、コレステロールオゾン化産物は、低密度リポタンパク（ＬＤＬ）中のタンパク質の二次構造を変え、脂質摂取を亢進し、泡沫細胞形成を促進する細胞毒素である。本発明の細胞傷害性コレステロールオゾン化産物はまた、自己免疫疾患、癌、腫瘍、細菌感染、ウィルス感染、真菌感染、潰瘍および／または、細胞毒素の局所投与が有益な結果を生むその他の疾病の治療および予防にも使用することが可能である。
（発明の背景）
循環器病は依然として、多くの国々において、主要疾患の一つ、主要死因の一つである。男性のほぼ３人に一人は６０歳前に大きな循環器病を発症する。女性の循環器病にこのような危険度は最初は低いが（１対１０の比率）、年齢と共にさらに優勢となる。例えば、６５歳を過ぎると、女性は、男性とちょうど同じ程度に循環器病に対して弱くなる。血管病、例えば、冠状動脈疾患、発作、再狭窄、および末梢血管病は、世界中到るところで死亡および身体障害の主要原因の一つとなっている。
循環器病の進行を抑えるために医師は食事やライフスタイルの変化を奨めるのであるが、一方、血管病による発作および死亡の発生率には脂血症に至る遺伝的素因が重要な要因となっている。従って、問題となるアテローム硬化病変の形成および治療に関する新しい洞察が求められている。
（発明の概要）
本発明者等は、先に、オゾンのような反応性の高い酸素分子種が抗体によって生産されることを示した。Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９８，２１９５（２００２）；Ｂａｂｉｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，３９２０（２００３）；Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，１４９０（２００３）。本出願は、オゾンのような反応性酸素分子種、およびコレステロールオゾン化産物が、アテローム硬化プラーク物質によって生成されることを示す証拠を提供する。
本発明によれば、コレステロールのオゾン化産物がアテローム硬化病変中に存在し、問題のプラークの形成を悪化または加速する可能性がある。例えば、コレステロールのオゾン化産物は、マクロファージによる脂質摂取を増進し、泡沫形成細胞が形成される速度を増す可能性がある。コレステロールのオゾン化産物はさらに、アポタンパクＢ１００の二次構造ばかりでなく、アポタンパクＢ１００が存在する低密度リポタンパク（ＬＤＬ）にたいしても悪影響を及ぼす可能性がある。
本発明によって示されるように、コレステロールオゾン化産物は、アテローム硬化病変のマーカーとなる。オゾンのみならず、コレステロールのオゾン化産物に結合するその他の結合因子を生成することのない抗体を用いてコレステロールのオゾン化産物の毒性を不活性化または抑制し、そうすることによってアテローム硬化症を治療・予防することが可能である。以上の観点から、本発明は、コレステロールオゾン化産物に対して向けられる抗体および結合実体を提供する。
本発明はまた、治療剤を結合させた抗体または結合実体を哺乳動物に投与することによって哺乳動物のアテローム硬化症を治療または予防する方法を目的とし、その抗体または結合実体は、アテローム硬化プラーク中に存在する分子または抗原、例えば、コレステロールオゾン化産物に結合することが可能であることを特徴とする。この治療剤は、例えば、アテローム硬化病変の成長を遅らせ、またはそのサイズを縮小させるのに役立たせることができる。
本出願はまた、コレステロールオゾン化の細胞傷害性産物を目的とし、自己免疫疾患、癌、腫瘍、細菌感染、ウィルス感染、真菌感染、潰瘍および／または、細胞毒素の局所投与が有効なその他の疾病の治療のために上記の細胞傷害性コレステロールオゾン化産物を用いる方法も目的とする。
本発明の一つの局面は、原核細胞または真核細胞に対して細胞傷害性を示すことのできるコレステロールのオゾン化産物の単離体である。このオゾン化産物は、マクロファージの脂質摂取、または泡沫細胞の形成を招く可能性がある。本発明のオゾン化産物はまた、低密度リポタンパク中のタンパク質の二次構造を変える可能性がある。例えば、本発明のオゾン化産物は、アポタンパクＢ１００の二次構造を変える可能性がある。
本発明のオゾン化産物は、式４ａ−１５ａ，７ｃの内の任意の一つを有する任意の化合物、またはそれらの組み合わせを含む。
Figure 2007504244
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 本発明の別の局面は、アテローム硬化病変の治療および予防用マーカーであって、式４ａまたは式５ａを有するコレステロールのオゾン化産物を含むマーカーである。
本発明の別の局面は、担体と、原核細胞または真核細胞に対して細胞傷害性を有する可能性のあるコレステロールオゾン化産物単離体とを含む組成物である。コレステロールオゾン化産物は、本出願に記載されるコレステロールオゾン化産物の内の任意のものであってよい。
本発明の別の局面は、コレステロールのオゾン化産物に結合することが可能な、単離された結合実体である。この結合実体が結合することが可能なコレステロールのオゾン化産物は、式４ａ−１５ａ，７ｃの内の任意の一つを有する任意の化合物、またはそれらの組み合わせであってもよい。ある実施態様では、オゾン化産物は４ａまたは５ａである。結合実体は、例えば、抗体である。結合実体は、ハプテン、例えば、式１３ａ、１４ａ、または１５ａを有するハプテンに向けられたものであってもよい。抗体結合実体の例は、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−５４２７またはＰＴＡ−５４２８を有するハイブリドーマＫＡ１−１１Ｃ５またはＫＡ１−７Ａ６から得られた抗体を含む。抗体結合実体のその他の例としては、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−５４２９およびＰＴＡ−５４３０を有するハイブリドーマＫＡ２−８Ｆ６またはＫＡ２−１Ｅ９から得られた抗体が挙げられる。
ある実施態様では、本発明の結合実体は治療剤に連結される。用いられる治療剤は、例えば、アテローム硬化病変の縮小、または、動脈のそれ以上の閉塞を防ぐことが可能である。本発明の結合剤と合わせて使用することが可能な治療剤の例としては、抗酸化剤、抗炎症剤、薬剤、小分子、ペプチド、ポリペプチド、または核酸が挙げられる。
本発明の別の局面は、コレステロールのオゾン化産物に連結される、原核細胞または真核細胞に対して細胞傷害性である単離された結合実体である。
本発明の別の局面は、患者のアテローム硬化症を治療する方法であって、コレステロールオゾン化産物に結合する結合剤を患者に投与する工程を包含する治療法である。結合剤が結合するコレステロールのオゾン化産物は、式４ａ−１５ａ、または７ｃの内の任意の一つを有する化合物であってもよい。結合剤は、反応性の高い酸素分子種を生成しないことが好ましい。ある実施態様では、結合性実体は、治療剤に連結される。この治療剤は、アテローム硬化病変の成長を遅らせ、またはそのサイズを縮小させるのに役立たせることができる。使用が可能な治療剤の例としては、抗酸化剤、抗炎症剤、薬剤、小分子、ペプチド、ポリペプチド、または核酸が挙げられる。
本発明の別の局面は、患者の標的細胞に結合することが可能な結合剤を患者に投与することによって、標的細胞を殺戮する方法であって、その際、結合剤は、コレステロールのオゾン化産物に連結される。この結合実体は抗体であってもよい。この実施態様では、結合実体すなわち抗体は、反応性の高い酸素分子種を生成してもよい。抗体はまた、一重項酸素を生成することが可能な化合物に連結されてもよい。一重項酸素を生成することが可能な化合物の例としては、アントラセン−９，１０−ジプロピオン酸エンドペルオキシドのようなエンドペルオキシドが挙げられる。一重項酸素を生成することが可能な化合物の他の例としては、プテリン、フラビン、ヘマトポルフィリン、テトラキス（４−スルフォナトフェニル）ポルフィリン、ビピリジルルテニウム（ＩＩ）錯体、ローズベンガル染料、キノン、ローダミン染料、フタロシアニン（ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎ）、ヒポクレリン（ｈｙｐｏｃｒｅｌｌｉｎ）、ルブロシアニン（ｒｕｂｒｏｃｙａｎｉｎ）、ピナシアノール、またはアロシアニン（ａｌｌｏｃｙａｎｉｎ）が挙げられる。
本発明の別の局面は、哺乳動物から細胞傷害性コレステロールオゾン化産物を除去する方法であって、コレステロールオゾン化産物に結合することが可能な結合実体または抗体を用いて、その哺乳動物の体液から細胞傷害性コレステロールオゾン化産物を分離することによって除去する方法である。オゾン化産物は哺乳動物の循環血から除去される。別の実施態様では、オゾン化産物は、体外において、哺乳動物の血液から除去される。さらに別の実施態様では、結合実体または抗体は、局所の組織に局所的に投与される。
本発明の別の局面は、コレステロールの細胞傷害性オゾン化産物に連結した抗体を哺乳動物に投与することによって、哺乳動物において癌を治療または予防する方法である。この抗体は癌細胞に結合することができる。
本発明の別の局面は、コレステロールの細胞傷害性オゾン化産物に連結した抗体を哺乳動物に投与することによって、哺乳動物において不適切な免疫応答を治療または阻止する方法である。この抗体は不適切な免疫応答に関与した免疫細胞に結合することができる。
本発明の別の局面は、抗体による反応性の高い酸素分子種の生産を修飾する因子を特定するための方法であって、（ａ）抗体と候補因子とを結合させること、（ｂ）形成された反応性酸素分子種を定量すること、および、（ｃ）形成された反応性酸素分子種の量を標準値と比較することによって特定する方法である。標準値は、候補因子無しで抗体から形成された反応性酸素分子種を定量することによって得られる。ある実施態様では、反応性の高い酸素分子種はオゾンである。
（発明の詳細な説明）
本発明によれば、アテローム硬化プラークにはコレステロールのオゾン化産物が存在する。コレステロールのこれらオゾン化産物は、例えば、アポタンパクＢ１００の構造ばかりでなく、アポタンパクＢ１００が含まれる低密度リポタンパク（ＬＤＬ）の構造をも変えたり、マクロファージによる脂質摂取を加速したり、また、形成される泡沫細胞の数を増すことによって、アテローム硬化症を悪化させたり、あるいはその進展を加速することを可能とする。従って、コレステロールのオゾン化産物は、問題の多い血管病の症状、例えば、心臓発作、うっ血性心不全、脳梗塞等をもたらす可能性が比較的高い高度のアテローム硬化病変の形成を加速する可能性がある。
本発明はまた、アテローム硬化症のマーカーとして有用なコレステロールのオゾン化産物を提供する。さらに、コレステロールのオゾン化産物の作用に対抗することが可能な組成物、キット、および結合剤も提供する。これらの組成物、キット、および結合剤は、アテローム硬化症、循環器病、およびその他の血管病を治療および予防するのに有用である。
別の実施態様では、本発明は、細胞毒素としてコレステロールのオゾン化産物を提供し、自己免疫疾患、癌、腫瘍、細菌感染、ウィルス感染、真菌感染、潰瘍および／または細胞毒素の局所投与が有効なその他の疾病の治療のために上記細胞傷害性コレステロールオゾン化産物を用いる方法を提供する。
（コレステロールのオゾン化）
本発明によれば、コレステロールは、アテローム硬化プラーク内で、オゾンのような反応性の高い酸素分子種によって酸化される。この過程でいくつかのコレステロールオゾン化産物が生成されるが、これらは、アテローム硬化症患者のから採取された組織または流体サンプルにおいて検出することが可能である。
コレステロールは、下記の構造（３）を有する
Figure 2007504244
 。
コレステロールが動脈に沈着すると、アテローム硬化プラークが形成される。本出願において説明されるように、アテローム硬化プラークは、オゾンのような反応性の高い酸素分子種を放出することが可能であり、このアテローム硬化プラークはまたコレステロールのオゾン化産物も生成する。特定の機構に限定されることを望むものではないが、マクロファージ、好中球、抗体、およびその他の免疫細胞が、アテローム硬化病変内部で網目を形成し、オゾンのような反応性の高い酸素分子種を放出するのであるらしい。生産された、反応性酸素分子種は、病変においてコレステロールと反応し、コレステロールを酸化し、いくつかの産物に変える。これらの産物は、患者から採取された生物学的サンプル中に検出することが可能である。
例えば、コレステロール３が酸化されると、セコ−ケトアルデヒド４ａおよびそのアルドール付加物５ａが、形成される主要産物となる。
Figure 2007504244
 さらに、化合物６ａ−１５ａ、および７ｃのような構造を有するコレステロールオゾン化産物も観察される。
Figure 2007504244
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 本発明によれば、セコ−ケトアルデヒド４ａ、そのアルドール付加物５ａ、および関連化合物、例えば、６ａ−１５ａまたは７ｃは、アテローム硬化症の患者から採取したアテローム硬化プラーク中に存在する。さらに、患者の血流中に検出されるセコ−ケトアルデヒド、アルドール付加物５ａ、および関連化合物６ａ−１５ａまたは７ｃの量は、その患者におけるアテローム硬化プラーク形成の広がりおよび重度と相関する。
例えば、そのアテローム硬化症病状が動脈内視鏡摘出術を正当化するほど重度の進展を遂げている８名の患者の内、６名の血流（血漿）において、アルドールが、７０−１６９０ｎＭの範囲で検出された（図５Ｃ）。一方、一般医学クリニックに通院する１群の患者からランダムに選ばれた患者から得られた１５サンプルでは、５ａが検出されたのは僅かに１サンプルのみであった。
さらに、本発明によれば、コレステロールのオゾン化産物は、酸化的にＬＤＬ、および／または、アポタンパクＢ１００（アポＢ−１００）すなわちＬＤＬのタンパク質成分を修飾することが可能である。ＬＤＬをセコ−ケトアルデヒド４ａまたはアルドール付加物５ａで処理すると、ＬＤＬおよび／またはアポＢ−１００のα−ヘリックス成分が減少し、ランダムコイル成分が増加し、これによって、この複合体の二次構造が変えられる。さらに重要なことは、セコ−ケトアルデヒド４ａまたはアルドール付加物５ａは、マクロファージによる脂質摂取を増進し、泡沫細胞の形成を促進することである。
本発明は、コレステロールのオゾン化産物の、これら否定的作用に対抗する方法を提供する。
（コレステロールオゾン化産物の作用に対抗する方法）
本発明によれば、コレステロールオゾン化産物の否定的作用は、そのコレステロールオゾン化産物に結合する薬剤によって調節または抑制することが可能である。別の実施態様では、コレステロールオゾン化産物を、アテローム硬化病変のマーカーおよび部位特異的抗原として用い、治療剤をアテローム硬化病変に搬送するようにすることも可能である。
以上から、本発明は、血管病、コレステロールの沈着を含む循環器病態、および細胞傷害性コレステロールオゾン化産物の放出と関連する問題点を治療または予防する方法に関する。このような病態および問題点は、ある解剖学的部位または系における血管の消失、傷害、または破壊と関連する可能性がある。「血管病態」または「血管病」という用語は、血流が阻害されている、または阻害されるようになった血管組織状態を指す。
本発明によって治療または予防される血管病は、哺乳類の血管病である。哺乳類という用語は任意の哺乳動物を意味する。哺乳動物の例をいくつか挙げるならば、例えば、イヌおよびネコのようなペット動物、ブタ、ウシ、ヒツジ、およびヤギのような農業動物、マウスおよびラットのような実験動物、サル、類人猿、およびチンパンジーのような霊長類、およびヒトがある。ある実施態様では、本発明の方法で処理されるのはヒトであることが好ましい。
本発明の組成物および方法で治療または予防される血管病態および疾患の例としては、アテローム硬化症（または動脈硬化症）、子癇前症、末梢血管病、心臓病、および脳梗塞が挙げられる。従って、本発明は、脳梗塞、動脈硬化症、急性冠状動脈症候群であって、不定なアンギナ、血栓症と心筋梗塞、プラーク破裂、冠状動脈または末梢動脈における一次的および二次的（ステント内）再狭窄を含む症候群、末梢四肢病、間欠性は行、および糖尿病合併症（虚血性心疾患、末梢動脈病、うっ血性心不全、網膜症、神経障害、腎症を含む）、脳梗塞または血栓症のような病気の治療法に向けられる。
本出願で提供される方法および試薬はまた、アテローム硬化プラーク発達における任意の段階で使用することが可能である。米国心臓協会によって採用され、本研究でも使用される新規の分類によれば、アテローム硬化症の進行時には、８種類の病変タイプを区別することが可能である。
Ｉ型病変は、内皮における小規模の脂質沈着（細胞内、およびマクロファージ泡沫細胞内）によって形成され、動脈壁において初期の、もっとも軽微な変化を引き起こす。この変化は、動脈壁の肥厚を招かない。
ＩＩ型病変は、内皮を１ミリ未満肥厚させる、黄色条または斑を含む脂肪斑によって特徴付けられる。この病変は、Ｉ型病変で観察されるものよりも多量の脂質の蓄積から成る。脂質含量は、病変の乾燥重量の約２０−２５％である。脂質の多くは、細胞内であって、主にマクロファージの泡沫細胞、および平滑筋細胞内に存在する。細胞外空間も脂質小滴を含むことがあるが、これらは、細胞内のものよりも小さく、小型の袋状粒子である。これら脂質小滴は、従来、コレステロールエステル（コレステリルオレエートおよびコレステリルリノレート）、コレステロール、およびリン脂質から成ると記載されている。本発明によれば、コレステロールオゾン化産物は、アテローム硬化病変形成に関連する細胞による脂質摂取を促進することが可能である。さらに、本出願に記載されるものと同じコレステロールオゾン化産物は、上記細胞の細胞内にも、細胞外にも蓄積することが可能である。
ＩＩＩ型病変も、前アテローム病変と記載される。ＩＩＩ型病変では、内皮は、ＩＩ型病変で観察されたものよりもやや大きく肥厚する。ＩＩＩ型病変は、動脈血流を塞ぐことはない。細胞外脂質および小胞状粒子は、ＩＩ型病変で観察されたものと同じであるが、量が増え（乾燥重量で約２５−３５％）、集まって小さな集合プールを形成し始める。
ＩＶ型病変はアテロームに関連する。病変は三日月形であり、動脈の厚みを増す。病変は、血漿コレステロールレベルが極めて高いヒトを除いては、動脈内腔をほとんど狭めることはない（多くの人々において動脈造影術でも病変は見えない）。ＩＶ型病変は、内皮層における細胞外脂質の広範な蓄積（乾燥重量の約６０％）から成る（時に脂質コアとも呼ばれる）。この脂質コアは、ミネラルの小塊を含むことがある。この病変は、破裂しやすく、また、剥がれた壁による血栓形成を生じやすい。
Ｖ型病変は線維性アテロームと関連する。病変は、主にＩ型コラーゲンから成る、１層または複数層の繊維組織を有する。Ｖ型病変では壁の厚みが増し、アテローム硬化症が進行するにつれて内腔の減少は増大する。この病変には特徴があり、それに基づいてさらに細分することが可能である。Ｖａ型病変では、新規組織は、脂質コアを有する病変の一部である。Ｖｂ型病変では、脂質コアと病変の他の部分は石灰化する（ＶＩＩ型病変となる）。Ｖｃ型病変では、脂質コアは消失し、脂質は全体として極小になる（ＶＩＩＩ型病変となる）。一般に、破壊を被る病変は、Ｖａ型病変である。この病変は比較的柔らかく、遊離のコレステロール一水塩結晶ではなく高濃度のコレステロールエステルを有する。Ｖ型病変は破裂し、壁が剥落して血栓を形成する可能性がある。
ＶＩ型病変は、ＩＶ型およびＶ型病変に重ねて、病変表面に破壊部を有する複雑な病変である。破壊部は、例えば、溝、侵食、または潰瘍（ＶＩａ型）であったり、血腫または出血部（ＶＩｂ型）であったり、血栓堆積（ＶＩｃ型）であったりする。ＶＩ型病変では、病変の厚みは増し、内腔はしばしば完全に閉塞される。この病変は、Ｖ型病変に変わることもあるが、Ｖ型病変よりも大きく、より閉塞的である。
ＶＩＩ型病変は、比較的発達した病変の大規模なミネラル化を特徴とする石灰化病変である。ミネラル化は、リン酸カルシウムおよびアパタイトの形を取り、これらが、死滅細胞および細胞外脂質の蓄積残留物に置き換わる。
ＶＩＩＩ型病変は、ほとんど脂質を持たず、主に複数層のコラーゲンから成る繊維性病変である。ＶＩＩＩ型病変は、血栓、または脂質性病変の脂質が退行し、拡張部がコラーゲンに変化した結果と考えられる。この病変は、中等サイズの動脈の内腔を閉塞することがあり得る。
アテローム硬化病変の形成において内皮傷害が最初のステップと考えられているが、この傷害は多くの場合コレステロールの蓄積、細胞の増殖、および結合組織繊維の形成を招く。傷を受けた内皮細胞および内皮細胞以外の内膜においてＩｇＧおよび補体因子Ｃ３が蓄積することが観察されている。血液からやってきた単核食細胞も、アテローム硬化病変における細胞集団の一部を為す。
本発明によれば、このような抗体および免疫細胞の集積は、反応性の高い酸素分子種の生産をもたらし、これが次にコレステロールオゾン化産物の形成に寄与すると考えられる。前述したように、アテローム硬化病変形成に関連する細胞内部における脂質の蓄積は、問題となるアテローム硬化病変の発達においてもっとも重要なステップの一つである。プラーク形成の一つの機構は、脂肪の蓄積がマクロファージの侵入を招き、これに続いてＴ細胞およびＢ細胞の侵入、および抗体生産がある。本出願に示すように、本発明のコレステロールオゾン化産物は、マクロファージによる脂質摂取を促進し、マクロファージ泡沫細胞の形成を強化する。従って、本発明者等が示したように、コレステロールオゾン化産物は、アテローム硬化症のような炎症性血管病を悪化させる可能性がある。
本発明は、血管病および病態を予防し、処置する治療組成物および方法を熟考する。本発明によって提供される組成物は、様々なやり方で血管病態を治療するのに用いることが可能である。
一つの実施態様では、本発明は、コレステロールオゾン化産物に結合する抗体または結合薬剤を動物に投与する工程を包含する方法を提供する。このような抗体、または結合実体は、コレステロールオゾン化産物を修飾し、そのオゾン化産物の、脂質負荷および泡沫細胞生成活性を抑制する。この方法で使用される抗体は、オゾンのような反応性酸素分子種を生成しないことが好ましい。抗体または結合剤は、本出願で記載されるコレステロールオゾン化産物の内の任意のもの、例えば、セコ−ケトアルデヒド４ａ、そのアルコール付加物５ａ、または関連化合物６ａ−１５ａまたは７ｃに結合することが可能である。このような抗体および結合実体は、コレステロールオゾン化産物と構造的に関連し、天然に生産されるコレステロールオゾン化産物と交差反応する抗体または結合実体調製物を生成する、ハプテンを用いて生産することが可能である。
例えば、別の実施態様では、本発明は、式３ｃ、１３ａ、１３ｂ、１４ａ、１４ｂ、１５ａ、または１４ｂの内から任意に選ばれる式を有するハプテンであって、コレステロールオゾン化産物と反応することが可能な抗体を生成するのに使用が可能なハプテンを提供する。
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 式１５ａを有する化合物に対して特異的となるように生産されたハイブリドーマＫＡ１−１１Ｃ５およびＫＡ１−７Ａ６は、ブダペスト協定の条項に基づいて、２００３年８月２９日、米国基準菌株保存機関（１０８０１Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．，２０１１０−２２０９ＵＳＡ（ＡＴＣＣ））に、ＡＴＣＣ登録番号ＡＴＣＣＮｏ．ＰＴＡ−５４２７およびＰＴＡ−５４２８として寄託された。式１４ａを有する化合物に対して特異的となるように生産されたハイブリドーマＫＡ２−８Ｆ６およびＫＡ２−１Ｅ９も、ブダペスト協定の条項に基づいて、２００３年８月２９日、米国基準菌株保存機関に、ＡＴＣＣ登録番号ＡＴＣＣＮｏ．ＰＴＡ−５４２９およびＰＴＡ−５４３０として寄託された。
別の実施態様では、コレステロールオゾン化産物は、アテローム硬化病変の標的またはマーカーとして用いられる。従って、コレステロールオゾン化産物に結合することが可能な結合実体に連結される治療剤を、アテローム硬化症の哺乳動物に投与することが可能である。アテローム硬化症および関連血管病を治療または予防するために、コレステロールオゾン化産物を、アテローム硬化病変の標的またはマーカーとして用いることが可能である。コレステロールオゾン化産物の内の任意のもの、例えば、セコ−ケトアルデヒド４ａ、そのアルドール付加物５ａ、および／またはＡ環脱水産物６ａを、結合実体および／または治療剤をアテローム硬化プラークに向けて狙い打ちするためのマーカーとして使用することが可能である。別に、式７ａから１５ａまで、または７ｃを有するコレステロールオゾン化産物の内の任意のものを、結合実体および／または治療剤をアテローム硬化プラークに向けて狙い打ちするためのマーカーとして使用することが可能である。
結合性実体は、コレステロールオゾン化産物（単数および複数）に結合するばかりでなく、アテローム硬化病変を縮小するように、あるいは、動脈のそれ以上の閉塞を阻止するように局所的に作用する治療仲介物または薬剤を搬送するように設計される。それとは別に、治療剤は、コレステロールオゾン化産物の否定的作用を阻止、遮蔽、または抑制してもよい。従って、コレステロールオゾン化産物に対して結合が可能な結合実体に連結される治療剤を、アテローム硬化症のような血管病の哺乳動物に投与することが可能である。
コレステロールオゾン化産物を認識することが可能であり、本発明の方法に使用することが可能な結合実体は、コレステロールオゾン化産物に結合することが可能な、任意の小分子、ポリペプチド、または抗体を含む。そのようなポリペプチドおよび抗体についてさらに精しく後述する。
結合実体に連結することが可能な治療剤としては、任意の抗酸化剤、薬剤、因子、化合物、ペプチド、ポリペプチド、核酸、または、アテローム硬化病変の酸化を抑え、または治療するために当業者が選ぶと思われる任意の介在因子が挙げられる。コレステロールオゾン化産物の活性に対抗し、アテローム硬化プラークを溶解、消化、分解、またはその成長を抑制し、あるいはその他のやり方でアテローム硬化症の進行を抑えるのに役立つ任意の治療剤の使用が可能である。
治療剤はまた、活性を有する代謝産物、およびその薬剤前駆体を含むように設計される。活性を有する代謝産物とは、治療剤が代謝された時に生産される治療剤の、活性を有する誘導体である。薬剤前駆体とは、代謝されて治療剤となるか、または、代謝されて、治療剤の、活性を有する代謝産物（単複）となる化合物である。本発明を用いて、治療剤、例えば、低分子量化合物、抗酸化剤、放射性核種、薬剤、酵素、ペプチド、タンパク質、治療性ポリペプチドをコードする核酸、発現ベクター、アンチセンスＲＮＡ、干渉的低分子量ＲＮＡ、リボザイム、または抗体のような治療剤を投与することが可能である。
例えば、本発明の結合実体を用いて繊維溶解剤を搬送することが可能である。このような治療剤としては、例えば、ストレプトキナーゼのような血栓溶解剤、組織プラスミノゲン活性剤、プラスミンおよびウロキナーゼ、外因系プロテアーゼ抑制因子（ＴＦＰＩ）のような抗血栓剤、抗炎症剤、メタロプロテイナーゼ抑制因子、ネマトード抽出抗凝固タンパク質（ＮＡＰ）、細胞増殖を抑制する薬剤、細胞増殖因子を抑制する薬剤等が挙げられる。さらに、本発明の結合実体に連結が可能な治療剤の、さらに別の例としては下記のものが挙げられる。すなわち、
１）脂質レベルを修飾する薬剤（例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ抑制因子、チロシン様物質、フィブラート系薬剤、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）の作用薬（ＰＰＡＲ−アルファ、ＰＰＡＲ−ガンマ、および／またはＰＰＡＲ−デルタ）；
２）酸化過程を調節および修飾する薬剤、例えば、抗酸化剤、反応性酸素分子種の修飾因子、コレステロールオゾン化産物の修飾因子、リポタンパク修飾因子（コレステロールオゾン化産物を含む）の抑制因子；
３）インスリン耐性および／または活性、またはグルコース代謝または活性を調節および修飾する薬剤、例えば、ＰＰＡＲ−アルファ、ＰＰＡＲ−ガンマ、および／またはＰＰＡＲ−デルタの作用因子、ＤＲＰ−ＩＶの修飾因子、およびグルココルチコイド受容体の修飾因子を含む薬剤であるが、ただしこれらに限定されない；
４）任意の血管位置における内皮細胞または平滑筋細胞における受容体または接着分子またはインテグリンの発現を調節および修飾する薬剤；
５）任意の血管位置における内皮細胞または平滑筋細胞の活性を調節および修飾する薬剤；
６）炎症関連受容体であって、ケモカイン受容体、ＲＡＧＥ、ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体、アンギオテンシン受容体、ＴＧＦ受容体、インターロイキン受容体、ＴＮＦ受容体、Ｃ−反応性タンパク質受容体、および、ＮＦ−ｋｂの活性化を含む炎症性シグナル伝達経路に関与する他の受容体を含むが、それらに限定されない炎症関連受容体を調節および修飾する薬剤；
７）内皮細胞、血管平滑筋またはリンパ球、単球、および、血管に、または血管内部に付着する好中球の増殖、アポトーシス、または壊死を調節および修飾する薬剤；
８）任意の細胞外基質タンパク質、すなわち、コラーゲン、エラスチン、およびプロテオグリカンを含むが、それらに限定されない細胞外基質タンパク質の生産、分解、または交差結合を調節および修飾する薬剤；
９）哺乳類血管内に存在する任意の細胞タイプの活性化、分泌、または脂質負荷を調節および修飾する薬剤；
１０）哺乳類血管内に存在する樹状細胞の活性化、増殖、または任意の他の改変を調節および修飾する薬剤；
１１）血管壁レベルで起こる血小板事象を修飾する活性化、接着、またはその他の過程を調節および修飾する薬剤；
１２）抗体および／またはアテローム硬化プラーク材料によるオゾンの生産を調節および修飾する薬剤；および、
１３）イブプロフェン、アセチルサリチル酸、ケトプロフェン等のような抗炎症剤。
本発明の結合実体は、上記の治療剤と共有的に連結されても、またはその他のやり方で結合されてもよい。結合実体を担持し、治療剤（単複）を含むリポソームを用いて、治療剤の搬送を促進することも可能である。投与されると、治療剤は、結合実体によってアテローム硬化病変部位に局在し、そのアテローム硬化病変領域の血流を調節し、病変を減衰させ、または、その他のやり方で動脈血流を改善するのに役立つ。本発明の結合実体はまた、遺伝子治療用ベクターのようなナノ粒子を搬送するのに用いることも可能である。
本発明の考える治療剤はまた、酸化剤に対して拮抗作用を有する任意の分子と定義される「抗酸化剤」を含む。このように定義された抗酸化剤は、１）抗体によるオゾン、または反応性酸素分子種の生成を抑制する抑制因子、２）コレステロールオゾン化産物の抑制因子、および３）コレステロールオゾン化産物による有毒作用を抑制する抑制因子を含む。好ましい抗酸化剤は、コレステロールオゾン化産物の生産を抑制するばかりでなく、すでに形成されたものを中和するものも含む。抗酸化作用は、分解を含む任意の機構を通じて生じてよい。一つの分類項目に収められる抗酸化剤として、反応性酸素分子種スカベンジャー、オゾン・スカベンジャー、あるいは、フリーラジカル・スカベンジャーが挙げられる。抗酸化剤は、必要な場合はいつでも入手可能となるように様々のタイプのものであってよい。好気生物では全身に渡って酸素が存在することを考えるならば、抗酸化剤は、様々の細胞、組織、器官および細胞外区画において利用可能であってよい。細胞外区画としては、細胞外流体スペース、眼房水、滑液、脳脊髄液、消化器分泌液、間質液、血液、およびリンパ液が挙げられる。抗酸化剤は、食事を補うことによって、あるいは、注射、静注投与などによって供給することが可能である。
使用が可能な抗酸化剤の例としては、アスコルビン酸、α−トコフェロール、γ−グルタミルシステイニルグリシン、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、α−リポ酸、ジヒドロリポエート、アセチル−５−メトキシトリプタミン、フラボン、フラボネン、フラボノール、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、メタロチオネイン、およびブチル化ヒドロキシトルエンが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
別の実施態様では、結合実体は、アテローム硬化プラークに対するレーザー血管成形剥離術を採用するための手段を提供する。本発明の、１種以上の結合実体が染料に接合され、しかも染料の吸収最大は、血管成形に使用されるレーザーの最大発射波長に一致するものとする。投与後、染料付き結合実体は、アテローム硬化病変のコレステロールオゾン化産物に結合するが、正常組織に対しては実質的に結合を示すことはない。この染料を、アテローム硬化病変に対してレーザーエネルギーを集束するための標的として用いることが可能である。剥離処置の間、レーザーからのエネルギーは染料によって吸収され、そのため、病変部位に集中させることが可能となる。その結果、剥離の効率は増すと考えられ、一方、周囲の正常組織に対する傷害は抑えられる。
多種多様な蛍光染料を、結合実体に対して接合させることが可能である。染料をタンパク質に、特に抗体に接合させるためのいくつかの方法が発表されている。染料の選択および接合の方法は、レーザー血管形成術およびタンパク質化学の従来技術に精通した当業者であればすぐに明らかになることであろう。レーザー血管形成術において有用と考えられる一つの染料はローダミンである。ローダミンは、蛍光染料であるが、その各種誘導体は、ほぼ５７０ｎｍの波長の光を吸収する。
結合実体は、現在利用可能な手順によってローダミンのような染料に連結させることが可能である。例えば、結合実体は、５０ｍＭのホウ酸ナトリウムバッファーｐＨ８．２に対して透析することが可能である。リサミンローダミンＢスルフォニルクロリド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ、オレゴン州）の新鮮な溶液を、乾燥アセトンに０．２５ｍｇ／ｍＬとして溶解して調製することが可能である。この溶液において、接合される結合実体の量よりもローダミンの方が６倍モル濃度過剰となる分液をガラス管に取る。アセトンを乾燥アルゴン流の下に蒸発させる。試験管のローダミン残渣に透析した抗体を加える。試験管にキャップをし、アルミニウムフォイルで被い、絶えず攪拌しながら４°Ｃで３時間インキュベートする。
結合実体溶液の容量の１／１０に等しい、１．５Ｍヒドロキシラミンヒドロクロリド（Ｓｉｇｍａ）溶液（ｐＨ８．０）の分液を反応混合液に加える。この溶液を、絶えず攪拌しながら４°Ｃで３時間インキュベートする。次に、反応混合液を、暗黒中にてホウ酸塩バッファーに対して大規模に透析する。このローダミン−抗体接合体は、染料の光脱色を避けるために暗黒中４°Ｃで保存することが可能である。
投与されると、標識結合実体は、染料を、特異的にアテローム硬化病変に搬送するが、正常組織には搬送しない。標識結合実体に結合する組織は、約５７０ｎｍの波長を有するレーザーを照射することによって剥離することが可能である。
別の実施態様では、本発明の結合実体を用いて、アテローム硬化病変部位に酵素を特異的に搬送することが可能である。この酵素は、プラークの１種以上の成分を消化することが可能であるならば、どのような酵素であってもよい。一つの酵素、または複数の酵素の組み合わせが、タンパク質化学の従来技術に精通した当業者に既知の、各種接合技術の内の一つによって結合実体に接合される。
別の方法では、本発明の結合実体は、酵素の不活性形、例えば、酵素前駆体または酵素−抑制因子複合体に結合される。この方法の利点は、比較的大量の酵素を投与し、大量の酵素をプラークに搬送することが可能な一方で、循環する接合体によって正常組織に対して傷害を起こすことが全くないことである。結合実体−酵素複合体がプラークに結合し、未結合の循環複合体が除去された後に、プラークの消化を開始するように酵素を活性化することが可能である。活性化は、酵素前駆体の特異的な分断、または酵素抑制因子の除去を含むことが考えられる。
別の実施態様では、治療の薬剤の搬送のために、アテローム硬化病変の他の因子を認識しそれに結合する、抗体または結合実体が使用される。ヒトのアテローム硬化プラークからは、各種可溶性タンパク質、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＢＩＣ（Ｃ３）、α１−アンチトリプシン、α２−マクログロブリン、フィブリノーゲン、アルブミン、ＬＤＬ、ＨＤＬ、α１−酸性糖タンパク質、β２−糖タンパク質、トランスフェリン、およびセルロプラスミンを含む可溶性タンパク質が抽出されている。病的な内皮も、少量の組織結合性ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＢ１Ｃを含むことが見出されている［Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，３４：３９１−４０５（１９７９）］。ＩｇＧは、病変内、および隣接内皮組織中に関されている［Ｐａｒｕｍｓ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，３８：２１１−２１６（１９８１），Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３４：２６４−２８０（１９８１），Ｈａｎｎｓｏｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｐａｔｈ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｅｃｔ．Ａ．，９２：４２９−４３５（１９８４）］。治療剤をアテローム硬化病変に搬送するには、上記タンパク質の内の任意のものを用いることが可能である。
米国特許第６，０２５，４７７号は、アテローム硬化プラークの細胞外成分として特異的に出現する精製抗原、および該抗原に向けられる抗体を提供する。この抗原は、複雑な炭水化物構造と、２００，０００ダルトンを超える分子量を有する。ハイブリドーマＱ１０Ｅ７によって記載されるモノクロナール抗体は、アテローム硬化病変に選択的に結合する。米国特許第６，０２５，４７７号を参照することにより本出願に含める。
さらに別の実施態様では、アテローム硬化症患者の血流に内因的に放出されるコレステロールの細胞傷害性オゾン化産物を、患者を体内的に処置することによって、あるいは、患者の血液を、そのオゾン化産物（単複）に結合し、そのコレステロールオゾン化産物の除去を促進する結合実体によって処置することによって除去することが可能である。本出願に記載されるように、アテローム硬化症患者から得られた血漿サンプルには、検出可能なレベルのコレステロールオゾン化産物があった。アテローム硬化症患者から成る試験群は、動脈内視鏡摘出術を必要とするほど進んだアテローム硬化病態を呈する８名の患者を含んでいた。コントロール群の患者は、一般的医学クリニックを訪れた患者の内からランダムに選ばれた。試験群の８名の患者の内６名において、アルドール５ａは、７０−１６９０ｎＭの範囲の検出可能な血漿レベルを持っていた（図５参照）。コントロール群の１５本の血漿サンプルの内ただ１本のみに検出可能な５ａが見られた。ケトアルデヒド４ａは、実際には、いずれの患者の血液サンプルにも検出されなかったが、用いたアッセイの検出限界は約１−１０ｎＭであった。ケトアルデヒド４ａは、アテローム硬化病変から放出の最中に、または放出後にアルドール５ａに変換される可能性がある。従って、アテローム硬化症患者の血流から細胞傷害性コレステロールオゾン化産物を除去するように設計される治療法では、アルドール付加物５ａを除去すべき一次産物としてよい。
血管病態を処置し、細胞傷害性コレステロールオゾン化産物を血流から除去するために本発明によって提供される治療法では、外科的な、またその他の侵襲的で、危険な治療処置を回避することが可能である。例えば、アテローム硬化症に対する現在の治療法は、一般に、外科的方法と、内科的に病気を管理する方法とに分割される。外科的方法は、閉塞領域をバイパスするための血管移植処置（例えば、冠状動脈バイパス移植術）、動脈壁からの閉塞性プラークの除去（例えば、頚動脈内視鏡摘出術）、または経皮的プラーク破壊（例えば、バルーン血管形成術）を必要とすることがある。外科的治療は、重大な危険をはらみ、かつ個々の病変のみを１時に１個ずつ処置するに過ぎない。外科的治療はまた、アテローム硬化症の進行を制限することもなく、再狭窄のような合併症と関連する。
本発明の方法を用いてコレステロールオゾン化産物を狙撃することは、心臓病の治療を簡単化し、患者が手術の危険および合併症を回避するのを可能とする。本発明の方法が手術の回避を可能とする理由の一つは、該方法によって特定されるコレステロールオゾン化産物が、アテローム硬化病変によって特異的に生産されるらしいことに基づく。従って、このオゾン化産物を狙撃することは、アテローム硬化症の部位と原因に対して正確に、特異的に狙撃することになる。同様に、血流から細胞傷害性オゾン化産物を除去することは、血管系に対するさらに新たな傷害の出現を阻止することを可能とする。
（コレステロールのオゾン化を阻止する介在因子を特定する）
本発明はさらに、抗体による反応性酸素分子種の形成を阻止する介在因子を特定する方法を提供する。この方法は、一重項酸素（１Ｏ２ ＊）の供給源を備えた抗体による反応性酸素分子種の生産を抑制する因子を特定するスクリーニングを含む。ここで用いられる一重項酸素（１Ｏ２ ＊）は、好中球のような、一重項酸素（１Ｏ２ ＊）の天然の供給源であってもよい。別に、この一重項酸素（１Ｏ２ ＊）は、一重項酸素の合成供給源であってもよい。例えば、光のような誘発因子に暴露されると一重項酸素を精製する、金属欠損ポルフィリンのような「感作性」分子を用いることが可能である。
これまで本発明者等によって示されたように、事実上任意の抗体または好中球が、その抗体または好中球が一重項酸素（１Ｏ２ ＊）に暴露されると、酸素分子種、例えば、スーパーオキシドラジカル（Ｏ２ −）、ヒドロキシルラジカル（ＯＨ・）、過酸化水素Ｈ２Ｏ２またはオゾン（Ｏ３）を含む、強力な反応性を有する酸素分子種−ただしこれらに限定されない−を生成することが可能である。Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９８，２１９５（２００２）；Ｂ．Ｍ．Ｂａｂｉｏｒ，Ｃ．Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｊ．Ｒｕｅｄｉ，Ａ．Ｇｕｉｔｉｅｒｒｅｚ，Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ Ｊｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，３９２０（２００３）；Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，１４９０（２００３）を参照されたい。上記から、本出願で用いる「反応性酸素分子種」という用語は、抗体生成による酸素分子種を意味する。これらの反応性酸素分子種は、１個以上の不対電子を所有するか、あるいは他のやり方で高い反応性を有する。なぜなら、それらは簡単に他の分子と反応するからである。このような反応性分子種としては、スーパーオキシドフリーラジカル、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、ペルオキシルラジカル、オゾン、およびオゾンと同じ化学的符号を有する、その他の、短命の３酸素付加物が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。さらに、本出願に記載される実験によって具体的に示されるように、アテローム硬化病変内部でオゾンが生成される。
抗体は、免疫系の他の成分を要することなく、すなわち、補体のカスケード反応や食細胞反応を要することなく一重項酸素（１Ｏ２ ＊）の反応性酸素分子種への変換を実行する。この、一重項酸素から反応性酸素分子種を生産する能力は、天然の免疫グロブリンばかりでなく、抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、およびＦｖ断片にも認められる。この活性はまた、抗体分子中のジスルフィドの存在と関連するものでもない。しかしながら、抗体が、一重項酸素から反応性酸素分子種を生成する能力は、抗体を変性すると失われる。このことは、抗体による反応性酸素分子種の生成のためには、無傷の、または事実上無傷の三次元構造が必要であることを示す。
抗体による反応性酸素分子種の生成にとって必要な最小要件は、酸素の存在である。従って、一般に好気条件が必要とされる。もっと具体的に言うと、体内での抗体の利用度は、最重要基質である１Ｏ２ ＊が手近にあるかどうかに依存するが、このような１Ｏ２ ＊は、様々の生理的過程において生産され、体内で利用可能である。Ｊ．Ｆ．Ｋａｎｏｆｓｋｙ Ｃｈｅｍ．−Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ７０，１（１９８９）および同論文中の参考文献を参照されたい。例えば、１Ｏ２ ＊は再環流の際に生産される。Ｘ．Ｚｈａｉ ａｎｄ Ｍ．Ａｓｈｒａｆ Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６９（Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８）Ｈ１２２９（１９９５）。さらに、食菌活動時、好中球活性化において生産される。Ｊ．Ｒ．Ｋａｎｏｆｓｋｙ，Ｈ．Ｈｏｏｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｗｅｖｅｒ， Ｓ．Ｊ．Ｗｅｉｓｓ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，９６９２（１９９８）；Ｂａｂｉｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１０９：３３−３４（２０００）。
一重項酸素（１Ｏ２）も、金属欠損ポルフィリン前駆体に光を照射することによって生成される。一重項酸素を反応性酸素分子種に転ずる生物学的変換は、可視光、赤外線を含む光、および、下紫外放射条件のもとで起こる。可視光条件を用いる場合、一重項酸素の供給源となることが可能な他の分子を用いることによって一重項酸素の生産を強化することが可能である。一重項酸素を生成する分子には、他の因子または誘発因子を要することなく一重項酸素を生成する分子ばかりでなく、誘発因子に対する暴露後に一重項酸素を生成することが可能となる「感作」分子も含まれる。他の因子または誘発因子を要することなく一重項酸素を生成することが可能な分子の例としては、エンドペルオキシドが挙げられるが、ただしこれに限定されない。ある実施態様では、用いられるエンドペルオキシドは、アントラセン−９，１０−ジプロピオン酸エンドペルオキシドである。感作分子の例としては、プテリン、フラビン、ヘマトポルフィリン、テトラキス（４−スルフォナトフェニル）ポルフィリン、ビピリジルルテニウム（ＩＩ）錯体、ローズベンガル染料、キノン、ローダミン染料、フタロシアニン、ヒポクレリン、ルブロシアニン、ピナシアノール、またはアロシアニンが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
感作分子は、誘発因子に暴露されると一重項酸素を生成するように励起される。そのような誘発因子の一つは光である。光は、感作分子の種類および構造に応じて、可視光、紫外線、または赤外線であってもよい。
従って、本発明は、抗体による反応性酸素分子種の生産を修飾することが可能な介在因子を特定するためのスクリーニング法であって、抗体と一重項酸素供給源の混合体を、ある因子に接触させること、および、抗体による反応性酸素生産がそれによって修飾されるかどうかを観察する工程を包含するスクリーニング法を提供する。ある実施態様では、介在因子による反応性酸素分子種の生産は比較的低いことが好ましい。別の実施態様では、介在因子による反応性酸素分子種の生産は比較的高いことが好ましい。
（細胞傷害性コレステロールオゾン化産物の用途）
本出願に記載されるように、セコ−ケトアルデヒド４ａ、そのアルドール付加物５ａ、および関連化合物６ａ−１５ａおよび７ｃは、いくつかの細胞タイプに対して細胞傷害性である。化合物７ｃの構造を下記に示す。
Figure 2007504244
 例えば、本出願に説明されるように、セコ−ケトアルデヒド４ａおよびそのアルドール付加物５ａは、Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ２２，５１７（１９６８）に記載されるようにヒトＢリンパ球（ＷＩ−Ｌ２）に対して細胞傷害性であり、Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３，１２３（１９８４）に記載されるようにＴリンパ球細胞系統（Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１）に対しても、Ｆｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７６，５２１７（１９７９）に記載されるように血管平滑筋細胞系統（ＶＳＭＣ）および腹大動脈内皮（ＨＡＥＣ）細胞系統に対しても、Ｒａｌｐｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４３，１５２８（１９７６）に記載されるようにラット組織マクロファージ（Ｊ７７４Ａ．１）に対しても、Ｍｂａｗｕｉｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．４６，１１９（１９８９）に記載されるように肺胞マクロファージ細胞系統（ＭＨ−Ｓ）に対しても細胞傷害性を有する。
同じ手順を用いて、本発明者等によって、化合物６ａ、７ａ、７ｃ、１０ａ、１１ａ、および１２ａも、白血球細胞系統に対して細胞傷害性であること、および、セコ−ケトアルデヒド４ａおよびそのアルドール付加物５ａも、神経細胞系統に対して細胞傷害性であることが判明した。
従って、本発明は、本発明のコレステロールオゾン化産物を含む組成物、および、不適切な免疫応答、自己免疫疾患、腫瘍、細菌感染、ウィルス感染、真菌感染、潰瘍および／またはその他の病態、細胞毒素の局所投与が有利である疾患を治療および予防する方法を提供する。
細胞毒素は、コレステロールオゾン化が、非病的組織に対して有害な作用を及ぼさないようマスクされなければならない場合がある。処方において４ａまたは５ａ細胞毒素をマスクするための手順の一つの例として、リポソームの使用が挙げられる。例えば、４ａまたは５ａ細胞毒素をリポソームの中に収め、結合性実体を、リポソームのリン脂質膜の中に固定することが可能である。結合性実体は、リポソームの、病的組織に対する局在を促進し、リポソームの脂質コートは、非病的組織を、細胞傷害性コレステロールオゾン化産物から保護する。リポソーム脂質コートはまた、アテローム硬化病変の脂質と相互作用を持ち、リポソーム内容の融合と放出をもたらすことを可能とする。
（癌および腫瘍を治療する）
別の実施態様では、細胞傷害性コレステロールオゾン化産物は、癌を治療または予防するのに使用することが可能である。従って、本発明は、化合物４ａから１５ａ、および７ｃの内の任意のものを含む抗癌細胞毒素、およびその製薬組成物を提供する。本出願で具体的に説明するように、４ａ、５ａおよび関連化合物は、いくつかの哺乳類細胞に対して、例えば、Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ２２，５１７（１９６８）に記載されるようにヒトＢ−リンパ球（ＷＩ−Ｌ２）に対して、Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３，１２３（１９８４）に記載されるようにＴ−リンパ球細胞系統（Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１）に対して、Ｆｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７６，５２１７（１９７９）に記載されるように血管平滑筋細胞系統（ＶＳＭＣ）に対して、Ｒａｌｐｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４３，１５２８（１９７６）に記載されるようにラット組織マクロファージ（Ｊ７７４Ａ．１）に対して、Ｍｂａｗｕｉｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．４６，１１９（１９８９）に記載されるように肺胞マクロファージ細胞系統（ＭＨ−Ｓ）に対して細胞傷害性を有する。従って、４ａおよび５ａ細胞毒素を、いくつかの異なる癌細胞タイプを殺戮、またはその増殖を抑制するために用いることが可能である。
本出願で用いる場合「癌」という用語は、哺乳類の固相腫瘍のみならず、血清学的悪性疾患も含む。「哺乳類の固相腫瘍」は、頭部および頚部の癌、肺癌、中皮腫、縦隔、食道、胃、膵臓、尿道、膀胱、肝胆嚢系、小腸、結腸、結腸直腸、肛門、腎臓、尿道、膀胱、前立腺、尿道、陰茎、睾丸、婦人科器官、卵巣、乳房、内分泌系、皮膚中枢神経系の癌；軟部組織および骨の肉腫、および皮膚および眼球内起源のメラノーマが挙げられる。「血清学的悪性疾患」という用語は、小児白血病およびリンパ腫、ホジキン病、リンパ節および皮膚起源のリンパ腫、急性および慢性白血病、プラズマ細胞新生物およびＡＩＤＳ関連性癌を含む。さらに、任意の進行段階の癌、例えば、一次、転移、および再発癌も治療が可能である。様々のタイプの癌に関する情報は、米国癌協会（ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ）、または、例えば、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｈａｒｒｉｓｏｎ‘ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１２ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．において認めることができる。ヒトおよび家畜の両用途が考慮される。
本出願で用いる「正常の哺乳類細胞」および「正常の動物細胞」という用語は、正常な成長調節機構（例えば、遺伝子調節）の下で成長し、正常な細胞分化を示す細胞と定義される。癌細胞は、正常細胞とは、その成長パターンおよび細胞表面の性質において異なる。例えば、癌細胞は、従来技術でよく知られる特質の中でも特に、周囲の細胞に無関心に、連続的にでたらめに成長する傾向がある。
哺乳類および、鳥類を含むその他の動物は、本出願に記載され、特許主張される方法および組成物によって治療してよい。そのような哺乳類および鳥類としては、ヒト、イヌ、ネコ、および家畜、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、七面鳥等が挙げられる。
上記から、本発明は、動物において癌細胞の増殖を処置、抑制または予防するための製薬組成物であって、該動物において標的癌を治療または予防するのに有効な量の、化合物４ａから１５ａ、および７ｃの内から任意に選ばれる化合物を含む細胞毒素と、製薬学的に受容可能な担体とを含み、その際、該細胞毒素は、癌細胞に選択的に結合する抗体または結合実体に連結されることを特徴とする製薬組成物を提供する。
本発明はまた、動物において癌細胞の増殖を処置、抑制または予防するための方法であって、有害な量の非癌性哺乳類細胞死を招くことなく、標的癌細胞死を誘発するのに十分な量の、化合物４ａから１５ａ、および７ｃの内から任意に選ばれる化合物を含む細胞毒素に、標的癌細胞を接触させる工程を包含し、その際、該細胞毒素は、癌細胞に選択的に結合する抗体または結合実体に連結されることを特徴とする方法を提供する。
本発明はさらに、動物において癌細胞の増殖を処置、抑制または予防するための方法であって、有害な量の非癌性哺乳類細胞死を招くことなく、標的癌細胞死を誘発するか、または癌細胞の増殖を抑制するのに十分な量の、化合物４ａから１５ａ、および７ｃの内から任意に選ばれる化合物を含む細胞毒素を含む処方を投与する工程を包含し、その際、該細胞毒素は、癌細胞に選択的に結合する抗体または結合実体に連結されることを特徴とする方法を提供する。
癌細胞に選択的に結合する抗体または結合実体は、利用可能な任意の組織特異的抗原、または当業者によって選択される任意の癌マーカーを認識、またはそれと結合することが可能である。
腫瘍抗原、および腫瘍抗原に対する抗体は既知である。上皮癌または肉腫細胞またはリンパ腫上に存在する腫瘍関連抗原と反応する結合実体、抗体、または抗体断片は、例えば、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ９，Ｎｏ．４，ｐｐ．５４８−５６４，１９９１，ａｎｄ Ｐａｗｌａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ ４９，ｐｐ．４５６８−４５７７，１９８９において、ＬＬ−２およびＥＰＢ−２（同じ）として開示される。Ｐｒｉｍｕｓ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４３：６８６−６９２，１９８３には別のものが開示されている。すなわち、抗ＣＥＡモノクロナール抗体が開示される。Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，３０：４１４，１９８９では、抗ＣＥＡモノクロナール抗体が開示、比較されている。Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５０：６４０５−６４０９，１９９０では、結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）と反応するモノクロナール抗体が開示される。Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，３１：２９２，１９９０では、膵臓の腫瘍関連エピトープと反応するモノクロナール抗体が開示される。ＫＣ−４ラットモノクロナール抗体も使用が可能である。このものは、独特の抗原決定基に対して特異的であり、新生癌細胞に対して選択的、かつ強力に結合するが、ヒトの正常組織に対しては結合しない（Ｃｏｕｌｔｅｒに付与された米国特許第４，７０８，９３０号）。
ＢｒＥ−３抗体（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ９：２２１（１９９０）、米国特許第５，０７５，２１９号）は、ヒト乳房上皮ムチンのポリペプチドコアのタンデム反復列に結合することが明らかになった。ムチンをグルコシル除去すると、より多くのタンデム反復エピトープの存在が暴露されて、抗体の結合が増す。従って、ＢｒＥ−３のような抗体は、新生癌腫瘍に積極的に結合する。なぜなら、これらの腫瘍は、正常上皮組織では発現されない、乳房上皮ムチンの脱グリコシル化形を発現するからである。この積極的結合と、乳癌患者のような癌患者の循環中にはこれらの抗体に対するエピトープは低濃度でしか見られないという観察事実を突き合わせれば、ムチンエピトープに対して特異性を有する抗体は癌療法においてきわめて効果的であることになる。
従って、本発明は、癌を治療および／または予防するための組成物および方法を提供する。
（移植拒絶反応を治療する）
Ｔリンパ球は、異種移植片（例えば、心臓のような移植臓器）の拒絶反応を主に引き起こす細胞タイプである。Ｔリンパ球（キラーおよびヘルパー）は、Ｔリンパ球表面に一過性にＩＬ−２受容体が出現することで特徴付けられる爆発的増殖を遂げることによって異種移植に反応する。爆発的増殖時に、Ｔリンパ球と特異的に反応する細胞毒素を投与することによってこれらの細胞を殺戮することによって、異種移植拒絶反応を抑制することが可能である。活性化Ｔリンパ球を特異的に認識する結合実体に細胞毒素を連結するならば、細胞毒素は、好都合にも、他の細胞（感染と戦うのに必要な安静または長期記憶Ｔリンパ球を含む）に有害な作用を及ぼすことはない。活性化Ｔリンパ球の上には存在するが、安静または長期記憶Ｔリンパ球の上には存在しない細胞表面タンパク質の一つは、インターロイキン２（ＩＬ−２）受容体である。従って、ＩＬ−２受容体に結合する結合実体に連結される細胞毒素の使用は、活性化Ｔリンパ球に対する選択性を実現する。
本出願中で記載されるように、用いられる細胞毒素は、セコ−ケトアルデヒド４ａ、そのアルドール付加物５ａ、または化合物４ａから１５ａまでと７ｃの内の任意のものである。これらのコレステロールオゾン化産物は、Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３，１２３（１９８４）に記載されるようにＴリンパ球細胞系統（Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１）に対して細胞傷害性を有する。ある実施態様では、４ａ−１２ａ、または７ｃ細胞毒素は、細胞溶解、細胞死を誘発し、または細胞増殖を抑制することが可能である。
４ａ−１４ａ、または７ｃ細胞毒素は、Ｔリンパ球の機能または増殖を抑制するのであるから、用いられる結合実体は、ＩＬ−２とＩＬ−２受容体との相互作用を阻止するように、あるいは阻止しないように結合する。一方、もしもＩＬ−２が結合する部位を遮断するならば、さらに確実にＴリンパ球の十分な活性化の阻止が確保されることになり、移植組織拒絶反応の抑制に貢献するいくつかの重要な現象をもたらすことが可能となる。
活性化Ｔリンパ球を選択的に狙撃することにより、本発明の方法は、全身的な免疫抑制、およびそれに基づく危機的な感染症の危険性をもたらすこと無く異種移植拒絶反応を抑制する。さらに、この方法は、ドナー特異的Ｔサプレッサーには手を出さないから、該Ｔサプレッサーは増殖し、異種移植片の寿命の延長を助けることが可能となる。さらに、治療は、異種移植後連続的である必要はなく、一連の治療後打ち切ることも可能である。
本発明の一つの実施態様は、ＩＬ−２受容体特異的結合実体として、例えば、４ａ−１５ａ、または７ｃ細胞毒素に連結される、Ｔリンパ球のＩＬ−２受容体に対して特異的な抗体を用いる。この細胞毒素は、結合実体が結合するＴリンパ球を溶解することが可能である。Ｔリンパ球のＩＬ−２受容体に対して特異的な抗体は、本出願に記載される標準法によって作製することが可能である。別に、そのような抗体は、例えば、Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙから購入することも可能である（例えば、マウス−ヒトモノクロナール抗ＩＬ−２受容体抗体）。この抗体は、モノクロナール、またはポリクロナールであってもよく、適当な任意の動物のものであってもよい。抗体がモノクロナールであり、治療される哺乳動物がヒトである場合、ヒトの、またはヒト化抗ＩＬ−２受容体抗体であることが好ましい。
ＩＬ−２受容体に対して特異的な抗体を生産するための、モノクロナール抗体の生産と最初のスクリーニングは、Ｕｃｈｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２６（４），１３９３に記載する通りに実行することが可能である。簡単に言うと、この方法は下記の工程を用いる。ヒトの培養Ｔリンパ球を、哺乳動物、例えば、マウスに注入し、その免疫化動物の脾臓を取り出し、脾臓細胞を分離し、次に、恒久細胞、例えば、マウスまたはヒト骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマを形成する。培養上清から得られた抗体含有上清について、下記のような補体依存性細胞傷害試験を用いて、ＩＬ−２受容体に対して特異的な抗体を求めてスクリーニングを行う。ヒトＴリンパ球およびＥＢＶ変換Ｂリンパ球を、５１Ｃｒクロム酸ナトリウムで標識し、標的細胞として用いる。この細胞を、ハイブリドーマ培養上清および補体とインキュベートし、上清を収集し、ガンマカウンターでカウントする。活性化Ｔリンパ球に対して毒性を示すが、安静ＴまたはＢリンパ球に対しては毒性を示さない上清を選び、さらに、５０キロダルトンの糖タンパク質ＩＬ−２受容体を沈殿させる（すなわち、それと特異的に反応する）抗体を含む上清を選出するためのスクリーニング工程を行う（Ｌｅｏｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ８０，６９５７に精しく記載される）。望みの抗ＩＬ−２受容体抗体は、通例法によって上清から精製される。
（自己免疫疾患の治療）
ＣＤ４＋Ｔリンパ球（本出願ではＣＤ４＋Ｔ細胞と呼ぶ）は、感染細胞、および癌と考えられる細胞との戦いにおいて他の白血球に与える「援助」のために免疫系では中心的なプレーヤーである。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、体液性免疫でも、細胞性免疫でも本質的な役割を演じる。さらに、この細胞は、寄生虫感染の際にも、好塩基球およびマスト細胞の分化を促進するように働く。もしもＣＤ４＋Ｔ細胞が（ＡＩＤＳ患者の場合のように）失われると、宿主は、通常は、宿主にとって脅威とはならないいくつかの病原体および腫瘍に対して脆弱になる。
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、病気の予防では重要な、有益な役割を果たす一方、これらの細胞の機能が常軌を逸すると重大な問題を招くことがある。ある個人の場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞の異常機能は、自己免疫やその他の病気を招く。ＣＤ４＋Ｔ細胞が関与する自己免疫疾患としては、多発性硬化症、関節リューマチ、および自己免疫ブドウ膜炎が挙げられる。実質的には、これらの疾患は、異常な免疫応答であって、免疫系が、侵入する病原体を攻撃するという正常な役割から逸れて、代わりに宿主の生体組織を攻撃し、その結果病気および死をすら招くという異常な免疫応答に関連する。攻撃の標的とされる宿主組織は、様々な自己免疫疾患においてそれぞれ異なる。例えば、多発性硬化症では、免疫系は、脳および脊髄の白質を攻撃し、関節リューマチでは、免疫系は、関節滑膜の内皮を攻撃する。活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞はまた、移植組織および器官の拒絶反応、およびＣＤ４＋Ｔ細胞リンパ腫の発達を含む、その他の疾患にも関係する。
上記から、本発明は、有害な免疫応答に対して有用な治療法を提供する。一つの実施態様では、本発明は、Ｔ細胞介在性自己免疫疾患を治療または予防する方法を提供する。別の実施態様では、本発明は、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞介在性自己免疫疾患を治療および予防する方法を提供する。治療が可能な疾患としては、例えば、多発性硬化症、関節リューマチ、サルコイドーシス、および自己免疫ブドウ膜炎、対宿主移植片病（ＧＶＨＤ）および／または炎症性腸疾患が挙げられる。
この方法で用いられる細胞毒素は、セコ−ケトアルデヒド４ａ、そのアルドール付加物５ａ、または式４ａから１５ａ、または７ｃのうちのいずれかを有する化合物である。これらのコレステロールオゾン化産物は、Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３，１２３（１９８４）に記載されるようにＴリンパ球細胞系統（Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１）に対して細胞傷害性を有する。ある実施態様では、４ａ−１５ａ、または７ｃ細胞毒素は、細胞溶解、細胞死を誘発し、または細胞増殖を抑制することが可能である。
４ａ−１５ａ、または７ｃ細胞毒素は、Ｔ細胞、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞を特異的に認識し、結合する結合実体と組み合わせて使用される。このような結合実体は、Ｔ細胞に対して選択性を有するものであればどのような結合実体であってもよい。例えば、本出願に記載される細胞傷害性オゾン化産物の搬送のための結合実施体として働くことのできる抗体を生成するために、任意のＴ細胞特異的抗原を使用することが可能である。実例としては、ヒト受容体タンパク質Ｈ４−１ＢＢが挙げられる。ｐＨ４−１ＢＢベクターにコードされるＨ４−１ＢＢのｃＤＮＡは、米国農業研究サービス系統保存機関（ＡＲＳＣＣ）に寄託され、登録番号ＮＲＲＬ Ｂ２１１３１を割り当てられている。このＨ４−１ＢＢタンパク質に対して特異的な抗体は、米国特許第６，５６９，９９７号に記載されている。
米国特許第６，５５６，０８２号によれば、ＯＸ−４０という名前の、ある特定のタンパク質抗原は、抗原活性化Ｔ細胞、特に、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞表面に特異的に発現される。ラットにおけるＥＡＥ疾患モデルを用い、この抗原は、炎症部位（この疾患モデルでは脊髄）に存在する活性化された、自己抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の表面では発現されるが、非炎症部位のＣＤ４＋Ｔ細胞には見られないことが判明した。これらのＣＤ４＋Ｔ細胞におけるこの抗原の、もっとも高度の発現は、自己免疫疾患の臨床的徴候の見られる前日に起こることが判明した。しかも、この抗原の発現は、病気が進行するにつれて低下した。ＯＸ−４０抗原の発現の特異性、およびその発現の一過性は、本発明において始めて示されたものであるが、この所見によって、動物、例えば、Ｔ細胞介在性病態を抱えるヒトにおいて、活性化Ｔ細胞を抗体を介して除去するための標的としてこの抗原を用いる試験法の試行が促された。
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、実験的に誘発される動物の、いくつかの自己免疫疾患、例えば、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）、および実験的自己免疫性ブドウ膜炎（ＥＡＵ）を引き起こすことが示されている。本出願に提供される方法および処方を試験するためにこのような動物モデルの使用が可能である。
（潰瘍の治療）
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉは、１９８２年、慢性胃炎患者の胃生検において始めて単離された、曲線状の、微好気性、グラム陰性菌である。Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ：１２７３−７５（１９８３）。もともとＣａｍｐｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉと名づけられていたが、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒという別の属の一部であると認識された。Ｇｏｏｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３９：３９７−４０５（１９８９）。この細菌は、ヒトの胃粘膜に集落を形成し、感染は数十年持続することもある。ここ数年の間に、この細菌の存在は、Ｂ型慢性胃炎と関連付けられるようになった。これは、大抵の感染者では無症状のままであるが、胃潰瘍および胃腺癌にかかる危険度を著明に増す。別の研究から、Ｈ．ｐｙｒｏｌｉ感染は、Ｂ型胃炎、胃潰瘍、および胃腫瘍の原因であるか、あるいは共同作用因子であることが強く示唆されている。例えば、Ｂｌａｓｅｒ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ９３：３７１−８３（１９８７）；Ｄｏｏｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：１５６２−６６（１９８９）；Ｐａｒｓｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２５：１１２７−３１（１９９１）を参照されたい。Ｈ．ｐｙｒｏｌｉは、経口ルートによって伝染すると考えられている。Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ：３４０，１１９４（１９９２）。感染の危険度は年齢と共に増すが、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１００：１４９５−１５０１（１９９１）、人ごみの中では促進される。Ｄｒｕｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．４３２２：３５９−６３（１９９０）；Ｂｌａｓｅｒ，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５：３８６−９３（１９９２）。先進国では、Ｈ．ｐｙｒｏｌｉ抗原に対する抗体の存在は、３０歳の人口と６０歳の人口では、それぞれ、２０％未満と５０％超越へと増加する。Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２２：５７−６２（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｚ．Ｍｅｄ．Ｊ．９９：６５７−５９（１９８６）。一方、発達途上国では、人口の８０％を超える人々が、２０歳までに既に感染する。Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ３６：１０８４−８８（１９９１）。
本発明によれば、Ｈ．ｐｙｒｏｌｉ抗原に結合する結合実体に連結する細胞毒素を用いて、Ｈ．ｐｙｒｏｌｉの増殖を抑制することが可能である。用いる細胞毒素は、セコ−ケトアルデヒド４ａ、そのアルドール付加物５ａ、または式６ａから１５ａ、または７ｃのうちのいずれかを有する化合物である。ある実施態様では、４ａまたは１５ａまたは７ｃ細胞毒素は、細胞溶解、細胞死を誘発し、または細胞増殖を抑制することが可能である。
（微生物感染の治療）
本発明の細胞傷害性コレステロールオゾン化産物はまた、微生物の増殖または感染を修飾するために用いることも可能である。
下記の標的微生物による感染は、本発明の細胞傷害性コレステロールオゾン化産物によって治療することが可能である。その標的微生物とは、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．，Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．，Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．，Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．，Ｇａｓｔｒｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ．，Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．，Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．，Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｐ．，Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐｐ．，等である。本発明の細胞傷害性コレステロールオゾン化産物によって治療することが可能な感染症としては、ブドウ球菌感染（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、チフス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、食中毒（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、例えばＯ１５７：Ｈ７）、桿菌赤痢（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａ）、肺炎（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｅｎｏｓａ、および／またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）、コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、潰瘍（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｒｏｌｉ）、およびその他が挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１５７：Ｈ７は、従来から、下痢、出血性大腸炎、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、および血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）の病気発生に関わるとされている。本発明の細胞傷害性オゾン化産物は、細菌の薬剤耐性株、および複数薬剤耐性株、例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの複数耐性株や、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓのバンコマイシン耐性株に対しても活性を有する。
本発明の抗微生物組成物はウィルスに対しても有効である。「ウィルス」という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡウィルス、ウィロイド、およびプリオンを指す。ウィルスは、エンベロープ付きおよびエンベロープ無しウィルスの両方、例えば、Ａ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、ポックスウィルス、ヘルペスウィルス、アデノウィルス、パポバウィルス、パルボウィルス、レオウィルス、オルビウィルス、ピコルナウィルス、ロタウィルス、アルファウィルス、ルビウィルス、インフルエンザウィルスＡ型およびＢ型、フラビウィルス、コロナウィルス、パラミコウィルス、モルビリウィルス、ニューモウィルス、ラブドウィルス、リサウィルス、オルソミクソウィルス、ブニャウィルス、フレボウィルス、ナイロウィルス、ヘパドナウィルス、アレナウィルス、レトロウィルス、エンテロウィルス、リノウィルス、およびフィロウィルスを含む。
本発明の化合物は、全身の、局所的な、および粘膜感染の治療において、ヒトを含む動物の真菌感染の治療に有用な活性の高い抗真菌剤である。本発明によって治療が可能な真菌感染の例としては、Ｃａｎｄｉｄａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、およびＦｕｓａｒｉｕｍによる感染が挙げられる。ある実施態様では、真菌感染は、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、またはＣａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａによって引き起こされる。
本発明の化合物は、ヒトを含む動物における各種真菌感染症の治療に有用である。そのような感染症としては、浅層、皮膚、皮下、および全身性真菌感染症、例えば、気道感染、消化管感染、循環器感染、尿路感染、ＣＮＳ感染、カンジダ症および慢性粘膜カンジダ症、および真菌による皮膚感染症、皮膚および粘膜皮膚カンジダ症、水虫、爪周囲炎、真菌性おむつかぶれ、カンジダ外陰炎、カンジダ亀頭炎、および外耳炎が挙げられる。該化合物は、全身性および局所性真菌感染症を予防するための予防薬として用いてもよい。予防薬としての使用は、免疫機能が危機に陥っている患者、例えば、ＡＩＤＳ患者、抗癌療法を受けている患者、または移植手術患者の感染予防のための、選択的消化器汚染防止処方の一部として好適である可能性がある。
いくつかの種のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓは、免疫機能がひどく冒されている患者では、侵襲的な脊髄肺感染を引き起こすことが知られている。胞子を吸い込むと、臨床的に明らかなアスペルギルス症が大きな三つの症状として現れることがある。最初の症状は、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症であるが、これはアスペルギルス種が気管支に集落を形成し、過敏症肺炎を引き起こす抗原を放出する際に発症する。第二の症状はアスペルギルス腫、すなわち「キノコ球」であるが、これは、肺の腔に、多くの場合、結核のような他の肺疾患と共同して発達する。第三の形態は、侵襲的肺または分散性アスペルギルス症であるが、これは、死亡率の高い生命を脅かす感染症である。
細胞傷害性コレステロールオゾン化産物の抗微生物活性は、当業者の利用可能な方法を用いて各種微生物に対して評価することが可能である。例えば、抗微生物活性は、本発明の細胞傷害性コレステロールオゾン化産物の、ある特定の微生物種の増殖を阻止する最小抑制濃度を特定することによって求められる。一つの実施態様では、抗微生物活性は、標準用量または用量反応法を用いて測定される、微生物の５０％を殺戮する細胞傷害性コレステロールオゾン化産物の量である。
微生物感染を、本出願に記載される細胞傷害性コレステロールオゾン化産物で治療するための、治療的に有効な用量を評価する方法は、そこにおいてはインビトロにおいて実質的に微生物の増殖が全く見られない、細胞傷害性コレステロールオゾン化産物の最小抑制濃度を求める工程を包含する。この方法によって、微生物の増殖を抑制するのに必要な、または、微生物の５０％を殺戮するのに必要な、細胞傷害性コレステロールオゾン化産物の、容量当たりの近似量を計算することが可能になる。この量は、例えば、標準的な微小希釈法によって求めることが可能である。例えば、同じ量の培養液、および実質的に同じ量の微生物を含む、一連の微生物培養管を準備し、細胞傷害性コレステロールオゾン化産物の分液を加える。これらの分液は、同じ容量の溶液中に異なる量の細胞傷害性コレステロールオゾン化産物を含む。微生物を１から１０世代に相当する期間培養し、培養液中の微生物の数を求める。
培養液の光学的濁度を用いても、微生物の増殖が起こっているかどうかを評価することが可能である。すなわち、光学的濁度に著明な増加が認められないのであれば、著明な微生物増殖は起こっていない。一方、光学的濁度が増加しているのであれば、微生物増殖は起こっている。細胞傷害性コレステロールオゾン化産物に暴露後、どれだけの数の微生物細胞が生存しているかを決めるには、培養液から少量の分液を、細胞傷害性コレステロールオゾン化産物を添加した時点（ゼロ時点）で、またその後に定期的に取り出す。この、培養液の分液を、微生物培養プレートに撒き、プレートを、微生物増殖に導く条件下にインキュベートし、コロニーが現れた時、そのコロニー数を数える。
（抗体および結合実体）
本発明は、コレステロールオゾン化産物に結合することが可能な抗体および結合実体、または、本発明の細胞傷害性コレステロールオゾン化産物を疾病部位に搬送するに当たってマーカーとなることが可能な標的抗原を提供する。本出願に記載されるように、コレステロールオゾン化産物に向けられた抗体および結合実体を用いて、これらコレステロールオゾン化産物の細胞傷害性を抑制または修飾し、それによって血管病、例えば、アテローム硬化症、心臓病、または循環器病を治療することが可能である。さらに前述したように、細胞傷害性コレステロールオゾン化産物を抗体または結合実体に連結し、病態や病気、例えば、自己免疫疾患、癌、腫瘍、細菌感染、ウィルス感染、真菌感染、潰瘍および／または、細胞毒素の局所投与が有効であるその他の病態または疾病を治療または予防するために用いることが可能である。
本出願で用いる「結合実体」という用語は、コレステロールオゾン化産物、またはその他の疾病マーカーを結合することが可能な抗体および、その他のポリペプチドを含む。
従って、一つの実施態様では、本発明は、コレステロールオゾン化産物、例えば、セコ−ケトアルデヒド４ａ、そのアルドール付加物５ａ、関連化合物、例えば、３ｃ、６ａ−１５ａ、または７ｃのコレステロールオゾン化産物またはハプテンの内の任意のもの、に向けられた抗体調製品および結合実体を提供する。このような抗体および結合実体は、コレステロール関連血管病、例えば、炎症性血管病、アテローム硬化症、心臓病、または循環器病を治療するのに有用である。ある実施態様では、コレステロールオゾン化産物は、抗体の調製をやり易くするように化学的に修飾することが可能である。例えば、セコ−ケトアルデヒド４ａ、そのアルドール付加物５ａ、および関連化合物、例えば、３ｃ、６ａ−１５ａ、または７ｃの化合物の内の任意のもの、のヒドラゾン誘導体を、抗体調製に用いることが可能である。このヒドロゾン誘導体は、化合物４ｂ、４ｃ、５ｂ、および６ｂ−１５ｂまたは１０ｃの内の任意のものと同様の構造を有する化合物を含む。
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 コレステロールオゾン化産物は、例えば、ヒドラジン化合物、例えば、２，４−ジニトロフェニルヒドラジンとの反応によってヒドロゾン誘導体に変換することが可能である。ある実施態様では、反応は、アセトニトリル、またはアルコール（例えば、メタノールまたはエタノール）のような有機溶媒において実行される。多くの場合、酸性環境および、酸素非含有、非反応性雰囲気が利用される。
本発明はさらに、コレステロールオゾン化産物、およびそのようなオゾン化産物のヒドラゾン誘導体に構造的に関連するハプテンに対しても向けられる。例えば、本発明は、式３ｃ、１３ａ、１３ｂ、１４ａ、１５ａ、または１５ｂを有するハプテンであって、コレステロールのオゾン化およびヒドラゾン産物と反応することが可能な抗体を生成することが可能なハプテンを提供する。
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 式１５ａを有する化合物に対して特異的となるように生産されたハイブリドーマＫＡ１−１１Ｃ５およびＫＡ１−７Ａ６は、ブダペスト協定の条項に基づいて、２００３年８月２９日、米国基準菌株保存機関（１０８０１Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．，２０１１０−２２０９ＵＳＡ（ＡＴＣＣ））に、ＡＴＣＣ登録番号ＡＴＣＣＮｏ．ＰＴＡ−５４２７およびＰＴＡ−５４２８として寄託された。式１４ａを有する化合物に対して特異的となるように生産されたハイブリドーマＫＡ２−８Ｆ６およびＫＡ２−１Ｅ９も、ブダペスト協定の条項に基づいて、２００３年８月２９日、米国基準菌株保存機関に、ＡＴＣＣ登録番号ＡＴＣＣＮｏ．ＰＴＡ−５４２９およびＰＴＡ−５４３０として寄託された。
本発明はまた、コレステロールオゾン化産物、または、病気の、任意の都合のよいマーカーに結合することが可能な、現在利用可能な手順によって作製される抗体および結合実体を提供する。これらの抗体の結合ドメイン、例えば、抗体のＣＤＲ領域はまた、任意の、好適な結合実体のバックボーンに移送すること、または、同バックボーンと併用することが可能である。
抗体分子は、免疫グロブリンと呼ばれる血漿タンパク質ファミリーに属する。この免疫グロブリンの基本的構造ブロック、免疫グロブリン襞またはドメインは、様々な形で、免疫系および他の生物学的認識システムの多くの分子において利用されている。標準的な抗体は、２本の、同一の、免疫グロブリン重鎖と、２本の同一の、免疫グロブリン軽鎖から成るテトラマー構造であり、約１５０，０００ダルトンの分子量を有する。
抗体の重鎖および軽鎖は異なるドメインから成る。各軽鎖は、一つの可変ドメイン（ＶＬ）と一つの定常ドメイン（ＣＬ）を有する。一方、各重鎖は、一つの可変ドメイン（ＶＨ）と三つまたは四つの定常ドメイン（ＣＨ）を有する。例えば、Ａｌｚａｉ，Ｐ．Ｎ．，Ｌａｓｃｏｍｂｅ，Ｍ−Ｂ．＆ Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．（１９８８）Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，５５５−５８０を参照されたい。約１１０個のアミノ酸残基から成る各ドメインは畳まれて、互いに向き合うようにまとめられた２枚のβ−シートから形成される、特徴的なβ−サンドイッチ構造、免疫グロブリン襞の形を取る。ＶＨおよびＶＬドメインはそれぞれ、３個の相補性決定領域（ＣＤＲ１−３）を有する。これらは、ドメインの一端においてβ−鎖に接続するループ、または屈曲である。軽鎖・重鎖両方の可変域が、全体として抗原特異性に与る。ただし、特異性に与る個々の鎖の度合いは必ずしも等しくない。抗体分子は、６個の無作為に選ばれたループ（ＣＤＲ）を用いることによって多数の分子に結合できるように進化を遂げる。
免疫グロブリンは、その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて異なるクラスに割り当てられる。少なくとも５種類の、大きな免疫グロブリンクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがある。これらの内のいくつかは、さらにサブクラス（異性形）に分類されることがある。例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２がそれである。免疫グロブリンのＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、およびミュー（μ）と呼ばれる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、二つの別々のタイプのどちらかに割り当てることが可能である。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元形態もよく知られている。
抗体の可変ドメインに関連して用いられる「可変」という用語は、可変ドメインのある部分は、抗体によってその配列が大きく異なるという事実を指す。可変ドメインは、各特定の抗体において、その特定の抗原に対して結合させるためのものであり、その特定の抗原に対する特異性を決定する。しかしながら、変化の度合いは、抗体の可変ドメイン全体に渡って均一に分布するのではない。逆に、変化の度合いは、軽鎖の可変ドメインでも重鎖の可変ドメインでも、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、別名超可変領域とも呼ばれる三つのセグメントに集中する。
可変ドメインの内比較的高い保存領域を、枠組み構造領域（ＦＲ）と呼ぶ。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、大部分β−シート形状を有する４個のＦＲ領域を含む。これらのＦＲ領域は、β−シート構造に接続する、場合によってはその一部となるループを形成する３個のＣＤＲによって連結される。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって寄せ集め保持され、別の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に与る。定常ドメインは、抗体の抗原に対する結合には直接与らないが、抗体依存性細胞毒性における抗体参加のような各種エフェクター機能を提示する。
上記から、本発明において使用が考慮される抗体は、各種の形態の内から選ばれる任意の形態、例えば、全体免疫グロブリン、Ｆｖ、Ｆａｂ、類似断片のような抗体断片や、可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む１本鎖抗体、および、類似の形態を含む任意の形態を取ることが可能であり、これらは全て、本出願で用いる、広義の「抗体」という用語の中に含まれる。本発明は、ポリクロナールであれ、モノクロナールであれ、抗体の全ての特異性の使用を考慮するものであり、ある特異なコレステロールオゾン化産物、またはその誘導体を認識し、それと免疫応答を有する抗体に限定されない。
さらに、抗体の結合領域、すなわちＣＤＲは、任意の好適な結合性実体ポリペプチドのバックボーン中に設けることが可能である。好ましい実施態様では、本出願で記載される方法との関連において、式３、３ｃ、４ａ、４ａ−１５ａ、７ｃの化合物の内の任意のものを始めとして、ヒドラゾン誘導体を含む、その誘導体に対して免疫特異性を有する抗体、結合性実体、またはその断片が使用される。
「抗体断片」という用語は、全長抗体の一部であって、一般に、抗原結合領域、すなわち可変領域を指す。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、およびＦｖ断片が挙げられる。抗体をパパイン消化することによって、それぞれが単一抗原結合部位を有する、Ｆａｂ断片と呼ばれる、２本の同一抗原結合断片と、残りの１本のＦｃ断片が得られる。従って、Ｆａｂ断片は、１本の無傷の軽鎖と、１本の重鎖の一部を有する。ペプシン処理すると、抗原に架橋結合することが可能な２本の抗原結合断片を有する、１本のＦ（ａｂ′）２断片と、ｐＦｃ′断片と呼ばれる、１本の残余断片が得られる。Ｆａｂ′断片は、ペプシン消化抗体の還元後に得られ、１本の無傷の軽鎖と、重鎖の一部とから成る。抗体１分子当たり２本のＦａｂ′断片が得られる。Ｆａｂ′断片は、抗体のヒンジ領域の１個以上のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端の数個の残基を加えた分だけＦａｂ断片とは異なる。
Ｆｖは、１個の完全な抗原認識・結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、１本の重鎖可変ドメインと１本の軽鎖可変ドメインが、緊密な非共有的連結で繋がれたダイマーから成る（ＶＨ−ＶＬダイマー）。この形態においてこそ、各可変ドメインの３個のＣＤＲ同士が相互作用を持って、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面に抗原決定部位を定める。全体では、６個のＣＤＲが、抗体に対する抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一可変ドメイン（または、抗原に対して特異的な僅か３個のＣＤＲしか含まない、Ｆｖの半分）であっても抗原を認識し、結合する能力を有する。ただし、その親和度は、全体結合部位よりも低い。本出願で用いる、抗体に関する「機能的断片」とは、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）、およびＦ（ａｂ′）２断片を指す。
さらに追加の断片としては、抗体断片から形成される、二重特異性抗体、直線的抗体、１本鎖抗体分子、および複数特異性抗体が挙げられる。１本鎖抗体とは、遺伝学的に融合された単一鎖分子となるように、適当なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含む、遺伝子工学的に加工された分子である。このような１本鎖抗体はまた、「１本鎖Ｆｖ」とも、“ｓＦｖ”抗体断片とも呼ばれる。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合について所望の構造を形成することを可能となるように、ＶＨとＶＬドメインの間にさらにポリペプチドリンカーを含む。ｓＦｖに関する総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
「二重特異性抗体」という用語は、二つの抗原結合部位を有する小型の抗体断片であって、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖の二つのドメインの間にペア形成ができないほど短いリンカーを用いることによって、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインとペア形成をするように強制され、二つの抗原結合部位を生み出す。二重特異性抗体についてはさらに精しく、例えば、欧州特許第４０４，０９７号、ＰＣＴ特許第９３／１１１６１号、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８（１９９３）に記載されている。
従って、本発明の考慮する抗体断片は、完全長抗体ではない。しかしながら、この抗体断片は、完全長抗体に対して、近似の、または、さらに向上した免疫学的特性を有することが可能である。この抗体断片は、約４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、９アミノ酸、約１２アミノ酸、約１５アミノ酸、約１７アミノ酸、約１８アミノ酸、約２０アミノ酸、約２５アミノ酸、約３０アミノ酸以上、と同程度に小型であってもよい。
一般に、本発明の抗体断片は、疾病マーカー、例えば、コレステロールのオゾン化産物に対して特異的に結合する抗体に比べ、近似の、またはより優れた免疫学的特性を有する限り、サイズにおいて任意の上限を有することが可能である。例えば、比較的小型の結合実体および軽鎖抗体断片は、もしそれが軽鎖抗体サブユニットに関連するものであるならば、２００未満のアミノ酸、約１７５未満、約１５０未満、または約１２０未満のアミノ酸を有するものであってもよい。さらに、比較的大型の結合実体および重鎖抗体断片は、もしそれが重鎖抗体サブユニットに関連するものであるならば、約４２５未満のアミノ酸、約３２５未満、または約３００未満のアミノ酸を有するものであってもよい。
疾病マーカーに対して特異性を有するように調製される抗体は、利用可能な任意の手法によって作製することが可能である。ポリクロナール抗体の調製法は当業者には利用可能である。例えば、Ｇｒｅｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ，ｉｎ：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍａｎｓｏｎ，ｅｄ．），ｐａｇｅｓ１−５（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ ｉｎ Ｒａｂｂｉｔｓ，Ｒａｔｓ Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｈａｍｓｔｅｒｓ，ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｓｅｃｔｉｏｎ ２．４．１（１９９２）を参照されたい。なお、これらの文書を引用することにより本出願に含める。
モノクロナール抗体も本発明に用いることが可能である。翻出願で用いる「モノクロナール抗体」という用語は、実質的には均一な抗体の集団から得られた抗体を指す。言い換えれば、この集団を構成する個々の抗体は、ごく少数存在することがある若干の抗体中に時折天然に起こる突然変異を除いては同一である。モノクロナール抗体は、単一の抗原部位に対して指向性を有するように調製されているので、極めて特異性が高い。さらに、通常、様々な決定基（エピトープ）に対して指向性を有するように調製される様々な抗体を含むポリクロナール抗体調製物とは違って、各モノクロナール抗体は、抗原上の単一決定基に対して指向性を有するように調製される。特異性に加えてさらに、モノクロナール抗体は、他の免疫グルブリンによる汚染に乱されることなく、ハイブリドーマ培養体によって合成される点で有利である。「モノクロナール」という修飾語は、抗体の特性が、実質的に均一な抗体集団から得られたものであることを示すものであって、その抗体が、何かある特定の方法によって生産されることを要求するものと考えてはならない。
本出願のモノクロナール抗体は、特に「キメラ」抗体を含む。キメラ抗体では、重鎖および／または軽鎖の一部が、ある特定の動物種、またはある特定の抗体クラスまたはサブクラスから得られた抗体の対応配列と同一、または相同であり、一方、該鎖（単複）の残りの部分は、別の動物種、または別の抗体クラスまたはサブクラスから得られた抗体の対応配列と同一、または相同である。このような抗体の断片も、所望の生物学的活性を示す限り、使用が可能である。米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，６８５１−５５（１９８４）を参照されたい。
モノクロナール抗体の調製も同様に通例通りである。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）；Ｃｏｌｉｇａｎ， ｅｔ ａｌ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ２．５．１−２．６．７；ａｎｄ Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｐａｇｅ７２６（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂ．（１９８８））を参照されたい。なお、これらの文書を引用することにより本出願に含める。モノクロナール抗体は、様々な既存の技術を用いてハイブリドーマ培養体から分離し、精製することが可能である。そのような分離技術としては、タンパク質Ａセファローズを備えたアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ， ｅｔ ａｌ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ２．７．１−２．７．１２ａｎｄ ｓｅｃｔｉｏｎｓ２．９．１−２．９．３；Ｂａｒｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ），ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅｓ７９−１０４（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９２））を参照されたい。
抗体のインビトロおよびインビボ操作法は、当業者には利用可能である。例えば、本発明に従って用いられるモノクロナール抗体は、前述のハイブリドーマ法で作製してもよいし、または、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるように組み換え法によって作製してもよい。本発明によって使用されるモノクロナール抗体は、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載される技術を用いてファージ抗体ライブラリーから分離してもよい。
抗体断片を作製する方法も従来技術において既知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８８）、なお、この文書を引用することにより本出願に含める）。本発明の抗体断片は、抗体のタンパク質を加水分解することによって、または、適当な宿主において抗体断片をコードする核酸を発現させることによって調製することが可能である。抗体断片は、従来法である、全体抗体をペプシンまたはパパインで消化することによって獲得することが可能である。例えば、抗体断片は、抗体をペプシンで酵素的に分断することによって、Ｆ（ａｂ′）２と記述される５Ｓ断片を得ることが可能である。この断片は、チオール還元剤を用いてさらに分断することによって、また、要すれば任意に、ジスルフィド結合から生じるスルフヒドリル基に対する遮蔽基を用いて、３．５Ｓ Ｆａｂ′の一価断片を得ることが可能である。別法として、ペプシンによる酵素的分断は、二つの一価のＦａｂ′断片と、１個のＦｃ断片を直接生産する。これらの方法は、例えば、米国特許第４，０３６，９４５号および４，３３１，６４７号、および該文書の参考文献中に記載されている。これらの特許の全体を引用することにより本出願に含める。
抗体を分断するその他の方法としては、例えば、重鎖を分離して一価の軽・重鎖断片を形成する方法、断片をさらに分断する方法、または、他の酵素的、化学的、または遺伝学的方法があるが、それらの方法も、その断片が、元の抗体によって認識される抗体に結合可能である限り、使用が可能である。例えば、Ｆｖ断片は、ＶＨ鎖とＶＬ鎖の連結を含む。この連結は非共有的であってもよいし、二つの可変鎖は、分子間ジスルフィド結合によって連結されてもよいし、グルタールアルデヒドのような薬品によって架橋結合されてもよい。Ｆｖ断片は、ペプチドリンカーによって接続されるＶＨおよびＶＬ鎖を含むことが好ましい。この１本鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドで接続されたＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造的遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子は発現ベクターに挿入され、次にベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉのような宿主に導入される。この組み換え宿主細胞は、二つのＶドメインを架橋結合するリンカーを備えた１本鎖ポリペプチドを合成する。ｓＦｖの生産法は、例えば、Ｗｈｉｔｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ：ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，ｐａｇｅ９７（１９９１）；Ｂｉｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６（１９８８）；Ｌａｄｎｅｒ，ｅｔ ａｌ，米国特許第４，９４６，７７８号；および、Ｐａｃｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１：１２７１−７７（１９９３）に記載される。
もう一つの形の抗体断片は、単一相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、多くの場合、抗原認識と結合に関与する。ＣＤＲペプチドは、対象抗体のＣＤＲをコードする遺伝子をクローンまたは構築することによって得られる。このような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて抗体生産細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって調製される。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ：ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ２，ｐａｇｅ１０６（１９９１）を参照されたい。
本発明は、ヒト抗体、および非ヒト（例えば、ラット）抗体のヒト化形態を考慮する。このようなヒト化抗体は、最小の、非ヒト免疫グロブリン由来配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、または、その他の、抗体の抗原結合配列）である。ヒト化抗体は、大部分、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であるが、該免疫グロブリンにおいて、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）が、非ヒト動物種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、またはウサギ由来の、所望の特異性、親和性、および能力を有する残基によって置換されるものである。
ある場合、ヒト免疫グロブリンのＦｖ枠組み構造残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、導入されたＣＤＲまたは枠組み構造配列にも見られない残基を含んでもよい。抗体の性能をさらに洗練し、最適化するために、これらの修飾は実行される。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１個の、典型的には２個の可変ドメインの、実質的に全てを含む。その際、ＣＤＲ領域の全て、または実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲに対応し、ＦＲ領域の全て、または実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンの共通配列である。ヒト化抗体はさらに、免疫グロブリン、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含むともっとも好適である。さらに詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３２１，５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３２，３２３−３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２，５９３−５９６（１９９２）；Ｈｏｌｍｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：２１９２−２２０１（１９９７）；ａｎｄ Ｖａｓｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１：１０５−１１５（１９９８）を参照されたい。
抗体を生産するためには標準法の利用が可能である一方、抗体のサイズ、抗体の複数鎖構造、および、抗体中に存在する６本の結合ループの複雑性は、改良に当たって、また、大量の抗体を生産する際にハードルとなる。従って、本発明は、結合実体であって、コレステロールのオゾン化産物を含む疾病マーカーを認識し結合することが可能なポリペプチドを含む結合実体の使用法を考慮する。
いくつかのタンパク質は、疾病マーカーに対する結合ドメインが付着するタンパク質スカフォールドとして働くことが可能であり、したがって適当な結合実体を形成することが可能である。結合ドメインは、本発明のコレステロールオゾン化産物に結合、または該産物と相互作用を持ち、一方、タンパク質スカフォールドは、結合ドメインが結合できるようにそれらドメインを単に保持し、安定化する。いくつかのタンパク質スカフォールドは利用可能である。例えば、ファージカプシド・タンパク質は利用が可能である。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ＆ Ｗｅｌｌｓ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：１７３−１８４（１９９４）の総説を参照されたい。ファージカプシド・タンパク質は、ランダムなペプチド配列、例えば、ウシ膵臓トリプシン抑制因子（Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ８９：２４２９−２４３３（１９９２））、ヒト成長ホルモン（Ｌｏｗｍａｎ えｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０：１０８３２−１０８３８（１９９１））；Ｖｅｎｔｕｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ１：７０−７５（１９９４））、および、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＩｇＧ結合ドメイン（Ｏ‘Ｎｅｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖ（Ｃｒａｂｂ，Ｌ．，ｅｄ．）ｐｐ．５１７−５２４，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９４））を含む配列を発現するためのスカフォールドとして利用されてきている。上記スカフォールドは、コレステロールオゾン化産物のような疾病マーカーに対する結合ドメインを含むように修飾することが可能な、ランダム化単一ループまたは領域を発現する。
研究者達はまた、繊維状ファージＭ１３の発現スカフォールドとして、小さい、７４個のアミノ酸から成るα−アミラーゼ阻害剤Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔを用いている。ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｓ．Ｊ．，＆ Ｈｏｅｓｓ，Ｒ．Ｈ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５０：４６０−４７０（１９９５）。Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｅｎｄａｅから得られたβ−シートタンパク質である。Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔは、ペプチド結合用スカフォールドとして魅力的な特質、例えば、小型、安定性、および、高解像度のＮＭＲおよびＸ線構造データが利用可能であることを含む、いくつかの特質を備える。例えば、Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔの全体的トポロジーは、一連のループによって接続される２枚のβ−シートを備えた免疫グロブリンのものと近似する。しかし、免疫グロブリンドメインと違って、Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔのβ−シートは、１個ではなく、２個のジスルフィド結合によって繋がれており、これが、このタンパク質の高い安定性を造りだしている。Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔのループは、免疫グロブリンに見られるＣＤＲループの同様の機能を営むが、インビトロ突然変異によって簡単にランダム化することが可能である。Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｉｃｅｓ ｔｅｎｄａｅから得られたものであり、ヒトに対しては抗原性を有する可能性がある。従って、Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔを用いる結合実体は、インビトロで使用するのが好ましい。
フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインも、結合実体を付着させるタンパク質スカフォールドとして利用されている。フィブロネクチンＩＩＩ型は、免疫グロブリンスーパーファミリーの大型サブファミリー（ｓ−型ＩｇファミリーのＦｎ３ファミリー）の一部である。配列、ベクター、および、このフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを、結合実体（例えばＣＤＲペプチド）のタンパク質スカフォールドとして利用するためのクローニング法は、例えば、米国特許出願第２００２００１９５１７号に記載されている。また、Ｂｏｒｋ，Ｐ．＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．（１９９２）、Ｐｒｏｐｏｓｅｄ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｉｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｂｙ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，８９９０−８９９４；Ｊｏｎｅｓ，Ｅ．Ｙ．（１９９３）Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３，８４６−８５２；Ｂｏｒｋ，Ｐ．，Ｈｏｍ，Ｌ．＆ Ｓａｎｄｅｒ，Ｃ．（１９９４）Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｆｏｌｄ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐａｔｔｅｒｎｓ ａｎｄ ｃｏｍｍｏｎ ｃｏｒｅ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４２，３０９−３２０；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｉ．Ｄ．＆ Ｓｐｉｔｚｆａｄｅｎ，Ｃ．（１９９４）Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ Ｓｔｒｕｃｔｒｕｅ ２， ２３３−３３７；Ｈａｒｐｅｚ，Ｙ．＆ Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．（１９９４）も参照されたい。
免疫系では、大規模なライブラリーから、特異的抗体が選択され、増幅される（親和性成熟）。免疫細胞で用いられる組み合わせ法は、突然変異、および結合実体の組み合わせライブラリーの生成によって模倣することが可能である。結合実体、抗体断片、および抗体の変種も、ディスプレイ型技術を用いて生成することが可能である。このようなディスプレイ型技術としては、例えば、ファージディスプレイ、レトロウィルスディスプレイ、リボソームディスプレイ、およびその他の技術が挙げられる。結合実体のライブラリーを生成し、そのライブラリーについてスクリーニングするために、従来技術で得られる技術を用いることが可能であり、また、選択された結合実体を、親和性成熟のようなさらに新たな成熟過程を経過させることも可能である。Ｗｒｉｇｈｔ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ、上記；Ｈａｎｅｓ ａｎｄ Ｐｌｕｃｔｈａｕ ＰＮＡＳ ＵＳＡ９４：４９３７−４９４２（１９９７）（リボソームディスプレイ）、Ｐａｒｍｌｅｙ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ Ｇｅｎｅ７３：３０５−３１８（１９８８）（ファージディスプレイ）；Ｓｃｏｔｔ ＴＩＢＳ１７：２４１−２４５（１９９２），Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ８７：６３７８−６３８２（１９９０），Ｒｕｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ２１：１０８１−１０８５（１９９３），Ｈｏｇａｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ１３０：４３−６８（１９９２），Ｃｈｉｓｗｅｌｌ ａｎｄ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ＴＩＢＴＥＣＨ１０：８０−８４（１９９２）、および米国特許第５，７３３，７４３号。
従って、本発明は、抗体、ＣＤＲ、または結合ドメインについて、その親和度、選択性、結合強度、および／またはその他の好ましい性質を最適化するように、抗体、ＣＤＲ、または結合ドメインを突然変異させる方法を提供する。結合ドメイン突然変異とは、選択された結合ドメイン（例えばＣＤＲ）の、アミノ酸配列変種を指す。一般に、結合ドメイン突然変異の１個以上のアミノ酸残基が、参照結合ドメイン中に存在するものと異なる。このような抗体突然変異では、参照アミノ酸配列との同一性、または類似性は必ず１００％未満である。一般に、突然変異種結合ドメインは、参照結合ドメインのアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性または類似性を有する。変異種結合ドメインは、参照結合ドメインのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、もっとも好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性または類似性を有する。
例えば、ファージディスプレイによる親和性成熟を、変異種結合ドメインを生成するための一つの方法として利用することが可能である。ファージディスプレイによる親和性成熟とは、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０（４５）：１０８３２−１０８３８（１９９１）に記載される方法を指す。さらに、Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：８８９−８９６（１９９２）も参照されたい。下記の記述に厳密に限定されるものではないが、この方法は、各部位において可能な全てのアミノ酸置換体を生成する目的で、いくつかの異なる部位においていくつかの結合ドメインまたは抗体の超可変領域を変異させる方法と簡単に書くこともできる。このようにして生成された結合ドメイン変異種は、繊維状ファージ粒子において融合タンパク質として得られた一価形式でディスプレイされる。融合は、一般にＭ１３のＩＩＩ遺伝子産物に対して為される。様々な突然変異種を発現するファージを、興味の性質、例えば、結合親和度または選択性を求めて数ラウンドの選択サイクルに渡って繰り返すことが可能である。興味の突然変異を分離し、配列決定する。このような方法が、より詳細に、米国特許第５，７５０，３７３号、米国特許第６，２９０，９５７号、およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１３（１１），２５０８−２５１５（１９９４）に記載されている。
上記から、一つの実施態様では、本発明は、疾病マーカー、例えば、コレステロールオゾン化産物を認識するに当たって結合特性が改善された結合実体、抗体、および抗体断片を生成するように、結合実体、抗体、および抗体断片を操作する方法を提供する。
既存の結合実体または抗体の一部を突然変異させる方法は、疾病マーカーに対する結合ドメインをコードするポリペプチドをコードする核酸を、ファージコート・タンパク質をコードする核酸に融合し、それによって融合タンパク質をコードする組み換え核酸を生成し、融合タンパク質をコードする組み換え核酸を突然変異させて、変異融合タンパク質をコードする変異核酸を生成し、この変異融合タンパク質をファージ表面に発現し、かつ、疾病マーカーに結合するファージを選択する工程を包含する。
従って、本発明は、疾病マーカー（例えば、コレステロールオゾン化産物、ハプテン、またはコレステロール誘導体）を認識し、結合することが可能な抗体、抗体断片、および結合実体ポリペプチドを提供する。本発明はさらに、抗体、抗体断片、および結合実体ポリペプチドについて、その結合特性、またはその他の所望の特性（例えば、安定性、サイズ、取り扱い易さ）を最適化するための操作法を提供する。
（用量、処方、および投与ルート）
本発明の組成物は、病気、例えば、アテローム硬化症、心臓病、循環器病、自己免疫疾患、癌、腫瘍、細菌感染、ウィルス感染、真菌感染、潰瘍および／または、細胞毒素の局所投与が有益な結果を生むその他の病態または疾病に関連する少なくとも一つの症状を緩和するために投与される。
この所望の効果（単複）を実現するために、細胞毒素、結合実体、抗体、またはそれらの組み合わせは、例えば、体重ｋｇ当たり、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５００から７５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇから約３００から５００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇから約１００から３００ｍｇ／ｋｇ、または、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇから約５０から１００ｍｇ／ｋｇの、単一用量または分割用量として投与されてよい。ただし、これ以外の用量であっても有益な結果をもたらす場合がある。投与される量は、様々な要因、例えば、治療剤が、細胞毒素か、結合実体か、または抗体か、哺乳動物の病気、体重、身体状態、健康、年齢、実現されるのは予防なのか治療なのか、および、治療剤は化学的に修飾されているか、を含む様々な要因に応じて変動するが、ただし、要因は上記のものに限定されない。このような要因は、動物モデル、または、従来技術で利用可能なその他の試験システムを用いることができる臨床家には簡単に決定することが可能である。
本発明による治療剤の投与は、例えば、治療受容者の生理的状体、投与の目的が治療か予防か、および、その他の、熟練した開業家には既知の要因に応じて、単一用量、複数用量として、あるいは、連続的に、または間欠的に行われてもよい。細胞毒素（単複）、抗体、またはそれらの組み合わせの投与は、事実上指定の期間連続的であってよいが、あるいは、間隔を置いて行われる一連の投与であってもよい。局所投与も全身投与も考慮される。
組成物を調製するために、細胞毒素（単複）、結合実体、抗体、またはそれらの組み合わせが、合成され、または他のやり方で獲得され、必要または所望に応じて精製される。次に、これらの治療剤は、凍結乾燥されるか、安定化され、その濃度は適当な量に調節されるが、治療剤は、要すれば任意に他の薬剤と組み合わせられる。単位用量に含まれる、細胞毒素、結合実体、抗体またはそれらの組み合わせの絶対重量は、広範に変動することが可能である。例えば、ある特定の細胞タイプに対して特異的な、少なくとも１種の細胞毒素、結合実体、または抗体を、約０．０１から約２ｇ、約０．１から約５００ｍｇ投与することが可能である。それとは別に、単位剤形は、約０．０１ｇから約５０ｇ、約０．０１ｇから約３５ｇ、約０．１ｇから約２５ｇ、約０．５ｇから約１２ｇ、約０．５ｇから約８ｇ、約０．５ｇから約４ｇ、または、約０．５ｇから約２ｇまでの範囲を変動することが可能である。
細胞毒素（単複）、結合実体、抗体またはその組み合わせの１日当たり用量も変動することが可能である。例えば、１日当たり用量は、約０．１ｇ／日から約５０ｇ／日、約０．１ｇ／日から約２５ｇ／日、約０．１ｇ／日から約１２ｇ／日、約０．５ｇ／日から約８ｇ／日、約０．５ｇ／日から約４ｇ／日、および、約０．５ｇ／日から約２ｇ／日までの範囲を変動してよい。
上記から、本発明の治療剤を含む、１種以上の好適な剤形を、各種ルート、例えば、経口、非経口（皮下、静脈内、筋肉内、および腹腔内を含む）、直腸、皮膚、経皮、胸郭内、肺内、および、鼻腔内（呼吸器）ルートを含む各種ルートを通じて投与することが可能である。治療剤はまた、持続放出用に処方されてもよい（例えば、ミクロカプセル封入によって、ＰＣＴ特許第９４／０７５２９号および米国特許第４，９６２，０９１号を参照）。処方は、適当な場合であれば、都合よくばらばらの単位剤形として提示されてもよいし、製薬技術でよく知られるいずれかの方法で調製されてよい。そのような方法は、治療剤を液性担体、固相基質、微粉状固相担体、またはそれらの組み合わせと混合する工程、次に、要すれば、その製品を所望の搬送システムに成形または導入する工程を含んでもよい。
本発明の治療剤を経口投与用に調製する場合、一般に、製薬学的に受容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わされて、製薬処方、または単位剤形を形成する。経口投与用の場合、治療剤は、粉末、顆粒状処方、溶液、懸濁液、乳液として存在してもよいし、または、チュウインガムから活性剤が吸収されるように、天然または合成ポリマーまたは樹脂の中に含まれてもよい。治療剤はまた、ボーラス、糖剤、またはペーストとして提示されてもよい。本発明の経口投与治療剤は、持続放出用に処方されてもよい。例えば、治療剤は、コートされてもよいし、微小カプセルに封入されてもよいし、あるいは、他のやり方で持続放出デバイスの中に封じ込まれてもよい。このような処方における全体活性成分は、処方重量の０．１から９９．９％を含む。
「製薬学的に受容可能な」とは、処方の他の成分と適合し、処方の服用者に対しても有害でない、担体、希釈剤、賦形剤、および／または塩を意味する。
本発明の治療剤を含む製薬処方は、よく知られ、簡単に入手が可能な成分を用い従来技術で既知の手順を用いて調製が可能である。例えば、治療剤は、一般的な賦形剤、希釈剤、または担体と処方し、錠剤、カプセル、溶液、懸濁液、散剤、アエロゾル等に成形することが可能である。このような処方に好適な賦形剤、希釈剤、および担体の例としては、バッファーを始め、充填剤および増量剤、例えば、でん粉、セルロース、糖分、マンニトール、およびケイ酸誘導体が挙げられる。結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびその他のセルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン、およびポリビニール−ピロリドンを使用することも可能である。グリセロールのような保湿剤、炭酸カルシウムおよび重炭酸ナトリウムのような崩壊剤も含めてよい。パラフィンのような溶解を遅らせる薬剤を含めてもよい。第４アンモニウム化合物のような吸収加速物質を含めてもよい。セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートのような界面活性剤を含めてもよい。カオリンおよびベントナイトのような吸着性担体を含めてもよい。タルク、ステアリン酸カルシウムおよびマグネシウム、および固相ポリエチレングリコールのような潤滑剤を含めてもよい。防腐剤を加えてもよい。本発明の組成物はまた、セルロースおよび／またはセルロース誘導体のような増粘剤を含んでもよい。組成物はまた、ゴムであって、例えば、キサンタン、グアまたはカルボゴムまたはアラビアゴム、あるいは別法としてポリエチレングリコール、ベントンおよびモンモリロナイト等のゴムを含んでもよい。
例えば、本発明の治療剤を含む錠剤またはカプレットは、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、および炭酸マグネシウムのような緩衝剤を含んでもよい。カプレットおよび錠剤はまた、不活性成分、例えば、セルロース、あらかじめゼラチン化したでん粉、二酸化ケイ素、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、微結晶セルロース、でん粉、タルク、二酸化チタン、安息香酸、クエン酸、コーンスターチ、鉱物油、ポリプロピレングリコール、リン酸ナトリウム、ステアリン酸亜鉛等のような不活性成分を含んでもよい。本発明の少なくとも１種の治療剤を含む、硬性または軟性ゼラチンカプセルは、不活性成分であって、例えば、ゼラチン、微結晶セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、でん粉、タルク、および二酸化チタン等の不活性成分ばかりでなく、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および植物油のような液性ベヒクルを含んでもよい。さらに、本発明の１種以上の治療剤を含む、腸管融解被覆錠剤またはカプレットは、胃における分解に抵抗し、十二指腸のより中性からアルカリに溶解するように設計される
本発明の治療剤はまた、エリクシル剤として、すなわち、経口投与用に好適な溶液として、あるいは、非経口投与用、例えば、筋肉内、皮下、腹腔内、または静脈内ルートによって投与するのに好適な溶液として処方することも可能である。本発明の治療剤の製薬処方は、水溶液または無水溶液、または分散体の形を取ってもよいし、あるいは別に乳液、懸濁液、または塗布剤の形を取ってもよい。
上記から、治療剤は、非経口投与用（例えば、注入、ボーラス注入、または連続点滴）に処方されてもよく、アンプル、あらかじめ充填された注射筒、少量の点滴容器、または、複数用量容器のような単位剤形として提示されてもよい。前述したように、剤形の使用期間の維持を助けるために防腐剤を加えることも可能である。活性剤とその他の成分は、懸濁液、溶液、または、油状または水性ベヒクルにおいて乳液を形成してもよく、処方剤、例えば、懸濁剤、安定化剤、および／または、分散剤を含んでもよい。あるいは別に、治療剤および他の成分は、無菌の固体を消毒下に単離して得られる、または溶液から凍結乾燥することによって得られる粉末形であって、使用前に、適当なベヒクル、例えば、無菌の、発熱物質フリーの水と調合されるように構成される粉末形であってもよい。
これらの処方は、従来技術でよく知られる、製薬学的に受容可能な担体、ベヒクル、およびアジュバントを含んでもよい。例えば、生理学的見地から受容可能な有機溶媒（単複）であって、水の外に、アセトン、エタノール、イソプロピルアルコール、“Ｄｏｗａｎｏｌ”の名称の下で販売されているグリコールエーテル、ポリグリコールとポリエチレングリコール、短鎖の酸のＣ１−Ｃ４アルキルエステル、乳酸エチルまたはイソプロピル、“Ｍｉｇｌｙｏｌ”の名称の下で市販される製品のような脂肪酸トリグリセリド、ミリスチン酸イソプロピル、動物、鉱物および植物油、および、ポリシロキサン等のような溶媒から選ばれる１種以上の有機溶媒を用いて溶液を調製することが可能である。
要すれば、抗酸化剤、界面活性剤、その他の防腐剤、フィルム形成、ケラト分解、またはコメド分解剤、芳香剤、香料、および着色剤の中から選ばれるアジュバントを加えることも可能である。抗酸化剤、例えば、ｔ−ブチルヒドロキノン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、およびα−トコフェロールおよびその誘導体を添加することも可能である。
さらに、本治療剤は、持続放出剤形等のような処方にも好適である。処方は、例えば、循環系または気道の特定の一部に対して、できれば長期に活性成分を放出するように構成することが可能である。コーティング、エンベロープ、および保護基質を、例えば、ポリマー物質、例えば、ポリラクチド−グリコレート、リポソーム、ミクロエマルジョン、ミクロ粒子、ナノ粒子、またはワックスのようなポリマー物質で作製してもよい。これらコーティング、エンベロープ、および保護基質は、滞留デバイス、例えば、ステント、カテーテル、腹膜透析チューブ、ドレーンデバイス等をコートするのに有用である。
局所投与の場合、本治療剤は、標的領域の直接塗布に関して従来技術で既知なように処方されてよい。局所塗布用に調製される主な形態は、例えば、クリーム、ミルク、ゲル、分散または微細乳液、大なり小なり粘り気を持たせたローション、含浸パッド、軟膏またはスティック、エロゾル処方（例えば、噴霧または泡剤）、石鹸、洗剤、ローションまたは石鹸ケーキの形を取る。この目的のために通例として用いられる形としては、傷口包帯、コート包帯または他のポリマーカバー、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゼリー、噴霧、およびエロゾルが挙げられる。上記から分かるように、本発明の治療剤は、皮膚投与用パッチまたは包帯を通じて搬送することが可能である。別に、本治療剤は、接着性ポリマー、例えば、ポリアクリレート、またはアクリレート／ビニールアセテート・コポリマーの一部となるように処方することも可能である。長期塗布のためには、微小孔および／または呼吸性裏張り積層体を用いるのが好ましいと考えられる。なぜならその場合皮膚のむくみ、または浸軟を抑えることが可能となるからである。裏張り層は、所望の保護および支持機能を与えるものである限り、適当な任意の厚さを有するものであってよい。適切な厚みは、一般に、約１０から約２００ミクロンである。
軟膏およびクリームは、適当な増粘剤および／またはゲル化剤を添加した、水性または油性基材と共に処方される。ローションは、水性または油性基材と共に処方され、一般に、さらに、１種以上の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、または着色剤を含む。活性成分は、例えば、米国特許第４，１４０，１２２号、４，３８３，５２９号、または４，０５１，８４２号に開示されるようにイオン導入法によって搬送することも可能である。局所処方における本発明の治療剤の重量パーセントは、処方の全体重量の０．０１％から９５％、典型的には０．１−８５重量％である。
点眼薬または点鼻薬のような点滴薬は、１種以上の分散剤、安定化剤、または懸濁剤を含む水性、または非水性基材に溶解させた１種以上の治療剤として処方されてもよい。液体噴霧剤は、加圧パックから搬送されると好都合である。点滴薬は、簡単な点眼用キャップ付き瓶、または、液体内容物を点滴として配送するように適応したプラスチック瓶の特殊形態閉鎖部を通じて搬送することが可能である。
本治療剤はさらに、口または喉における局所投与用に処方してもよい。例えば、活性成分は、さらに芳香基材、通常は蔗糖およびアカシアまたはトラガカントを含むローゼンジとして；ゼラチンおよびグリセリンまたは蔗糖、およびアカシアのような不活性基材を含む香錠として；および、本発明の組成物を適当な液性担体に溶解させて含む口臭剤として処方されてもよい。
本発明の製薬処方は、任意に加えられる成分として、製薬学的に受容可能な担体、希釈剤、可溶化または乳化剤、および、従来技術で利用可能なタイプの塩を含んでもよい。このような物質の例としては、正常な生食液、例えば、生理学的緩衝液および水が挙げられる。本発明の製薬処方において有用な担体および／または希釈剤の、特定の、非限定的例としては、水、および、生理学的に受容可能な緩衝塩液、例えば、リン酸緩衝塩液ｐＨ７．０−８．０が挙げられる。
本発明の活性成分はまた、気道に投与されてもよい。従って、本発明はまた、本発明の方法に使用されるエロゾル製薬処方および剤形も提供する。一般に、このような剤形は、本発明の薬剤の少なくとも一つについて、ある特定の免疫応答、血管病態または疾病の臨床症状の治療または予防に効果的な量を含む。本発明の方法に関連して治療した免疫応答、血管病態または疾病の１種以上の症状が統計的に有意に緩和された場合、それがどれほどのものであっても、それは、その免疫応答、血管病態または疾病が、本発明の範囲内で治療されたと考察される。
別に、吸入または吸引による投与の場合、組成物は、乾燥粉末、例えば、治療剤と、ラクトースまたはでん粉のような適当な粉末基材から成る粉末混合物の形を取ってもよい。粉末組成物は、カプセルまたはカートリッジのような単位剤形として提示されてもよいし、あるいは、ゼラチンまたは薄膜パックであって、粉末が、そのパックから、吸入器、吸引器、または定量吸入器（例えば、Ｎｅｗｍａｎ，Ｓ．Ｐ．ｉｎ Ａｅｒｏｓｏｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｌｕｎｇ，Ｃｌａｒｋｅ，Ｓ．Ｗ．ａｎｄ Ｄａｖｉａ，Ｄ．ｅｄｓ．，ｐｐ．１９７−２２４，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９８４に開示される加圧式定量吸入器（ＭＤＩ）および乾燥粉末吸入器を参照されたい）の助けを借りて投与されるようになっていてもよい。
本発明の治療剤はまた、エロゾルまたは吸入形で投与される場合、水溶液として投与することも可能である。従って、その他のエロゾル製薬処方は、例えば、適応症すなわち治療される疾病に対して特異的な、本発明の１種以上の治療剤を約０．１ｍｇ／ｍｌから約１００ｍｇ／ｍｌ含む生理学的に受容可能な緩衝塩液を含んでもよい。液体に溶解または懸濁しない、微細な粉末状固相治療剤の形を取る乾燥エロゾルも、本発明の実行には有用である。本発明の治療剤は、微細粉末として処方されてもよいし、平均粒径が約１と５μｍの間、あるいは別に２と３μｍの間の微細な粉末を含んでもよい。微細粒子は、従来技術でよく知られる技術を用いて、粉砕およびスクリーンろ過によって調製することが可能である。粒子は、散剤の形を取ってもよい、この微細化材料の所定量を吸入することによって投与されてもよい。各剤形の個別のエロゾル用量に含まれる、一つの活性成分、または複数の活性成分の単位含量は、それ自体が、特定の免疫応答、血管病態または疾病を治療するのに有効な量を構成する必要がないことが理解されよう。なぜならば、必要な有効量は、複数の剤形の投与によって達成が可能なのであるから。さらに、有効量は、剤形中の用量未満を用いても、個別の投与において、または一連の投与において達成される。
吸入によって、上気道（鼻腔）または下気道に投与する場合、本発明の治療剤は、噴霧器、または加圧パック、または、エロゾル噴霧を搬送する、他の適当な手段によって好適に搬送される。加圧パックは、適当な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、またはその他の適当なガスを含んでもよい。加圧エロゾルの場合、剤形単位は、定量を搬送するためのバルブを設けることによって定められる。噴霧器としては、米国特許第４，６２４，２５１号、３，７０３，１７３号、３，５６１，４４４号、および４，６３５，６２７号に記載されるものが挙げられるが、ただしそれらに限定されない。本出願に開示されるタイプのエロゾル搬送システムは、多くの供給業者、例えば、Ｆｉｓｏｎｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、マサチューセッツ州）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐ．（Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，ニュージャージー州）、およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍｏｓｅａｌ Ｃｏ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ、カリフォルニア州）を含む業者から入手が可能である。鼻腔内投与の場合、本治療剤は、点鼻器、液体噴霧器、例えば、プラスチック瓶噴霧器または定量吸入器を用いて投与してもよい。噴霧器の典型的なものはＭｉｓｔｏｍｅｔｅｒ（Ｗｉｎｔｒｏｐ）およびＭｅｄｉｈａｌｅｒ（Ｒｉｋｅｒ）である。
さらに、活性成分も、前述の病態の治療のためであれ、その他の病態の治療のためであれ、他の治療剤、例えば、鎮痛剤、抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、気管支拡張剤等と組み合わせて使用してもよい。
（キット）
本発明はさらに、パックされた製薬組成物、例えば、病気をコントロール、予防、または治療するためのキットまたはその他の容器に関する。キットまたは容器は、病気をコントロールするための製薬組成物の有効量、および、その、病気をコントロールするための製薬組成物を使用するための指示事項を収容する。製薬組成物は、本発明の少なくとも１種の結合実体、または抗体を、病気をコントロール、予防、または治療することが可能となるよう、治療的有効量として含む。
一つの実施態様では、キットは、コレステロールのオゾン化産物に特異的に結合する抗体を含む容器を含む。抗体は、直接、または間接的に連結される治療剤を有する。抗体はまた、液体、粉体、または、その他の、動物に簡単に投与される形態において供給される。
別の実施態様では、本発明は、病気がコントロール、予防、または治療されるように、治療的有効量の、少なくとも１種の細胞傷害性コレステロールオゾン化産物を含む製薬組成物を提供する。コレステロールオゾン化産物を有するこのキットは、例えば、好ましくない細胞タイプを抑制、または殺戮するための細胞毒素として使用することが可能である。
本発明の別の実施態様では、キットは、コレステロールの細胞傷害性オゾン化産物と接合する結合実体を含むことも考えられる。このキットは、自己免疫疾患、癌、腫瘍、細菌感染、ウィルス感染、潰瘍および／または、細胞毒素の局所投与が有益な結果を生むその他の疾病に苦しむ患者を治療するのに使用が可能と考えられる。この結合実体−細胞毒素接合体は、患者に注入投与するのに好適な剤形で供給されるならばそれは好ましいと考えられる。上記から、キットは、適当な製薬賦形剤に懸濁させた場合のような、懸濁液として結合実体−細胞毒素接合体を含むものであってもよい。別に、接合体は、再構成するのに好適な固体形であってもよい。
本発明のキットは、本発明の組成物を投与するのに有用なツールを備えた容器を含んでいてもよい。そのようなツールとしては、注射筒、スワッブ、カテーテル、無菌液等が挙げられる。
下記の実施例は、本発明を具体的に説明するもので、限定するものではない。上述したように本発明ついては数多くの変種および修飾を、本発明の精神や範囲から逸脱することなく実現することが可能である。
（実施例１：材料および方法）
アテローム硬化動脈標本の手術による分離および操作。組織サンプルを、頚動脈内視鏡切除術によって得た。サンプルは、アテローム硬化プラークと、若干の内皮および中膜の付着物を含んでいた。プラーク分析のプロトコールは、Ｓｃｒｉｐｐｓ臨床ヒト被験者委員会の承認を得、手術前に患者の承認を得た。新鮮な頚動脈内視鏡摘出組織は、手術による除去後３０分以内に分析した。プラーク標本は、保存も、防腐処置もしていないことに注意されたい。全ての分析操作は、外科的切除後２時間以内に完了した。標本には固定液を加えなかった。
ヒトアテローム硬化動脈標本によるインディゴカルミンの酸化。前述のように分離した動脈内視鏡摘出組織（ｎ＝１５）を、ほぼ等しい湿重量（±５％）の二つのセクションに分割した。各標本を、インディゴカルミン１（２００μＭ、Ａｌｄｒｉｃｈ）とウシカタラーゼ（１００μｇ）を含むリン酸バッファー生食液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、１．８ｍＬ）に移した。インディゴカルミン１は、オゾンを捕捉するための化学的トラップとなるように加えた。Ｔａｋｅｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ２３０，１８３（１９９０）；Ｔａｋｅｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６１，６１９（１９８９）。ミリスチン酸フォルバル（ＰＭＡ、４０μｇを０．２ｍＬのＤＭＳＯに溶解したもの）、またはＤＭＳＯ（０．２ｍＬ）を、タンパク質キナーゼＣの活性化因子として加えた。各サンプルを、組織ホモジェナイザーにより１０分間ホモジェナイズし、次に遠心した（１０，０００ｒｐｍで１０分）。上清を傾斜法により取り出し、フィルター（０．２μｍ）を通過させ、ろ液を、定量的ＨＰＬＣを用いてイサチンスルフォン酸２の有無について分析した。
図１Ｂに示すように、インディゴカルミン１による可視的吸収は漂白され、反応は、新規の化学的分子種を生じ、これは、定量的ＨＰＬＣによって検出され（表１）、イサチンスルフォン酸と特定された（図１Ａも参照）。
イサチンスルフォン酸２定量のためのＨＰＬＣアッセイ。ＨＰＬＣ分析を、Ｌ−７２００自動サンプラー、Ｌ−７１００ポンプ、およびＬ−７４００ｕ．ｖ．検出器（２５４ｎｍ）を備えたＨｉｔａｃｈｉＤ−７０００装置を用いて実行した。Ｌ−７１００は、Ｄｅｌｌ ＧＸ１５０ＰＣコンピュータにおいてＨｉｔａｃｈｉ−ＨＳＭソフトウェアを用いて制御した。ＬＣ条件は、Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ ＲＰ−Ｃ１８カラム、および、アセトニトリル：水（０．１％ＴＦＡ）（８０：２０）移動相１．２ｍＬ／分であった。イサチンスルフォン酸２は、約９．４分の保持時間ＲＴを持っていた。定量化は、マッキントッシュ用のＧｒａｐｈＰａｄ ｖ３．０ソフトウェアを用い、真正サンプルのピーク面積対濃度の標準曲線に対してピーク面積を比較して行った（表１）。
（表１）
（活性化アテローム硬化動脈材料によって形成されるイサチンスルフォン酸（ＩＳＡ）
Figure 2007504244
 Ｈ２ １８Ｏにおけるヒトアテローム硬化動脈標本によるインディゴカルミン１の酸化。本実験は、下記の例外を除き、前述のインディゴカルミン定量と同様に行った。先ず、各プラーク標本（ｎ＝２）を、９５％を超えるＨ２ １８Ｏのリン酸バッファー（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）に加えた。第二に、ろ液はＰＤ１０カラムで脱塩し、Ｆｉｎｎｅｇａｎエレクトロスプレイ質量分析器を用い陰性エレクトロスプレイ質量分析によって分析した。生のイオン量データをＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ３．０フォーマットに抽出し表示した。
この実験から、プラーク物質とＨ２ １８Ｏ（＞９５％１８Ｏ）の存在下では、１８Ｏ同位元素は、イサチンスルフォン酸２のラクタムカルボニルの中に取り込まれることが示された。オゾンのみが、インディゴカルミン１の二重結合を酸化的に分断して、イサチンスルフォン酸２のラクタムカルボニルに対する、Ｈ２ １８Ｏからの同位元素の取り込みを増進することができると考えられるので、恐らくオゾンが、インディゴカルミン１を酸化する反応性酸素分子種であったと思われる。かくして、オゾンが、アテローム硬化プラークの内部に生成される。また、Ｗｅｎｔｈｗｏｒｔｈ Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９８，２１９５（２００２）；Ｂ．Ｍ．Ｂａｂｉｏｒ，Ｃ．Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｊ．Ｒｕｅｄｉ，Ａ．Ｇｕｉｔｉｅｒｒｅｚ，Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ Ｊｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，３９２０（２００３）；Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，１４９０（２００３）も参照されたい。
アテローム硬化動脈標本におけるアルデヒド抽出および誘導体形成過程。前述のように分離した動脈内視鏡摘出標本を、ほぼ等しい湿重量（±５％）の二つのセクションに分割した。各標本を、ウシカタラーゼ（１００μｇ）と、フォルボルミリスチン酸（４０μｇを０．２ｍＬのＤＭＳＯに溶解したもの）かＤＭＳＯ（０．２ｍＬ）のどちらかを含むリン酸バッファー生食液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、１．８ｍＬ）に移した。各サンプルを、組織ホモジェナイザーにより１０分間ホモジェナイズした。次に、前述のように分離した、ホモジェナイズした動脈内視鏡摘出サンプルをジクロロメタン（ＤＣＭ、３×５ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機相を減圧留去した。残渣をエタノール（０．９ｍＬ）に溶解し、２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（１００μＬ、２ｍＭ、および１Ｎ ＨＣｌ）のエタノール液を加えた。溶液を通じて窒素を５分間バブルさせ、次に、溶液を２時間攪拌した。得られた懸濁液を０．２２μｍフィルターにてろ過し、ろ液をＨＰＬＣアッセイによって分析した。下記参照。コレステロール３（１−２０μＭ）をこの条件下で処理すると、４ａまたは５ａは形成されなかった。ＰＭＡ添加前後におけるアテローム硬化動脈抽出物に検出される４ｂの量を、動脈抽出物における４ａレベルに対するＰＭＡ添加の有意性を定めるために（ｐ＜０．０５を有意と判断した）、スチューデントの両側ｔ−検定を行い、マッキントッシュ用Ｇｒａｐｈｐａｄ ｖ３．０ソフトウェアによって決めた。
この条件下での４ａの誘導体形成の間、４ａの濃度範囲（５から１００μＭ）において、４ａの約２０％が５ｂに変換された。このデータは、５ａの測定量が、同じプラークサンプルに存在する４ａの２０％を超えており、これは、３のオゾンによる分解後のアルドール形成によって生じたものであることを示す。用いた誘導体形成条件下において４ａが６ｂに変換される度合いは、４ａの濃度範囲（５から１００μＭ）において一貫して＜２％であった。これらの所見は、プラーク抽出物中に存在し、ケトアルデヒド４ａの量の２％を越える６ａの量が、誘導体形成前に存在していたものであり、オゾン分解産物４ａから水のβ−除去によって生じたものであることを示す。
いくつかのプラーク抽出物において、主な三つのヒドラゾン産物４ｂ−６ｂの他に、７ａのヒドラゾン誘導体（７ｂと呼ばれる）が痕跡量（＜５ｐｍｏｌ／ｍｇ）検出された（ＲＴ約２６分、［Ｍ−Ｈ］−５７９、ＳＯＭ、図２と４）。化合物７ａは、５ａのＡ環脱水産物である。誘導体形成後のプラーク抽出物中の７ｂの量は、用いたＨＰＬＣアッセイの検出限界に近づいたので、プラークサンプル全てについてこの化合物を完全に分析調査することはしなかった。化合物７ａと７ｂの形状割り当ては、真正の合成物質７ｂを用いた１Ｈ−１Ｈ ＲＯＳＥＹ実験に基づく。
Figure 2007504244
Figure 2007504244
 図４におけるＲＴ約２６分ピーク［Ｍ−Ｈ］−５７９を有する化合物を特定するために、化合物６ｂ、７ａ、７ｂ、８ａ、および９ａの合成調製物を用いた。
ヒドラゾンのＨＰＬＣ−ＭＳ分析。ＨＰＬＣ−ＭＳ分析を、Ｌ−７２００自動サンプラー（規則的注入量１０μｌ）、Ｌ−７１００ポンプ、およびＬ−７４００ｕ．ｖ．検出器（３６０ｎｍ）またはＬ−７４５５ダイオードアレイ検出器（２００−４００ｎｍ）を備えたＨｉｔａｃｈｉＤ−７０００装置、および、直列接続Ｍ−８０００イオン捕捉質量分析装置（陰性イオンモード）を用いて実行した。Ｌ−７１００およびＭ−８０００は、Ｄｅｌｌ ＧＸ１５０ＰＣコンピュータにおいてＨｉｔａｃｈｉ−ＨＳＭソフトウェアを用いて制御した。ＨＰＬＣは、Ｖｙｄｅｃ Ｃ１８逆相カラムを用いて実行した。イソクラチック移動相（７５％アセトニトリル、２０％メタノール、および５％水）を０．５ｍＬ／分で用いた。ピーク高および面積は、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｄ７０００クロマトグラフィーステーション・ソフトウェアを用いて求め、真正物質の標準曲線との比較から濃度に変換した。上記条件下では、ヒドラゾン４ｂ−６ｂの検出限界は１−１０ｎＭの間にあった。このＨＰＬＣシステムでは、シスとトランスヒドラゾン異性体の分解は得られなかった。
抽出されて誘導体形成したアテローム硬化物質の代表的ＨＰＬＣ−ＭＳを図４に示す。重要なヒドラゾン化合物についていくつかの真性サンプルの保持時間および質量比を表２に示す。
（表２：真正ヒドラゾンのＬＣＭＳ分析）
Figure 2007504244
 ａ真正アルデヒド８ａのヒドラゾンは、前述の誘導体形成過程によって調製したが、アルデヒド８ａは独立に合成、精製しなかった。ｂ市販のケトン９ａのヒドラゾンは、前述の誘導体形成過程によって調製したが、独立に合成、精製しなかった。ｃ真正アルデヒド１０ａのヒドラゾンは、前述の誘導体形成過程によって調製したが、独立に合成、精製しなかった。ｄ８ｂと９ｂの区別は、それぞれのｕ．ｖ．スペクトラムに基づいて行った［Ｈｉｔａｃｈｉ Ｌ−７４５５ダイオードアレイ検出器（２００−４００ｎｍ）にて測定］。α、β−不飽和ヒドラゾン８ｂは４３５ｎｍのλｍａｘを有するが、一方、ヒドラゾン９ｂは４１６ｎｍのλｍａｘを有する。
アルデヒド４ａおよび５ａに関する血漿サンプルの分析。２４時間以内に頚動脈内視鏡切除術を受ける予定の患者（ｎ＝８）から血漿サンプルを得た。これらの血漿サンプル全てについて、サンプル採取後３日目に４ａおよび５ａの有無について分析した。コントロールサンプルは、一般内科クリニックに通院するランダムな患者（ｎ＝１５）から得、採取後７日目に分析した。典型的な処置では、ＥＤＴＡ（１ｍｌ）に入れた血漿をジクロロメタン（ＤＣＭ、３×１ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機相を減圧留去した。残渣をメタノール（０．９ｍＬ）に溶解し、２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（１００μＬ、０．０１Ｍ、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ）および１Ｎ ＨＣｌのエタノール溶液を加えた。溶液を通じて窒素を５分間バブルさせ、次に、溶液を２時間攪拌した。得られた懸濁液を０．２２μｍフィルターにてろ過し、ろ液を前述のようにＨＰＬＣアッセイによって分析した。予備実験から、血漿から抽出される５ａの量は、１日につき約５％減少することが明らかになった。
真正サンプル４ａ、４ｂ、５ａ、５ｂ、６ａ、６ｂ、７ａ、７ｂ、８ａ、および８ｂの調製。一般的方法。別様に明言しない限り、全ての反応は、不活性雰囲気下、乾燥試薬、溶媒、および炎乾燥ガラス器具を用いて行った。開始物質は全て、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｉｇｍａ、Ｆｉｓｈｅｒ、またはＬａｎｃａｓｔｅｒから購入し、受け入れたままの状態で使用した。ケトン９ａはＡｌｄｒｉｃｈから入手した。フラッシュカラムクロマトグラフィーは全てシリカゲル（２３０−４００メッシュ）を用いて行った。準備段階の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、Ｍｅｒｃｋ（０．２５、０．５、または１ｍｍ）の被覆シリカゲルＫｉｅｓｅｌｇｅｌ６０Ｆ２５４プレートを用いて行った。１Ｈ ＮＭＲスペクトラムは、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＭＸ−６００（６００ＭＨｚ）、ＡＭＸ−５００（５００ＭＨｚ）、ＡＭＸ−４００（４００ＭＨｚ）、またはＡＣ−２５０（２５０ＭＨｚ）スペクトロメーターにて記録した。１３Ｃ ＮＭＲスペクトラムは、ＡＭＸ−５００（１２５．７ＭＨｚ）、またはＡＭＸ−４００（１００．６ＭＨｚ）にて記録した。化学シフトは、内部標準からのδスケールにおいて百万分のいくつ（ｐｐｍ）で表した。高解像度質量分析スペクトラムは、ＶＧ ＺＡＢ−ＶＳＥ装置にて記録した。
３β−ヒドロキシ−５−オキソ−５，６−セココレスタン−６−アル（４ａ）。
本化合物は、Ｋ．Ｗａｎｇ，Ｅ．Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，Ｗ．Ａ．Ｐｒｙｏｒ，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ５８，２２５（１９９３）に概説されている通りに合成した。コレステロール３（１ｇ、２．６ｍｍｏｌ）の、クロロフォルム−メタノール（９：１）（１００ｍｌ）溶液を、ドライアイス温度で１０分オゾン化した。反応混合液を蒸発させ、水−酢酸（１：９、５０ｍｌ）においてＺｎ粉末（６５０ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）により室温で３時間攪拌した。この還元混合物を、ジクロロメタン（１００ｍｌ）で希釈し、水で洗浄した（３×５０ｍｌ）。合わせた有機分画を硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー［酢酸エチル−ヘキサン（２５：７５）］にて精製したところ、標記の化合物４ａが白色の固体（８２０ｍｇ、７６％）として得られた：
Figure 2007504244
 。
３β−ヒドロキシ−５−オキソ−５，６−セココレスタン−６−アルの２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン（４ｂ）。本化合物は、Ｋ．Ｗａｎｇ，Ｅ．Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，Ｗ．Ａ．Ｐｒｙｏｒ，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ５８，２２５（１９９３）に概説されている通りに合成した。２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（５２ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルフォン酸（１ｍｇ、０．００５２ｍｍｏｌ）を、ケトアルデヒド４ａ（１００ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１０ｍｌ）溶液に加えた。この反応混合液を室温で４時間攪拌し、減圧留去した。残渣を酢酸エチル（１０ｍｌ）に溶解し、水（３×２０ｍｌ）で洗浄した。合わせた有機分画を硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー［酢酸エチル−ヘキサン（１：４）］にて精製したところ、標記の化合物４ｂが黄色の固体（１００ｍｇ、７０％）で、シスとトランス異性体の混合物（１：４）として得られた。ヘキサン−塩化メチレンで結晶化させたところ、トランス４ｂが黄色針状結晶として得られた（３０ｍｇ、２１％）：
Figure 2007504244
 。
３β−ヒドロキシ−５β−ヒドロキシ−Ｂ−ノルコレスタン−６β−カルボキサルデヒド（５ａ） 本化合物は、Ｔ．Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｋｏｄａｍａ，Ｙ．Ａｒａｍａｋｉ，Ｒ．Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．Ｗ．Ｍ．Ｖａｎ Ｓｏｅｓｔ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒ４２，６３４９（２００１）に概説されている通りに合成した。ケトアルデヒド４ａ（８００ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）のアセトニトリル−水（２０：１，１００ｍｌ）溶液に、Ｌ−プロリン（２２０ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合液を室温で２時間攪拌し、減圧留去した。残渣を酢酸エチル（５０ｍｌ）に溶解し、水（３×５０ｍｌ）で洗浄した。合わせた有機分画を硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー［酢酸エチル−ヘキサン（１：４）］にて精製したところ、標記の化合物５ａが白色の固体（５８０ｍｇ、７３％）として得られた：
Figure 2007504244
 。
３β−ヒドロキシ−５β−ヒドロキシ−Ｂ−ノルコレスタン−６β−カルボキサルデヒドの２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン（５ｂ）。本化合物は、Ｋ．Ｗａｎｇ，Ｅ．Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，Ｗ．Ａ．Ｐｒｙｏｒ，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ５８，２２５（１９９３）に概説されている通りに合成した。２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（５２ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）および塩酸（１２Ｍ、２滴）を、アルデヒド５ａ（１００ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１０ｍｌ）溶液に加えた。この反応混合液を室温で４時間攪拌し、減圧留去した。残渣を酢酸エチル（１０ｍｌ）に溶解し、水（３×２０ｍｌ）で洗浄した。合わせた有機分画を硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー［酢酸エチル−ヘキサン（１：４）］にて精製したところ、標記の化合物５ｂが黄色の固体（９０ｍｇ、６２％）、トランス−５ｂフェニルヒドラゾンとして得られた：
Figure 2007504244
 。
５−オキソ−５，６−セココレスト−３−エン−６−アル（６ａ）。本化合物は、Ｐ．Ｙａｔｅｓ，Ｓ．Ｓｔｉｖｅｅｒ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．６６，１２０９（１９８８）に概説されている通りに合成した。メタンスルフォニルクロリド（４００μｌ、２．８７ｍｍｏｌ）を、攪拌中の、ケトアルデヒド４ａ（３００ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（６５μｌ，０．８４ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍｌ）溶液に氷浴の温度で滴下した。得られた溶液を、０℃でアルゴン中で３０分攪拌し、トリエチルアミン（４００μｌ、２．８７ｍｍｏｌ）を加え、混合液を室温に温めた。２時間後、反応混合液を減圧留去した。残渣を塩化メチレン（１５ｍｌ）に溶解し、水で洗浄した。合わせた有機分画を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し減圧留去した。未精製残渣をシリカゲルクロマトグラフィー［酢酸エチル−ヘキサン（１：９）］にて精製した。分画を蒸発させたところ、アルデヒド６ａが無色の油状物（１５３ｍｇ、５３％）として得られた：
Figure 2007504244
 。
５−オキソ−５，６−セココレスト−３−エン−６−アルの２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン（６ｂ）。２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（４５ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を、ケトアルデヒド６ａ（８０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルフォン酸（１ｍｇ、０．００５２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１０ｍｌ）溶液に加えた。この反応混合液を室温で２時間攪拌し、減圧留去した。残渣を塩化メチレン（１０ｍｌ）に溶解し、水（３×２０ｍｌ）で洗浄した。合わせた有機分画を硫酸ナトリウム上で乾燥し減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー［酢酸エチル−ヘキサン（１５：８５）］にて精製したところ、標記の化合物６ｂが黄色固体（７０ｍｇ、６０％）として得られた：
Figure 2007504244
 。
５β−ヒドロキシ−Ｂ−ノルコレスト−３−エン−６β−カルボキサルデヒド（７ａ）。本化合物は、Ｐ．Ｙａｔｅｓ，Ｓ．Ｓｔｉｖｅｅｒ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．６６，１２０９（１９８８）に概説されている通りに合成した。ナトリウムメトキシドのメタノール液（０．５Ｍ、０．１６ｍｍｏｌ）を、ケトアルデヒド４ａ（５０ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）の無水メタノール（１０ｍｌ）溶液にアルゴン雰囲気下室温で滴下した。３０分後、メタノールを減圧除去し、残渣をジクロロメタン（２０ｍｌ）に溶解し、水（３×２０ｍｌ）で洗浄した。合わせた有機分画を硫酸ナトリウム上で乾燥し減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー［酢酸エチル−ヘキサン（１：９）］にて精製したところ、標記のアルデヒド７ａが無色の油状物（１６ｍｇ、３２％）として得られた：
Figure 2007504244
 。
５β−ヒドロキシ−Ｂ−ノルコレスト−３−エン−６β−カルボキサルデヒドの２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン（７ｂ）。２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（８ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルフォン酸（１ｍｇ、５．２μｍｏｌ）を、アルデヒド７ａ（１５ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（５ｍｌ）溶液に加えた。この反応混合液を室温で２時間攪拌し、減圧留去し、塩化メチレン（１０ｍｌ）で希釈した。有機相を水（３×２０ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発乾固した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー［酢酸エチル−ヘキサン（１：９）］にて精製したところ、ヒドラゾン７ｂが黄色固体（９ｍｇ、４１％）として得られた：
Figure 2007504244
 。
３β−ヒドロキシ−Ｂ−ノルコレスト−５−エン−６−カルボキサルデヒド（８ａ）。アルデヒド５ａ（５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）とリン酸（８５％、５ｍｌ）のアセトニトリル−塩化メチレン（１：１、４ｍｌ）溶液を、環流しながら３０分加熱した。この反応混合液を減圧留去し、塩化メチレン（５０ｍｌ）で希釈し、水（３×２０ｍｌ）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧留去した。残渣を、酢酸エチル−ヘキサン（１：４）を含むシリカゲルによる液体クロマトグラフィーにて精製したところ、α，β−不飽和アルデヒド８ａから成る標記のアルデヒド１２ｍｇ（２５％）が得られた。８ａの１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）は、
Figure 2007504244
 。
Ｂ−ノルコレスト−３，５−ジエン−６−カルボキサルデヒド１２ａ、白色固体（２７ｍｇ、６０％）が、この反応の副産物として得られた：
Figure 2007504244
Figure 2007504244
 。
アミノ酸によるケトアルデヒド４ａのアルドール化。典型的な過程では、ケトアルデヒド４ａ（２ｍｇ、４．８μｍｏｌ）を、１本のＮＭＲ管においてＤＭＳＯ−ｄ６（８００μｌ）とＤ２Ｏ（８０μｌ）に溶解した。この溶液に、ａ）Ｌ−プロリン、ｂ）グリシン、ｃ）Ｌ−リシン塩酸、ｄ）Ｌ−リシンエチルエステルジクロリドの内のどれかの１当量を加えた。複数の時点で、サンプルを、１Ｈ ＮＭＲにて分析した。通例として、反応の後では、１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）におけるいくつかの共鳴点の変化を監視した：
Figure 2007504244
 。この条件下では、ＤＭＳＯ−ｄ６（８００μｌ）とＤ２Ｏ（８０μｌ）にはアルドール化は起こらない。
アテローム硬化動脈および血液分画によるセコケトアルデヒド４ａのアルドール化。典型的な過程では、ケトアルデヒド４ａ（５ｍｇ、０．００１２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ−ｄ６（８００μｌ）とＤ２Ｏ（８０μｌ）に溶解した。この溶液に、ａ）組織ホモジェナイザーによってＰＢＳ（１ｍｌ）にてホモジェナイズし、次に凍結乾燥したアテローム硬化動脈（２．１ｍｇ）、ｂ）凍結乾燥したヒト血液（１ｍｌ）、ｃ）凍結乾燥したヒト血漿（１ｍｌ）、ｄ）凍結乾燥したＰＢＳ（１ｍｌ）の内のどれかを加えた。複数の時点で、サンプルを取り出し、前述の通り１Ｈ ＮＭＲにて分析した。この条件下では、凍結乾燥ＰＢＳの存在下で４ａのアルドール化は起こらなかった。
（４ａおよび５ａによる生物学的研究）
体内でコレステロールの酸化によって生成されるオキステロールがいくつかこれまでに記載されている。Ｅ．Ｌｕｎｄ，Ｉ．Ｂｊｏｒｋｈｅｍ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２８，２４１（１９９５）。さらに、コレスタン側鎖のみが構造的に異なる５ａの類縁体が、天然の細胞傷害性産物を探る一般的スクリーニングの一部として、海綿Ｓｔｅｌｌｅｔｔａ ｈｉｗａｓａｅｎｓｉｓから分離された。Ｔ．Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｋｏｄａｍａ，Ｙ．Ａｒａｍａｋｉ，Ｒ．Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｖａｎ Ｓｏｅｓｔ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．４２，６３４９（２００１）；Ｂ．Ｌｉｕ，Ｚ．Ｗｅｉｓｈａｎ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．４３，４１８７（２００２）。しかしながら、ステロール４ａおよび５ａのように、ステロイド核が破壊された誘導体はこれまで報告されていない。
細胞傷害性アッセイ。ＷＩ−Ｌ２ヒトＢ−リンパ球、ＨＡＡＥ−１ヒト腹大動脈内皮細胞系統、ＭＨ−Ｓラット肺胞マクロファージ細胞系統、およびＪ７７４Ａ．１ラット組織マクロファージ細胞系統を、ＡＴＣＣより入手した。ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）およびヒト血管平滑筋細胞（ＶＳＭＳ）を、Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅから入手した。Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６−１Ｔ−リンパ球は、Ｊ．Ｋａｙｅ博士（スクリップス研究所）から恵与された。細胞は、１０％仔牛血清を含む、ＡＴＣＣ推奨培養液中で培養した。細胞は、３７℃で、５または７％ＣＯ２を含む調節雰囲気下でインキュベートした。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイのために、接着細胞を、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡの添加によって、または掻き落とすことによって収集した。得られた細胞を、９６ウェルマイクロタイター・プレート（ウェル当たり２５，０００細胞）に撒き、２４−４８時間回復させた。細胞を穏やかに洗浄し、培養液を、５％仔牛血清を含む新鮮培養液と交換した。二点測定以上の細胞サンプルを、３、４ａ、または５ａ（０−１００μＭ）で１８時間処理した。次に、細胞傷害性を、培養細胞から放出される乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を測定することによって定量した。簡単に言うと、ケトアルデヒド４ａ、アルドール５ａ、またはコレステロール３のいずれかによる処理期間の終了時に、９６ウェルプレートの培養細胞について、細胞上清におけるＬＤＨ活性を、ＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，米国）にて測定した。１００％細胞傷害性は、トリパンブルー排出によって示される死亡細胞によって放出されるＬＤＨの最大量、または細胞の分解時０．９％トリトンＸ−１００によって検出されるＬＤＨの最大量と定義された。ＩＣ５０値は、濃度対細胞傷害性（％）に関する生の二点測定のデータを、マッキントッシュ用Ｇｒａｐｈｐａｄ ｖ３．０ソフトウェアを用いて非線形回帰分析（Ｈｉｌｌプロット）と比較することによって求めた。
脂質負荷アッセイ（泡沫細胞形成）。Ｊ７７４．１マクロファージは、１０％仔牛血清を含む、ＡＴＣＣ推奨培養液中で培養した。細胞は、８ウェルチェンバー・スライドにて、３７℃で、５または７％ＣＯ２を含む雰囲気調節下でインキュベートした。次に、細胞を、抗酸化剤２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノールトルエン（１００μＭ）、ジエチレントリアミン−ペンタ酢酸（１００μＭ）、および下記のいずれか、すなわちＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）、ＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）とアテロナール−Ａ ４ａ（２０μＭ）、または、ＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）とアテロナール−Ｂ ５ａ（２０μＭ）を含む同じ培養液にて７２時間インキュベートした。終了時、細胞を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４９にて２度洗浄した。次に、細胞を、ＰＢＳに溶解した６％（ｖ／ｖ）パラフォルムアルデヒドにて３０分固定し、プロピレングリコールにて２分濯ぎ、脂質を、５ｍｇ／ｍｌのオイルレッドＯにて８分染色した。細胞を、Ｈａｒｒｉｓのヘマトキシリンで４５秒カウンター染色し、背景染色を、６％パラフォルムアルデヒドにて除去し、その後ＰＢＳで１回洗浄し、水道水で１回洗浄した。スライドグラスにグリセロールでカバースリップを載せ、このスライド標本を光学顕微鏡観察によって調べた。各スライドの単一視野において数えられた合計少なくとも１００個の細胞について、脂質担持細胞の得点数を数え、細胞合計のパーセントとして表した。１００×倍率で写真を撮った。
円偏光二色性。ＰＢＳ（ｐＨ７．４，１％イソプロパノロールを含む）に溶解したＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）、ＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）と４ａ（１０μＭ）、および、ＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）と５ａ（１０μＭ）の円偏光二色性（ＣＤ）スペクトラムを、恒温調節（±０．１℃）の０．１ｃｍ石英キュベットにおいてＡｖｉｖ分光偏光計にて３７℃で記録した。信号対雑音比を向上させるために、各測定について複数のスペクトラム（３個）を平均した。各測定値におけるモル楕円スペクトラムの曲面解除は、デルパソコンにてＣＤＰｒｏ ｓｕｉｔｅソフトウェア（コロラド州立大学のＮａｒａｓｉｍｈａ Ｓｒｅｅｒａｍａによる）を用いて実行した。
（実施例２：アテローム硬化プラークはオゾンおよびコレステロールのオゾン分解産物を生成する）
前述の方法を用いて、本実施例は、１５名のヒト患者（ｎ＝１５）から頚動脈内視鏡摘出術で得たアテローム硬化組織が、インディゴカルミン１との反応によって検出可能なオゾンを生産することが可能であることを示す。
（アテローム硬化プラークによって生産されるオゾンによるインディゴカルミンの脱色）
本発明者等は、以前に、抗体被覆白血球を、タンパク質キナーゼＣ活性化因子、４−β−フォルボル１２−ミリスチン酸１３−アセテート（ＰＭＡ）で、インディゴカルミン１（オゾンを捕捉するための化学的トラップ）の溶液において処理すると、インディゴカルミン１の可視性吸収が脱色され、インディゴカルミン１がイサチンスルフォン酸２に変換されることを見出した。例えば、Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９８，２１９５（２００２）；Ｂ．Ｍ．Ｂａｂｉｏｒ，Ｃ．Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｊ．Ｒｕｅｄｉ，Ａ．Ｇｕｉｔｉｅｒｒｅｚ，Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ Ｊｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，３９２０（２００３）；Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，１４９０（２００３）を参照されたい。イサチンスルフォン酸の構造は図１Ａに示される。これらの実験を、Ｈ２ １８Ｏ（＞９５％１８Ｏ）で行った場合、イサチンスルフォン酸２のラクタムカルボニルへの同位元素の取り込みが観察された。上記参照。この過程は、オゾンと１Ｏ２＊とを、他の、同様にインディゴカルミン１を酸化する可能性のある酸化剤と区別する。なぜなら、炎症と関連すると考えられる酸化剤の中では、オゾンだけが、インディゴカルミン１の二重結合を酸化的に分断し、イサチンスルフォン酸２のラクタムカルボニルの中に同位元素（Ｈ２ １８Ｏ）を取り込ませるからである（上記および図１Ａ参照）。
実施例１で述べたように、プラーク物質を、問題のあるアテローム硬化症を抱えていると考えられる１５名のヒト患者から頚動脈内視鏡摘出術によって得た。各プラーク物質を二つの等しい部分（約５０ｍｇの湿重量で１ｍＬのＰＢＳに懸濁させたもの）に分割した。プラーク物質の各部分を、インディゴカルミン１（２００μＭ）とウシカタラーゼ（５０μｇ／ｍＬ）の、リン酸緩衝生食液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭリン酸バッファー、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）（１ｍＬ）溶液に加えた。分析は、ＤＭＳＯ（１０μＬ）またはフォルボルミリステート（ＰＭＡ、１０μＬ、２０μｇ／ｍＬ）のＤＭＳＯ溶液を、プラーク物質懸濁液のどちらか一方の分液に添加することで開始した。
１の可視吸収の脱色は、ＰＭＡ添加によって、１５個のプラークサンプルの内１４に観察された（図１Ｂ）。この脱色は、逆相ＨＰＬＣ分析で定められるように、イサチンスルフォン酸２の形成を伴っていた（図１ＡおよびＣ）。形成されるイサチンスルフォン酸２の量は、試験されるプラーク分離体によって１．０から２６２．１ｎｍｏｌ／ｍｇの範囲を変動した。様々な分離体によって生成されるイサチンスルフォン酸２の平均量は、７２．６２±２１．６９ｎｍｏｌ／ｍｇであった。
プラーク物質懸濁液のＰＭＡ活性化を、インディゴカルミン１（２００μＭ）を含む、Ｈ２ １８Ｏ含有ＰＢＳ（＞９５％１８Ｏ）（ｎ＝２）で実行すると、遊離分断産物であるイサチンスルフォン酸のマススペクトラムにおける［Ｍ−Ｈ］−２２８および２３０のマス断片ピークの相対的強度によって示されるように、インディゴカルミン１のラクタムカルボニル酸素の約４０％は１８Ｏを取り込んだ（図１Ｄ）。
インディゴカルミン１によるこの実験から、活性化アテローム硬化プラーク物質によってオゾンが生産されることが示された。
（コレステロールのオゾン分解産物）
アテローム硬化プラーク中に存在する主要脂質の一つはコレステロール３である。Ｄ．Ｍ．Ｓｍａｌｌ，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ８，１０３（１９８８）。化学モデル実験において、研究者達は、一組のオキシダント、例えば、３Ｏ２、１Ｏ２ ＊、・Ｏ２ −、Ｏ２ ２−、ヒドロキシルラジカル、Ｏ３と・Ｏ２ ＋、およびオゾンＯ３の内で、オゾンのみが、コレステロールのΔ５，６二重結合を分断して５，６−セコステロール４ａを生成することを示した（図２Ａ）。この所見は、他の化学的報告、すなわち、５，６−セコステロール４ａが、コレステロール３のオゾン分解の主要産物であることを示す報告と一致する。Ｇｕｍｕｌｋａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５，１９７２（１９８３）；Ｊａｗｏｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３，５４５（１９８８）；Ｐａｒｙｚｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１，１２２２（１９９０）；Ｃｏｒｎｆｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．５４，５９０（１９５３）。
従って、その後の実験は、５，６−セコステロール４ａ、またはコレステロールのその他のオゾン分解産物が、アテローム硬化プラークの中にあるかどうかを検出・特定する方向に向けられた。そのため、１４名の患者（ｎ＝１４）のヒトアテローム硬化プラークについて、ＰＭＡによる活性化の前後で５，６−セコステロール４ａの有無を求めた。
これらの実験には、Ｐｒｙｏｒと同僚達によって開発された分析法の変法を用いた。Ｋ．Ｗａｎｇ，Ｅ．Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，Ｗ．Ａ．Ｐｒｙｏｒ，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ５８，２２５（１９９３）を参照されたい。この変法は、ホモジェナイズしたプラーク物質（約５０ｍｇの湿重量）のＰＢＳ（１ｍＬ、ｐＨ７）懸濁液を有機溶媒（塩化メチレン、３×５ｍＬ）で抽出し、有機分画を、２，４−ジニトロフェニルヒドラジン塩酸（ＤＮＰＨ ＨＣｌ）（２ｍＭエタノール液、ｐＨ６．５）で室温で２時間処理する工程を包含する。この反応混合液を、ＨＰＬＣ（直接注入、３６０ｎｍにおけるｕ．ｖ．検出）および直接導入陰性イオンエレクトロスプレイ質量分析によって、４ｂ、すなわち、オゾン分解産物４ａの２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン誘導体の有無について分析した（図３）。ヒドラゾン４ｂは、１４個の不活性化プラーク抽出物の内１１個に（プラーク１ｍｇにつき６．８から６１．３ｐｍｏｌ／ｍｇ）、また、全ての活性化プラーク抽出物に検出された（１．４から２００．６ｐｍｏｌ／ｍｇ）。さらに、４ｂの量から判断される、プラーク物質における４ａの量は、ＰＭＡの活性化によって著明に増大した。特に、ＰＭＡを用いない場合、４ｂの平均量は１８．７±５．７ｐｍｏｌ／ｍｇであった。それとは対照的に、ＰＭＡを加えると、４ｂの平均量は４２．５±１３．６ｐｍｏｌ／ｍｇとなった（ｎ＝１４、ｐ＜０．０５）（図３Ａ−Ｂ）。
４ｂの他に、プラーク抽出物のＨＰＬＣ分析の際、さらに二つの大きなヒドラゾンピークが観察された。第１ピークは、ＲＴ〜２０．５分と［Ｍ−Ｈ］−５９７を持ち、第２ピークは、ＲＴ〜１８．０分と［Ｍ−Ｈ］−５７９を持っていた（図３Ａ，Ｂ）。ヒドラゾン４ｂは、これらのピークと簡単に区別することが可能である。なぜなら、４ｂは約１３．８分の保持時間（ＲＴ〜１３．８分と［Ｍ−Ｈ］−５９７を持っているからである（図３Ａ，Ｂ）。真正サンプルと比較することによって、ＲＴ〜２０．８分のピークは、アルドール縮合産物５ａのヒドラゾン誘導体５ｂであると判定された（図２および３Ｅ）。化学モデル実験において、Ｐｒｙｏｒは以前に、４ａのヒドラジン誘導体形成の主な副産物が、アルドール縮合産物５ａのヒドラゾン誘導体５ｂであり、その相対量は、酸の濃度と反応時間の両方の関数であることを述べていた。Ｋ．Ｗａｎｇ，Ｅ．Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，Ｗ．Ａ．Ｐｒｙｏｒ，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ５８，２２５（１９９３）。
用いた誘導体形成条件下における４ａの５ｂへ変換される度合いは、試験した４ａの濃度範囲（５から１００μＭ）において約２０％であった。しかしながら、２０％を超える変換もしばしば観察された。同じプラークサンプルに存在する４ａの２０％を越える５ａの測定値は、３がオゾン分解された後にアルドール化されたことによるものらしい。
アミノ基またはカルボン酸基を含む多くの生化学的成分がアルドール化反応を触媒するようである。そのような成分はプラークや血液にも存在し、４ａから５ａへの変換を促進するのかも知れない。その後の実験によって、下記のアミノ酸および物質も４ａから５ａへの変換を促進することが示されている。すなわち、Ｌ−Ｐｒｏ（２時間、完全な変換）、Ｇｌｙ（２４時間、完全変換）、Ｌ−Ｌｙｓ．ＨＣｌ（２４時間、完全変換）、Ｌ−Ｌｙｓ（ＯＥｔ）．２ＨＣｌ（１００時間、６２％変換）を始めとして、アテローム性動脈（２２時間、完全変換）、全血（１５時間、完全変換）、血漿（１５時間、完全変換）、および血清（１５時間、完全変換）からの抽出物である。これら介在因子は全て、背景反応速度に比べて、４ａから５ａへの変換を加速した。
前述したように、プラーク内のケトアルデヒド４ａの量は、ＰＫＡ活性化に応じて増加した。一方、ＰＭＡの５ａの形成に及ぼす作用はそれほど明瞭ではなかった。ある場合には、５ａのレベルはＰＭＡ活性化後増加したが（図５Ｂ、患者ＦとＨ）、別の場合では、５ａのレベルはＰＭＡ活性化後減少した（図５Ｂ，患者Ｃ、Ｇ、およびＮ）。
１８分［Ｍ−Ｈ］−５７９のピーク（図３Ａ，Ｂ）の特定を助けるため、いくつかのカルボニル含有ステロイド誘導体６ａ−９ａで、その２，４−ジフェニルヒドラゾン誘導体が、マススペクトラムにおいて［Ｍ−Ｈ］−５７９のピークを有する誘導体６ａ−９ａを合成して分析した。真性サンプルとのＨＰＬＣの共同注入、陰性エレクトロスプレイ質量分析、およびｕ．ｖ．スペクトラムの比較によって、〜１８分のピークは６ｂ、すなわち、６ａのヒドラゾン誘導体で、４ａのＡ環脱水産物であると判定された（図３Ｄ）。４ａから６ａへの変換の程度を、誘導体形成に選ばれた標準条件下において調べた。この変換程度は、試験した４ａの濃度範囲（５から１００μＭ）において一貫して２％未満であることが判明した。これらのデータから、プラーク抽出物中のケトアルデヒド４ａの量の２％を超えて存在する６ａの量は、誘導体形成前に存在していたものであり、水のβ−除去による４ａのオゾン分解産物から生じたものであることが示された。
３種の主要ヒドラゾン産物４ｂ−６ｂの他に、もう一つの産物７ｂが検出され、７ａのヒドラゾン誘導体であり、５ａのＡ環脱水産物であると判定された。この産物（７ｂ）は、いくつかのプラーク抽出物中に痕跡量（＜５ｐｍｏｌ／ｍｇ）存在し、約２６分（［Ｍ−Ｈ］−５７９、図４）の保持時間を持っていた。一方、プラーク抽出物における７ｂの量は、用いたＨＰＬＣアッセイの検出限界に近く、全てのプラークサンプルにおけるこの化合物の有無に関する調査はまだ実行されていない。
活性化プラーク物質は、化学的名称がオゾンという物体によってインディゴカルミン１の二重結合を酸化的に分断すること、および、コレステロールのΔ５，６−二重結合は、既知の化学によれば、オゾン独特の経路を通じて分断されるという実験的証拠から、アテローム硬化プラークはオゾンを生成することが可能であるという結論がどうしても導かれる。さらに、コレステロールの、これらの独特のオゾン酸化産物は、プラーク活性化前にも存在するのであるから、オゾンは、アテローム硬化プラークの発達中にも生成されることになる。
外から投与されたオゾンは、生体内においても、インターロイキン（ＩＬ）−１α、ＩＬ−８、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、血小板凝集因子（ＰＡＦ）、増殖関連癌遺伝子（Ｇｒｏ）−α、核因子（ＮＦ）−κＢ、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αの活性化を通じて炎症を促進することはよく確かめられている。炎症におけるオゾンの、これらの一般的に知られている作用の他に、オゾンが、プラーク部位に生産された場合、この内因的に生成されたオゾンが、この疾病の発症および慢性化を促進する病理的役割をさらに増進するような、アテローム硬化プラーク独特の状況がある。コレステロールのオゾン分解は、プラーク独特のものかも知れない。なぜなら、必要な高濃度のオゾンとコレステロールが、発生したオゾンを捕捉することのできる、他の反応物質が何も無い所で出会うのはこの場所しか無いからである。
アテローム硬化動脈が、抗体および１Ｏ２ ＊生成システムを、活性化マクロファージおよびミエロペルオキシダーゼという形で含む限り、アテローム硬化病変が、抗体触媒水−酸化経路を通じてＯ３を生成することは可能であると考えられる。実際、３のΔ５，６−二重結合が分断されて４ａを生じるという所見は、炎症中に抗体触媒によってオゾンが生産されることを裏付けるさらなる証拠である。生体内において、コレステロールの酸化によって多くのオキシステロールが生成されることが知られており、かつ、海綿Ｓｔｅｌｌｅｔｔａ ｈｉｗａｓａｅｎｓｉｓから、構造的にコレステタン側鎖においてのみ異なる５ａの類縁体が、細胞傷害性天然産物に対する全身性スクリーンの一部として分離されている。Ｔ．Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｋｏｄａｍａ，Ａｒａｍａｋｉ，Ｒ．Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．Ｗ．Ｍ．Ｖａｎ Ｓｏｅｓｔ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒ４２，６３４９（２００１）；Ｂ．Ｌｉｕ，Ｚ．Ｗｅｉｓｈａｎ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．４３，４１８７（２００２）。一方、ステロール４ａ−６ａのように、ステロイド核が破壊された誘導体は、我々の知る限り、ヒトでは報告されていない。従って、このような他のステロイドおよびその誘導体を探索し、それらの生物学的機能を調べることが重要である。
（実施例３：コレステロールオゾン分解産物はアテローム硬化症患者の血流に存在する）
本発明者は、以前に、オゾンが、水−酸化経路が抗体触媒される際に生成されること、および、強力な酸化剤であるオゾンが炎症に関与する可能性があることを示した。Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９８，２１９５（２００２）；Ｂ．Ｍ．Ｂａｂｉｏｒ，Ｃ．Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｊ．Ｒｕｅｄｉ，Ａ．Ｇｕｉｔｉｅｒｒｅｚ，Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ Ｊｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，３９２０（２００３）；Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，１４９０（２００３）。
炎症は、アテローム硬化症の病態発生の一因子と考えられている。Ｒ．Ｒｏｓｓ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４０，１１５（１９９９）；Ｇ．Ｋ．Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｐ．Ｌｉｂｂｙ，Ｕ．Ｓｃｈｏｅｎｂｅｃｋ，Ｚ．−Ｑ．Ｙａｎ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９１，２８１（２００２）。しかしながら、本発明前には、炎症性動脈疾患を、その他の炎症過程と区別することを可能とする、特異的、非侵襲的方法は無かった。アテローム硬化プラーク独特の組成物、および、アテローム硬化プラーク物質によって血中に放出される産物が、そのような方法を提供するかも知れない。特に、アテローム硬化病変は、高濃度のコレステロールを含む。本出願に示すように、オゾンがアテローム硬化病変によって生成され、４ａ、および／またはそのアルドール産物である５ａのようなコレステロールのオゾン分解産物も、アテローム硬化病変によって生成される。このため、このようなコレステロールオゾン分解産物が、アテローム硬化症のような炎症性動脈疾患のマーカーとなり得るかどうかを確かめるためにさらに実験を行った。
二つの患者コホートから得られた血漿サンプルを、４ａまたは５ａの有無について分析した。コホートＡは、そのアテローム硬化疾患が、動脈内視鏡摘出を必要とするほどに進んだ病態を呈する患者（ｎ＝８）から成っていた。コホートＢは、一般内科クリニックに通院する患者からランダムに選択された患者であった。コホートＡの８名の患者の内６名に、アルドール５ａが検出され、その量は７０−１６９０ｎＭの範囲に渡っていた（〜１−１０ｎＭがアッセイの検出限界である）（図５Ａ−Ｃ）。コホートＢから得られた１５個の血漿サンプルの内ただ一つにおいてのみ、５ａが検出可能であった。ケトアルデヒド４ａは、どの患者の血液サンプルにおいても検出されなかった（〜１−１０ｎＭがアッセイの検出限界である）。これらのデータは、４ａは、血液中に含まれる触媒によって５ａに変換されたのか、または、血漿内成分は、４ａおよび５ａに対して差動親和性を有することを示す。
以前は、「オキシステロール」の血清分析は、コレステロールの自己酸化の問題のために困難があった。Ｈ．Ｈｉｅｔｔｅｒ，Ｐ．Ｂｉｓｈｏｆｆ，Ｊ．Ｐ．Ｂｅｃｋ，Ｇ．Ｏｕｒｉｓｓｏｎ，Ｂ．Ｌｕｕ，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．９，７５（１９８６）。しかしながら、本出願に記載するように、コレステロール３の生物学的関連の酸化によって生成される、全てのコレステロールオゾン化産物の中で、ステロイド誘導体４ａおよび５ａはオゾン特異的である。これらの研究は、血漿中のアルドール化産物５ａの存在は、これは、そのＤＮＰヒドラゾン誘導体５ｂとして検出されるが、アテローム硬化症における発達した動脈炎症を示すマーカーとなり得ることを示す。従って、抗体触媒によるオゾン生成は、動脈硬化症に至る病理学的カスケード反応へと導くコレステロール蓄積、炎症、酸化、および細胞傷害という、他の立場から見ると一見無関係な因子を連結するものとなるかも知れない。
いくつかの研究から、コレステロールの酸化産物は、細胞傷害性、アテローム病原性、および突然変異原性のような生物学的活性を有することが示されている。Ｈ．Ｈｉｅｔｔｅｒ，Ｐ．Ｂｉｓｈｏｆｆ，Ｊ．Ｐ．Ｂｅｃｋ，Ｇ．Ｏｕｒｉｓｓｏｎ，Ｂ．Ｌｕｕ，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．９，７５（１９８６）；Ｊ．Ｌ．Ｌｏｒｅｎｓｏ，Ｍ．Ａｌｌｏｒｉｏ，Ｆ．Ｂｅｒｎｉｎｉ，Ａ．Ｃｏｒｓｉｎｉ，Ｒ．Ｆｕｍａｇａｌｌｉ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１８，７７（１９８７）；Ａ．Ｓｅｖａｎｉａｎ，Ａ．Ｒ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，４１９８（１９８４）。コレステロールの酸化産物４ａおよび５ａはこれまでヒトでは見られないと考えられていたので、これらの化合物の、アテローム硬化症の鍵となる重要な局面に対する作用を下記に述べるようにさらに調べた。
（実施例４：コレステロールのオゾン分解産物の細胞傷害性）
コレステロールのいくつかの酸化産物は、細胞傷害性、アテローム病原性、および突然変異原性のような生物学的活性を有する。本実施例では、４ａおよび５ａの、各種細胞系統に対する細胞傷害性を分析した。
本実験には、下記の細胞系統を用いた。すなわち、Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ２２，５１７（１９６８）に記載されるヒトＢ−リンパ球（ＷＩ−Ｌ２）；Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３，１２３（１９８４）に記載されるＴ−リンパ球細胞系統（Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１）；Ｆｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７６，５２１７（１９７９）に記載される血管平滑筋細胞系統（ＶＳＭＣ）および腹大動脈内皮（ＨＡＥＣ）細胞系統；Ｒａｌｐｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４３，１５２８（１９７６）に記載されるラット組織マクロファージ（Ｊ７７４Ａ．１）；および、Ｍｂａｗｕｉｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．４６，１１９（１９８９）に記載される肺胞マクロファージ細胞系統（ＭＨ−Ｓ）である。
化学的に合成された４ａおよび５ａは、アテローム硬化プラーク中に存在することが既知であるある範囲の細胞タイプ、すなわち、白血球、血管平滑筋、および内皮細胞に対して細胞傷害性である。結果を図６と表３に示す。
（表３）
Figure 2007504244
 ４ａと５ａのＩＣ５０値は、調べた細胞系統に対して極めて近似している。さらに、化合物４ａと５ａの、調べた細胞系統に対する細胞傷害性プロフィールも極めて近似していた。この結果は、４ａと５ａの間の著明な構造上の違いを考えると驚くべきことである。しかしながら、４ａと５ａは、前述したようにアミノ酸のような細胞成分によって促進される過程において相互に平衡するが、この細胞傷害性アッセイの時間枠内においても４ａと５ａは互いに平衡しているのかも知れない。従って、化合物４ａと５ａは、生体内でも近似の細胞傷害性を有するかも知れない。
同様の手順を用いて、化合物６ａ、７ａ、７ｃ、１０ａ、１１ａ、および１２ａも、本発明者によって、白血球細胞系統に対して細胞傷害性を有することが示され、また、セコ−ケトアルデヒド４ａとそのアルドール付加物５ａも、神経細胞系統に対して細胞傷害性を有することが示された。
オゾンとコレステロールの接触は、細胞傷害性ステロイド４ａ−６ａの生体内生産を招き、これが、前述したように、内皮細胞または平滑筋細胞の傷害を促進し、あるいは、アテローム内部の炎症細胞のアポトーシスを誘発することによって病変の進行に役割を演じているのかも知れない。アテローム硬化プラークの、前述の結晶相におけるコレステロールのオゾン分解が、動脈閉塞前の最終段階とされるプラークの不安定化を促すのかもしれない。
（実施例５：コレステロールのオゾン分解産物は、泡沫細胞の形成を促し、ＬＤＬおよびアポタンパクＢ１００構造を変える）
低密度リポタンパク（ＬＤＬ）を、そのアテローム硬化原性を高めるように修飾することが、循環器病発症の鍵となる決定的に重要な事象と考えられている。Ｄ．Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２０９６３（１９９７）。例えば、ＬＤＬ、またはアポタンパクＢ１００（ＬＤＬのタンパク質成分であるアポＢ−１００）の酸化的修飾は、ＣＤ３６、およびその他の、マクロファージのスカベンジャー受容体を介してマクロファージに摂取されるＬＤＬの取り込みを増加させるが、この修飾は、アテローム硬化症の発症において決定的に重要な病理学的原因事象である。本実施例は、コレステロールのオゾン分解産物４ａおよび５ａが、マクロファージから泡沫細胞への転換を促進し、かつ、ＬＤＬおよびアポＢ−１００の構造を修飾することを示す実験を記載する。
実施例１で前述したように、ＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）を、非活性化ラットマクロファージ（Ｊ７７４．１）の存在下に４ａまたは５ａとインキュベートした。４ａまたは５ａに暴露後、これらのマクロファージは脂質負荷を開始し、泡沫細胞が、反応容器の中に現れ始めた（図７）。
さらに、ヒトのＬＤＬ（１００μｇ／ｍｌ）を４ａおよび５ａ（１０μＭ）とインキュベートすると、円偏光二色性によって検出されるように、アポＢ−１００の構造に時間依存性変化が得られた（図８Ｂ，Ｃ）。４ａおよび５ａ無添加の場合の全体ＬＤＬの円偏光二色性分析から、ＬＤＬの二次構造は、実験の持続時間（４８時間）においては概して安定であることが明らかになった（図８Ａ）。図８Ａに示すように、正常なＬＤＬのタンパク質内容は、大部分がα螺旋構造（〜４０±２％）であり、より少量がβ構造（〜１３±３％）、βターン（〜２０±３％）、およびランダムコイル（２７±２％）となる。４ａおよび５ａとインキュベートしたＬＤＬのスペクトラムの形は、元のＬＤＬとやや似ているものの（図８ＢおよびＣ），主にα螺旋構造の消失（４ａ〜２３±５％；５ａ〜２０±２％）による二次構造の著明な消失が見られ、それに対応してランダムコイルのパーセンテージがより高くなった（４ａ〜３９±２％；５ａ〜３２±４％）。このことから、４ａおよび５ａコレステロールのオゾン分解産物は、ＬＤＬ構造の統合性を冒すようである。
ＬＤＬ構造を修飾するためには、４ａおよび５ａコレステロールのオゾン分解産物のアルデヒド成分と、アポＢ−１００リシン残基のε−アミノ側基との間に共有的反応を起こし、シッフ塩基、またはエナミン中間産物を形成することが考えられる。これは、マロンジアルデヒドとアポＢ−１００の４−ヒドロキシノネナルとの間の反応において以前に観察された化合物と近似する。Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，３８８３（１９８４）；Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １，１３５（１９８７）；Ｆｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．２８，１４６６（１９８７）。このシッフ塩基またはエナミン中間産物は、相当な長寿なので、誘導体化されたＬＤＬは、マクロファージのスカベンジャー受容体によって認識される形態に変化させられる可能性がある。以上から、４ａおよび５ａのコレステロールオゾン分解産物と、アポＢ−１００の間の共有的反応によって、アポＢ−１００−ＬＤＬ複合体が誘導され、これが、マクロファージのスカベンジャー受容体によってより高速に認識され、捕捉されるので、図７で観察される泡沫細胞の生成を招くと考えられる。
アルデヒド成分を含む、コレステロールの唯一の既知の酸化形は、４ａと５ａのオゾン分解産物である。従って、このコレステロール誘導体と、ＬＤＬ／アポＢ−１００との間の反応は、コレステロールと、泡沫細胞形成、動脈プラーク形成の間を繋ぐミッシングリンクを提供するものかも知れない。従って、患者の血流において、高濃度の４ａおよび５ａオゾン分解産物を検出することは、それらの患者のアテローム硬化症の病状の直接の尺度を提供する可能性がある。
（実施例６：コレステロールオゾン化産物に対して特異的な抗体を生成する）
本実施例は、式１３ａ、１４ａ、または１５ａを有するハプテンに対して特異的となるように調製され、コレステロールのオゾン化およびヒドラゾン産物に対して反応することが可能な抗体について述べる。式１３ａ、１４ａ、または１５ａを有するハプテンの構造を下記に示す。
Figure 2007504244
 化合物１３ａは、４−［４−フォルミル−５−（４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−シクロヘキシル）−７ａ−メチル−オクタヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］ペンタン酸である。
Figure 2007504244
Figure 2007504244
 。
（方法）
化合物１３ａ、１４ａ、および１５ａのＫＬＨ接合体を調製した。マウスを、標準法によりこれらのＫＬＨ接合体によって免疫化した。マウスから脾臓を取り出し、分散させ、抗体産生細胞として脾臓細胞を得た。
脾臓細胞とＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞、マウス骨髄腫から得たＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８１を、あらかじめ３７℃に温めた、血清無添加ＲＰＭＩ−１６４０培養液（ｐＨ７．２）に、それぞれ、３×１０４細胞／ｍｌおよび１×１０４細胞／ｍｌの密度となるように懸濁した。この懸濁液を遠心し、沈殿を収集した。沈殿に対して、５０ｗ／ｖ％のポリエチレングリコール（ｐＨ７．２）を含む、血清無添加ＲＰＭＩ−１６４０培養液を１分間に渡って滴下し、次に、得られた混合物を３７℃で１分インキュベートした。血清無添加ＲＰＭＩ−１６４０培養液（ｐＨ７．２）をさらに混合物に滴下し、最終容量を５０ｍｌとし、遠心によって沈殿を収集した。沈殿を、ＨＡＴ培養液に懸濁し、２００μｌ分液に分割、それぞれを９６ウェルマイクロプレートに配布した。このマイクロプレートを３７℃で１週間インキュベートしたところ、約１，２００種類のハイブリドーマが形成された。このハイブリドーマの上清について、イムノアッセイによってコレステロールオゾン化産物に対する結合の有無を分析した。
式１５ａを有する化合物に対して特異的となるように生産されたハイブリドーマＫＡ１−１１Ｃ５およびＫＡ１−７Ａ６は、ブダペスト協定の条項に基づいて、２００３年８月２９日、米国基準菌株保存機関（１０８０１Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．，２０１１０−２２０９ＵＳＡ（ＡＴＣＣ））に、ＡＴＣＣ登録番号ＡＴＣＣＮｏ．ＰＴＡ−５４２７およびＰＴＡ−５４２８として寄託された。式１４ａを有する化合物に対して特異的となるように生産されたハイブリドーマＫＡ２−８Ｆ６およびＫＡ２−１Ｅ９も、ブダペスト協定の条項に基づいて、２００３年８月２９日、米国基準菌株保存機関に、ＡＴＣＣ登録番号ＡＴＣＣＮｏ．ＰＴＡ−５４２９およびＰＴＡ−５４３０として寄託された。
ハプテン１５ａのＫＬＨ接合体に対して特異的となるように生産された、モノクロナール抗体調製物ＫＡ１−７Ａ６：６およびＫＡ１−１１Ｃ５：６、および、ハプテン１４ａのＫＬＨ接合体に対して特異的となるように生産された調製物ＫＡ２−８Ｆ６およびＫＡ２−１Ｅ９のプールを生成した。１５ａに対して免疫惹起させたモノクロナール抗体ＫＡ１−７Ａ６：６およびＫＡ１−１１Ｃ５：６の、オゾン化産物５ａおよびコレステロールハプテン３ｃに対する結合力価を、ＥＬＩＳＡアッセイによって定量した。ＥＬＩＳＡアッセイはまた、ＫＡ２−８Ｆ６：４およびＫＡ２−１Ｅ９：４抗体（オゾン化産物５ａに対して惹起されたもの）の、１３ｂ、１４ｂ、およびコレステロールハプテン３ｃに対する結合力価を定量するためにも実行した。
コレステロールハプテン３ｃの構造を下に示す。
Figure 2007504244
 。
ＥＬＩＳＡアッセイは下記のように行った。１３ａ、１４ａ、３ｃ、１３ｂ、１４ｂ、または１５ａのＢＳＡ接合体を別々に、ハイバインド９６−ウェルマイクトタイタープレート（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）に加え、４℃で一晩放置した。プレートをＰＢＳで徹底的に洗浄し、ミルク溶液（ＰＢＳに１％ｗ／ｖに溶解したもの、１００μＬ）を加えた。プレートを室温で２時間放置し、ＰＢＳで洗浄した。様々な抗体標本を含む培養体をＰＢＳで連続希釈し、各希釈液の５０μＬを、別々に各列の第１ウェルに加えた。混合および希釈後に、プレートを４℃で一晩放置した。プレートをＰＢＳで洗浄し、ヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ接合体（０．０１μｇ、５０μＬ）を加えた。プレートを３７℃で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、基質液（５０μＬ）３，３′、５，５′−テトラメチルベンジジン［０．１ｍｇ、１０ｍＬの酢酸ナトリウム（０．１Ｍ、ｐＨ６．０）と過酸化水素（０．０１％ｗ／ｖ）において］を加えた。プレートを暗黒中で３０分現像した。硫酸（１．０Ｍ、５０μＬ）を加えて反応を停止させ、光学的密度を４５０ｎｍで測定した。
記録力価は、最大光学密度の５０％に相当する血清希釈度である。データはＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ３．０で分析し、少なくとも二重測定値の平均値として記録した。
（結果）
ＥＬＩＳＡ試験の結果を表４と５に示す。
（表４：１５ａ、オゾン化産物５ａ、およびコレステロールハプテン３ｃに対する抗１５ａ抗体ＫＡ１−７Ａ６：６およびＫＡ１ １１Ｃ５：６の結合力価）
Figure 2007504244
 ＊力価は、１５ａ、５ａ、および３ｃのＢＳＡ接合体に対してＥＬＩＳＡによって測定した。
絶対値は、結合した場合、最大吸収の５０％に相当する、抗体の組織培養上清液の希釈係数である。
表４に示されるように、前述のように測定した場合、見かけの結合親和度は、ほとんど同じである。
（表５：１５ａ、１４ｂ、およびコレステロールハプテン３ｃに対する抗５ａ抗体ＫＡ２−８Ｆ６：４およびＫＡ２−１Ｅ９：４の結合力価）
Figure 2007504244
 ＊力価は、１５ｂ、１４ｂ、およびコレステロールハプテン３ｃのＢＳＡ接合体に対してＥＬＩＳＡによって測定した。絶対値は、１３ｂ、１５ｂ、およびコレステロールハプテン３ｃのＢＳＡ接合体に結合した場合、最大吸収の５０％に相当する、抗体の組織培養上清液の希釈係数である。
これらの結果は、コレステロールオゾン化産物に対して、親和性の高い抗体標本を生成することが可能であることを示す。
（実施例７：さらに別の、コレステロールオゾン化産物の検出方法）
本実施例は、コレステロールオゾン化産物は、各種手法、例えば、これらオゾン化産物の遊離アルデヒド基を蛍光性成分に接合すること、および、これらオゾン化産物に対して反応性を有する抗体を用いる工程を包含する方法によって検出が可能であることを示す。
（材料と方法）
（一般的方法）
別様に明言しない限り、全ての反応は、乾燥試薬、溶媒、および炎乾燥ガラス器具を用いて行った。開始物質は全て、別様に明言しない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙから購入し、搬入されたまま使用した。コレステロール−［２６，２６，２６，２７，２７，２７−Ｄ６］は、ＭＥＤＩＣＡＬ ＩＳＯＴＯＰＥＳ，ＩＮＣ．から購入した。フラッシュカラムクロマトグラフィーはシリカゲル（２３０−４００メッシュ）を用いて行った。コレステロールのオゾン化産物４ａおよび５ａ、およびオゾン化産物４ａおよび５ａの２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン（それぞれ４ｂおよび５ｂ）は、前述の実施例に記載する通りに合成した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、Ｍｅｒｃｋ（０．２５ｍｍ）の被覆シリカゲルＫｉｅｓｅｌｇｅｌ６０Ｆ２５４プレートを用いて行い、パラ−アニスアルデヒド染色で可視化した。１Ｈ ＮＭＲスペクトラムは、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＭＸ−６００（６００ＭＨｚ）スペクトロメーターにて記録した。１３Ｃ ＮＭＲスペクトラムは、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＭＸ−６００（１５０ＭＨｚ）スペクトロメーターにて記録した。化学シフトは、外部標準からのδスケールにおいて百万分のいくつ（ｐｐｍ）で表した。
（３β―ヒドロキシ−５−オキソ−５，６−セココレスタン−６−アルのダンシルヒドラゾンの合成（４ｄ））
ダンシルヒドラジン（５０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルフォン酸（１ｍｇ、０．００５２ｍｍｏｌ）を、コレステロールオゾン化産物４ａ（６５ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（８ｍｌ）溶液に加えた。この反応混合液をアルゴン雰囲気下室温で２時間攪拌し、減圧留去した。残渣を塩化メチレン（１０ｍｌ）に溶解し、水（２×１０ｍｌ）で洗浄した。有機分画を硫酸マグネシウム上で乾燥し減圧濃縮した。未精製の黄色油状物をシリカゲルクロマトグラフィー［酢酸エチル−ヘキサン（１：１；７：３）］にて精製したところ、標記の化合物４ｄ（７０ｍｇ、６８％）が、幾何学的異性体（シス：トランス、８：９２）の混合物として得られた：
Figure 2007504244
 ＊２Ｃは、この信号は、ダンシル成分からの２個の炭素信号（ｇＨＳＱＣの場合はＣ０）に相当すると考えられることを示す。
（３β―ヒドロキシ−５β−ヒドロキシ−Ｂ−ノルコレスタン−６β−カルボキサルデヒドのダンシルヒドラゾンの合成（５ｃ））
コレステロールオゾン化産物５ａ（３０ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（５ｍｌ）溶液に、ダンシルヒドラジン（２５ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）と塩酸（濃縮液、０．０５ｍｌ）を加えた。直ちに形成される白色沈殿を、水（０．２ｍｌ）を加えて溶解した。この均一な反応混合液をアルゴン雰囲気下室温で３時間攪拌し、蒸発乾燥した。赤色残渣を塩化メチレン（１０ｍｌ）に溶解し、水（２×１０ｍｌ）で洗浄した。有機分画を硫酸マグネシウム上で乾燥し減圧濃縮した。未精製の黄色油状物を、先ずシリカゲルクロマトグラフィー［酢酸エチル−塩化メチレン（１：４−１：１）］で、次に、予備的ＨＰＬＣ（Ｃ１８Ｚｏｒｂａｘ ２１．２２ｍｍおよび２５ｃｍ、１００％アセトニトリル）で精製したところ、標記の化合物５ｃ（１４．５ｍｇ、３０％）が、幾何学的異性体（シス：トランス、１７：８３）の混合物として得られた：
Figure 2007504244
 。
（３β−ヒドロキシ−５−オキソ−５，６−セコ−［２６，２６，２６，２７，２７，２７−Ｄ６］−コレスタン−６−アル（Ｄ６−４ａ）の合成）
酸素中にオゾンを含ませた気体混合物を、Ｄ６−コレステロール（５０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）の、５ｍＬクロロフォルム−メタノール（９：１）溶液中に、−７８°で１分間バブルさせた。その時までに溶液はやや青みを帯びた。この反応混合液を蒸発させ、２．５ｍＬの酢酸−水（９：１）中でＺｎ粉末によって、室温で３時間攪拌した。この不均一な混合物を塩化メチレン（１０ｍｌ）で希釈し、水（３×５ｍｌ）と塩水（５ｍＬ）で洗浄した。有機分画を硫酸マグネシウム上で乾燥し蒸発させた。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル５：１、３：１、および２：１で溶出）で精製したところ、標記の化合物が白色固体（４４ｍｇ、０．１０４ｍｍｏｌ）として得られた。収率：８１％。
Figure 2007504244
 。
（３β−ヒドロキシ−５β−ヒドロキシ−Ｂ−ノルコレステロール−［２６，２６，２６，２７，２７，２７−Ｄ６］−６β−カルボキサルデヒド（Ｄ６−５ａ）の合成）
Ｄ６−４ａ（２６ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル−水（２０：１、５ｍＬ）の溶液にＬ−プロリン（１１ｍｇ）を加えた。この反応混合液を室温で２時間攪拌し、減圧留去した。残渣を酢酸エチル（１０ｍＬ）に溶解し、水（２×５ｍｌ）と塩水で洗浄した。有機分画を硫酸マグネシウム上で乾燥し蒸発させたところ、白色の固体が残った。これは、分析したところ、ＮＭＲにおいて純粋であった（２６ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ、収率：１００％）。
Figure 2007504244
 。
（４−（５−（４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソシクロヘキシル）−７α−メチル−４−（２−オキソエチル）−オクタヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル）ペンタン酸１５ａの合成）
３β−ヒドロキシコレスト−５−エン−２４−オン酸３ｃのオゾン分解を、Ｄ６−５ａで記載した通りに実行した。
Figure 2007504244
 。
（コレステロールのオゾン化産物の抽出）
血液および組織サンプルから全脂質を抽出するために、ＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒ法の変法を用いた。Ｂｌｉｇｈ ＥＧ，Ｄ．Ｗ．Ｃａｎ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ １９５９，３７，９１１−１７を参照されたい。抗凝固剤としてクエン酸またはＥＤＴＡを含む真空性チューブに収集したヒト血漿（２００μＬ）を４℃で保存し、キャップ付きガラス管においてリン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ、３００μＬ）に加えた。メタノール（５００μＬ）を加え、サンプルを短時間渦巻き攪拌した。クロロフォルム（１ｍＬ）を加え、サンプルを２分間渦巻き攪拌し、３０００ｒｐｍで５分遠心し、有機層を取り出した。このクロロフォルム添加、渦巻き攪拌、および遠心から成る過程を繰り返した。有機分画を合わせ、減圧蒸留した。通例の適応指示に基づいて頚動脈内視鏡摘出術を受けた患者から、内視鏡摘出された標本を得た。Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｇｒｅｅｎ病院内の検閲委員会は、ヒト被験者試験プロトコールを承認した。標本は、分析前、−７０℃で凍結保存した。分析には、組織標本を室温に温め、次に、水溶液バッファー（ＫＨ２ＰＯ４，０．５Ｍ、１−２ｍＬ）中で、組織ホモジェナイザー（Ｔｅｋｍａｒ）にてホモジェナイズした。このホモジェネートを、メタノール：クロロフォルム（１：３、６ｍＬ）の溶液に加え、３０００ｒｐｍで５分遠心した。有機分画を収集した。残りの水性混合分画にクロロフォルム（６ｍＬ）を加え、サンプルを遠心した（３０００ｒｐｍ５分）。合わせた有機分画を減圧留去した。
（抽出されたコレステロールオゾン化産物の、ダンシルヒドラジンによる誘導体形成、およびＨＰＬＣ分析）
前述の、留去血液または組織抽出物を、ダンシルヒドラジン（２００μＭ）およびＨ２ＳＯ４（１００μＭ）を含むイソプロパノール（２００μＭ）に再懸濁し、３７℃で４８時間インキュベートした。分析法は、蛍光検出（励起波長３６０ｎｍ、発光波長４５０ｎｍ）を用いるＨｉｔａｃｈｉ Ｄ−７０００ＨＰＬＣシステムによるＨＰＬＣ分析に基づく。このシステムは、アセトニトリル：水（９０：１０、０．５ｍＬ／分）から成るイソクラチック移動相を備えたＶｙｄｅｃ Ｃ−１８ＲＰカラムに接続される。オゾン化産物５ａ（５ｂ）のダンシル誘導体の保持時間（ＲＴ）は約８．１分であった。５ａ（５ｂ）のヒドラジン誘導体の保持時間は約１０．７分であった。濃度は、通例として、マッキントッシュパソコンとプリズム４．０ソフトウェアを用い、真正標準を基準としたピーク面積計算によって求めた。
（ガスクロマトグラフィー−質量分析）
蒸発標本は、塩化メチレンにて１ｍＬ容量に再構成し、さらに、この濃縮プラーク抽出物に対して、１００μＬのピリジン、および１％トリメチルクロロシランを含む１００μＬのＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）−トリフルオロアセタミドを添加することによってシリル化した。サンプルを３７℃で２時間インキュベートし、回転蒸発によって蒸発乾固した。各サンプルを、分析前に、１００μＬの塩化メチレンに再懸濁した。２．５μｌのサンプルを、非分岐注入（Ａｇｉｌｅｎｔ７６７３オートサンプラー）によって、ＨＰ−５ｍｓカラム、３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）×０．２５ｕｍ薄層厚さ、流速１．２ｍｌ／分、注入温度２９０℃で注入した。温度プログラムは、５０℃でスタートし、５分維持し、次に２０℃／分で３００℃まで上昇し、１２分維持した。質量分析は、Ａｇｉｌｅｎｔモデル５９７３不活性状態、走査範囲５０−７００ｍ／ｚ、ｍ／ｚ３５４および３６０に対する、選択的イオン監視（ＳＩＭ）走査の下に行った。ＭＳ ｑｕａｄ温度は１５０℃であり、ＭＳ発射源温度は２８０℃であった。
（ハプテン１５ａの、担体タンパク質ＫＬＨおよびＢＳＡに対する結合）
１−エチル−３，３′−ジメチルアミノプロピル−カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ、１．５ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）とスルフォＮ−ヒドロキシスクシニミド（１．８ｍｇ，０．００８ｍｍｏｌ）とを、０．０１ｍＬのＨ２Ｏに溶解し、これを、ハプテン（２．５ｍｇ，０．００６ｍｍｏｌ）の０．１ｍＬのＤＭＦ溶液に溶解した。この混合液を渦巻き攪拌し、室温で２４時間維持し、その後、ＰＢＳバッファー（０．９ｍｌ、０．０５ｍＭ、ｐＨ＝７．５）に溶解したＢＳＡ（５ｍｇ）に４℃で加えた。この最終混合液を、４℃で２４時間維持し、−２０℃で保存した。化合物１５ａのＫＬＨまたはＢＳＡ接合体を合成するのに関わった反応を下記に示す。
Figure 2007504244
 反応ａは、前述のように、化合物３ｃのＯ３／Ｏ２によるオゾン分解を含む。反応ｂは、化合物１５ａを、ＥＤＣおよびＨＯＢｔのＤＭＦ溶液によって一晩処理し、次に、ＢＳＡまたはＫＬＨのリン酸バッファー生食液（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４とインキュベートした過程を含む。
モノクロナール抗体生産は標準法によって実行した。８週齢の１２９ＧＩＸ＋マウスの免疫化は、マウス１匹当たり、５０μＬのＰＢＳに溶解した１０μｇのＫＬＨ−１５ａ接合体で、等量のＲＩＢＩアジュバントを含む抗原液をＩＰ注入し、これを、３日置きに、合計５回の免疫化処置することによって行った。結成の抗体力価はＥＬＩＳＡで定量した。３０日後、１００μＬのＰＢＳに溶解した５０μｇのＫＬＨ−１５ａ接合体を、尾の側面静脈に静脈注入（ＩＶ）した。３日後、動物を屠殺し、脾臓を融合のために取り出した。免疫化動物の脾臓細胞は、ＲＰＭＩ培養液にてＸ６３−Ａｇ８．６５３骨髄細胞と５：１混合し、遠心し、３７℃で１ｍＬのＰＥＧ１５００に再懸濁した。ＰＥＧを、９ｍＬのＲＰＭＩにて３分間希釈し、３７℃で１０分インキュベートし、次に遠心し、培養液に再懸濁し、１５×９６ウェルプレートに撒いた。ＥＬＩＳＡを実行して、コレステロールのオゾン化産物４ａまたは５ａには結合するが、コレステロールには結合しない抗体を選別した。選ばれたハイブリドーマを２世代に渡ってサブクローンし、モノクロナール性を確保した。
（ＡｐｏＥノックアウトマウスの上行大動脈の組織切片の調製）
標本は液体窒素にて急速冷凍した。１０ミクロン切片を取り、ガラススライドに載せた。標本を、１：１エチルアルコール：ジエチルエーテル２０分、１００％エタノール１０分、および９５％エタノール１０分の順で浸透させた。ＰＢＳにて洗浄後、コレステロールオゾン化産物に対して特異的な抗体の１：２００希釈液を適用し、組織と共に１時間インキュベートした。二次標識を、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の４０：１希釈液を用いて実行した。組織像を、ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ ｍｉｃｒｏｆｉｒｅディジタルカメラにて得、アドベのフォトショップにて処理した。
（結果）
（コレステロールオゾン化産物のダンシルヒドラゾンの蛍光検出）
前述の実施例において述べた通り、コレステロールオゾン化産物は、Ｋ．Ｗａｎｇ，Ｅ．Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，Ｗ．Ａ．Ｐｒｙｏｒ，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ５８，２２５（１９９３）による化学的研究において開発された分析法の変法を用いて、生体内で検出することが可能である。この変法は、ＰＢＳ（１ｍＬ）ｐＨ７．４に溶解した、プラーク物質（〜５０ｍｇ湿重量）ホモジェネートの懸濁液を、有機溶媒（塩化メチレン、３×５ｍＬ）で抽出し、この有機溶媒可溶性分画を２，４−ジニトロフェニルヒドラジン塩酸（ＤＮＰＨ ＨＣｌ）（２ｍＭ、ｐＨ６．５）のエタノール溶液にて室温で２時間処理する工程を包含する。この反応混合液を、４ｂ、４ａおよび５ｂの２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン（２，４−ＤＮＰ）誘導体、５ａの２，４−ＤＮＰ誘導体の有無について調べるために、逆相ＨＰＬＣ（直接注入、３６０ｎｍでｕ．ｖ．検出）、および直接導入陰性イオンエレクトロスプレイ質量分析にて分析した。この技法は、高速であり、かつ高感度である。しかしながら、このアッセイは生物サンプルに応用する場合、いくつかの制限がある。そのような制限としては、３６０ｎｍの紫外線吸収では他の生物化合物との干渉があること、共役反応時４ｂから５ｂへの変換があること、および、低濃度のコレステロールオゾン化産物では共役反応の効率が低下することが挙げられる。
従って、アッセイの高感度が実現可能かどうかを確かめるために、新しい手法を試験した。この方法は、蛍光発色団を有するヒドラジンに対してコレステロールオゾン化産物を接合し、その後、蛍光を検出し、ＨＰＬＣ分析する工程を包含する。選ばれた傾向発色団はダンシル基であった。アッセイは、抽出されたコレステロールオゾン化産物を、前述の酸性条件下で、ダンシルヒドラジンによって誘導体形成する工程を包含する。ダンシルヒドラジンと、コレステロールオゾン化産物４ａとの反応産物は、下記に示す４ｄである。
Figure 2007504244
 ダンシルヒドラジンと、コレステロールオゾン化産物５ａとの反応産物は、下記に示す５ｃである。
Figure 2007504244
 。
ダンシルヒドラジンの誘導体形成の反応効率を、ヘキサン、メタノール、クロロフォルム、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、およびイソプラノール（ＩＰＡ）のようなある範囲の溶媒について評価した。この分析から、反応能率の観点からＩＰＡが最適の溶媒であり、コレステロールオゾン化産物４ａが自発的にアルドール化して５ａとなる率がもっとも低いと判定された。反応効率は、化学的に合成された真正のダンシルヒドラゾン標準４ｄおよび５ｃを用いてＨＰＬＣにて定量化した（図９）。ＩＰＡに溶解したダンシルヒドラジン（２００μＭ）と硫酸（１００μＭ）によって３７℃４８時間でコレステロールオゾン化産物４ａの誘導体形成をすると、約１１．２分の保持時間（ＲＴ）を有する４ａヒドラゾン誘導体４ｄが形成されるが、その誘導体形成効率は８６±８．０％であった。重要なことは、５ｃの僅か１．３％のみが、この誘導体形成過程の際に４ａまたは４ｄのアルドール化で形成されたに過ぎないことである。５ａの、そのダンシルヒドラゾン誘導体５ｃ（ＲＴ〜１９．４分）への変換効率は、５ａの、０．０１−１００μＭの濃度範囲において８３±１１％であった。ダンシル−ヒドラゾン４ｄおよび５ｃに対する感受性レベルは〜１０ｎＭであった。
血漿サンプルにおいて、４ａおよび５ａコレステロールオゾン化産物が抽出され、誘導体形成する効率を求めるために、ヒトの血漿サンプルに５ａを添加し、次に、２，４−ＤＮＰまたはダンシルヒドラジンで共役結合した。どちらの方法でも検出された接合ヒドラゾンの量に有意差はなかった。すなわち、ダンシルヒドラゾン５ｃとして誘導体形成したもの３７．５±１．９％、２，４−ＤＮＰヒドラゾン５ｂとして回収されたもの３１±８．９％であった。
（同位元素希釈ガスクロマトグラフィーと直接導入質量分析（ＩＤ−ＧＣＭＳ））
現在、血液（血漿）およびアテローム硬化動脈のようなコレステロールの豊富な組織におけるオキシステロールの定量に用いられる分析法は大抵、ＧＣと、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）、または、選択イオン監視（ＳＩＭ）の組み合わせに基づく。ＦＩＤ法よりもＳＩＭが優る利点は、検出の特異性である。生物基質におけるオキシステロールの分析にはこの特異性が必要である。ＳＩＭ戦略にとって決定的に重要な局面は、内部標準の使用である。もっとも一般的なものは５α−コレスタンである。Ｊｉａｌｉｌ，Ｉ．，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｄ．Ａ．，Ｇｒｕｎｄｙ，Ｓ．Ｍ．Ａｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．１９９１，１１，４８２−４８８；Ｈｏｄｉｓ，Ｈ．Ｎ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｄ．Ｗ．，Ｓｅｖａｎｉａｎ，Ａ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ１９９１，８９，１１７−１２６。しかしながら、重水素標識内部標準を備えるＧＣ−ＭＳは好ましい方法である。なぜなら、この方法は、高感度で、特異的で、異なる分析対象の異なる回収率を補正するからである。Ｄｚｅｌｅｔｏｖｉｃ，Ｓ．，Ｂｒｕｅｕｅｒ，Ｏ．，Ｌｕｎｄ，Ｅ．，Ｄｉｓｚｆａｌｕｓｙ，Ｕ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９５，２２５，７３−８０。重水素標識内部標準の役割は二重である。先ず、同位元素量と濃度との相関による定量化を可能にする。第二に、抽出過程前に、既知量の重水素標識分子を添加することによって、コレステロールオゾン化産物の抽出効率の評価が可能になる。Ｌｅｏｎｉ，Ｖ．，Ｍａｔｅｒｍａｎ，Ｔ．，Ｐａｔｅｌ，Ｐ．，Ｍｅａｎｅｙ，Ｓ．，Ｄｉｃｚｆａｌｕｓｙ，Ｕ．，Ｂｊｏｒｋｈｅｌｍ，Ｉ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．２００３，４４，７９３−７９９。
下記に概説するように、６重水素付加コレステロールオゾン化産物Ｄ６−４ａおよびＤ６−５ａを、［２６，２６，２６，２７，２７，２７−Ｄ］−コレステロール（重水素付加３ｃ）から調製した。
Figure 2007504244
 合成の第１工程（ａ）では、７８℃で、Ｄ６−３ｃのクロロフォルム−メタノール（９：１）溶液にオゾンをバブルして、Ｄ６−４ａを生成した。第２工程（ｂ）では、Ｄ６−４ａをＤＮＳＯに溶解し、室温で２．５時間プロリンと反応させてＤ６−５ａを生成した。
Ｄ６−４ａとＤ６−５ａを内部標準として用いて、所蔵のＡｇｉｌｅｎｔ ＧＣ／ＭＳによってこのＧＣ／ＭＳの感度を試験した。典型的な手法では、真正コレステロール、４ａ、５ａ、Ｄ６−コレステロール、Ｄ６−４ａ、およびＤ６−５ａのサンプルを、アルゴン雰囲気下３７℃で２時間ピリジンおよびＢＳＴＦＡで処理して、それぞれのトリメチルシリルエーテルに変換した。揮発物の除去後（減圧下）、残渣を塩化メチレンに溶解し、オートサンプラー瓶に移した。
次に、ＧＣ−ＭＳを、５９７３不活性ＭＳＤに接続したＡｇｉｌａｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ６８９０ＧＣ（分岐型／非分岐型入力システム、および７６８３オートインジェクター・モジュール）にて実行した。マススペクトロメーターをフルイオン走査モードで作動させた。観察された保持時間（ＲＴ）およびＭ＋イオンは下記の通り。４ａおよび５ａ（ＲＴ＝２９．６分、Ｍ＋３５４）；Ｄ６−４ａとＤ６−５ａ（ＲＴ＝２９．６分、Ｍ＋３６０）；コレステロール（ＲＴ＝２７．２分、Ｍ＋３２９）；Ｄ６−コレステロール（ＲＴ＝２７．２分、Ｍ＋３３５）。ＧＣ−ＭＳ内部におけるコレステロールオゾン化産物４ａおよび５ａの、導き出された断片化は下に示す通りである。
Figure 2007504244
 上に示すように、コレステロールオゾン化産物４ａおよび５ａの両方とも、約Ｍ＋３５４の断片を生ずる。重水素（Ｄ６）導入４ａおよび５ａコレステロールオゾン化産物は、約Ｍ＋３６０の断片を生ずる。
従って、ＧＣ−ＭＳアッセイでは、コレステロールオゾン化産物４ａと５ａの間には何の差も観察されなかった。これは恐らくコレステロールオゾン化産物４ａが、シリル化工程の際に５ａに変換されるためと考えられる。従って、Ｍ＋３５４（または３６０）の量は、真正４ａおよび５ａコレステロールオゾン化産物の濃度の尺度となる。３５４イオンピークの面積は、濃度と直線関係にあり、これまでに測定された感度の低位レベルは、コレステロールオゾン化産物では１０ｆｇ／μＬである（前述の実施例で記載したＬＣ／ＭＳアッセイの検出限界に対して推定２ｌｏｇの増加と等価である）。
このＧＣＭＳアッセイの有効性は、臨床的に摘出された頚動脈プラーク物質から得られたコレステロールオゾン化産物の抽出によっても確かめられた。通例分析のために頚動脈内視鏡摘出術を受けた患者から入手した頚動脈内視鏡摘出組織（ｎ＝２）を、組織ホモジェナイザーで１０分ホモジェナイズし（アルゴン雰囲気下）、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨで抽出した。この抽出物を前述のようにシリル化し、ＧＣ−ＭＳ分析にて調べた（図１０および１１）。イオン量対時間に関するＧＣ−ＭＳトレースは、まだ定義されていない数多くのオキシステロールがあることを示す。一方、結合オゾン化産物４ａおよび５ａ（ＲＴ＝２２．４９分）は明瞭に区別された。
これらのデータは、生物サンプルにおける４ａおよび５ａコレステロールオゾン化産物の全体的抽出、およびそれらの産物の分析におけるＧＣ−ＭＳアッセイの実行性を明瞭に確立し、前述の実施例におけるアテローム硬化プラークの分析について記載された結果を裏付ける。
（コレステロールオゾン化産物４ａおよび５ａの、免疫組織化学的局在特定）
前述のように、マウスを、コレステロールオゾン化産物４ａの類縁体である化合物１５ａのＫＬＨ接合体によって免疫化した。ハイブリドーマ法によってモノクロナール抗体を生成した。コレステロールオゾン化産物５ａに対して優れた結合親和性＜１μＭを持ち、その特異性は、コレステロール（１０００倍低い親和度）に対するものよりも優れる２種類のマウスモノクロナール抗体、１１Ｃ５および７Ａ７が得られた。
４ａ類縁体であるハプテンに対する抗５ａ抗体の生成はさほど驚くには当たらない。なぜなら、上に示したように、血液にコレステロールオゾン化産物４ａを加えることは、直ちに５ａへの変換をもたらすからである。
ＡｐｏＥ欠損マウスから得られた大動脈の凍結固定切片を、抗体１１Ｃ５、およびＦＩＴＣ標識抗ＩｇＧ二次抗体によって免疫組織化学的に染色し、その染色像を、非特異的マウス抗体で染色した連続切片と比較すると、血管の内皮以下の細胞層を含むアテローム硬化症領域におけるコレステロールオゾン化産物５ａの局在が明らかになる。抗体を可溶性コレステロールで吸収しても、内皮以下の蛍光は除去されなかった。
（参考文献）
Figure 2007504244
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Figure 2007504244
 本明細書で参照または引用した特許および刊行物は全て、本発明が関係する当業者の熟練レベルを示すものであり、これら参照特許または刊行物はそれぞれ、それがあたかも個別にその全体が本明細書に組み込まれる、または個別にその全体が本明細書に記載されるのと同程度に、参照することにより本明細書に含められる。本出願人は、前記引用特許または刊行物に含まれる任意の、および全ての材料および情報を、本明細書に物理的に組み込む権利を保留する。
本明細書に記載される特定の方法および組成物は、好ましい実施態様を表すものであり、例示的なものであり、本発明の範囲に対する限定を意図されたものではない。その他の目的、局面、および実施態様は、本明細書を見れば当業者には思い当たるものであり、それらは、特許請求の範囲に定められる、本発明の精神の中に含まれる。異なる代置および修正が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書に開示される発明に対して為され得ることは当業者には容易に明らかであろう。本明細書に例を挙げて具体的に説明された本発明は、どの一つの要素または複数の要素、または、どの一つの制限または複数の制限−それらはいずれも本明細書にはそれと指定して必須と開示されてはいない−が欠けたままでも好適に実施されよう。本明細書に例を挙げて具体的に説明された方法および手順は、異なる工程順序で好適に実行されようし、また、本明細書、または本特許請求項に示された工程順序に必ずしも限定されない。本明細書、および付属の請求項で用いられる単数形の“ａ（一つの）”“ａｎ（一つの）”および“ｔｈｅ（その）”は、文脈から明らかに別様と判断されない限り、複数への参照を含む。従って、例えば、「一つの宿主細胞」という言及は、複数の、そのような宿主細胞（例えば、培養体または集団）等を含む。どのような状況下においても、本発明が、本明細書に特異的に開示される、特定の実施例または実施態様または方法に限定されるものと解釈してはならない。どのような状況下においても、本特許が、試験官、または他の、特許局および商標局の役人または雇員によって為された発言によって、その発言が、本出願人によって、特定的に、かつ、尋問・留保なく、返書において明白に採用されていない限り、制限されるものと解釈してはならない。
上記に用いられた用語および表現は、説明の用語として用いられたもので、限定の用語として用いられたものではなく、このような用語および表現の使用には、図示し説明した特質、およびその一部に対する等価物を排除する意図は全く無く、むしろ各種修正は、ここに請求される本発明の範囲内において可能であることが認められている。従って、本発明は、好ましい実施態様、および要すれば任意に採用される特質に基づいて具体的に開示されたけれども、本明細書に開示される概念については、修正および変更が、当業者によって求められようが、そのような修正および変更は、付属の特許請求項に定められる本発明の範囲内にあると考えられることを理解しなければならない。
本発明は、本明細書において広く、一般的に記述された。この一般的開示に含まれる、さらに狭い種類、さらに細かい集団もそれぞれ、本発明の一部を形成する。このことは、種属から何かの主題を外す条項または否定的制限を有する本発明の一般的記述をも、その外された材料が本明細書に特異的に明言されようとされまいと、含む。
他の実施態様も下記の特許請求項の中に含まれる。さらに、本発明の特質または局面がマーカッシュのグループ分けに基づいて記述される場合でも、当業者ならば、本発明は、マーカッシュグループのうちの任意の個別メンバー、またはメンバーのサブグループに基づいても記述されることが理解されよう。
図１Ａ−Ｄは、インディゴカルミン１が、４−β−フォルボル１２−ミリスチン酸１３−酢酸（ＰＭＡ）処理ヒトアテローム硬化病変によって酸化されてイサチンスルフォン酸を形成することが可能であることを示す。図１Ａは、インディゴカルミン１が、オゾンによってイサチンスルフォン酸２に変換される際に起こる化学的変化を示す。図１Ｂは、インディゴカルミン１が、ＰＭＡ−活性化アテローム硬化病変によって脱色される様を示す。各ガラス瓶は、リン酸バッファー生食液（ＰＢＳ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）ｐＨ７．４に溶解させたインディゴカルミン１（２００μＭ）とウシカタラーゼ（５０μｇ）の溶液に分散させた、等量のアテローム硬化プラーク（約５０ｍｇの湿重量）を含む。右側の瓶に対しては、写真は、ＰＭＡ（１０μＬ、４０μｇ／ｍＬ）のＤＭＳＯ溶液の添加３０分後に撮影した。左側の瓶に対しては、ＰＭＡ無しで等量のＤＭＳＯを加えた。反応混合液の全体量は１ｍＬであった。図１Ｃは、逆相ＨＰＬＣで分析した場合、図１Ｂに示した＋ＰＭＡ瓶の上清において新規のＨＰＬＣピークが生じたことを示す。この新規のピークは、約９．７１分の保持時間（ＲＴ）を有するイサチンスルフォン酸２に対応する。図１Ｄは、図１Ｂにおいて前述したように、ＰＭＡ活性化ヒトアテローム硬化プラーク物質で、インディゴカルミン１と反応させた物質の遠心上清の陰性イオンスプレイ質量分析図を示す。プラーク物質懸濁液のＰＭＡ活性化を、インディケーターのインディゴカルミン１を用いてＨ２ １８Ｏ中で実行した場合、遊離分断産物イサチンスルフォン酸２のマススペクトラムにおける［Ｍ−Ｈ］−２３０の質量断片ピークの出現および相対的強度によって示されるように、インディゴカルミン１のラクタムカルボニル酸素の約４０％が１８Ｏを取り込んだ。正常な水（Ｈ２ １６Ｏ）の存在下にインディゴカルミン１から形成されたイサチンスルフォン酸２は、２２８の［Ｍ−Ｈ］−質量断片ピークを有する。 図２Ａは、コレステロール３がオゾン分解されて、５，６−セコステロール４ａを形成し、それがアルドール化によって５ａに変換される過程に含まれる化学的工程を示す。２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（２ｍＭ、０．０８％ＨＣｌの溶液）による誘導体形成によって、それぞれ、ヒドラゾン誘導体４ｂおよび５ｂが得られる。誘導体形成過程において４ａから形成される５ｂの量は約２０％であった。５ａと５ｂのコンフォメーション割り当ては、Ｋ．Ｗａｎｇ，Ｅ．Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，Ｗ．Ａ．Ｐｒｙｏｒ，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ５８，２２５（１９９３）の記載する通りに行った。 図２Ｂは、図３の約１８分［Ｍ−Ｈ］−５７９において溶出するピークに対する標準として調べた、オキシステロール６ａ−９ａ、および２，４−ジニトロフェニルヒドラジン塩酸誘導体６ｂ−７ｂの構造を示す。７ａ−７ｂのコンフォメーション割り当ては、真正の合成７ｂ物質を用いた１Ｈ−１Ｈ ＲＯＳＥＹ実験に基づく。 図３Ａ−Ｅは、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）を用いて、ヒドラゾン４ｂ、５ｂおよび６ｂについてプラーク物質と化学的に合成した真正サンプルの分析結果を示す。条件：吸着環境−ＨＳＲＰ−Ｃ１８カラム、７５％アセトニトリル、２０％水、５％メタノール、０．５ｍＬ／分の流速、３６０ｎｍ検出、直接導入陰性イオンエレクトロスプレイ質量分析（ＭＳ）（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｍ８０００装置）。プラーク抽出物を、２，４−ジニトロフェニルヒドラジン塩酸（ＤＮＰＨ ＨＣｌ）で誘導体形成後分析を行った。図３Ａは、ＰＭＡ活性化無しのプラーク物質について、本出願に記載する通りに２，４−ジニトロフェニルヒドラジンによる誘導体形成後のＬＣＭＳ分析の結果を示す。ＰＭＡ（４０μｇ／ｍＬ）による活性化前に化合物４ｂ（ＲＴ〜１４．１分）、５ｂ（ＲＴ〜２０．５分）、および６ｂ（ＲＴ〜１８分）がアテローム硬化病変中に検出された。図３Ｂは、前述のように、ＰＭＡ（４０μｇ／ｍＬ）による活性化、抽出、および、２，４−ジニトロフェニルヒドラジンによる誘導体形成後におけるプラーク物質のＬＣＭＳ分析結果を示す。ＰＭＡ（４０μｇ／ｍＬ）による活性化後、アテローム硬化病変では、より大量の化合物４ｂ（ＲＴ〜１４．１分）、および、より少量の化合物６ｂ（ＲＴ〜１８分）が検出された。 図３Ｃは、真正の４ｂのＨＰＬＣ分析を示す。挿入図は、質量分析を示す。図３Ｄは、真正の６ｂのＨＰＬＣ分析を示す。挿入図は、質量分析を示す。 図３Ｅは、真正の５ｂのＨＰＬＣ分析を示す。挿入図は、質量分析を示す。 図４Ａ−Ｄは、アテローム硬化物質の抽出標本と誘導体形成標本のＨＰＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。この分析では、痕跡的ヒドラゾンを検出するために１００μｌ注入容量を用いた。図４Ａは、下記に詳述する条件を用いて得られた時間対強度のＬＣトレースを示す。ＲＴ２６．７は７ｂである（真正物質との比較による）。ＲＴ〜２４．７のピークは、「Ｍ−Ｈ」−４６１を有する未知のヒドラゾンである。図４Ｂは、［Ｍ−Ｈ］−５９７における単一イオン監視を示す。 図４Ｃは、［Ｍ−Ｈ］−５７９における単一イオン監視を示す。図４Ｄは、［Ｍ−Ｈ］−４６１における単一イオン監視を示す。 図５Ａ−Ｃは、患者Ａ−Ｎのアテローム硬化病変抽出物におけるコレステロールオゾン化産物の濃度を示す。図５Ａは、ＰＭＡによる活性化前後において、患者のアテローム硬化病変からの４ａ抽出および誘導体形成後に得られた、ヒドラゾン４ｂの測定濃度を示す棒グラフである。マッキントッシュ用ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ３を用いてスチューデントのｔ−ｔｅｓｔ（両側性）（ｐ＜０．０５，ｎ＝１４）で求めた、活性化前後で検出された量の数値を示す。図５Ｂは、ＰＭＡによる活性化前後において、患者のアテローム硬化病変からの５ａ抽出および誘導体形成後に得られた、５ｂの測定濃度を示す棒グラフである（ｎ＝１４）。 図５Ｃは、患者から採取した血漿サンプルから５ａを抽出し誘導体形成を行った後に得られた５ｂの測定濃度を示す。コホートＡ（ｎ＝８）の患者は、２４時間以内に動脈内視鏡摘出術を受ける予定であった（血漿分析はサンプル採取後３日に実施された）。コホートＢ（ｎ＝１５）の患者は、一般医学クリニックに通院する患者の中からランダムに選ばれた（血漿分析はサンプル採取後７日に行われた）。予備試験では、５ａの血漿レベルは１日当たり約５％低下したことに注意。この定量の条件下では、４ｂおよび５ｂの検出限界は１−１０ｎＭであった。従って、４ｂまたは５ｂが見かけ上存在しない場合は、４ｂまたは５ｂのレベルは１０ｎＭ未満である。 図６Ａは、Ｂ細胞（ＷＩ−Ｌ２）細胞系統に対する３、４ａ、および５ａの細胞傷害性を示す。各データポイントは、少なくとも二重の測定値の平均である。４ａ（四角）および５ａ（三角）のＩＣ５０±標準誤差は、マッキントッシュコンピュータ用Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ３．０ソフトウェアを用いて非線形回帰分析（Ｈｉｌｌプロット分析）によって求めた。この濃度範囲では、３（逆三角）では細胞傷害性は観察されなかった。図６Ｂは、Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）細胞系統に対する３、４ａ、および５ａの細胞傷害性を示す。各データポイントは、少なくとも二重の測定値の平均である。４ａ（四角）および５ａ（三角）のＩＣ５０±標準誤差は、マッキントッシュコンピュータ用Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ３．０ソフトウェアを用いて非線形回帰分析（Ｈｉｌｌプロット分析）によって求めた。この濃度範囲では、３（逆三角）では細胞傷害性は観察されなかった。 図７Ａ−Ｂは、コレステロールのオゾン分解産物４ａおよび５ａが、マクロファージによる脂質摂取を増し、泡沫細胞を産生することを示す。図７Ａは、Ｊ７７４．１マクロファージとインキュベートしたＬＤＬは、これらのマクロファージの脂質負荷に対してほとんど何の作用も及ぼさないことを示す。マクロファージは先ず、１０％仔牛血清を含むＲＰＭＩ−１６４０中で２４時間培養し、次に、ＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）を含む同じ培養液で７２時間インキュベートした。細胞は、４％フォルムアルデヒドにて固定し、ヘマトキシリンおよびオイルレッドＯで、脂質顆粒が暗赤色に染まるように染色した。倍率１００倍。図７Ｂは、オゾン分解産物４ａとインキュベートしたＬＤＬは、マクロファージの脂質負荷を誘発し、泡沫細胞を産生させることを示す。Ｊ７７４．１マクロファージを、１０％仔牛血清を含むＲＰＭＩ−１６４０中で２４時間培養した。次に、細胞を、ＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）とオゾン分解産物４ａ（２０μＭ）を含む同じ培養液で７２時間インキュベートした。細胞は、４％フォルムアルデヒドにて固定し、ヘマトキシリンおよびオイルレッドＯで、脂質顆粒が暗赤色に染まるように染色した。倍率１００倍。マクロファージに対するオゾン分解産物４ａの作用は、オゾン分解産物５ａの作用と区別できないことに注意されたい。 図８Ａ−Ｃは、ＬＤＬの二次構造は、円偏光二色性で検出した場合、オゾン分解産物４ａまたは５ａに暴露されることによって変化させられることを示す。提出の結果は、各サンプルにつき少なくとも二重実験に基づくものである。図８Ａは、正常なＬＤＬのタンパク質内容は、大部分がα螺旋構造（〜４０±２％）であり、より少量がβ構造（〜１３±３％）、βターン（〜２０±３％）、およびランダムコイル（２７±２％）となることを示す。図８Ａは、３７℃におけるＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のＬＤＬ（１００μｇ／ｍｌ）について得られた時間依存性円偏光二色性スペクトラムを示す。図８Ｂは、３７℃におけるＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でＬＤＬをオゾン分解産物４ａとインキュベートした場合、アポＢ−１００の二次構造が消失することを示す。図８Ａは、３７℃におけるＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のＬＤＬ（１００μｇ／ｍｌ）および４ａ（１０μＭ）について得られた時間依存性円偏光二色性スペクトラムを示す。 図８Ｃは、３７℃におけるＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でＬＤＬをオゾン分解産物５ａとインキュベートした場合、アポＢ−１００の二次構造が消失することを示す。図８Ａは、３７℃におけるＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のＬＤＬ（１００μｇ／ｍｌ）および５ａ（１０μＭ）について得られた時間依存性円偏光二色性スペクトラムを示す。 図９は、コレステロールオゾン化産物４ａおよび５ａのダンシルヒドラジン（それぞれ４ｄおよび５ｃ）の構造、および、これらヒドラジン誘導体のＨＰＬＣパターンを示す。図示のように、コレステロールオゾン化産物４ａおよび５ａは、異なるＨＰＬＣ保持時間を有するダンシルヒドラジン接合体を生ずる。 図１０は、コレステロールオゾン化産物が、ヒトの頚動脈標本において、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣＭＳ）によって検出可能であることを示す。図示のクロマトグラムは、アテローム硬化プラーク抽出物の典型的なものである。２２．４９分に溶出するピークは、コレステロールオゾン化産物４ａおよび５ａ両方に対応するピークである。質量分析クロマトグラフ挿入図は、２２．４９分で溶出する分子種はｍ／ｚ３５４を有することを示す。 図１１は、二つのアテローム硬化プラークの、ＩＤ−ＧＣＭＳによる定量分析結果を示す。検出された、コレステロールオゾン化産物４ａおよび５ａの量は、組織ｍｇ当たり約８０−１００ｐｍｏｌ／ｍｇであり、ＬＣ−ＭＳ分析によって検出されたものと近似していた。各バーは、二重抽出物であることを示し、平均±ＳＥＭとして表されている。

Claims (51)

  1. 原核細胞または真核細胞に対して細胞傷害性であり得る、単離されたコレステロールのオゾン化産物。
  2. マクロファージの脂質摂取か、またはマクロファージからの泡沫細胞形成を引き起こし得る、請求項１に記載のオゾン化産物。
  3. 低密度リポタンパクにおけるタンパク質の二次構造を変えることが可能な、請求項１に記載のオゾン化産物。
  4. 前記タンパク質はアポタンパクＢ１００である、請求項３に記載のオゾン化産物。
  5. 式４ａを有する、請求項１に記載のオゾン化産物
    Figure 2007504244
     。
  6. 式５ａを有する、請求項１に記載のオゾン化産物
    Figure 2007504244
     。
  7. 式６ａ〜１５ａ、７ｃのうちのいずれか一つ、またはそれらの組み合わせを有する、請求項１に記載のオゾン化産物
    Figure 2007504244
    Figure 2007504244
    Figure 2007504244
     。
  8. 担体と、原核細胞または真核細胞に対して細胞傷害性であり得る単離されたコレステロールのオゾン化産物とを含む、組成物。
  9. 前記オゾン化産物が式４ａを含む、請求項８に記載の組成物
    Figure 2007504244
     。
  10. 前記オゾン化産物が式５ａを含む、請求項８に記載の組成物
    Figure 2007504244
     。
  11. 前記オゾン化産物が、式６ａ〜１５ａ、７ｃのうちのいずれか一つ、またはそれらの組み合わせを有する化合物を含む、請求項８に記載の組成物
    Figure 2007504244
    Figure 2007504244
    Figure 2007504244
    Figure 2007504244
     。
  12. コレステロールのオゾン化産物に結合することが可能な、単離された結合実体。
  13. 前記コレステロールのオゾン化産物が、式４ａの化合物である、請求項１２に記載の結合実体
    Figure 2007504244
     。
  14. 前記コレステロールのオゾン化産物が、式５ａの化合物である、請求項１２に記載の結合実体
    Figure 2007504244
     。
  15. 前記抗体がまた、式６ａ、７ａ、７ｃ、８ａ、９ａ、１０ａ、１１ａ、１２ａ、１３ａ、１４ａ、または１５ａのうちのいずれか一つを有する化合物に対して結合することが可能である、請求項１２に記載の結合実体
    Figure 2007504244
    Figure 2007504244
    Figure 2007504244
    Figure 2007504244
     。
  16. 前記結合実体が、式１３ａ、１４ａ、または１５ａを有するハプテンに対して生じる、請求項１２に記載の結合実体
    Figure 2007504244
     。
  17. 前記結合実体が抗体である、請求項１２に記載の結合実体。
  18. 前記単離された抗体が、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−５４２７またはＰＴＡ−５４２８を有するハイブリドーマＫＡ１−１１Ｃ５またはＫＡ１−７Ａ６に由来する、請求項１７に記載の結合実体。
  19. 前記単離された抗体が、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−５４２９またはＰＴＡ−５４３０を有するハイブリドーマＫＡ２−８Ｆ６またはＫＡ２−１Ｅ９に由来する、請求項１７に記載の結合実体。
  20. 前記結合実体が、治療剤に連結されている、請求項１２に記載の結合実体。
  21. 前記治療剤が、アテローム硬化病変を軽減するか、または動脈のさらなる閉塞を防止することが可能である、請求項２０に記載の結合実体。
  22. 前記治療剤が、抗酸化剤、抗炎症剤、薬剤、小分子、ペプチド、ポリペプチド、または核酸である、請求項２０に記載の結合実体。
  23. コレステロールのオゾン化産物に連結された結合実体であって、該コレステロールのオゾン化産物は、原核細胞または真核細胞に対して細胞傷害性である、結合実体。
  24. 前記結合実体が抗体である、請求項２３の結合実体。
  25. 前記コレステロールのオゾン化産物は、式４ａ〜１５ａまたは７ｃのうちのいずれか一つの化合物である、請求項２３に記載の結合実体
    Figure 2007504244
    Figure 2007504244
    Figure 2007504244
    Figure 2007504244
     。
  26. アテローム硬化病変を治療または予防するためのマーカーであって、式４ａまたは式５ａを有するコレステロールのオゾン化産物を含む、マーカー
    Figure 2007504244
     。
  27. 患者のアテローム硬化症を治療するための方法であって、コレステロールのオゾン化産物に対して結合することが可能な結合剤を該患者に投与する工程を包含する、方法。
  28. 前記コレステロールのオゾン化産物は、式４ａ〜１５ａまたは７ｃのうちのいずれか一つを有する化合物である、請求項２７に記載の方法
    Figure 2007504244
    Figure 2007504244
    Figure 2007504244
    Figure 2007504244
     。
  29. 前記結合剤が、活性酸素種を生成しない、請求項２７に記載の方法。
  30. 前記結合実体が、治療剤に連結されている、請求項２７に記載の方法。
  31. 前記治療剤が、アテローム硬化病変の成長の遅滞、または該アテローム硬化病変のサイズの縮小を促進し得る、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記治療剤が、抗酸化剤、抗炎症剤、薬剤、小分子、ペプチド、ポリペプチド、または核酸である、請求項３０に記載の方法。
  33. 患者の標的細胞を殺すための方法であって、
    標的細胞に結合することが可能な結合剤を該患者に投与する工程を包含し、該結合剤は、コレステロールのオゾン化産物に連結される、方法。
  34. 前記結合実体が抗体である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記抗体が、活性酸素種を生成する、請求項３３に記載の方法。
  36. 前記抗体がまた、一重項酸素を生成することが可能な化合物に連結される、請求項３３に記載の方法。
  37. 前記一重項酸素を生成することが可能な化合物が、エンドペルオキシドである、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記一重項酸素を生成することが可能な化合物が、アントラセン−９，１０−ジプロピオン酸エンドペルオキシドである、請求項３６に記載の方法。
  39. 前記一重項酸素を生成することが可能な化合物が、プテリン、フラビン、ヘマトポルフィリン、テトラキス（４−スルフォナトフェニル）ポルフィリン、ビピリジルルテニウム（ＩＩ）錯体、ローズベンガル染料、キノン、ローダミン染料、フタロシアニン、ヒポクレリン、ルブロシアニン、ピナシアノール、またはアロシアニンである、請求項３６に記載の方法。
  40. 哺乳動物から細胞傷害性コレステロールオゾン化産物を除去するための方法であって、コレステロールのオゾン化産物に結合することが可能な結合実体または抗体を用いて、該哺乳動物の体液から該細胞傷害性コレステロールオゾン化産物を分離する工程を包含する、方法。
  41. 前記コレステロールのオゾン化産物が、式４ａの化合物である、請求項４０に記載の方法
    Figure 2007504244
     。
  42. 前記コレステロールのオゾン化産物が、式５ａの化合物である、請求項４０に記載の方法
    Figure 2007504244
     。
  43. 前記コレステロールのオゾン化産物が、式６ａ〜１５ａまたは７ｃのうちのいずれか一つを有する化合物である、請求項４０に記載の方法
    Figure 2007504244
    Figure 2007504244
    Figure 2007504244
    Figure 2007504244
     。
  44. 前記オゾン化産物が、哺乳動物の循環血から除去される、請求項４０に記載の方法。
  45. 前記オゾン化産物が、哺乳動物の血液から生体外で除去される、請求項４０に記載の方法。
  46. 前記結合実体または前記抗体が、局所組織に対して局所的様式で投与される、請求項４０に記載の方法。
  47. 哺乳動物の癌を治療または予防する方法であって、コレステロールの細胞傷害性オゾン化産物に連結した抗体を該哺乳動物に投与する工程を包含し、該抗体は癌細胞に結合することが可能である、方法。
  48. 哺乳動物の不適切な免疫応答を治療または予防する方法であって、コレステロールの細胞傷害性オゾン化産物に連結した抗体を該哺乳動物に投与する工程を包含し、該抗体は、該不適切な免疫応答に関与する免疫細胞に結合することが可能である、方法。
  49. 抗体からの、活性酸素種の産生を調節する因子を同定するための方法であって、
    （ａ）抗体および候補因子を結合する工程、
    （ｂ）形成された活性酸素種の量を決定する工程、および、
    （ｃ）形成された活性酸素種の量を、該候補因子なしで該抗体から形成された活性酸素種の量を決定することによって得られた標準値と比較する工程、
    を包含する、方法。
  50. 前記活性酸素種がオゾンである、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記抗体は、式４ａ〜１５ａまたは７ｃのうちのいずれか一つを有するコレステロールオゾン化産物に結合することが可能である、請求項４７〜４９のいずれか１項に記載の方法
    Figure 2007504244
    Figure 2007504244
    Figure 2007504244
    Figure 2007504244
     。
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