CN1875030A - 用于治疗和预防动脉粥样硬化和/或心血管疾病的胆甾醇臭氧化产物 - Google Patents

Abstract

如本发明中所述，当胆甾醇存在于动脉粥样硬化斑块中时，其可被氧化。该反应产生细胞毒性胆甾醇氧化或臭氧化产物。本申请涉及胆甾醇臭氧化产物、对抗这些产物的结合实体以及应用这些结合实体和细胞毒性治疗各种疾病的方法。

Description

用于治疗和预防动脉粥样硬化和/或心血管疾病的胆甾醇臭氧化产物

                     相关申请

本申请要求2003年9月5日提交的临时申请序号60/500,845和2003年11月6日提交的临时申请序号60/517,940的优先权，所述两个申请的公开内容全部结合到本发明中。

                   政府权利声明

本文所述的发明在由国家健康所(National Institutes of Health)授权的准许号POCA 27489之下，在美国政府支持下做出的。

                     发明领域

本发明涉及通过阻碍在动脉粥样硬化病变(lesions)中产生的胆甾醇臭氧化产物的作用而治疗和预防动脉粥样硬化和/或心血管疾病的组合物及方法。根据本发明中所述，胆甾醇臭氧化产物是能改变低密度脂蛋白(LDLs)中的蛋白质的二级结构、促进脂质吸收和增加泡沫细胞形成的细胞毒素。本发明的细胞毒性胆甾醇臭氧化产物还能用于治疗或预防自身免疫性疾病、癌症、肿瘤、细菌感染、病毒感染、真菌感染、溃疡和/或其它其中局部给予细胞毒素有益的疾病。

                     发明背景

在大多数国家，心血管疾病一直是主要的疾病之一和死亡率主要的原因之一。大约有三分之一的男性在60岁之前患有一种主要的心血管疾病。虽然女性最初显示较低的风险(1比10的比率)，但心血管疾病随年龄增加变得更加普遍。例如，65岁以后，女性患心血管疾病与男性几乎相同。诸如冠心病、休克、再狭窄和外周血管病等的血管病一直是全世界死亡率和残障(handicap)的主要原因之一。

虽然医生鼓励改变饮食和生活方式以降低心血管疾病的发生，但导致血脂异常的遗传性倾向是影响因血管疾病所致休克和死亡的主要因素。因此，需要对其形成有新的了解并对有问题的动脉粥样硬化病变有新的治疗方法。

                    发明概述

发明人以前已表明诸如臭氧等的活性氧形式是由抗体所产生。Wentworth等，Science 298，2195(2002)；Babior等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100，3920(2003)；P.Wentworth等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100，1490(2003)。本申请提供的事实表明诸如臭氧等的活性氧形式以及胆甾醇臭氧化产物是由动脉粥样硬化斑块物质所产生。

根据本发明，胆甾醇臭氧化产物存在于动脉粥样硬化斑块中，并可恶化或加速有问题斑块的集结的发展。例如，胆甾醇臭氧化产物通过巨噬细胞促进脂质的吸收并加速泡沫细胞形成的速率。胆甾醇臭氧化产物还能可逆性地影响脱辅基蛋白B₁₀₀的二级结构以及其中发现脱辅基蛋白B₁₀₀的低密度脂蛋白(LDL)的二级结构。

如本发明中所述，胆甾醇臭氧化产物是动脉粥样硬化病变的标记物。不产生臭氧的抗体以及其它与胆甾醇臭氧化产物结合的结合剂可被用于失活或抑制胆甾醇臭氧化产物的毒性，从而用于治疗或预防动脉粥样硬化。因此，本发明提供直接对抗胆甾醇臭氧化产物的抗体和结合实体。

本发明还涉及一种治疗或预防哺乳动物动脉粥样硬化的方法，该方法通过给予所述哺乳动物一种抗体和结合实体，所述抗体和结合实体具有一个与其相连的治疗剂，其中所述抗体和结合实体能够与存在于动脉粥样硬化病变的分子或抗原结合，例如，一种胆甾醇臭氧化产物。

本申请还涉及胆甾醇臭氧化的细胞毒性产物以及应用这些细胞毒性的胆甾醇臭氧化产物治疗以下疾病的方法：自身免疫性疾病、癌症、肿瘤、细菌感染、病毒感染、真菌感染、溃疡和或其它其中局部给予细胞毒素有益的疾病。

本发明的一个方面是一种可对原核或真核细胞具有细胞毒性的分离的胆甾醇臭氧化产物。这种臭氧化产物可引起巨噬细胞脂质的吸收或泡沫细胞的形成。本发明的臭氧化产物还可改变低密度脂蛋白中蛋白质的二级结构。例如，本发明的臭氧化产物可改变脱辅基蛋白B100的二级结构。

本发明的臭氧化产物包括具有下式4a-15a、7c或其组合的任何之一的任何化合物。

本发明的另一方面是一种治疗或预防动脉粥样硬化病变的标志物，其包含具有式4a或式5a的胆甾醇臭氧化产物。

本发明的另一方面是一种组合物，其包含载体和可对原核或真核细胞具有细胞毒性的分离的胆甾醇臭氧化产物。所述胆甾醇臭氧化产物可以是任何一种上述的胆甾醇臭氧化产物。

本发明的另一方面是一种可与胆甾醇臭氧化产物结合的分离的结合实体。所述结合实体可结合的胆甾醇臭氧化产物可以是例如具有式4a-15a、7c或其组合的任何之一的任何化合物。在某些实施方案中，所述臭氧化产物为4a或5a。所述结合实体可以是例如一种抗体。所述结合实体可以由对抗一种半抗原例如具有式13a、14a或15a的半抗原所产生。抗体结合实体的实例包括源自具有ATCC保藏编号PTA-5427或PTA-5428的杂交瘤KA1-11C5或KA1-7A6的抗体。抗体结合实体的其它实例包括源自具有ATCC保藏编号PTA-5429和PTA-5430的杂交瘤KA2-8F6或KA2-1E9的抗体。

在某些实施方案中，本发明的结合实体与治疗剂相连接。所用的治疗剂可例如降低动脉粥样硬化病变或者进一步预防动脉梗塞。可与本发明结合剂使用的治疗剂的实例包括抗氧化剂、抗炎剂、药物、小分子、肽、多肽或核酸。

本发明的另一方面是一种与胆甾醇臭氧化产物连接的分离的结合实体，其中所述胆甾醇臭氧化产物对原核或真核细胞具有细胞毒性。

本发明的另一方面是一种治疗患者动脉粥样硬化的方法，该方法包含给予该患者可与胆甾醇臭氧化产物结合的结合剂。所述结合剂结合的胆甾醇臭氧化产物可以是一种具有任何一种式4a-15a或7c的化合物。所述结合剂优选不产生活性氧的形式。在某些实施方案中，所述结合实体与治疗剂连接。这些治疗剂可帮助减慢动脉粥样硬化病变的扩大或者减小动脉粥样硬化病变的体积。可用的治疗剂的实例包括抗氧化剂、抗炎剂、药物、小分子、肽、多肽或核酸。

本发明的另一方面是一种杀死患者靶细胞的方法，该方法通过给予该患者能与所述靶细胞结合的结合剂进行，其中所述结合剂与胆甾醇臭氧化产物连接。这种结合实体可以是一种抗体。在该实施方案中，该结合实体或抗体能产生活性氧的形式。所述抗体也与能产生单线态氧的化合物连接。能产生单线态氧的化合物的实例包括内过氧化物，如蒽-9，10-二丙酸内过氧化物(endoperoxide)。能产生单线态氧的化合物的其它实例包括诸如下列的化合物：蝶呤、黄素、血卟啉、四(4-磺化苯基)卟啉、联吡啶基钌(II)复合物、玫瑰红染料、醌、罗丹明染料、酞菁染料、竹红菌甲素(hypocrellin)、rubrocyanin、频哪氰醇或别菁。

本发明的另一方面是一种从哺乳动物中除去细胞毒性的胆甾醇臭氧化产物的方法，该方法通过采用一种能与胆甾醇臭氧化产物结合的结合实体或抗体，从哺乳动物的体液中分离出所述细胞毒性的胆甾醇臭氧化产物进行。可从哺乳动物的循环血液中除去所述臭氧化产物。在另一实施方案中，可从哺乳动物的血液中体外除去所述臭氧化产物。在另一实施方案中，以局部化定位的方式给予局部组织所述结合实体或抗体。

本发明的另一方面是一种治疗或预防哺乳动物癌症的方法，该方法通过给予该哺乳动物能与细胞毒性的胆甾醇臭氧化产物连接的抗体进行，其中所述抗体能与癌细胞结合。

本发明的另一方面是一种治疗或预防哺乳动物的不适当的免疫反应的方法，该方法通过给予该哺乳动物能与细胞毒性的胆甾醇臭氧化产物连接的抗体进行，其中所述抗体能与涉及所述不适当的免疫反应的免疫细胞结合。

本发明的另一方面是一种鉴定能调节抗体中活性氧形式产生的药物的方法，该方法通过以下步骤进行：(a)使抗体与候选药物结合；(b)测定形成的活性氧形式的量；和(c)将形成的活性氧形式的量与通过测定无候选药物的抗体形成的活性氧形式的量所得到的标准值相比较。在某些实施方案中，所述活性氧形式为臭氧。

                        图示说明

图1A-D显示通过4-β-佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)-处理的人动脉粥样硬化病变，将靛蓝胭脂红1氧化形成靛红磺酸2。

图1A说明在通过臭氧将靛蓝胭脂红1转化形成靛红磺酸2的过程中发生的化学变化。

图1B说明通过PMA-激活的动脉粥样硬化病变将靛蓝胭脂红1脱色。各玻璃管中装有等量的动脉粥样硬化斑块(净重约50mg)在靛蓝胭脂红1(200μM)和牛过氧化氢酶(50μg)的pH7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS，10mM磷酸钠，150mM NaCl)的溶液中的分散液。向右侧管中加入PMA(10μL，40μg/mL)的DMSO溶液后30分钟，给样本照相。向左侧管中加入同样体积的无PMA的DMSO。反应混合物的总体积为1mL。

图1C显示通过反相HPLC分析，在图1B中所示的+PMA管的上清液中，出现新的HPLC峰。该新的峰对应于靛红磺酸2，其保留时间(R_T)约为9.71min。

图1D显示一种上清液的负离子电喷物质谱图，该上清液为离心的PMA-激活的人动脉粥样硬化斑块物与如上图1B中所示的靛蓝胭脂红1反应的上清液。当采用指示剂靛蓝胭脂红1在H₂ ¹⁸O中进行悬浮斑块物质的PMA-激活时，通过分离的断裂产物靛红磺酸2的质谱图中[M-H]^-230质量碎片峰的表观和相对密度可见，大约40％靛蓝胭脂红1的内酰胺羰基氧结合¹⁸O。正常水(H₂ ¹⁶O)存在下由靛蓝胭脂红1形成的靛红磺酸2具有质量碎片峰[M-H]^-228。

图2A说明涉及胆甾醇3臭氧分解得到5，6-secosterol 4a，而4a可被醛醇化转化为5a的化学步骤。用2，4-二硝基苯肼(2mM的0.08％HCl溶液)衍生化分别得到腙衍生物4b和5b。在该衍生化过程中，由4a形成5b的量约为20％。5a和5b的构型排列如K.Wang，E.Bermudez，W.A.Pryor，Steroids 58，225(1993)所述。

图2B显示氧化型胆甾醇6a-9a和2，4-二硝基苯肼盐酸盐衍生物6b-7b的结构，根据图3中[M-H]^-579的约18min洗脱峰为标准确定。采用真实合成的7b物质，以¹H-¹H ROESY实验为基础确定7a-7b的构型排列。

图3A-E说明采用液相色谱质谱联用仪(LCMS)对斑块物质和腙的化学合成真实样本4b、5b和6b的分析。用2，4-二硝基苯肼盐酸盐(DNPH HCl)衍生化后的斑块提取物的测定条件：Adsorbosphere-HSRP-C18柱，75％乙腈、20％水、5％甲醇，0.5mL/min流速，360nm检测，在线负离子电喷物质谱(MS)(Hitachi M8000仪)。

图3A显示斑块物质不经PMA活化但按本文所述用2，4-二硝基苯肼衍生化后的LCMS分析图。在用PMA(40μg/mL)活化前，对动脉粥样硬化病变检测化合物4b(RT～14.1min)、5b(RT～20.5min)和6b(RT～18min)。

图3B显示为斑块物质经PMA(40μg/mL)活化、提取以及按如上所述用2，4-二硝基苯肼衍生化后的LCMS分析图。在用PMA(40μg/mL)活化后，在动脉粥样硬化病变检测到大量的化合物4b(RT～14.1min)、较少量的化合物6b(RT～18min)。

图3C说明真实4b的HPLC分析图；插图为质谱分析图。

图3D说明真实6b的HPLC分析图；插图为质谱分析图。

图3E说明真实5b的HPLC分析图；插图为质谱分析图。

图4A-D显示为提取和衍生化的动脉粥样硬化物质的HPLC-MS分析图，其中检测痕量腙使用的进样体积为100μl。图4A显示采用以上详述的条件测定的时间对强度的LC图。R_T 26.7为7b(对应于真实物质)。在R_T～24.7处的峰为一种未知具有[M-H]^-461的腙。图4B提供[M-H]^-597的单一离子监测。图4C提供[M-H]^-579的单一离子监测。图4D提供[M-H]^-461的单一离子监测。

图5A-C显示为患者A-N的动脉粥样硬化提取物中胆甾醇臭氧化产物的浓度。

图5A为显示从患者的动脉粥样硬化病变中提取并衍生化的4a后、用PMA活化之前和活化之后，所测定的腙4b的浓度的条形图。该条形图显示，采用Macintosh的GraphPad Prism V3进行Student t-检验(双尾)(p＜0.05，n＝14)分析所测定的活化之前和活化之后所检测的很多量的值。

图5B为显示从患者的动脉粥样硬化病变中提取并衍生化的5a后、用PMA活化之前和活化之后，所测定的5b的浓度的条形统计图表(n＝14)。

图5C为一幅显示从患者的血浆样本中提取并衍生化的5b后，所测定的5a的浓度的条形统计图表。对A部分(n＝8)患者在24小时内进行颈动脉内膜切除术操作(收集样本后进行3日血浆分析)。B部分(n＝15)患者随机选自一个综合性医院门诊部的患者(收集样本后进行7日血浆分析)。注意到在5a的初步调查血浆水平中，每日约下降5％。在该分析条件下，4b和5b的检测限为1-10nM。因此，在当无明显的4b或5b情况下，4b或5b的水平低于10nM。

图6A说明3、4a和5a对B-细胞(W1-L2)细胞系的细胞毒性。各数据点为至少两次测定的平均值。采用Macintosh计算机的GraphPadPrism v3.0软件，用非线性回归分析(Hill图分析)计算4a(■)和5a(▲)的IC₅₀s±标准差。在该浓度范围内未发现3()的细胞毒性。

图6B说明3、4a和5a对T-细胞(Jurkat)细胞系的细胞毒性。各数据为至少两次测定的平均值。采用Macintosh计算机的GraphPad Prismv3.0软件，用非线性回归分析(Hill图分析)计算4a(■)和5a(▲)的IC₅₀s±标准差。在该浓度范围内未发现3()的细胞毒性。

图7A-B说明胆甾醇臭氧分解产物4a和5a通过巨噬细胞增加载脂而产生泡沫细胞。

图7A显示与J774.1巨噬细胞培养的LDL对那些巨噬细胞的载脂几乎无影响。现将巨噬细胞在含有10％胎牛血清的RPMI-1640中培养24小时，然后在含有LDL(100μg/mL)的相同培养基中培养72小时。将细胞用4％甲醛固定，用苏木精和红油O染色，使得脂质颗粒染成深红色。放大倍率x100。

图7B显示与臭氧分解产物4a培养的LDL诱导巨噬细胞载脂以产生泡沫细胞。将J774.1巨噬细胞先在含有10％胎牛血清的RPMI-1640中培养24小时。然后在含有LDL(100μg/mL)和臭氧分解产物4a(20μM)的相同培养基中培养72小时。将细胞用4％甲醛固定，用苏木精和红油O染色，使得脂质颗粒染成深红色。放大倍率x100。注意到臭氧分解产物4a对巨噬细胞的作用与臭氧分解产物5a的作用没有区别。

图8A-C说明通过园二色性谱检测，通过暴露于臭氧分解产物4a或5a可改变LDL的二级结构。每份样本的报告的结果来源于至少两份试验。

图8A表明正常LDL的蛋白含量具有较大比例的α螺旋状结构(～40±2％)以及较少量的β结构(～13±3％)、β旋转’(turn’)(～20±3％)和随机盘绕(～27±2％)。图8A表明在37℃下，在PBS(pH7.4)中，LDL(100μg/mL)的时间依赖性园二色散光谱。

图8B表明LDL与臭氧分解产物4a在37℃下的PBS(pH7.4)中培养能减少apoB-100的二级结构。图8A表明LDL(100μg/mL)和4a(10μM)在37℃下的PBS(pH7.4)中的时间依赖性园二色散光谱。

图8C表明LDL与臭氧分解产物5a在37℃下的PBS(pH7.4)中培养能减少apoB-100的二级结构。图8A表明LDL(100μg/mL)和5a(10μM)在37℃下的PBS(pH7.4)中的时间依赖性园二色散光谱。

图9显示丹酰肼胆甾醇臭氧化产物4a和5a(分别为4d和5c)的结构以及这些肼衍生物的HPLC洗脱方式。如图所示，胆甾醇臭氧化产物4a和5a能引起具有不同HPLC保留时间的丹酰腙轭合。

图10说明通过气相色谱-质谱(GCMS)分析，可检测人颈动脉样本中的胆甾醇臭氧化产物。所示的色谱图为典型的动脉粥样硬化斑块提取物的谱图。22.49分钟洗脱的峰为对应于胆甾醇臭氧化产物4a和5a的峰。插入的质谱色谱图说明22.49分钟洗脱的碎片具有m/z 354。

图11提供两种动脉粥样硬化斑块(P1和P2)的ID-GCMS定量分析图。所检测的胆甾醇臭氧化产物4a和5a的量为每mg组织约80-100pmol，该量与LC-MS分析测定的结果类似。每个条形代表一式两份的提取物，并以平均值±SEM报告。

                        发明详述

根据本发明，胆甾醇臭氧化产物存在于动脉粥样硬化斑块中，那些胆甾醇臭氧化产物可加速或促进动脉粥样硬化的发展，例如通过改变脱辅基蛋白B₁₀₀的结构以及其中发现脱辅基蛋白B₁₀₀的低密度脂蛋白(LDLs)的结构、通过加速巨噬细胞的脂质吸收以及通过增大所形成的泡沫细胞的数量。因此，胆甾醇臭氧化产物可加速晚期动脉粥样硬化病变的形成，该病变很可能导致问题性的血管疾病症状，例如心脏病发作、充血性心力衰竭、休克等。

本发明还提供用作动脉粥样硬化的标记物的胆甾醇臭氧化产物。还提供可抵消胆甾醇臭氧化产物的作用的组合物、药剂盒和结合剂。这些组合物、药剂盒和结合剂可用于治疗和预防动脉粥样硬化、心血管疾病和其它血管疾病。

在另一实施方案中，本发明提供作为细胞毒素的胆甾醇臭氧化产物以及应用这些细胞毒性的臭氧化产物治疗以下疾病的方法：自身免疫性疾病、癌症、肿瘤、细菌感染、病毒感染、真菌感染、溃疡和/或其它其中局部给予细胞毒素有益的疾病。

胆甾醇臭氧化

根据本发明，通过活性氧形式(如臭氧)，可将动脉粥样硬化斑块物质中的胆甾醇氧化。大量的胆甾醇臭氧化产物通过该过程产生，并可在动脉粥样硬化患者中提取的组织或体液中检测所述臭氧化物。

胆甾醇具有以下结构(3)。

当胆甾醇沉积在动脉中时，可形成动脉粥样硬化斑块。如本发明所述，动脉粥样硬化斑块可释放活性氧形式，如臭氧；这些动脉粥样硬化斑块物质还产生胆甾醇臭氧化产物。虽然不希望受限于具体的机制，但巨噬细胞、嗜中性粒细胞、抗体和其它免疫细胞似乎与动脉粥样硬化病变有关，并能释放活性氧形式，如臭氧。所产生的活性氧形式与病变部位的胆甾醇反应，将胆甾醇氧化成大量可在患者的生理样本中检测到的产物。

例如，当胆甾醇3被氧化时，断-酮醛(seco-ketoaldehyde)4a及其羟醛加成物5a为形成的主要产物。

另外，还可发现具有如化合物6a-15a和7c那些结构的胆甾醇臭氧化产物。

根据本发明，所述断-酮醛4a、其羟醛加成物5a以及相关化合物如6a-15a或7c存在于从患有动脉粥样硬化的患者中提取的动脉粥样硬化斑块物质中。另外，存在于患者血流中的所述断-酮醛4a、其羟醛加成物5a以及相关化合物如6a-15a或7c的量与患者中动脉粥样硬化斑块形成的程度和严重性相关。

例如，在患有足以发展成为确保进行动脉内膜切除术的动脉粥样硬化疾病的8名患者中的6名患者的血流中，检测到的羟醛5a的量的范围为70-1690nM(图5C)。但是，从随机选自综合性医疗诊所的一组患者的15份血浆样本中，仅有一份可检测到羟醛5a。

另外，根据本发明，胆甾醇臭氧化产物能氧化性地改变LDL和/或脱辅基蛋白B₁₀₀(apoB-100)，LDL的蛋白组分。用断-酮醛4a或其羟醛加成物5a处理LDL可降低α-螺旋状的含量并能增加LDL和/或apoB-100的随机盘绕含量，从而改变该复合物的二级结构。更明显地是，所述断-酮醛4a或羟醛加成物5a可增加巨噬细胞的脂质吸收并促进泡沫细胞的形成。

本发明提供抵消胆甾醇臭氧化产物的负性作用的方法。

阻碍胆甾醇臭氧化产物的作用的方法

根据本发明，可通过与这些胆甾醇臭氧化产物结合的药物控制或抑制胆甾醇臭氧化产物的负性作用。在其它实施方案中，可将胆甾醇臭氧化产物用作动脉粥样硬化病变的标记物和位点特异性的抗体，这样可将治疗剂转运至动脉粥样硬化病变中。

因此，本发明涉及治疗或预防血管疾病、涉及胆甾醇堆积的循环疾病以及与细胞毒性胆甾醇臭氧化产物的释放相关的疾病。这些疾病可能与解剖学部位或系统中的脉管系统的损伤、损害或破坏有关。术语“血管病症”或“血管疾病”指其中血流被损害或变坏的血管组织的状态。

可通过本发明治疗或预防的血管疾病为哺乳动物的血管疾病。词语哺乳动物指任何哺乳动物。哺乳动物的某些实例包括例如宠物动物，如狗和猫；农场动物，如猪、牛、羊和山羊；实验动物，如小鼠和大鼠；灵长类的动物，如猴、猿和黑猩猩；以及人。在某些实施方案中，优选通过本方法治疗人。

可用本发明的组合物和方法治疗或预防的血管病症和疾病的实例包括动脉粥样硬化(或动脉硬化症)、子痫前症、外周血管疾病、心脏病和休克。因此，本发明涉及治疗诸如以下疾病的方法：中风、动脉粥样硬化、急性冠心病综合征(包括不稳定性心绞痛、血栓症和心肌梗塞)、斑块破裂、冠状动脉或外周动脉中的原发性和继发性(支架)再狭窄、移植诱发的硬化症、外周肢端病、间歇性跛行和糖尿病复症(包括缺血性心脏病、外周动脉疾病、充血性心力衰竭、视网膜病、神经病和肾病)、中风或血栓症。

本发明提供的方法和药物还可用于动脉粥样硬化斑块发展的任何阶段。根据美国心脏学会采取的以及该研究使用的一种新的分类方法，可将动脉粥样硬化发展过程中的8种病变的类型区别分类。

I型病变由内膜中的小脂质沉淀(细胞内及巨噬细胞的泡沫细胞中)所形成，能引起动脉壁内的最初和最小的变化。这些变化不增厚动脉壁。

II型病变的特征在于增加内膜厚度不大于1毫米的脂肪条痕，包括着色的条痕或斑纹。它们由比I型病变中发现的更多的脂质聚集组成。脂质含量约为病变干重的20-25％。大部分该脂质处于细胞内，主要在巨噬细胞的泡沫细胞以及平滑肌细胞中。细胞外空间可含有脂质小滴，但它们比细胞内的那些更小，并可含有小血管颗粒。以前将这些脂质小滴认为是由胆甾醇酯(胆甾醇基油酸酯和胆甾醇基亚油酸酯)、胆甾醇和磷脂构成。根据本发明，胆甾醇臭氧化产物可促进与动脉粥样硬化病变形成相关的细胞吸收脂质。另外，类似本文所述的胆甾醇臭氧化产物可在这些细胞之内或之外聚集。

III型病变也被描述为前动脉粥样化(preatheroma)病变。在III型病变内，内膜比II型病变中发现的仅稍为增厚。III型病变不阻碍动脉血流。细胞外脂质和囊状颗粒与II型病变中发现的相同，但是存在的量增加(约为25-35％干重)，并开始小量聚集。

IV型病变与动脉粥样化相关。它们为月牙形状并增加动脉的厚度。除使患者具有很高的血浆胆甾醇水平外，该斑块可以不使动脉内腔变得很狭窄(对于大多数人，通过血管照相术并不能发现病变)。IV型病变由内膜层(有时称为脂质核)中胞外脂质的大量聚集(约为60％干重)而组成。该脂质核可含有小量矿物质。这些病变易于破裂并形成管壁血栓症。

V型病变与纤维化动脉粥样化相关。它们具有一或多层主要由I型胶原蛋白组成的纤维组织。V型病变壁厚度增加，原因是动脉粥样硬化的发展增加了内腔的减小。这些病变具有进一步再细分的特征。在Va型病变中，新组织是具有脂质核病变的一部分。在Vb型病变中，脂质核和病变的其它部分被钙化(导致VII型病变)。在Vc型病变中，脂质核不存在，而脂质通常极小(导致VIII型病变)。通常，经历破坏的病变为Va型病变。它们相对柔软，具有高浓度的胆甾醇酯而非游离的胆甾醇单水合物结晶。V型病变能破裂并形成管壁血栓症。

VI型病变是迭加在IV型和IV型病变之上的、具有斑块表面破坏的复杂的病变，如裂缝、侵蚀或溃疡(VIa型)、血肿或充血(VIb型)和血栓堆积(VIc型)。VI型病变具有增厚的病变，内腔经常完全被封闭。这些斑块可转化为V型斑块，但是它们更大并更能引起阻塞。

VII型病变是钙化的病变，其特征在于更严重的斑块的大面积矿物化。矿物化采用磷酸钙和磷灰石形式，代替了死细胞和胞外脂质的聚集残余物。

VIII型病变是主要由胶原蛋白层和极少量脂质组成的纤维化病变。VIII型病变是血栓的脂质衰退或普遍性转化为胶原蛋白的脂质病变的脂质病变的结果。这些病变可阻塞中等大小的动脉的内腔。

虽然现认为内皮损伤是动脉粥样硬化病变形成的最初步骤，但是这些损伤经常导致胆甾醇聚集、内膜增厚、细胞增值以及结缔组织纤维形成。现已发现损伤内皮细胞和非内皮化内膜中IgG和补充因子C3的聚集。源于血液中的单核噬菌细胞也是动脉粥样硬化病变内的细胞群的一部分。

根据本发明，这些抗体和免疫细胞的聚集可导致产生活性氧形式，该活性氧形式依次可有助于形成胆甾醇臭氧化产物。如上所述，与动脉粥样硬化病变形成相关的细胞内脂质的聚集是严重的动脉粥样硬化病变发展的关键步骤之一。斑块形成的一个机理是脂肪堆积导致巨噬细胞的流入，然后依次流入T细胞、B细胞和抗体产物。如本发明所示，本发明的胆甾醇臭氧化产物促进巨噬细胞吸收脂质并增加巨噬细胞的泡沫细胞的形成。因此，发明人表明胆甾醇臭氧化产物可加速炎性血管疾病，如动脉粥样硬化。

本发明涉及用于预防和治疗血管疾病和病症的治疗性组合物和方法。本发明提供的组合物可用于治疗各种不同的血管病症。

在一实施方案中，本发明提供一种涉及给予哺乳动物能与胆甾醇臭氧化产物结合的抗体或结合剂的方法。这种抗体或结合实体调节胆甾醇臭氧化产物并抑制这样的臭氧化产物的载脂和泡沫细胞产生的活性。优选本方法中所用的抗体不产生活性氧形式，如臭氧。抗体或结合剂可结合本文所述的任何胆甾醇臭氧化产物，例如断-酮醛4a、其羟醛加成物5a或相关的化合物6a-15a或7c。这些抗体和结合实体可用半抗原产生，所述半抗原结构上与胆甾醇臭氧化产物相关，并产生与天然产生的胆甾醇臭氧化产物交互反应的抗体或结合实体制备物。

例如，在另一实施方案中，本发明提供具有任何一种式3c、13a、13b、14a、14b、15a或15b的半抗原，所述半抗原可用于产生能与胆甾醇臭氧化产物反应的抗体。

杂交瘤KA1-11C5和KA1-7A6是由对抗式15a化合物而产生，在2003年8月29日的布达佩斯条约规定下，保存在美国典型培养物保藏中心(10801 University Blvd.，Manassas，Va.，20110-2209 USA(ATCC))，ATCC保藏编号为ATCC保藏编号PTA-5427和PTA-5428。杂交瘤KA2-8F6和KA2-1E9是由对抗式14a化合物而产生，也在2003年8月29日布达佩斯条约规定下，保存在ATCC，ATCC保藏编号为ATCC PTA-5429和PTA-5430。

在另一实施方案中，胆甾醇臭氧化产物用作动脉粥样硬化病变的靶标或标记物。由此，可给予患有动脉粥样硬化的哺乳动物连接于能够结合胆甾醇臭氧化产物的结合实体的治疗剂。因此，为治疗或预防动脉粥样硬化和相关血管疾病，可将胆甾醇臭氧化产物用作动脉粥样硬化病变的靶标或标记物。任何胆甾醇臭氧化产物，例如所述断-酮醛4a、其羟醛加成物5a和/A-环脱水产物6a，可用作动脉粥样硬化斑块的靶向结合实体和/或治疗剂的标记物。另外，具有式7a-15a或7c的任何胆甾醇臭氧化产物都可用作动脉粥样硬化斑块的靶向结合实体和/或治疗剂。

所设计的结合实体不仅能与胆甾醇臭氧化产物结合，还可转运能局部作用降低动脉粥样硬化病变或进一步预防动脉栓塞的治疗剂或药物。另外，所述治疗剂可阻断、屏蔽或抑制胆甾醇臭氧化产物的负性作用。因此，可给予患有血管疾病(如动脉粥样硬化)的患者连接于能够结合胆甾醇臭氧化产物的结合实体的治疗剂。

能够识别胆甾醇臭氧化产物并能用于本发明方法中的结合实体包括能够结合胆甾醇臭氧化产物的任何小分子、多肽或者抗体。以下进一步详述此类多肽和抗体。

能连接于这些结合实体的治疗剂包括任何氧化剂、药物、因子、化合物、肽、多肽、核酸或其它本领域技术人员选择用于降低氧化作用或治疗动脉粥样硬化的药物。可使用能抵制胆甾醇臭氧化产物的活性或者用于溶解、消化、破坏或抑制动脉粥样硬化斑块生长或者其它减缓动脉粥样硬化发展的任何治疗剂。

治疗剂还包括活性代谢物及其前药。活性代谢物是当治疗剂代谢时所产生的治疗剂的衍生物。前药是一种或者代谢为治疗剂或者代谢为一种活性代谢物的化合物。可使用本发明给予诸如以下的治疗剂：小分子量化合物、抗氧化剂、放射性核素、药物、酶、肽、蛋白质、核酸，它们可编码治疗性多肽、表达载体、反义-RNA、小干扰RNA、核酶或抗体。

例如，可用本发明的结合实体转运纤维蛋白溶解剂。这些治疗剂包括例如血栓溶解剂(如溶栓酶、组织血纤维蛋白溶酶原活化剂、血纤维蛋白溶酶和尿激酶)、抗血栓剂(如组织因子蛋白酶抑制剂(TFPI))、抗炎剂、金属蛋白酶抑制剂、线虫提取的抗凝血蛋白(NAPs)、抑制细胞生长的药物、抑制细胞生长因子的药物等。可与本发明的结合实体连接的治疗剂的其它实例包括下列：

1)调节血脂水平的药物，例如HMG-CoA还原酶抑制剂、拟甲状腺素、贝特类药物、过氧物酶体增殖-激活受体的激动剂(PPAR)(包括PPAR-α、PPAR-γ和/或PPAR-δ)；

2)控制和调节氧化过程的药物，例如抗氧化剂、活性氧形式调节剂、胆甾醇臭氧化产物改性剂、或者改变脂蛋白的因子(包括胆甾醇臭氧化产物)的调节剂；

3)控制和调节胰岛素抗性和/或活性或葡萄糖代谢或活性的药物，包括但不限于PPAR-α、PPAR-γ和/或PPAR-δ的激动剂、DPP-IV的改性剂和糖皮质激素的调节剂；

4)控制和调节任何血管位置中内皮细胞或平滑肌细胞上受体或粘附分子或粘合素的表达的药物；

5)控制和调节任何血管位置中内皮细胞或平滑肌细胞的活性的药物；

6)控制和调节炎症相关受体的药物，所述受体包括但不限于趋化因子受体、RAGE、toll样受体、血管紧缩素受体、TGF受体、白细胞介素受体、TNF受体、C-反应性蛋白受体以及其它涉及炎症信号途径(包括NF-kb的激活)的受体；

7)控制和调节内皮细胞、血管平滑肌或淋巴细胞、单细胞以及粘附于血管或在血管中的嗜中性粒细胞的增值、凋亡或坏死的药物；

8)控制和调节胞外基质蛋白(包括但不限于胶原蛋白、弹性蛋白和蛋白聚糖)的产生、降解或交联的药物；

9)控制和调节哺乳动物脉管内任何类型的细胞的活化、分泌或载脂的药物；

10)控制和调节哺乳动物脉管内树状细胞的活化、增殖或任何其它改性的药物；

11)控制和调节能改变在血管壁的水平的血小板活动的活化、粘附或任何其它过程的药物；

12)通过抗体和/或动脉粥样硬化斑块物质控制和调节臭氧产生的药物；和

13)抗炎剂，如布洛芬、乙酰水杨酸、酮布芬等。

本发明的结合实体可与这些治疗剂共价连接或者与这些治疗剂缔合。可用带有所述结合实体并含有治疗剂的脂质体促进治疗剂的转运。当给药时，所述治疗剂通过结合实体定位于动脉粥样硬化病变的位点处，并帮助控制、减少或促进动脉粥样硬化病变域中改善的动脉血流。还可用本发明的结合实体转运纳米粒子，如基因治疗的载体。

本发明所预期的治疗剂还包括“抗氧化剂”，即对一种氧化剂具有拮抗作用的任何分子。这样定义的抗氧化剂包括1)通过抗体产生的臭氧或活性氧形式的抑制剂，2)胆甾醇臭氧化产物抑制剂，3)胆甾醇臭氧化产物引起的毒性作用的抑制剂。优选的抗氧化剂包括能抑制胆甾醇臭氧化产物产生以及中和已形成的胆甾醇臭氧化产物的那些物质。抗氧化剂作用可通过任何机理进行，包括催化作用。一类抗氧化剂包括活性氧形式的清除剂、臭氧清除剂或游离基清除剂。抗氧化剂可具有不同的类型，使得如果及当需要它们时得以提供。对于需氧生物中存在的氧，抗氧化剂可以存在于不同的细胞、组织、器官和胞外区室中。后者包括胞外流体间隙、眼内流体、滑液流体、脑脊髓流体、胃肠道分泌液、间质流体、血液和淋巴流体。抗氧化剂可通过补充于饮食中或通过注射、静脉内给药等提供。

可使用的抗氧化剂的实例包括但不限于抗坏血酸、α-生育酚、γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸、γ-谷氨酰转肽酶、α-硫辛酸、二氢硫辛酸酯、乙酰基-5-甲氧基色胺、黄酮、flavonenes、黄酮醇、过氧化氢酶、过氧化酶、过氧化物岐化酶、金属硫因和丁羟甲苯。

在另一实施方案中，所述结合实体提供一种使用动脉粥样硬化斑块的激光血管成形术消除的途径。可将本发明的一或多个结合实体与染料轭合，该染料的最大吸收度与所用的血管成形术的激光的最大发射波长对应。给予后，带有染料的结合实体与动脉粥样硬化病变中的胆甾醇臭氧化产物结合，但基本上不与正常组织结合。可将该染料用作将激光能量聚焦于动脉粥样硬化病变上的靶标。在消除过程中，激光能量被染料吸收，由此可在疾病区域集中。因此，可增加该消除的效率，同时对周围正常组织病变最小。

现有很多种用于与结合实体轭合的荧光染料。目前已公开很多种与蛋白质(尤其是抗体)轭合的方法。对于激光血管成形术和蛋白质化学的领域中的技术人员来讲，选择轭合的染料和方法是非常显而易见的。激光血管成形术中可使用的一种染料为罗丹明。罗丹明是一种荧光染料，其各种衍生物在波长大约570nm处吸收光。

可根据现有的方法，将结合实体与染料(如罗丹明)连接起来。例如，将所述结合实体在50mM硼酸钠缓冲液pH8.2中透析。在无水丙酮中制备0.25mg/mL的丽丝胺罗丹明B磺酰氯(Molecular Probes，Inc.Eugene，Oreg.)的新配制溶液。向一玻璃管中转移一等份该溶液，该等份溶液代表比要轭合的结合实体的量超过6倍的摩尔量的罗丹明。在干燥氩气流下蒸发丙酮。将透析的抗体加入到试管中残留的罗丹明中。将管盖塞，用铝箔包裹，并在稳定振摇下在4℃下孵育3小时。

将一份等于结合实体溶液1/10体积的1.5M盐酸羟胺(Sigma)溶液(pH8.0)加入到反应混合物中。在稳定振摇下，将该溶液在4℃下孵育30分钟。然后在暗处将反应混合物用硼酸盐缓冲液充分透析。在4℃下，在暗处储存罗丹明-抗体轭合物以避免染料的光照脱色。

给予后，该标记的结合实体特异性将染料转运至动脉粥样硬化病变而不转运至正常组织。通过应用波长大约570nm的激光，可消除结合所述标记结合实体的组织。

在另一实施方案中，可用本发明的结合实体将酶特异性转运至动脉粥样硬化病变位点处。该酶可以是能够消化一或多种斑块组分的任何酶。通过蛋白质化学领域技术人员已知的多种轭合技术之一种，可将所述酶或酶的组合与结合实体轭合。

在另一种方法中，可将本发明的结合实体与酶的非活性形式偶合，例如酶原或酶-抑制剂复合物。该方法的优点为可以给予大量的酶，因此可通过循环轭合物将大量的酶转运至斑块处，同时对正常组织不产生任何破坏。所述结合实体-酶轭合物与斑块结合并且未结合的循环轭合物清除后，该酶可被激活使得开始消化斑块。活化涉及特定断裂所述酶原或除去酶抑制剂。

在另一实施方案中，识别和结合动脉粥样硬化病变中其它因子的抗体或结合实体用于转运治疗剂。已从人动脉粥样硬化斑块中提取了多种可溶性蛋白质，包括IgA、IgG、IgM、B1C(C3)、α₁-抗胰蛋白酶、α₂-巨球蛋白、纤维蛋白原、白蛋白、LDL、HDL、α₁-酸醣蛋白、β₂-醣蛋白、转铁蛋白和血浆铜蓝蛋白。还发现患病的内膜含有少量结合-IgG、IgA和B1C的组织[Hollander，W.等，Atherosclerosis，34：391-405(1979)]。在斑块和邻近的内皮组织中已发现IgG[Parums，D.等，Atherosclerosis，38：211-216(1981)，Hansson，G.等，Experimental andMolecular Pathology，34：264-280(1981)，Hannson，G.等，Acta Path.Microbiol.Immunol.Scand.Sect.A.，92：429-435(1984)]。可用任何这些蛋白质将治疗剂转运至动脉粥样硬化病变。

美国专利6,025,477提供纯化的作为动脉粥样硬化斑块的胞外组分而特定存在的抗原和直接对抗所述抗原的抗体。该抗原具有复杂的碳水化合物结构，分子量大于200,000道尔顿。杂交瘤Q10E7所述的单克隆抗体选择性与动脉粥样硬化病变结合。美国专利6,025,477结合到本文中作为参考。

在另一实施方案中，通过用结合所述臭氧化产物并促进胆甾醇臭氧化产物除去的结合实体体内处理患者或者体外处理患者的血液，可除去内源性释放至患有动脉粥样硬化的患者的血流中的细胞毒性胆甾醇臭氧化产物。如本发明所述，动脉粥样硬化患者的血浆样本具有可检测水平的胆甾醇臭氧化产物。动脉粥样硬化患者的试验组包括8名具有足以发展成为确保进行动脉内膜切除术的动脉粥样硬化疾病状态的患者。对照组患者随机选自综合性医疗诊所的患者。试验组8名患者中的6名患者具有检测到的羟醛5a的血浆水平，其量的范围为70-1690nM(参见图5)。对照组15份血浆样本中仅有一份可检测到羟醛5a。在任何患者的血液样本中实际上都没有检测到酮醛4a，但是所用的该分析检测限为约1-10nM。酮醛4a在从动脉粥样硬化病变中释放过程中或之后，可能转化为羟醛5a。因此，在所设计从动脉粥样硬化患者血流中除去细胞毒性胆甾醇臭氧化产物的疗法中，所述羟醛加成物5a可以是要除去的主要产物。

本发明提供的治疗血管病症和从血流中除去细胞毒性胆甾醇臭氧化产物的治疗方法可避免手术和其它侵害性和危险性的治疗步骤。例如，目前动脉粥样硬化的治疗方法通常分为手术方法和药物处理该疾病的方法。手术方法可能必须要进行血管移植操作以绕过阻塞区域(如冠状动脉旁路移植)、从动脉壁中除去阻塞的斑块(如颈动脉内膜切除术)或者经皮裂化斑块(如球形血管成形术)。手术疗法带有明显的风险，并且一次仅治疗单一病变。手术疗法还不能限制动脉粥样硬化的发展，且与并发症(如再狭窄)有关。

使用本发明方法靶向胆甾醇臭氧化产物可简化心脏病的治疗方法，并使患者避免手术的风险和并发症。本发明可避免手术的原因之一是在此鉴定的胆甾醇臭氧化产物似乎由动脉粥样硬化病变特异性地产生。因此，靶向那些臭氧化产物将准确并特异性地作用于动脉粥样硬化的位置和病因。类似地，从血流中除去细胞毒性臭氧化产物还可预防血管系统的损伤。

鉴别预防胆甾醇臭氧化产物的试剂

本发明还提供鉴别通过抗体阻断活性氧形式的形成的试剂的方法。这些方法包括通过抗体筛选抑制活性氧形式形成的试剂，所述抗体已由单线态氧源(¹O₂*)提供。所使用的单线态氧源(¹O₂ ^*)可以是天然的单线态氧源(¹O₂ ^*)，如一种嗜中性粒细胞。另外，单线态氧源(¹O₂ ^*)可以是合成的单线态氧源。例如，可使用“光敏剂”分子(如无金属卟啉)在暴露于诱发剂(如光)后产生单线态氧。

如发明人已表明，当抗体或嗜中性粒细胞暴露于单线态氧(¹O₂ ^*)时，基本上任何抗体或嗜中性粒细胞都能产生强力的活性氧形式，包括但不限于过氧化物基(O₂ ^-)、羟基(OH^*)、过氧化氢H₂O₂或臭氧(O₃)。参见P.Wentworth Jr.等，Science 298，2195(2002)；B.M.Babior，C.Takeuchi，J.Ruedi，A.Guitierrez，P.Wentworth Jr.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 100，3920(2003)；P.Wentworth Jr等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A100 1490(2003)。因此，此处所用术语“活性氧形式”是指抗体产生的氧形式。这些活性氧形式具有一或多种不成对的电子或者其它的活性，原因是它们易于与其它分子反应。这些活性氧形式包括但不限于过氧化物游离基、过氧化氢、羟基、过氧基、臭氧和其它具有与臭氧相同化学信号的短暂存在的三氧加成物。另外，按本发明所述的试验工作说明，臭氧产生于动脉粥样硬化病变中。

抗体将单线态氧(¹O₂ ^*)转化为活性氧形式，而不需要任何其它的免疫系统的组分，即不需要补体、级联或吞噬作用。这种从单线态氧中产生活性氧形式的能力存在于完整的免疫球蛋白和抗体片段中，如Fab、F(ab’)₂和Fv片段。该活性还与抗体分子中二硫化物的存在有关。但是，如果抗体失活，抗体从单线态氧中产生活性氧形式的能力完全被破坏。这表明抗体产生活性氧形式需要完整或基本完整的三维结构。

抗体产生活性氧形式的最低要求是存在氧气。因此，通常需要需氧条件。更具体地讲，体内使用抗体依赖于关键底物¹O₂ ^*的可利用性，而这种¹O₂ ^*产生于各种生理活动期间，因此体内可以提供。参见J.F.Kanofsky Chem.Biol.Interactions 70，1(1989)以及其中的参考文献。例如，再灌注中产生¹O₂ ^*。X.Zhai和M.Ashraf Am.J.Physiol.269(Heart Circ.Physiol.38)H1229(1995)。另外，¹O₂ ^*也产生于噬菌作用过程的嗜中性粒细胞的活化中。J.R.Kanofsky，H.Hoogland，R.Wever，S.J.Weiss J.Biol.Chem.263，9692(1988)；Babior等，Amer.J.Med.，109：33-34(2000)。

单线态氧(¹O₂)还可通过无金属卟啉前体的光照射产生。这种单线态氧向活性氧形式的生理性转化发生于光中，包括可见光、红外光和紫外光辐射条件下。当使用可见光条件时，可用能提供单线态氧源的其它分子增强单线态氧的产生。产生单线态氧的分子包括能产生单线态氧而不需要其它因素或诱发剂的分子，以及在暴露于一种诱发剂后能产生单线态氧的“光敏剂”分子。能产生单线态氧而不需要其它因素或诱发剂的分子的实例包括但不限于内过氧化物。在某些实施方案中，使用的内过氧化物可以是蒽-9，10-二丙酸内过氧化物。光敏剂分子的实例包括但不限于蝶呤、黄素、血卟啉、四(4-磺化苯基)卟啉、联吡啶基钌(II)复合物、玫瑰红染料、醌、罗丹明染料、酞菁染料、竹红菌甲素、rubrocyanins、频哪氰醇或别菁。

当光敏剂分子暴露于一种诱发剂时，可被诱发产生单线态氧。一种这类诱发剂为光。根据所述光敏剂的类型和结构不同，这种光可以是可见光、紫外光或红外光。

因此，本发明提供一种筛选可调节抗体产生的活性氧形式的试剂的方法，该方法包括使抗体和单线态氧源的混合物与药物接触，并观察是否能调节抗体产生的活性氧形式。在某些实施方案中，所述试剂优选产生较低活性的氧形式。在其它实施方案中，所述药物优选产生较高活性的氧形式。

细胞毒性胆甾醇过氧化产物的用途

如本发明所提供，所述断-酮醛4a、其羟醛加成物5a以及相关化合物6a-15a和7c对很多细胞类型具有细胞毒性。化合物7c的结构如下所示。

例如，本发明所述的断-酮醛4a及其羟醛加成物5a对下列细胞具有细胞毒性：Levy等在Cancer 22，517(1968)中所述的人B-淋巴细胞(WI-L2)；Weiss等在J.Immunol.133，123(1984)中所述的T-淋巴细胞系(Jurkat E6.1)；Folkman等在Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76，5217(1979)中描述的血管平滑肌细胞系(VSMC)和腹动脉内皮(HAEC)细胞系；Ralph等在J.Exp.Med.143，1528(1976)中描述的鼠组织巨噬细胞(J774A.1)；以及Mbawuike等在J.Leukoc.Biol.46，119(1989)中描述的肺泡巨噬细胞系(MH-S)。

使用类似的方法，发明人已表明化合物6a、7a、7c、10a、11a和12a对白细胞系具有细胞毒性，并已表明所述断-酮醛4a及其羟醛加成物5a对神经细胞系具有细胞毒性。

因此，本发明提供包含所述胆甾醇臭氧化产物的组合物以及用于治疗和预防以下疾病的方法：不适当的免疫反应、自身免疫性疾病、癌症、肿瘤、细菌性感染、病毒性感染、真菌性感染、溃疡和/或其它其中局部给予细胞毒素有益的病症或疾病。

可能必须掩盖所述细胞毒素以使胆甾醇臭氧化对非患病组织无不利影响。在制剂中掩盖4a或5a细胞毒素的方法的一个实例包括使用脂质体。例如，可将4a或5a细胞毒素置于脂质体中，然后可将结合实体定位于脂质体的磷脂膜中。该结合实体促进脂质体向患病组织的定位，而该脂质体的脂质外层保护非疾病组织免受细胞毒性胆甾醇臭氧化产物影响。该脂质体的脂质外层还能与动脉粥样硬化病变中的脂质相互作用，从而导致所述脂质体内容物的融合和释放。

治疗癌症和肿瘤

在另一实施方案中，所述细胞毒性胆甾醇臭氧化产物可用于治疗或预防癌症。因此，本发明提供包括任何化合物4a-15a和7c的抗癌细胞毒素及其药用组合物。如本发明中所述，所述4a、5a和相关化合物对很多哺乳动物细胞都具有细胞毒性，包括Levy等在Cancer 22，517(1968)中所述的人B-淋巴细胞(WI-L2)；Weiss等在J.Immunol.133，123(1984)中所述的T-淋巴细胞系(Jurkat E6.1)；Folkman等在Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76，5217(1979)中描述的血管平滑肌细胞系(VSMC)和腹主动脉内皮(HAEC)细胞系；Ralph等在J.Exp.Med.143，1528(1976)中描述的鼠组织巨噬细胞(J774A.1)；以及Mbawuike等在J.Leukoc.Biol.46，119(1989)中描述的肺泡巨噬细胞系(MH-S)。因此，可用所述4a和5a细胞毒素杀死或抑制大量不同癌细胞类型的生长。

此处所用术语“癌症”包括哺乳动物实体瘤以及血液恶性肿瘤。“哺乳动物实体瘤”包括头颈癌、肺癌、间皮瘤、纵隔癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝胆管系统癌、小肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、肛门癌、肾癌、尿道癌、膀胱癌、前列腺癌、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、妇科器官癌、卵巢癌、乳房癌、内分泌系统癌、皮肤癌、中枢神经系统癌；软组织和骨的肉瘤；以及皮肤和眼内起源的黑素瘤。“血液恶性肿瘤”包括儿童白血病和淋巴瘤、何杰金氏病、淋巴细胞和皮肤来源的淋巴瘤、急性和慢性白血病、血浆细胞肿瘤和与AIDS有关的癌症。另外，可治疗任何发展阶段的癌症，如原发、转移和复发的癌症。从美国癌症中心(www.cancer.org)或从Wilson等(1991)Harrison’s Principles of Internal Medicine，第12版，MCGraw-Hill，Inc.中可发现很多种类型的癌症的信息。人用和兽用均可。

此处所用术语“正常哺乳动物细胞”和“正常动物细胞”被定义为在正常生长控制机制(如基因控制)下生长并呈现正常细胞分化的细胞。癌细胞与正常细胞的差别在于其生长方式和其细胞表面的性质不同。例如，与其邻近细胞不同，在本领域熟知的其它特征中，癌细胞趋向于持续性和无秩序性生长。

哺乳动物和包括鸟类的其它动物可通过本发明所述和所要求的方法和组合物治疗。这些哺乳动物和鸟类包括人、狗、猫和家畜，例如马、牛、羊、山羊、鸡、火鸡等。

因此，本发明提供一种治疗、抑制或预防动物中癌细胞生长的药用组合物，该组合物包含有效治疗或预防动物中靶标癌的量的包含化合物4a-15a和7c中任一种化合物的细胞毒素，以及药学上可接受的载体，其中可将所述细胞毒素与选择性与癌细胞结合的抗体或结合实体连接。

本发明还提供一种治疗、抑制或预防动物中癌细胞生长的方法，该方法包括使靶标癌细胞与一定量的包含化合物4a-15a和7c中任一种化合物的细胞毒素接触，所述量足以诱导靶标癌细胞死亡而不诱发不需要量的非癌性哺乳动物细胞的死亡，其中可将所述细胞毒素与选择性与癌细胞结合的抗体或结合实体连接。

本发明还提供一种治疗、抑制或预防动物中癌细胞生长的方法，该方法包括给予一定量的包含化合物4a-15a和7c中任一种化合物的细胞毒素的制剂，所述量足以诱导靶标癌细胞死亡或抑制癌细胞生长，而不诱发不需要量的非癌性哺乳动物细胞的死亡，其中可将所述细胞毒素与选择性与癌细胞结合的抗体或结合实体连接。

选择性与癌细胞结合的抗体或结合实体可识别或结合任何现有的组织特异性抗原或本领域技术人员所选择的癌标记物。

肿瘤抗原和对抗肿瘤抗原的抗体是已知的。与肿瘤或肉瘤细胞或淋巴瘤中存在的肿瘤相关抗原反应的结合实体、抗体或抗体片段公开于例如Goldenberg等，Journal of Clinical Oncology，Vol 9，No.4，pp.548-564，1991和Pawlak等，Cancer Research，Vol 49，pp.4568-4577，1989中，例如LL-2和EPB-2(相同)。其它公开于Primus等，Cancer Res.，Vol 43：686-692，1983，其公开抗-CEA单克隆抗体；Hansen等，Proc.Am.Assoc.Cancer Res.，30：414，1989，其公开和比较抗-CEA单克隆抗体；Gold等，Cancer Res.，50：6405-6409，1990，其公开与克隆特异性抗原-p(CSAp)反应的单克隆抗体；以及Gold等，Proc.Am.Assoc，Cancer Res.，31：292，1990，其公开与胰腺肿瘤相关的抗原决定基反应的单克隆抗体。也可用KC-4小鼠单克隆抗体，它对独特的抗原决定簇具有特异性，并选择性与赘生肿瘤细胞强力结合，而不与正常人体组织结合(Coulter的美国专利No.4,708,930)。

已表明BrE-3抗体(Peterson等，Hybridoma 9：221(1990)；美国专利No.5,075,219)能与人乳房上皮粘液素的多肽核心的串联重复序列结合。当该粘液素被脱糖基化时，暴露出更多的串联重复序列抗原决定基的存在，并且抗体的结合增加。因此，抗体(如BrE-3)优先与赘生肿瘤结合，原因是它们表达一种不表达于正常上皮组织的非糖基化形式的乳房上皮粘液素。这种优先结合与在肿瘤患者(如乳腺癌患者)的循环中所发现的这些抗体的低浓度的抗原决定基结合，使得抗体对粘液素抗原决定基具有特异性，以便高效地治疗肿瘤。

因此，本发明提供治疗和/或预防癌症的组合物和方法。

治疗移植性排斥

T-淋巴细胞是主要引起同种异体移植物(如移植器官，如心脏)排斥的细胞类型。T-淋巴细胞(杀伤细胞和辅助细胞)通过进行一种增殖性爆发对同种异体移植物作出反应，特征在于在IL-2受体的T-淋巴细胞表面短暂存在。在增殖性爆发期间通过给予特异性与T-淋巴细胞反应的细胞毒素杀死这些细胞可抑制同种异体移植物排斥。通过将细胞毒素与特异性识别激活的T-淋巴细胞的结合实体连接，该细胞毒素将有利地避免对其它细胞(包括对抗感染所需的静止或长期记忆T-淋巴细胞)的不利影响。一种存在于激活的T-淋巴细胞上而非静止或长期记忆T-淋巴细胞上的细胞表面蛋白质为白细胞介素-2(IL-2)受体。因此，使用连接于结合IL-2受体的结合实体的细胞毒素为激活的T-淋巴细胞提供了选择性。

如本发明所述，所用的细胞毒素为断-酮醛4a、其羟醛加成物5a或具有化合物4a-15a和7c的任何相关化合物。这些胆甾醇臭氧化产物对Weiss等在J.Immunol.133，123(1984)中所述的T-淋巴细胞系(Jurkat E6.1)具有细胞毒性。在某些实施方案中，4a-12a或7c细胞毒素可诱发细胞裂解、诱发细胞死亡或抑制细胞生长。

因为4a-14a或7c细胞毒素抑制T-淋巴细胞的功能和生长，所以所用的结合实体可结合，而使得其阻断或不阻断IL-2与IL-2受体的相互作用。但是，阻断IL-2结合的位点将提供进一步的保证，使得T-淋巴细胞不能完全被激活，并可导致产生几种引起抑制组织排斥的重要现象。

通过选择性靶向于激活的T-淋巴细胞，本发明方法以不引起一般免疫抑制及其所导致的威胁生命的感染的风险的方式，抑制同种异体移植物排斥。另外，该方法省掉供体-特异性的T抑制细胞，从而可增殖并帮助延长同种异体移植物的存活。再者，同种异体移植后，治疗不需要继续，但在治疗过程之后可以间断。

本发明的一实施方案使用作为所述IL-2受体特异性的结合实体的抗体，例如对T-淋巴细胞上的IL-2受体具有特异性的抗体，与4a-5a或7c细胞毒素共价性连接。该细胞毒素能使与所述结合实体结合的T-淋巴细胞溶解。可采用此处所述的标准技术制备对T-淋巴细胞上IL-2受体具有特异性的抗体。另外，例如可从Becton Dickenson公司购买这些抗体(如小鼠-人单克隆抗-IL-2受体抗体)。所述抗体可以是单克隆或多克隆抗体，并可从任何适当的动物中得到。当所述抗体为单克隆并且所治疗的哺乳动物是人时，优选人或人源化的抗-IL-2受体抗体。

可按Uchiyama等(1981)J.Immunol.126(4)，1393中所述进行对IL-2受体产生那些特异性的单克隆抗体的制备和最初的筛选。简言之，本发明的方法使用下列步骤。将培养的人T-淋巴细胞注射入哺乳动物(如小鼠)中，移出所述免疫过的动物的脾，分离脾细胞，然后与无限增殖immortal的细胞(如小鼠或人骨髓瘤细胞)融合，形成杂交瘤。然后按如下所述采用补体依赖性细胞毒性试验，对已培养的上清液中含抗体的上清液筛选对IL-2受体特异性的抗体。将人T-淋巴细胞和EBV转化的B-淋巴细胞用⁵¹Cr铬酸钠标记，然后用作靶细胞；将这些细胞与杂交瘤培养物上清液以及与补体一起孵育，然后收集上清液，用伽马计数器计数。选择对激活的T-淋巴细胞呈现细胞毒性而对静止的T-或B-淋巴细胞无细胞毒性的那些上清液，然后再进行筛选步骤以选择那些含有沉淀的抗体的上清液，所述抗体沉淀(即特定的反应)50千道尔顿糖蛋白的IL-2受体(在Leonard等(1983)P.N.A.S.USA 80，6957中有详细描述)。采用常规技术从上清液中纯化所要求的抗-IL-2受体抗体。

治疗自身免疫性疾病

CD4⁺T-淋巴细胞(在此称为CD4⁺T-细胞)是免疫系统中重要的参与者，因为在抗击感染和潜在性癌细胞中它“帮助”提供其它白细胞。CD4⁺T-细胞在肱骨(humeral)和细胞介导的免疫性中发挥重要作用。另外，在寄生虫感染中，它们促进嗜曙红细胞和肥大细胞的分化。如果该CD4⁺T-细胞数量耗尽(如在AIDS患者中)，宿主容易感染很多通常不会对宿主产生威胁的病原体和肿瘤。

但是，虽然CD4⁺T-细胞在疾病预防中发挥重要的有益作用，但是这些细胞的异常功能可产生严重的问题。在某些个体中，CD4⁺T-细胞的异常功能导致自身免疫性疾病和其它疾病。CD4⁺T-细胞涉及的自身免疫性疾病包括多发性硬化病、类风湿性关节炎和自身免疫性葡萄膜炎。这些疾病本质上与异常免疫反应有关，其中免疫系统的正常的攻击侵袭性病原体的作用被搅乱，而代替它的是攻击宿主体内组织，导致患病，甚至死亡。不同的自身免疫性疾病，所进攻的靶向宿主组织不同。例如，在多发性硬化病中，免疫系统进攻大脑和脊髓的白色物质，而在类风湿性关节炎中，免疫系统进攻关节的滑液内层。激活的CD4⁺T-细胞也与其它疾病有关，包括移植组织和器官的排斥和CD4⁺T-细胞淋巴瘤的发展。

因此，本发明提供一种用于治疗不需要的免疫反应的方法。在一实施方案中，本发明提供治疗或预防T-细胞介导的自身免疫性疾病的方法。在其它实施方案中，本发明提供治疗和预防激活的CD4⁺T-细胞介导的自身免疫性疾病的方法。可治疗的疾病包括，例如多发性硬化病、类风湿性关节炎、肉状瘤病和自身免疫性葡萄膜炎、移植物抗宿主疾病(GVHD)和/或炎性肠疾病。

这些方法中所用的细胞毒素是断-酮醛4a、其羟醛加成物5a或者具有任何式4a-15a或7c的化合物。这些胆甾醇臭氧化产物对Weiss等在J.Immunol.133，123(1984)中所述的T-淋巴细胞系(Jurkat E6.1)具有细胞毒性。在某些实施方案中，所述4a-15a或7c细胞毒素可诱导细胞溶解、诱导细胞死亡或抑制细胞生长。

可将所述4a-15a或7c细胞毒素用于与结合实体轭和，所述结合实体特异性地识别并结合T-细胞或优选CD4⁺T-细胞。这种结合实体可以是对T-细胞具有选择性的任何结合实体。例如，可使用任何T-细胞特异性抗原以产生可作为转运本发明提供的细胞毒性胆甾醇臭氧化产物的结合实体的抗体。实例包括人受体蛋白质H4-1BB。载体pH4-1BB中编码H4-1BB的cDNA储存于农业研究服务培养物保藏中心，保藏编号为NRRL B21131。美国专利6,569,997中描述对这种H4-1BB蛋白质的特异性抗体。

根据美国专利6,566,082，称为OX-40的特别的蛋白质抗原特定表达在T-细胞激活的抗原的细胞(特别是例如CD4⁺T-细胞)表面上。使用大鼠EAE疾病模型，表明该抗原表达在炎症部位(该疾病模型中的脊髓)上存在的被激活的对自动抗原-特异性CD4⁺T-细胞的表面上，而在非炎症部位上的CD4⁺T-细胞上不存在。发现在这些CD4⁺T-细胞上最高表达的该抗原出现在临床自动免疫信号开始前的那日；而当疾病发展时，该抗原的表达降低。本发明首次表明OX-40抗原表达的特异性以及该表达的暂时性，这促进对该抗原作为抗体的可能靶标的研究，所述抗体由患有T-细胞介导疾病的动物(例如人)中激活的T-细胞的耗尽所引发。

已表明CD4⁺T-细胞是动物中数种试验性诱发的自身免疫性疾病的原因，包括实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、胶原蛋白诱发的关节炎(CIA)以及实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)。这些动物模型可用于检测本发明提供的方法和制剂。

治疗溃疡

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)是一种在1982年首次从慢性胃炎患者的胃活组织检查中分离的弯曲的、微需氧的、革兰氏阴性菌，Warren等，Lancet：1273-75(1983)。原来命名为幽门弯曲杆菌(Campylobacter pylori)，现已认识到它是作为一个称之为螺杆菌的独立属的部分，Goodwin等，Int.J.Syst.Bacteriol.39：397-405(1989)。该细菌定居于人胃粘膜中，感染可持续数十年。在最后的几年中，细菌的存在一直与慢性B型胃炎有关，是一种在大多数感染的患者中可能无症状，但却增加了很大的患消化器官溃疡和胃腺癌的风险的病症。其它研究强力表明幽门螺杆菌感染或者可能是B型胃炎、消化器官溃疡和胃肿瘤的原因或者可能是其辅助因素，参见如Blaser，Gastroenterology 93：371-83(1987)；Dooley等，New Engl.J.Med.321：1562-66(1989)；Parsonnet等，New Engl.J.Med.325：1127-31(1991)。现认为幽门螺杆菌通过口腔途径传播，Thomas等，Lancet：340，1194(1992)。感染风险岁年龄而增加，Graham等，Gastroenterology 100：1495-1501(1991)，并且拥挤现象促进感染，Drumm等，New Engl.J.Med.4322：359-63(1990)；Blaser，Clin.Infect.Dis.15：386-93(1992)。在发达国家，在30和60岁人中，抗幽门螺杆菌抗原的抗体的存在分别从小于20％增加至超过50％，Jones等，Med.Microbiol.22：57-62(1986)；Morris等，N.Z.Med.J.99：657-59(1986)，虽然在发展中国家，20岁的人超过80％的人群已受感染，Graham等，Digestive Diseases andSciences 36：1084-88(1991)。

根据本发明，连接结合于幽门螺杆菌抗原的结合实体的细胞毒素可用于抑制幽门螺杆菌的生长。所用的细胞毒素为断-酮醛4a、其羟醛加成物5a或具有式6a-15a或7c中任一化合物。在某些实施方案中，所述4a或15a或7c细胞毒素可诱发细胞裂解、诱发细胞死亡或抑制细胞生长。

治疗微生物感染

本发明的细胞毒性胆甾醇臭氧化产物还能用于调节微生物的生长和感染。可通过本发明的细胞毒性胆甾醇臭氧化产物治疗以下靶向微生物的感染：单胞菌(Aeromonas spp.)、芽孢杆菌(Bacillus spp.)、拟杆菌(Bacteroides spp.)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter spp.)、梭菌(Clostridium spp.)、肠道杆菌(Enterobacter spp.)、肠球菌(Enterococcusspp.)、埃希菌(Escherichia spp.)、gastrospirillum sp.、螺旋杆菌(Helicobacter spp.)、克氏杆菌(Klebsiella spp.)、沙门氏菌(Salmonellaspp.)、志贺氏菌(Shigella spp.)、葡萄球菌(Staphylococcus spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)、弧菌(Vibrio spp.)、耶尔森菌(Yersinia spp.)等。可通过本发明的细胞毒性胆甾醇臭氧化产物治疗的感染包括那些与以下感染有关的感染：葡萄球菌感染(金黄色葡萄球菌)、斑疹伤寒症(伤寒沙门菌)、食物中毒(大肠杆菌，如O157:H7)、bascillary痢疾(志贺氏菌痢疾)、肺炎(绿脓杆菌和/或洋葱假单胞菌)、霍乱(霍乱弧菌)、溃疡(幽门螺杆菌)和其它感染。已发现大肠杆菌血清型O157:H7与腹泻、出血性大肠炎、血友病性尿毒综合征(HUS)和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)。本发明的细胞毒性胆甾醇臭氧化产物还具有对抗抗药性和多发性抗药性菌株的活性，例如金黄色葡萄球菌的多发性抗药性菌株和屎肠球菌和粪肠球菌的万古霉素抗药性菌株。

本发明的抗微生物组合物还对抗病毒有效。术语“病毒”指DNA和RNA病毒、类病毒和朊病毒。病毒包括囊膜和非囊膜病毒，例如A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、乳多孔病毒、细小病毒、呼吸道肠道病毒、环状病毒、细小核糖核酸病毒、轮状病毒、alphaviruses、rubivirues、A和B型流感病毒、黄病毒、冠病毒、副粘病毒、麻疹病毒、肺炎病毒、弹状病毒、狂犬病病毒、正粘液病毒、布尼亚病毒、白蚁热病毒、内罗病毒、嗜肝DNA病毒、沙状病毒、逆转录病毒、肠道病毒、鼻病毒和丝状病毒。

本发明化合物是可用于治疗动物(包括人)全身性、局部性和粘膜性感染的真菌性感染的活性抗真菌剂。可通过本发明治疗的真菌感染的实例包括念珠菌、曲霉菌和镰刀菌引起的感染。在某些实施方案中，真菌感染由白色念珠菌或光滑念珠菌引起。

本发明化合物用于治疗动物(包括人)的各种真菌感染。这些感染包括表面、皮肤、皮下和系统性真菌感染，如呼吸道感染、胃肠道感染、心血管感染、尿道感染、CNS感染、念珠菌病和慢性锐突念珠菌病以及由真菌引起的皮肤感染、皮肤和粘膜皮肤念珠菌病、脚癣、甲沟炎、真菌绒毛性皮疹、念珠菌性外阴炎、念珠菌性龟头炎和外耳炎。可将本发明化合物用作预防系统性和局部性真菌感染的预防剂。在预防免疫应答削弱的患者(如AIDS患者、接受癌症治疗患者或移植器官的患者)的感染中，预防剂可适合用作一种选择性消化道的净化作用体系。

已知几种曲霉菌属在严重免疫应答削弱的患者中能引起侵害性窦性肺部感染。吸入孢子后，临床曲霉病可以以三种主要的表现形式出现。当曲霉菌定居于支气管树并释放出引起高度敏感性肺炎的抗体时，产生第一种表现形式，过敏性支气管肺部曲霉病。第二种表现形式，即曲霉肿或“真菌球”，是在肺腔道中产生，通常与其它肺病(如肺结核)有关。第三种形式，即侵入性肺部或播散性曲霉病，是一种具有很高死亡率的威胁生命的感染。

可采用本领域技术人员已知的方法，评估所述细胞毒性胆甾醇臭氧化产物对这些不同种类的微生物的抗微生物活性。抗微生物活性例如可通过确定预防具体微生物种类生长的本发明的细胞毒性胆甾醇臭氧化产物的最小抑制浓度(MIC)来测定。在一实施方案中，抗微生物的活性是采用标准剂量或剂量反应方法测定的杀死50％微生物的细胞毒性胆甾醇臭氧化产物的量。

评估用本发明所述的细胞毒性胆甾醇臭氧化产物治疗微生物感染的治疗有效量的方法包括确定细胞毒性胆甾醇臭氧化产物的最小抑制浓度，在该浓度下体外几乎无微生物生长。这种方法能计算每一体积抑制微生物生长或杀死50％微生物所需的细胞毒性胆甾醇臭氧化产物的大约量。这种量例如可通过标准微稀释方法确定。例如，制备一系列装有等体积培养基和基本上相等量的微生物的微生物培养管，然后加入等份的细胞毒性胆甾醇臭氧化产物。在相同体积的溶液中，各等份试样含有不同量的细胞毒性胆甾醇臭氧化产物。在对应于1-10代的时间内培养微生物，并确定培养基中微生物的数量。

还可用所述培养基的光密度估量是否出现微生物生长—如果光密度未出现明显增加，则没有出现明显的微生物生长。但是，如果光密度增加，则出现微生物生长。为确定暴露于细胞毒性胆甾醇臭氧化产物后存活多少微生物细胞，当加入细胞毒性胆甾醇臭氧化产物(零时间)时以及其后的规定时间间隔内，可移出一小份培养基。将该等份培养基涂覆在一种微生物培养基板上，在有益于微生物生长的条件下孵育该板，当出现菌落时，对那些菌落计数。

抗体和结合实体

本发明提供能与胆甾醇臭氧化产物或任何靶向抗原结合的抗体和结合实体，所述靶向抗原能作为将本发明毒性臭氧化产物转运至疾病部位的标记物。如本文所述，可用直接针对胆甾醇臭氧化产物的抗体和结合剂抑制或调节这些胆甾醇臭氧化产物的细胞毒性，从而治疗血管疾病，如动脉粥样硬化、心脏病或心血管疾病。还如上所述，可将所述细胞毒性胆甾醇臭氧化产物与抗体和结合剂连接并用于治疗或预防诸如下列病症或疾病：自身免疫性疾病、癌症、肿瘤、细菌感染、病毒感染、真菌感染、溃疡和/或其它其中局部给予细胞毒素有益的疾病。

此处所用术语“结合实体”包括能结合胆甾醇臭氧化产物或其它疾病标记物的抗体和其它多肽。

因此，在一实施方案中，本发明提供直接针对胆甾醇臭氧化产物的抗体制品和结合实体，所述胆甾醇臭氧化产物例如断-酮醛4a、其羟醛加成物5a、诸如任何3c、6a-15a或7c胆甾醇臭氧化产物或半抗原的相关化合物。这些抗体和结合实体用于治疗胆甾醇相关的血管疾病，如炎性血管疾病、动脉粥样硬化、心脏病和心血管疾病。在某些实施方案中，可将该胆甾醇臭氧化产物化学修饰以易于抗体的制备。例如，可用所述断-酮醛4a、其羟醛加成物5a和诸如任何化合物3c、6a-15a或7c的相关化合物的腙衍生物来制备抗体。这些腙衍生物包括具有诸如化合物4b、4c、5b和任何6b-15b或10c的那些结构的化合物。

例如可通过与肼化合物(如2，4-二硝基苯肼)反应，将胆甾醇臭氧化产物转化为腙衍生物。在某些实施方案中，在有机溶剂，如乙腈或醇类(如甲醇或乙醇)中，进行该反应。经常利用酸性环境和不含氧、无反应性的气氛。

本发明还涉及结构上与胆甾醇臭氧化产物和这些臭氧化产物的腙衍生物相关的半抗原。例如，本发明提供具有式3c、13a、13b、14a、14b、15a或15b的半抗原，其可用于产生能与胆甾醇臭氧化和腙产物反应的抗体。

按照布达佩斯条约的条款，于2003年8月29日将针对式15a化合物而产生的杂交瘤KA1-11C5和KA1-7A6保藏于美国典型培养物保藏中心(10801 University Blvd.，Manassas，Va.，20110-2209 USA(ATCC))，ATCC保藏编号为PTA-5427和PTA-5428。按照布达佩斯条约的条款，同样于2003年8月29日将针对式14a化合物而产生的杂交瘤KA2-8F6和KA2-1E9保藏于ATCC，ATCC保藏编号为PTA-5429和PTA-5430。

本发明还提供通过现有方法制备的可结合胆甾醇臭氧化产物或任何常规的疾病标记物的抗体和结合实体。这种抗体的结合结构域，例如这些抗体的CDR区可转移到或与任何方便的结合实体骨架一起利用。

抗体分子属于称作免疫球蛋白的血浆蛋白家族，其基本构件——免疫球蛋白折叠或结构域在免疫系统和其他生物识别系统的许多分子中以多种形式被使用。标准的抗体是四聚体结构，由两条完全相同的免疫球蛋白重链和两条完全相同的轻链组成，分子量约为150,000道尔顿。

抗体的重链和轻链由不同的结构域组成。每条轻链具有一个可变区结构域(VL)和一个恒定区结构域(CL)，而每条重链具有一个可变区结构域(VH)和三个或四个恒定区结构域(CH)。参见例如Alzari，P.N.，Lascombe，M.-B.& Poljak，R.J.(1988)Three-dimensional structure ofantibodies.Annu.Rev.Immunol.6，555-580。由约110个氨基酸残基组成的各结构域折叠成特征性β夹层结构即免疫球蛋白折叠，所述β夹层结构由两个互相挤在一起的β折叠形成。VH和VL结构域各有三个互补决定区(CDR1-3)，其为环或转角，在结构域的一端连接β链。轻链和重链两者的可变区通常均对抗原特异性作出贡献，尽管各单独的链对特异性的贡献并不总是均等。抗体分子通过使用六个随机化环(CDR)，已进化成可结合大量的分子。

根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可归为不同的类别。至少有五(5)种主要的免疫球蛋白类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些类别中的几种可进一步细分成亚类(同种型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。对应于免疫球蛋白的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类别的重链恒定区分别称为alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)。根据其恒定区的氨基酸序列，抗体的轻链可归为两种截然不同的类型中的一种，所述两种类型称为kappa(κ)和lambda(λ)。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是公知的。

就抗体的可变区而言，术语“可变”指一种抗体与另一种抗体之间可变区结构域的某些部分在序列上有极大差异这个事实。可变区结构域是用来结合的，它决定各具体抗体对其具体抗原的特异性。但是，可变性并不在抗体可变区结构域当中均匀分布。相反，可变性集中在轻链可变区结构域和重链可变区结构域中的三个称为互补决定区(CDR，也称为高变区)的区段。

较高度保守的可变区结构域部分称为框架(FR)区。天然重链和轻链的可变区结构域各自包含四个主要采取β折叠构型的FR区，所述FR区由三个CDR连接，形成连接β折叠结构的环，在某些情况下构成β折叠结构的一部分。各链中的CDR通过FR区紧连在一起，与其他链的CDR一起对抗体的抗原结合位点的形成作出贡献。恒定区结构域不直接涉及抗体与抗原的结合，但显示各种效应子功能，如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。

因此，设想用于本发明的抗体可以是任何各种形式，包括完整免疫球蛋白，抗体片段如Fv、Fab和类似片段，包括可变区结构域互补决定区(CDR)的单链抗体，以及相似的形式，所有这些形式均落入本文所用的概括性术语“抗体”之内。本发明设想使用多克隆抗体或单克隆抗体的任何特异性，并不限于识别和与具体的胆甾醇臭氧化产物或其衍生物发生免疫反应的抗体。

此外，可将抗体的结合区或CDR置于任何合适结合实体多肽的骨架中。在优选的实施方案中，就本文所述的方法而言，使用对任何式3、3c、4a-15a、7c的化合物及其衍生物(包括腙衍生物)具有免疫特异性的抗体、结合实体或其片段。

术语“抗体片段”指全长抗体的部分，通常是抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab片段、Fab′片段、F(ab′)₂片段和Fv片段。用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个完全相同的称作Fab片段的抗原结合片段(各片段具有单一抗原结合位点)及残余的Fc片段。Fab片段因此具有完整轻链和一条重链的一部分。用胃蛋白酶处理产生具有两个能够与抗原交联的抗原结合片段的F(ab′)₂片段及称作pFc′片段的残余片段。胃蛋白酶消化的抗体被还原后，获得Fab′片段，其由完整轻链和重链的一部分组成。每个抗体分子可获得两个Fab′片段。Fab′片段与Fab片段不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端添加少数残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。

Fv是包含完全抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这个区由牢固非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体(V_H-V_L二聚体)组成。各可变区结构域的三个CDR正是以这种构型相互作用，来确立V_H-V_L二聚体表面上的抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗体抗原结合特异性。但是，即使单个可变区结构域(或只包含三个对抗原有特异性的CDR的半个Fv)也有识别和结合抗原的能力，尽管比完整结合位点的亲和力要低。本文所用的涉及抗体的“功能片段”指Fv、F(ab)和F(ab′)₂片段。

另外的片段可包括双抗体、线型抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。单链抗体是包含轻链可变区和重链可变区的基因工程分子，通过合适的多肽连接体连接成基因工程融合单链分子。这种单链抗体也称为“单链Fv”或“sFv”抗体片段。通常，Fv多肽另外还包含VH结构域和VL结构域之间的、使sFv能够形成需要的抗原结合结构的多肽连接体。有关sFv的综述参见Pluckthun的ThePharmacology of Monoclonal Antibody，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，N.Y.，第269-315页(1994)。

术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中所述片段在同一多肽链上包含轻链可变区结构域(VL)连接的重链可变区结构域(VH)(VH-VL)。通过使用短得不能使同一链上的两个结构域发生配对的连接体，所述结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，造成两个抗原结合位点。双抗体在例如EP 404,097；WO 93/11161和Hollinger等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 90：6444-6448(1993)中有更充分的描述。

因此，本发明设想的抗体片段不是全长抗体。但是，相对于全长抗体，这种抗体片段可具有类似或改进的免疫学性质。这种抗体片段可小至约4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、9个氨基酸、约12个氨基酸、约15个氨基酸、约17个氨基酸、约18个氨基酸、约20个氨基酸、约25个氨基酸、约30个氨基酸或更多。

一般来说，相对于特异性结合疾病标记物(例如，胆甾醇臭氧化产物)的抗体，本发明的抗体片段只要具有类似或改进的免疫学性质，可具有任何最高大小限制。例如，较小的结合实体和轻链抗体片段可具有不到约200个氨基酸、不到约175个氨基酸、不到约150个氨基酸或不到约120个氨基酸，如果所述抗体片段与轻链抗体亚单位相关。此外，较大的结合实体和重链抗体片段可具有不到约425个氨基酸、不到约400个氨基酸、不到约375个氨基酸、不到约350个氨基酸、不到约325个氨基酸或不到约300个氨基酸，如果所述抗体片段与重链抗体亚单位相关。

直接作用于疾病标记物的抗体可通过任何现有的方法制备。制备多克隆抗体的方法是本领域技术人员可获得的。参见例如Green等，Production of Polyclonal Antisera，见： Immunochemical Protocols(Manson编辑)，第1-5页(Humana Press)；Coligan等，Production ofPolyclonal Antisera in Rabbits，Rats Mice and Hamsters，见： Current Protocols in Immunology，2.4.1节(1992)，所述参考文献通过引用结合到本文中。

单克隆抗体也可应用于本发明。本文所用的术语“单克隆抗体”指从基本均质性抗体群体获得的抗体。换句话说，除了在较少量的某些抗体中有偶然的天然突变之外，构成群体的单个抗体都是完全相同的。单克隆抗体是高度特异性的，可针对单一抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，各单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优势还在于它们通过杂交瘤培养来合成，不受其他免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表示抗体从基本均质性抗体群体获得的特性，不能被解释为要求抗体通过任何具体方法来生产。

本文的单克隆抗体明确包括“嵌合”抗体，所述“嵌合”抗体中一部分重链和/或轻链与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体的相应序列一致或同源，所述链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体的相应序列一致或同源。也可使用这种抗体的片段，只要它们显示所需的生物活性。参见美国专利第4,816,567号；Morrison等，Proc.Natl.Acad Sci.81，6851-55(1984)。

单克隆抗体的制备同样是常规的。参见例如Kohler & Milstein，Nature，256：495(1975)；Coligan等，2.5.1-2.6.7节；和Harlow等，见：Antibodies：A Laboratory Manual，第726页(Cold Spring Harbor Pub.(1988))，这些参考文献通过引用结合到本文中。可通过各种已确立的技术，从杂交瘤培养物分离和纯化单克隆抗体。这种分离技术包括蛋白A琼脂糖凝胶亲和层析、大小排阻层析和离子交换层析。参见例如Coligan等，2.7.1-2.7.12节和2.9.1-2.9.3节；Barnes等，Purification ofImmunoglobulin G(IgG)，见： Methods in Molecular Biology，第10卷，第79-104页(Humana Press(1992)。

体外和体内操作抗体的方法是本领域技术人员可获得的。例如，按照本发明进行使用的单克隆抗体可通过上述杂交瘤方法来制备，或可通过如美国专利第4,816,567号中描述的重组方法来制备。也可使用在Clackson等，Nature 352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol Biol.222：581-597(1991)中描述的技术，从噬菌体抗体文库分离用于本发明的单克隆抗体。

制备抗体片段的方法也是本领域公知的(参见例如Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork，(1988)，其通过引用结合到本文中)。可通过抗体的蛋白酶解或通过在合适的宿主中表达编码抗体片段的核酸，来制备本发明的抗体片段。可通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全抗体的常规方法，获得抗体片段。例如，可通过用胃蛋白酶对抗体进行酶解切割，提供称作F(ab′)₂的5S片段，来生产抗体片段。可使用硫醇还原剂和任选使用由裂解二硫键获得的巯基的封闭基团，进一步切割此片段，产生3.5S Fab′单价片段。或者，用胃蛋白酶进行酶解切割直接产生两个单价Fab′片段和一个Fc片段。这些方法在例如美国专利第4,036,945号和4,331,647号及其中包含的参考文献中有描述。这些专利通过引用整体结合到本文中。

也可使用其他抗体切割方法，如分离重链以形成单价轻-重链片段，片段的进一步切割，或者其他酶学、化学或遗传学技术，只要片段结合被完整抗体识别的抗原。例如，Fv片段包含V_H链和V_L链的缔合。这种缔合可以是非共价的，或者可变链可通过分子间二硫键连接或通过化学试剂如戊二醛交联。优选Fv片段包含通过肽连接体连接的V_H链和V_L链。通过构建由寡核苷酸连接的包含编码V_H结构域和V_L结构域的DNA序列的结构基因，来制备这些单链抗原结合蛋白(sFv)。将结构基因插入表达载体中，后者随后引入到宿主细胞如大肠杆菌。重组宿主细胞合成单一多肽链，其中的连接体肽桥接两个V结构域。生产sFv的方法由例如Whitlow等， Methods：a Companion to Methods in Enzymology，第2卷，第97页(1991)；Bird等，Science 242：423-426(1988)；Ladner等，美国专利第4,946,778号；和Pack等， Bio/Technology11：1271-77(1993)描述。

另一种形式的抗体片段是编码(coding for)单一互补决定区(CDR)的肽。CDR肽(“最小识别单位”)经常参与抗原识别和结合。可通过克隆或构建编码目的抗体CDR的基因，获得CDR肽。这种基因例如通过使用聚合酶链式反应从抗体生产细胞的RNA合成可变区来制备。参见例如Larrick等， Methods：a Companion to Methods in Enzvmology，第2卷，第106页(1991)。

本发明设想人形式和人源化形式的非人(例如鼠)抗体。这种人源化抗体是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)₂或抗体的其他抗原结合亚序列)，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。在很大程度上，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者的互补决定区(CDR)残基被来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的具有所需特异性、亲和力和容量的CDR残基置换。

在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基置换。此外，人源化抗体可包含既不见于受者抗体也不见于引入的CDR或框架序列的残基。造成这些修饰是进一步改进和最优化抗体性能。一般来说，人源化抗体基本包含至少一种、通常两种可变区结构域的全部，其中全部或基本全部的CDR区与非人免疫球蛋白的对应，且全部或基本全部的FR区是人免疫球蛋白共有序列的。人源化抗体最好还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是一部分人免疫球蛋白恒定区。更多的细节参见Jones等，Nature 321，522-525(1986)；Reichmann等，Nature 332，323-329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2，593-596(1992)；Holmes等，J.Immunol.，158：2192-2201(1997)和Vaswani等，Annals Allergy，Asthma & Immunol.，81：105-115(1998)。

虽然可获得标准化的方法来产生抗体，但抗体的大小、抗体的多链结构和抗体中存在的六个结合环的复杂性构成了改进和生产大量抗体的障碍。因此，本发明进一步设想使用结合实体，其包含可识别和结合疾病标记物(包括胆甾醇臭氧化产物)的多肽。

大量蛋白质可用作蛋白质支架结构，疾病标记物的结合区域可与之连接并且形成适合的结合实体。结合结构域与本发明的胆甾醇臭氧化产物结合或相互作用，而蛋白质支架仅仅支持和稳定结合结构域，以便它们能够进行结合。有各种蛋白质支架可以使用。例如，可使用噬菌体衣壳蛋白。参见Clackson & Wells，Trends Biotechnol.12：173-184(1994)中的综述。噬菌体衣壳蛋白已被用作展示随机肽序列的支架，包括牛胰腺胰蛋白酶抑制剂(Roberts等，PNAS 89：2429-2433(1992))、人生长激素(Lowman等，Biochemistry 30：10832-10838(1991)，Venturini等，Protein Peptide Letters 1：70-75(1994))和链球菌的IgG结合结构域(O′Neil等，Techniques in Protein Chemistry V(Crabb，L编辑)第517-524页，Academic Press，San Diego(1994))。这些支架已展示可被修饰以包括疾病标记物(如胆甾醇臭氧化产物)的结合结构域的单一随机化环或区。

研究者也已使用小的74个氨基酸的α淀粉酶抑制剂——淀粉酶抑肽(Tendamistat)作为丝状噬菌体M13上的呈递支架。McConnell，S.J.，&Hoess，R.H.，J.Mol.Biol.250：460-470(1995)。淀粉酶抑肽是来自轮枝链霉菌(Streptomyces tendae)的β折叠蛋白质。它具有的多种特征使其成为引人注意的多肽结合支架，包括小尺寸、稳定性和可获得高分辨率NMR和X射线结构数据。淀粉酶抑肽的总体拓扑结构与免疫球蛋白的结构域相似，两个β折叠通过一系列的环连接。与免疫球蛋白结构域形成对比的是，淀粉酶抑肽的β折叠通过两个而不是一个二硫键结合在一起，这是这种蛋白质稳定性相当大的原因。淀粉酶抑肽的环可起到类似于见于免疫球蛋白的CDR环的功能，且可容易通过体外诱变而被随机化。淀粉酶抑肽源自轮枝链霉菌，在人类中可有抗原性。因此，采用淀粉酶抑肽的结合实体优选在体外应用。

纤连蛋白III型结构域也已被用作可连接结合实体的蛋白质支架。纤连蛋白III型是免疫球蛋白超家族的大亚家族(Fn3家族或s-型Ig家族)的一部分。将这种纤连蛋白III型结构域用作结合实体(如CDR肽)的蛋白质支架的序列、载体和克隆方法在例如美国专利申请公开20020019517中提供。另参见Bork，P.& Doolittle，R.F.(1992)Proposedacquisition of an animal protein domain by bacteria.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，8990-8994；Jones，E.Y.(1993)The immunoglobulin superfamilyCurr.Opinion Struct.Biol.3，846-852；Bork，P.，Hom，L.& Sander，C.(1994)The immunoglobulin fold.Structural classification，sequencepatterns and common core.J.Mol.Biol.242，309-320；Campbell，I.D.&Spitzfaden，C.(1994)Building proteins with fibronectin type III modulesStructure 2，233-337；Harpez，Y.& Chothia，C.(1994)。

在免疫系统中，从大文库选择和扩增特异性抗体(亲和力成熟)。可通过结合实体的组合文库的诱变和产生，来模拟免疫细胞使用的组合技术。因此，变异的结合实体、抗体片段和抗体也可通过展示类型的技术来产生。这种展示类型的技术包括例如噬菌体展示、反转录病毒展示、核糖体展示和其他技术。可使用本领域可获得的技术来产生结合实体的文库和筛选这些文库，选出的结合实体可进行另外的成熟过程，如亲和力成熟。Wright和Harris，出处同上，Hanes和PlucthauPNAS USA 94：4937-4942(1997)(核糖体展示)，Parmley和Smith Gene73：305-318(1988)(噬菌体展示)，Scott TIBS 17：241-245(1992)，Cwirla等，PNAS USA 87：6378-6382(1990)，Russel等，Nucl.Acids Research21：1081-1085(1993)，Hoganboom等，Immunol.Reviews 130：43-68(1992)，Chiswell和McCafferty TIBTECH 10：80-84(1992)，和美国专利第5,733,743号。

本发明因此还提供使抗体、CDR或结合结构域突变，以最优化它们的亲和力、选择性、结合强度和/或其他需要性质的方法。突变结合结构域指选定的结合结构域(例如CDR)的氨基酸序列变异体。一般来说，突变结合结构域中的一个或多个氨基酸残基与参考结合结构域中存在的不同。这种突变抗体与参考氨基酸序列的序列一致性或相似性必然是不到100％。一般来说，突变结合结构域与参考结合结构域的氨基酸序列有至少75％的氨基酸序列一致性或相似性。优选突变结合结构域与参考结合结构域的氨基酸序列有至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％的氨基酸序列一致性或相似性。

例如，使用噬菌体展示的亲和力成熟可用作产生突变结合结构域的一种方法。使用噬菌体展示的亲和力成熟指在Lowman等，Biochemistry 30(45)：10832-10838(1991)中描述的过程，另参见Hawkins等，J.Mol Biol.254：889-896(1992)。虽然不严格局限于以下描述，但该过程可简要描述为涉及几个结合结构域或抗体超变区在多个不同位点的突变，目的是在每个位点产生所有可能的氨基酸置换。这样产生的结合结构域突变体以单价方式从丝状噬菌体颗粒展示为融合蛋白。通常对M13的基因III产物造成融合。表达不同突变体的噬菌体可循环几轮，以选择目的特性，例如结合亲和力或选择性。分离目的突变体并测序。这种方法更详细地描述于美国专利第5,750,373号、美国专利第6,290,957号和Cunningham，B.C.等，EMBO J.13(11)，2508-2515(1994)中。

因此，在一个实施方案中，本发明提供操纵结合实体或抗体多肽或编码它们的核酸，以产生具有改进的识别疾病标志物(如胆甾醇臭氧化产物)的结合性质的结合实体、抗体和抗体片段的方法。

这种使现有的结合实体或抗体的部分突变的方法涉及：将疾病标记物的结合结构域的编码多肽的编码核酸融合到噬菌体外被蛋白的编码核酸以产生编码融合蛋白的重组核酸，使编码融合蛋白的重组核酸突变以产生编码突变融合蛋白的突变核酸，在噬菌体的表面上表达突变融合蛋白，及选择结合疾病标记物的噬菌体。

因此，本发明提供可识别和结合疾病标记物(如胆甾醇臭氧化产物、半抗原或胆甾醇衍生物)的抗体、抗体片段和结合实体多肽。本发明进一步提供操纵这些抗体、抗体片段和结合实体多肽，以最优化它们的结合性质或其他需要性质(例如稳定性、大小、容易使用)的方法。

剂量、制剂和给药途径

给予本发明的组合物以达到降低与以下疾病相关的至少一种症状：动脉粥样硬化、心脏病、心血管疾病、自身免疫性疾病、癌症、肿瘤、细菌性感染、病毒性感染、真菌性感染、溃疡和/或其它其中局部给予细胞毒素有益的病症或疾病。

为获得所要求的效果，可将所述细胞毒素、结合实体、抗体及其组合物以单剂量或分剂量给予，例如每kg体重至少约0.01mg至约500-750mg，至少约0.01mg至约300-500mg，至少约0.1mg至约100-300mg或者至少约1mg至约50-100mg，虽然其它剂量可提供有益的效果。给予的量将随各种因素而变化，包括但不限于所述治疗剂是否是细胞毒素、结合实体或抗体、哺乳动物的疾病、体重、身体状况、健康状况、年龄、是否要达到预防作用或治疗作用以及所述治疗剂是否被化学修饰。这些因素可以容易地通过临床医生应用本领域提供的动物模型或其它试验系统来确定。

根据例如接受者的生理状况、给药目的是治疗性还是预防性以及其它技术熟练人员已知的其它因素不同，本发明的治疗剂的给予可以是单剂量、多剂量、连续给予或间断给予的方式。所述细胞毒素、结合实体、抗体及其组合的给予可以是在一预选时间期间内基本上连续的给予或者可以以一系列间隔剂量的方式给予。局部性和全身性给药都包括在内。

为制备所述组合物，通过合成或其它方式获得并纯化为所必须或要求的所述细胞毒素、结合实体、抗体或其组合。然后将这些治疗剂冷冻干燥或灭菌，将它们的浓度调节至适当的量，然后将所述治疗剂与其它药物任选混合。包括在单位剂量中的所给的细胞毒素、结合实体、抗体及其组合的绝对重量可以有很大范围的变化。例如，特别对于一具体细胞的类型，可给予约0.01-2g或约0.1-500mg的至少一种细胞毒素、结合实体或抗体。另外，单位剂量可以在以下范围内变化，约0.01g-50g、约0.01g-35g、约0.1g-25g、约0.5g-12g、约0.5g-8g、约0.5g-4g或者约0.5g-2g。

所述细胞毒素、结合实体、抗体及其组合的日剂量也可以变化。这种日剂量的范围为例如约0.1g/日-50g/日，0.1g/日-25g/日，0.1g/日-12g/日，0.5g/日-8g/日，0.5g/日-4g/日以及0.5g/日-2g/日。

因此，可通过各种途径，包括口服、非肠道(包括皮下、静脉内、肌内和腹膜内)、直肠、皮肤、经皮、胸腔内、肺内和鼻内(呼吸道)途径给予一或多种适合的包括本发明治疗剂的单位剂型。还可将所述治疗剂制成缓释制剂(例如，使用微囊化作用，参见WO 94/07529和美国专利No.4,962,091)。适合时，一般可将所述制剂制成分立的单位剂型，并且可通过制药领域熟知的任何方法制备。这些方法可包括如下步骤：将治疗剂与液体载体、固体基质、半固体载体、分散均匀的固体载体或其组合混合，然后如果必要，将产物引入或成型进入所要求的转运系统中。

当制备供口服给药的本发明的治疗剂时，一般可将所述治疗剂与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合而形成药用制剂或单位剂型。为进行口服给药，所述治疗剂可以是粉末剂、颗粒剂剂型、溶液剂、混悬剂、乳剂或者在天然或合成多聚物或树脂中供消化咀嚼胶中的活性成分的形式。所述治疗剂也可以是大药丸、干药糖剂或糊剂形式。还可将本发明的口服给药的治疗剂制成缓释制剂。例如，可将所述治疗剂包衣、微囊化或者置于其它的缓释装置中。这些制剂中活性组分的总量为所述制剂重量的0.1-99.9％。

“药学上可接受的”是指能与制剂的其它组分相容，并且对其接受者无害的载体、稀释剂、赋形剂和/或盐。

含有本发明的所述治疗剂的药用制剂可通过采用熟知的且易于提供的成分经本领域已知的方法制备。例如，可用常规赋形剂、稀释剂或载体制备所述治疗剂的制剂，并形成片剂、胶囊剂、溶液剂、混悬剂、粉末剂、气雾剂等。适用于此类制剂的赋形剂、稀释剂和载体的实例包括缓冲剂以及填充剂和填料，如淀粉、纤维素、糖、甘露醇和硅酸类衍生物。还可使用诸如以下的粘合剂，如羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和其它纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮。湿润剂可包括例如甘油，崩解剂可包括例如碳酸钙和碳酸氢钠。延迟溶解的试剂还可包括如石蜡。也可包括吸收加速剂，如季铵化合物。可包括表面活性剂，如十六烷醇和单硬脂酸甘油酯。可加入吸附性载体，如高岭土和皂土。还可包括润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙和镁以及固体聚乙二醇。还可加入防腐剂。本发明的组合物还可包含增稠剂，如纤维素和/或纤维素衍生物。它们还可含有胶类，如黄原胶、瓜耳胶或carbo胶或阿拉伯胶、或者其它的聚乙二醇、膨润土和蒙脱石等。

例如，含有本发明治疗剂的片剂或囊片可包括缓冲剂，如碳酸钙、氧化镁和碳酸镁。囊片和片剂还可包含非活性组分，如纤维素、预明胶化淀粉、二氧化硅、羟丙基甲基纤维素、硬脂酸镁、微晶纤维素、淀粉、滑石粉、二氧化钛、苯甲酸、柠檬酸、玉米淀粉、矿油、聚丙二醇、磷酸钠、硬脂酸锌等。含有至少一种本发明治疗剂的硬或软明胶胶囊可包含非活性组分，如明胶、微晶纤维素、十二烷基硫酸钠、淀粉、滑石粉和二氧化钛等，以及液体介质，如聚乙二醇(PEGs)和植物油。另外，设计含有一或多种本发明治疗剂的肠溶包衣囊片或片剂以抵抗胃中的崩解，并能在十二指肠的更加中性至碱性环境中溶解。

还可将本发明的治疗剂制成适于常规口服给药的酏剂或溶液剂或是适合与非肠道给药的溶液剂，例如经肌内、皮下、腹膜内或静脉内途径。本发明治疗剂的药用剂型还可采用水溶性或无水的溶液剂或分散剂的形式，或者乳剂或混悬剂或药膏的形式。

因此，可将所述治疗剂制成供非肠道给药的制剂(例如通过注射给药，如大量注射剂或持续输注剂)，可以以安瓿、预充填注射器、小体积输注容器或者多剂量容器内的单位剂量形式提供。如上所指出的那样，可加入防腐剂以帮助保持该剂型的存放。所述活性剂和其它组分可形成在油性或水性介质中的混悬剂、溶液剂或乳剂，并可包含制剂性成分，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。另外，所述治疗剂和其它组分可以是供使用前用适当的介质(如无菌、无热原的水)溶解形成的粉末形式，其通过无菌固体的无菌分离或者通过溶液的冷冻干燥获得。

这些制剂可含有药学上可接受的本领域熟知的载体、介质和添加剂。除水外，还可采用一或多种从生理学观点上可接受的选自下列的有机溶剂例如制备溶液剂，所述溶剂有如丙酮、乙醇、异丙醇、乙二醇醚(如以商品名“Dowanol”销售的产品)、多元醇和聚乙二醇、短链羧酸的C₁-C₄烷基酯、乳酸乙基或异丙基酯、脂肪酸三甘油酯(如以商品名“Miglyol”销售的产品)、豆蔻酸异丙基酯、动物、矿物和植物油以及聚硅醚。

如果必要，可加入选自下列的辅助剂：抗氧化剂、表面活性剂、其它防腐剂、成膜剂、促脱皮或促脱粉刺剂、芳香剂、矫味剂和着色剂。可加入抗氧化剂，如叔丁基氢化喹啉酮、丁羟茴醚、丁羟甲苯和α-生育酚及其衍生物。

另外，所述治疗剂还适于制成缓释剂型等的制剂。可将这些制剂制成可在一定时间期间内，在血管系统或呼吸道的的特定部位释放所述活性剂的制剂。包衣、包封物和保护基质可用例如聚合物(如聚交酯-甘醇酸酯)、脂质体、微乳化物、微粒、纳米颗粒或蜡质制备。这些包衣、包封物和保护基质用于包被内在的装置，例如支架、导管、腹膜透析管、排泄装置等。

为进行局部给药，可将所述治疗剂制成本领域已知的供直接应用于靶标面积的制剂。局部应用主要限定的形式采用例如霜剂、乳剂、凝胶剂、分散剂或微乳剂、增稠至更大或更小程度的洗剂、浸渍垫、软膏剂或粘贴剂、气雾剂(例如喷雾剂或泡沫)、皂剂、清洁剂、洗剂或肥皂饼形式。这种目的的其它常规形式包括伤口敷料、包覆绷带或其它多聚物遮盖物、软膏剂、霜剂、洗剂、糊剂、胶状物、喷雾剂和气雾剂。因此，本发明的治疗剂可通过皮肤给药的贴剂或绷带转运。另外，可将所述治疗剂制成一种粘附性多聚物的部分，如聚丙烯酸酯或丙烯酸酯/乙烯乙酸酯的共聚物。为长期应用，可能要求使用微孔和/或可呼吸性基底薄片，这样可使皮肤水合作用和浸渍作用最小化。基底层可以为能提供所要求的保护和支持功能的任何适合的厚度。适合的厚度一般为约10-200微米。

例如可用水溶性或油性基质加上适当的增稠剂和/或凝胶剂制成软膏剂和霜剂。洗剂可用水溶性或油性基质制备，一般还可含有一或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂或着色剂。所述活性组分还可通过例如在美国专利Nos.4,140,122；4,383,529；或4,051,842中所公开的离子电渗疗法转运。局部制剂中存在的本发明的治疗剂的重量百分比依据多种因素而定，但通常为该制剂总重量的0.01％-95％，一般为0.1-85％。

诸如滴眼剂或滴鼻剂的滴剂可用一或多种治疗剂在水溶性或油性基质中制备，还可包括一或多种分散剂、稳定剂或悬浮剂。液体喷雾剂一般由加压包装中转运出来。滴剂可通过简单的带盖的滴眼小瓶、或者通过适于滴状转运液体内容物的塑料小瓶或者通过特殊定形的闭合容器转运。

还可将所述治疗剂制成口腔或咽喉内局部给药的制剂。例如，可将所述活性组分制成锭剂，其还包含矫味基质，通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄耆胶；糊剂，其包含在惰性基质(如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)中的组合物；以及口腔洗剂，其包含在适当的液体载体中的本发明的组合物。

本发明的药用制剂可包含作为任选的组分、药学上可接受的载体、稀释剂、稳定剂或乳化剂以及本领域可提供的类型的盐。这些物质的实例包括正常的盐水溶液，如生理缓冲盐水溶液和水。本发明药用制剂中所用的载体和/或稀释剂的具体的非限定性实例包括水和生理上可接受的缓冲盐水溶液，如磷酸盐缓冲盐水溶液pH7.0-8.0。

还可将本发明的活性组分对呼吸道给药。因此，本发明还提供在本发明方法中使用的气雾剂的药用制剂或剂型。通常，这些剂型包含一定量的有效用于治疗或预防特定的免疫反应、血管病症或疾病的临床症状的至少一种本发明的药物。已按照本发明方法治疗的免疫反应、血管病症或疾病的一或多种症状的任何统计学上明显的减弱都认为是本发明范围内的这些免疫反应、血管病症或疾病的治疗方法。

另外，为进行吸入或吹入法给药，所述组合物可采用干粉形式，例如所述治疗剂和适当的粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。该粉末组合物可以是在例如胶囊或药筒或例如明胶或水泡中的单位剂量形式，所述粉末从中在吸入器、吹入器或计量的-剂量吸入器(参见例如Newman，S.P.在 Aerosols and the Lung，Clarke.S.W.和Davia，D.eds.，pp.197-224，Butterworths，London，England，1984中公开的加压计量剂量吸入器(MDI)和干粉吸入器)帮助下给予。

当以气雾剂或吸入剂形式给予时，还可以以水溶液给予本发明的治疗剂。因此，其它气雾剂药用剂型可包含例如生理上可接受的缓冲盐水溶液，所述溶液包含约0.1mg/ml-100mg/ml之间的一或多种特别用于治疗病所述症或疾病的本发明的治疗剂。在本发明的实践中还可使用不溶解或混悬于液体中的分散均匀的固体治疗剂形式的干粉气雾剂。可将本发明的治疗剂制成粉化气雾剂，其包含具有平均粒径约1-5μm之间的，或者2-3μm之间的分散均匀的颗粒。分散均匀的颗粒可通过使用本领域熟知的技术进行粉碎和过筛制备。所述颗粒可通过吸入预定量的分散均匀的物质(可以是粉末形式)而给予。应清楚的是包含在各剂量形式的单一气雾剂剂量中的活性组分的单位含量不需要是其本身组成的治疗具体免疫反应、血管病症或疾病的有效剂量，原因是所述必要的有效剂量可通过各剂量单位的多次给药而达到。另外，可采用小于单位剂量形式的剂量，或者单独或者以系列给药的方式，达到所述有效剂量。

为通过吸入进行上(鼻腔)或下呼吸道给药，可方便地通过从喷雾器或加压包装中或其它转运气雾喷射剂的常规装置转运本发明的治疗剂。加压包装可包括适当的抛射剂，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适合的气体。在加压气雾剂中，所述单位剂量可通过提供用于释放已计量过的剂量的阀门来确定。喷雾器包括但不限于在美国专利Nos.4,624,251；3,703,173；3,561,444和4,635,627中说明的那些。本发明公开的所述类型的气雾剂转运系统来自于多种商业来源，包括Fisons公司(Bedford，Mass.)、Schering公司(Kenilworth，NJ)和American Pharmoseal公司(Valencia，CA)。为进行鼻腔给药，还可通过滴鼻剂、液体喷射剂，如通过塑料小瓶喷雾器或计量吸入器，给予所述治疗剂。喷雾器的类型为Mistometer(Wintrop)和Medihaler(Riker)。

另外，为治疗所述病症或某些其它病症，所述活性组分还可与其它治疗剂联合使用，其它治疗剂有如疼痛缓和剂、抗炎剂、抗组胺剂、支气管扩张剂等。

药剂盒

本发明还涉及一种用于控制、预防或治疗疾病的包装的药用组合物，如药剂盒或其它容器。所述药剂盒或容器装有治疗有效量的用于控制疾病的药用组合物以及使用所述药用组合物控制疾病的说明书。所述药用组合物包含至少一种控制、预防或治疗疾病的治疗有效量的本发明的结合实体或抗体。

在一实施方案中，所述药剂盒包括一种装有与胆甾醇臭氧化产物特异性结合的抗体的容器。所述抗体能直接或间接与相关治疗剂连接。所述抗体也可以以液体形式、粉末形式或其它易于给予动物的形式的提供。

在另一实施方案中，本发明提供一种药用组合物，该组合物包含至少一种控制、预防或治疗疾病的治疗有效量的细胞毒性的胆甾醇臭氧化产物。这种药剂盒含有一种可用作例如一种抑制或杀死不需要细胞类型的细胞毒素的胆甾醇臭氧化产物。

在本发明的另一实施方案中，所述药剂盒含有一种与细胞毒性的胆甾醇臭氧化产物轭合的结合实体。可使用这种药剂盒治疗患有以下疾病的患者：自身免疫性疾病、癌症、肿瘤、细菌感染、病毒感染、溃疡和/或其它其中局部给予细胞毒素有益的疾病。这种结合实体-细胞毒素轭合物优选以适于通过注射给予患者的形式提供。因此，该药剂盒可能含有悬浮形式的结合实体-细胞毒素轭合物，例如悬浮在适合的药用赋形剂中。另外，所述轭合物可以是适于再溶解的固体形式。

本发明的药剂盒还可含有用于给予本发明组合物的工具。这些工具包括注射器、拭子、导管、防腐剂溶液等。

下列实施例用于说明本发明，但不做限定。在不背离本发明精神和范围下，可对以上所提及的本发明进行大量改变和修改。

                   实施例1：材料和方法

动脉粥样硬化的动脉标本的手术分离和处理。通过颈动脉的动脉内膜切除术获得组织样品。所述样品含有动脉粥样硬化斑块和一些粘附的血管内膜和中膜。斑块分析的方案由Scripps Clinic Human SubjectsCommittee批准，外科手术前要得到患者的同意。通过颈动脉的动脉内膜切除术手术切除的新鲜组织在30分钟内进行分析。注意，斑块样品既不进行储存也不进行防腐处理。所有的分析操作都在手术切除后2小时内完成。标本中没有加入固定液。

动脉粥样硬化的人动脉标本对靛蓝胭脂红1的氧化。如上所述分离的动脉内膜切除术标本(n＝15)分成湿重近似相等(±5％)的两部分。将各标本置于含靛蓝胭脂红1(200μM，Aldrich)和牛过氧化氢酶(100μg)的磷酸缓冲盐水(PBS，pH 7.4，1.8mL)中。加入靛蓝胭脂红1充当臭氧的化学阱(chemical trap)。Takeuchi等，Anal.Chim.Acta 230，183(1990)；Takeuchi等，Anal.Chem.61，619(1989)。加入十四烷酸佛波醇酯(PMA，40μg于0.2mL DMSO中)或DMSO(0.2mL)作为蛋白激酶C的激活物。用组织均质机均质各样品10分钟，然后离心(10,000rpm 10分钟)。倾析上清液，通过过滤器(0.2μm)，用定量HPLC分析滤液中靛红磺酸2的存在。

如图1B所示，靛蓝胭脂红1的可见吸光度被漂白，反应产生可用定量HPLC检测(表1)并被鉴定为靛红磺酸2(另参见图1A)的新化学物质。

定量靛红磺酸2的HPLC测定。在带L-7200自动进样器、L-7100泵和L-7400紫外检测器(254nm)的Hitachi D-7000仪上进行HPLC分析。所述L-7100用Dell GX150 PC计算机上的Hitachi-HSM软件来控制。LC条件为Spherisorb RP-C₁₈柱和乙腈∶水(0.1％TFA)(80∶20)流动相1.2mL/分钟。靛红磺酸2的保留时间R_T为约9.4分钟。通过使用Macintosh上的GraphPad v3.0软件，将峰面积与峰面积对真实样品浓度的标准曲线相比较，进行定量(表1)。

         表1

由活化的动脉粥样硬化动脉物质形成的靛红磺酸2(ISA)。

样品	ISA nmol/mg
		1	27.3
2	54.4
		3	27.6
4	1.0
		5	30.1
6	238.3
		7	39.4
8	152.9
		9	127
10	262.1
		11	27.9
12	64.6
		13	1.4
14	3.2
		15	32.1

平均值±平均标准误差＝72.62±21.69

在H₂ ¹⁸O中动脉粥样硬化的人动脉标本对靛蓝胭脂红1的氧化。此实验按以上靛蓝胭脂红测定所述进行，但有以下例外。第一，将各斑块样品(n＝2)加入到于95％以上H₂ ¹⁸O中的磷酸盐缓冲液(10mM，pH7.4)中。第二，滤液在PD10柱上脱盐，在Finnegan电喷射质谱仪上通过负离子电喷射质谱分析。原始的离子丰度数据摘录成Graphpad Prism(3.0版本)格式，以供显示。

这些实验表明，在斑块材料和H₂ ¹⁸O(＞95％¹⁸O)存在下，¹⁸O同位素掺入到靛红磺酸2的内酰胺羰基中。因为只有臭氧能够氧化裂解靛蓝胭脂红1的双键，促进来自H₂ ¹⁸O的同位素掺入到靛红磺酸2的内酰胺羰基中，臭氧很可能是氧化靛蓝胭脂红1的活性氧物质。因此，在动脉粥样硬化病变中产生臭氧。另参见P.Wentworth Jr.等，Science298，2195(2002)；B.M.Babior，C.Takeuchi，J.Ruedi，A.Guitierrez，P.Wentworth Jr.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100，3920(2003)；P.Wentworth Jr.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100，1490(2003)。

来自动脉粥样化动脉标本的醛的抽提和衍生化方法。如上所述分离的动脉内膜切除术标本分成湿重近似相等(±5％)的两部分。将各标本置于含牛过氧化氢酶(100μg)和十四烷酸佛波醇酯(40μg于0.2mLDMSO中)或DMSO(0.2mL)的磷酸缓冲盐水(PBS，pH 7.4，1.8mL)中。用组织均质机均质各样品10分钟。动脉内膜切除术样品均质后，如上分离，然后用二氯甲烷(DCM，3×5mL)洗涤。真空蒸发合并的有机部分。残余物溶于乙醇(0.9mL)中，并加入2，4-二硝基苯肼(100μL，2mM，和1N HCl)的乙醇溶液。向溶液中吹入氮气5分钟，然后搅拌溶液2小时。将所得悬浮液滤过0.22μm过滤器，滤液通过HPLC测定进行分析(见下文)。当胆甾醇3(1-20μM)在这些条件下处理时，没有形成4a或5a。将添加PMA前后在动脉粥样化动脉抽提物中检出的4b的量进行Student双侧t测验分析，以确定PMA添加对动脉抽提物中4a水平的显著性(p＜0.05认为显著)，并用Macintosh上的Graphpad v3.0软件测定所述量。

4a在这些条件下衍生化的过程中，在4a的浓度范围(5-100μM)内，约有20％的4a转化成5b。这些数据表明，测定量的5a(超过相同斑块样品中存在的4a的20％)是由3臭氧解后醛醇化而产生的。在所采用的衍生化条件下4a转化成6b的程度在4a的浓度范围(5-100μM)内始终＜2％。这些观察结果表明，斑抽提物中存在的6a量超过酮醛4a量的2％，在衍生化之前就存在，是通过水的β消除从臭氧解产物4a产生的。

除了三种主要的腙产物4b-6b之外，在几个斑块抽提物中还检出痕量(＜5pmol/mg)的7a腙衍生物(称作7b)(R_T～26分钟，[M-H]^-579，SOM图2 & 4)。化合物7a是5a的A环脱水产物。衍生化的斑块抽提物中7b的量接近所采用的HPLC测定的检出限，因此没有在所有的斑块样品中进行此化合物的完全分析研究。化合物7a和7b的构型排布基于合成物质7b的¹H-¹H ROESY实验。

利用化合物6b、7a、7b、8a和9a的合成制品来鉴定图4中具有R_T～26分钟的峰[M-H]^-579的化合物。

腙的HPLC-MS分析。在带L-7200自动进样器(正常注射体积10μl)、L-7100泵、L-7400紫外检测器(360nm)或L-7455二极管阵列检测器(200-400nm)和线内M-8000离子阱质谱仪(以负离子方式)的HitachiD-7000仪上进行HPLC-MS分析。所述L-7100和M-8000用Dell GX150PC计算机上的Hitachi-HSM软件来控制。使用Vydec C₁₈反相柱进行HPLC。采用0.5mL/分钟等度流动相(75％乙腈，20％甲醇和5％水)。用Hitachi D7000色谱工作站软件测定峰高和峰面积，通过与真实物质的标准曲线比较转化为浓度。在这些条件下，腙4b-6b的检出限在1-10nM之间。使用这种HPLC系统，没有获得顺式和反式腙异构体的拆分。

抽提出并衍生化的动脉粥样硬化物质的代表性HPLC-MS在图4中显示。几种关键腙化合物的真实样品的保留时间和质量比例在表2中显示。

        表2  真实腙的LCMS分析

腙	RT/分钟	[M-H]-
			4b	13.9	597
5b	20.3	597
			6b	18.0	579
7b	26.8	579
			a，d8b	26.6	579
b9b	16.5	579
			c10b	48.2	561

^a真实醛8a的腙通过上述衍生化方法制备，醛8a不单独合成和纯化。

^b市售酮9a的腙通过上述衍生化方法制备，不单独合成和纯化。^c真实醛10a的腙通过上述衍生化方法制备，不单独合成和纯化。^d8b和9b之间的辨别基于它们的紫外光谱来作出[通过Hitachi L-7455二极管阵列检测器(200-400nm)测量]。α，β-不饱和腙8b的λ_max为435nm，而腙9b的λ_max为416nm。

血浆样品中醛4a和5a的分析。从按计划在24小时内进行颈动脉的动脉内膜切除术的患者(n＝8)获得血浆样品。样品收集后3天分析所有这种血浆样品中4a和5a的存在。从普通医学诊所的随机患者(n＝15)获得对照血浆样品，并在收集后7天进行分析。在典型的方法中，用二氯甲烷(DCM，3×1mL)洗涤EDTA(1ml)中的血浆。真空蒸发合并的有机部分。残余物溶于甲醇(0.9mL)中，并加入2，4-二硝基苯肼(100μL，0.01M，Lancaster)和1N HCl的乙醇溶液。向溶液中吹入氮气5分钟，然后搅拌溶液2小时。将所得悬浮液滤过0.22μm过滤器，滤液通过HPLC测定进行分析(见上文)。初步研究揭示，可从血浆抽提的5a的量每天下降约5％。

真实样品4a、4b、5a、5b、6a、6b、7a、7b、8a和8b的制备

一般方法。除非另有指定，所有反应均在存在干燥剂、溶剂和火焰干燥的玻璃器具的惰性气氛中进行。所有原料均购自Aldrich、Sigma、Fisher或Lancaster，并按获得时原样使用。酮9a获自Aldrich。所有快速柱色谱均使用硅胶60(230-400目)来进行。制备型薄层层析(TLC)使用Merck(0.25、0.5或1mm)涂铺硅胶Kieselgel 60 F₂₅₄板来进行。¹H NMR谱在Bruker AMX-600(600MHz)、AMX-500(500MHz)、AMX-400(400MHz)或AC-250(250MHz)波谱计上记录。¹³C NMR谱在Bruker AMX-500(125.7MHz)或AMX-400(100.6MHz)波谱计上记录。化学位移以相对于内标的百万分之一(ppm)以δ标度来报告。高分辨率质谱在VG ZAB-VSE仪器上记录。

3β-羟基-5-氧代-5，6-断胆甾烷-6-醛(4a)。此化合物按K.Wang，E.Bermúdez，W.A.Pryor，Steroids 58，225(1993)中的一般描述进行合成。在干冰温度下，使胆甾醇3(1g，2.6mmol)的氯仿-甲醇(9∶1)(100ml)溶液臭氧化10分钟。蒸发反应混合物，在室温下用Zn粉(650mg，10mmol，于水-乙酸(1∶9，50ml)中)搅拌3小时。用二氯甲烷(100ml)稀释被还原的混合物，并用水(3×50ml)洗涤。合并的有机级分用硫酸钠干燥，真空蒸发至干。残余物用硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(25∶75)]纯化，得到标题化合物4a，为白色固体(820mg，76％)：

¹H NMR(CDCl₃)δ9.533(s，1H，CHO)，4.388(m，1H，H-3)，3.000(dd，J＝14.0，4.0Hz，1H，H-4e)，0.927(s，3H，CH₃-19)，0.827(d，J＝6.8Hz，3H，CH₃-21)，0.782(d，J＝6.8Hz，3H，CH₃)，0.778(d，J＝6.8Hz，3H，CH₃)，0.603(s，3H，CH₃-18)；¹³C NMR(CDCl₃)δ217.90(C-5)，202.76(C-6)，70.81(C-3)，55.96(C-17)，54.26(C-14)，52.52(C-10)，46.70(C-4)，44.17(C-7)，42.43(C-13)，42.17(C-9)，39.75(C-12)，39.33(C-24)，35.85(C-22)，35.61(C-20)，34.58(C-8)，33.99(C-1)，27.87(C-25)，27.73(C-16)，27.52(C-2)，25.22(C-15)，23.62(C-23)，22.91(C-11)，22.70(C-27)，22.44(C-26)，18.44(C-21)，17.46(C-19)，11.42(C-18).

C₂₇H₄₆O₃Na(M+Na)⁺HRMALDITOFMS计算值441.3339，实测值441.3355。

3β-羟基-5-氧代-5，6-断胆甾烷-6-醛的2，4-二硝基苯腙(4b)。此化合物按K.Wang，E.Bermúdez，W.A.Pryor，Steroids 58，225(1993)中的一般描述进行合成。将2，4-二硝基苯肼(52mg，0.26mmol)和对甲苯磺酸(1mg，0.0052mmol)加入到酮醛4a(100mg，0.24mmol)的乙腈(10ml)溶液。在室温下搅拌反应混合物4小时，真空蒸发至干。残余物溶于乙酸乙酯(10ml)并用水(3×20ml)洗涤。合并的有机部分用硫酸钠干燥，真空蒸发至干。残余物通过硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(1∶4)]纯化，得到标题化合物4b，为黄色固体(100mg，70％)，是顺式和反式异构体(1∶4)的混合物。从己烷-二氯甲烷结晶得到反式4b，为黄色针状物(30mg，21％)：

¹H NMR(CDCl₃)：δ10.994(s，1H，NH)，9.107(d，J＝2.8Hz，1H，H-3′)，8.316(dd，J＝9.6，2.8Hz，1H，H-5′)，7.923(d，J＝9.6Hz，1H，H-6′)，7.419(dd，J＝6.0，3.6Hz，1H，H-6)，4.417(m，1H，H-3)，2.971(dd，J＝13.6，4.0Hz，1H，H-4e)，1.076(s，3H，CH₃-19)，0.915(d，J＝6.4Hz，3H，CH₃-21)，0.853(d，J＝6.4Hz，3H，CH₃)，0.849(d，J＝6.4Hz，3H，CH₃)，0.710(s，3H，CH₃-18)；¹³C NMR(CDCl₃)δ216.05(C-5)，150.84(C-6)，144.96(C-1′)，137.87(C-4′)，130.23(C-5′)，128.90(C-2′)，123.50(C-3′)，116.52(C-6′)，71.42(C-3)，56.07(C-17)，54.54(C-14)，52.69(C-10)，47.34(C-4)，42.61(C-13)，42.61(C-9)，39.82(C-12)，39.42(C-24)，36.99(C-8)，35.96(C-22)，35.67(C-20)，34.13(C-1)，32.65(C-7)，27.98(C-16)，27.93(C-25)，27.90(C-2)，25.31(C-15)，23.70(C-23)，23.12(C-11)，22.78(C-27)，22.52(C-26)，18.56(C-21)，17.77(C-19)，11.67(C-18)；

C₃₃H₅₀N₄O₆Na(M+Na)HRMALDITOFMS计算值621.3622，实测值621.3622：λ_max 360nm，ε2.57±0.31×10⁴M^-1cm^-1。

3β-羟基-5β-羟基-B-降胆甾烷-6β-甲醛(5a)。此化合物按T.Miyamoto，K.Kodama，Y.Aramaki，R.Higuchi，R.W.M.Van Soest，Tetrahedron Letter 42，6349(2001)中的一般描述进行合成。向酮醛4a(800mg，1.9mmol)的乙腈-水(20∶1，100ml)溶液加入L-脯氨酸(220mg，1.9mmol)。在室温下搅拌反应混合物2小时，真空蒸发至干。残余物溶于乙酸乙酯(50ml)并用水(3×50ml)洗涤。合并的有机级分用硫酸钠干燥，真空蒸发。残余物通过硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(1∶4)]纯化，得到标题化合物5a，为白色固体(580mg，73％)：

¹H NMR(CDCl₃)δ9.689(d，J＝2.8Hz，1H，CHO)，4.115(m，1H，H-3)，3.565(s，1H，3β-OH)，2.495(broad s，1H，5β-OH)，2.234(dd，J＝9.2，3.2Hz，1H，H-6)，0.920(s，3H，CH₃-19)，0.904(d，J＝6.4Hz，3H，CH₃-21)，0.854(d，J＝6.8Hz，3H，CH₃)，0.850(d，J＝6.8Hz，3H，CH₃)，0.705(s，3H，CH₃-18)；¹³C NMR(CDCl₃)δ204.74(C-7)，84.26(C-5)，67.33(C-3)，63.89(C-9)，56.10(C-14)，55.67(C-17)，50.42(C-6)，45.47(C-10)，44.72(C-13)，44.22(C-4)，40.02(C-8)，39.67(C-12)，39.44(C-24)，36.15(C-22)，35.58(C-20)，28.30(C-16)，27.98(C-2)，27.91(C-25)，26.69(C-1)，24.55(C-15)，23.78(C-23)，22.78(C-27)，22.52(C-26)，21.54(C-11)，18.71(C-21)，18.43(C-19)，12.48(C-18).

C₂₇H₄₆O₃Na(M+Na)⁺HRMALDITOFMS计算值441.3339，实测值441.3351。

3β-羟基-5β-羟基-B-降胆甾烷-6β-甲醛的2，4-二硝基苯腙(5b)。此化合物按K.Wang，E.Bermúdez，W.A.Pryor，Steroids 58，225(1993)中的一般描述进行合成。将2，4-二硝基苯肼(52mg，0.26mmol)和盐酸(12M，2滴)加入到醛5a(100mg，0.24mmol)的乙腈(10ml)溶液。在室温下搅拌反应混合物4小时，真空蒸发至干。残余物溶于乙酸乙酯(10ml)并用水(3×20ml)洗涤。合并的有机部分用硫酸钠干燥，真空蒸发至干。残余物通过硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(1∶4)]纯化，得到标题化合物5b黄色固体(90mg，62％)，为反式5b苯腙：

¹H NMR(CDCl₃)11.049(s，1H，NH)，9.108(d，J＝2.4Hz，1H，H-3′)，8.280(dd，J＝9.6，2.6Hz，1H，H-5′)，7.901(d，J＝9.6Hz，1H，H-6′)，7.561(d，J＝7.2Hz，1H，H-7)，4.214(m，1H，H-3)，3.349(s，1H，3β-OH)，2.337(dd，J＝9.2，6.8Hz，1H，H-6)，0.967(s，3H，CH₃-19)，0.917(d，J＝6.8Hz，3H，CH₃-21)，0.850(d，J＝6.4Hz，3H，CH₃)，0.846(d，J＝6.4Hz，3H，CH₃)，0.713(s，3H，CH₃-18)；¹³C NMR(CDCl₃)δ155.18(C-7)，145.12(C-1′)，137.51(C-4′)，129.91(C-5′)，128.64(C-2′)，123.57(C-3′)，116.36(C-6′)，83.35(C-5)，67.56(C-3)，56.34(C-17)，56.34(C-9)，55.56(C-14)，51.47(C-6)，45.50(C-10)，44.76(C-13)，43.62(C-4)，42.59(C-8)，39.66(C-12)，39.43(C-24)，36.16(C-22)，35.58(C-20)，28.50(C-16)，28.07(C-2)，27.98(C-25)，27.70(C-1)，24.67(C-15)，23.78(C-23)，22.78(C-27)，22.52(C-26)，21.63(C-11)，18.75(C-21)，18.67(C-19)，12.48(C-18)；

C₃₃H₅₀N₄O₆Na(M+Na)⁺HRMALDITOFMS计算值621.3622，实测值621.3625。HPLC-MS检测：R_T 20.8分钟；[M-H]^-597；λ_max 361nm，ε2.47±0.68×10⁴M^-1cm^-1。

5-氧代-5，6-断胆甾-3-烯-6-醛(6a)。此化合物按P.Yates，S.Stiveer，Can.J.Chem.66，1209(1988)中的一般描述进行合成。将甲磺酰氯(400μl，2.87mmol)滴加到冰浴温度下搅拌的酮醛4a(300mg，0.72mmol)和三乙胺(65μl，0.84mmol)的CH₂Cl₂溶液(15ml)中。所得溶液在0℃氩气下搅拌30分钟，然后加入三乙胺(400μl，2.87mmol)，将溶液升温至室温。2小时后，将反应混合物真空蒸发至干。残余物溶于二氯甲烷(15ml)并用水(3×20ml)洗涤。合并的有机级分用无水硫酸钠干燥，真空蒸发。粗残余物通过硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(1∶9)]纯化。蒸发所得级分，得到醛6a(153mg，53％)，为无色油。

                                         H NMR(CDCl₃)显示δ9.574(s，1H，CHO)，6.769(m，1H，H-3)，5，822(d，J＝10Hz，1H，H-4)，2.512(dd，J＝16.8，3.6Hz，1H，H-7)，1.070(s，3H，CH₃-19)，0.882(d，J＝6.8Hz，3H，CH₃-21)，0.845(d，J＝6.8Hz，3H，CH₃)，0.841(d，J＝6.8Hz，3H，CH₃)，0.674(s，3H，CH₃-18)；¹³C NMR(CDCl₃)δ208.22(C-5)，202.42(C-6)，147.46(C-3)，128.44(C-4)，56.08(C-17)，54.96(C-14)，47.80(C-10)，45.05(C-7)，42.33(C-13)，42.04(C-9)，39.73(C-12)，39.43(C-24)，35.93(C-22)，35.71(C-20)，35.42(C-1)，33.77(C-8)，27.97(C-25)，27.67(C-16)，25.22(C-15)，24.67(C-2)，23.71(C-23)，23.27(C-11)，22.77(C-27)，22.51(C-26)，18.54(C-21)，17.71(C-19)，11.48(C-18).

C₂₇H₄₅O₂(M+H)⁺HRMALDITOFMS计算值401.3414，实测值401.3404。

5-氧代-5，6-断胆甾-3-烯-6-醛的2，4-二硝基苯腙(6b)。将2，4-二硝基苯肼(45mg，0.23mmol)加入到酮醛6a(80mg，0.2mmol)和对甲苯磺酸(1mg，0.0052mmol)的乙腈(10ml)溶液。在室温下搅拌反应混合物2小时，真空蒸发至干。残余物溶于二氯甲烷(10ml)并用水(3×20ml)洗涤。合并的有机级分用硫酸钠干燥，真空蒸发至干。残余物通过硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(15∶85)]纯化，得到标题化合物6b，为黄色固体(70mg，60％)：

反式-6b ¹H NMR(CDCl₃)显示δ10.958(s，1H，NH)，9.104(d，J＝2.4Hz，1H，H-3′)，8.288(dd，J＝9.8，2.8Hz，1H，H-5′)，7.896(d，J＝9.6Hz，1H，H-6′)，7.337(dd，J＝5.6，5.6Hz，1H，H-6)，6.771(m，1H，H-3)，5.822(d，J＝10Hz，1-H，H-4)，2.600(ddd，J＝16.4，4.8，4.8Hz，1H，H-7)，1.139(s，3H，CH₃-19)，0.897(d，J＝6.4Hz，3H，CH₃-21)，0.840(d，J＝6.8Hz，3H，CH₃)，0.837(d，J＝6.8Hz，3H，CH₃)，0.703(s，3H，CH₃-18)；¹³C NMR(CDCl₃)δ207.78(C-5)，151.17(C-6)，147.69(C-3)，145.00(C-1′)，137.61(C-4′)，129.97(C-5′)，128.52(C-2′)，128.38(C-4)，123.48(C-3′)，116.46(C-6′)，56.05(C-17)，54.68(C-14)，47.87(C-10)，42.30(C-13)，41.69(C-9)，39.72(C-12)，39.37(C-24)，36.35(C-8)，35.91(C-22)，35.66(C-20)，35.34(C-1)，32.84(C-7)，27.93(C-25)，27.73(C-16)，24.93(C-15)，24.68(C-2)，23.69(C-23)，23.24(C-11)，22.74(C-27)，22.48(C-26)，18.52(C-21)，17.81(C-19)，11.58(C-18)；

C₃₃H₄₈N₄O₅Na(M+Na)⁺HRMALDITOFMS计算值603.3517，实测值603.3523。HPLC-MS检测：R_T 18.3分钟；[M-H]^- 579；λ_max 360nm，ε2.29±0.23×10⁴M^-1cm^-1。

5β-羟基-B-降胆甾-3-烯-6β-甲醛(7a)。此化合物按P.Yates，S.Stiveer，Can.J.Chem.66，1209(1988)中的一般描述进行合成。在室温氩气氛下，将甲醇中的甲醇钠(0.5M，0.16mmol)滴加到酮醛4a(50mg，0.125mmol)的无水甲醇溶液(10ml)中。30分钟后，真空除去甲醇，残余物溶于二氯甲烷(20ml)并用水(3×20ml)洗涤。合并的有机级分用硫酸钠干燥，真空蒸发。残余物通过硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(1∶9)]纯化，得到标题化合物醛7a，为无色油(16mg，32％)：

¹H NMR(CDCl₃)δ9.703(d，J＝3.2，1H，CHO)，5.716(m，2H，H-3 andH-4)，2.398(dd，J＝9.6，3.6Hz，1H，H-6)，0.953(s，3H，CH₃-19)，0.904(d，J＝6.4Hz，3H，CH₃-21)，0.854(d，J＝6.4Hz，3H，CH₃)，0.849(d，J＝6.4Hz，3H，CH₃)，0.706(s，3H，CH₃-18)；¹³C NMR(CDCl₃)δ204.41(C-7)，134.21(C-3)，126.66(C-4)，81.44(C-5)，64.49(C-9)，55.86(C-14)，55.55(C-17)，48.44(C-6)，45.12(C-10)，44.47(C-13)，39.92(C-8)，39.45(C-12)，39.40(C-24)，36.16(C-22)，35.57(C-20)，29.06(C-1)，28.31(C-16)，27.98(C-25)，24.73(C-15)，23.76(C-23)，22.78(C-27)，22.53(C-26)，21.69(C-2)，21.24(C-11)，18.74(C-21)，18.44(C-19)，12.37(C-18)；

C₂₇H₄₄O₂Na(M+Na)⁺HRMALDITOFMS计算值423.3233，实测值423.3240。

5β-羟基-B-降胆甾-3-烯-6β-甲醛的2，4-二硝基苯腙(7b)：将2，4-二硝基苯肼(8mg，0.041mmol)和对甲苯磺酸(1mg，5.2μmol)加入到醛7a(15mg，0.037mmol)的乙腈溶液(5ml)中。在室温下搅拌反应混合物2小时，真空蒸发，并用二氯甲烷(10ml)稀释。有机层用水水(3×20ml)洗涤，用硫酸钠干燥，并蒸发至干。残余物通过硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(1∶9)]纯化，得到腙7b，为黄色固体(9mg，41％)：

¹H NMR(CDCl₃)trans-7b 11.060(s，1H，NH)，9.119(d，J＝2.8Hz，1H，H-3′)，8.291(dd，J＝9.2，2.0Hz，1H，H-5′)，7.930(d，J＝9.6Hz，1H，H-6′)，7.546(d，J＝7.2Hz，1H，H-7)，5.761(ddd，J＝10.2，4.4，2.0Hz，1H，H-3)，5.705(d，J＝9.6Hz，1H，H-4)，2.485(dd，J＝10.4，7.6Hz，1H，H-6)，0.977(s，3H，CH₃-19)，0.917(d，J＝6.4Hz，3H，CH₃-21)，0.848(d，J＝6.8Hz，3H，CH₃)，0.844(d，J＝6.4Hz，3H，CH₃)，0.707(s，3H，CH₃-18)；¹H-¹H ROESY NMR显著相关性(H₄-H₆)，(H₆-H₇)，(H₇-H₈)，(H₇-H₁₉)，缺乏相关性(H₃-H₁₉)，(H₄-H₇)，(H₄-H₁₉)，(H₆-H₁₉)；¹³C NMR(CDCl₃)δ154.62(C-7)，145.09(C-1′)，137.59(C-4′)，133.89(C-3)，129.94(C-5′)，128.68(C-2′)，127.12(C-4)，123.57(C-3′)，116.42(C-6′)，80.91(C-5)，56.83(C-9)，56.07(C-14)，55.39(C-17)，49.58(C-6)，45.00(C-10)，44.58(C-13)，42.50(C-8)，39.44(C-12)，39.44(C-24)，36.17(C-22)，35.54(C-20)，30.46(C-1)，28.53(C-16)，27.98(C-25)，24.91(C-15)，23.74(C-23)，22.77(C-27)，22.52(C-26)，21.79(C-2)，21.31(C-11)，18.76(C-21)，18.76(C-19)，12.34(C-18).

HPLC-MS检测：RT 18.3分钟；[M-H]-579；λ_max 364nm，ε2.32±0.17×10⁴M^-1cm^-1。

3β-羟基-B-降胆甾-5-烯-6-甲醛(8a)将醛5a(50mg，0.12mmol)和磷酸(85％，5ml)的乙腈-二氯甲烷溶液(1∶1，4ml)加热回流30分钟。真空蒸发反应混合物，用二氯甲烷(50ml)稀释，并用水(3×20ml)洗涤。有机层用硫酸钠干燥，真空蒸发。残余物通过硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(1∶4)]纯化，得到标题醛，为12mg(25％)的α，β不饱和醛8a：

                                            ¹H NMR(CDCl₃)of 8a显示δ9.958(s，1H，CHO)，3.711(tt，J＝10.8，4.5Hz，1H，H-3)，3.475(dd，J＝14.1，4.8，1H，H-4)，2.563(dd，J＝11.0，11.0Hz，1H，H-8)，0.953(s，3H，CH₃-19)，0.941(d，J＝6.9Hz，3H，CH₃-21)，0.881(d，J＝6.6Hz，3H，CH₃)，0.876(d，J＝6.6Hz，3H，CH₃)，0.746(s，3H，CH₃-18)；¹³C NMR(CDCl₃)δ189.44(C-7)，168.74(C-5)，139.21(C-6)，70.88(C-3)，60.16(C-9)，55.40(C-17)，54.48(C-14)，46.35(C-10)，46.19(C-8)，45.27(C-13)，39.86(C-12)，39.55(C-24)，36.26(C-4)，36.22(C-22)，35.64(C-20)，33.93(C-1)，31.32(C-2)，28.62(C-16)，28.09(C-25)，26.65(C-15)，24.00(C-23)，22.90(C-27)，22.64(C-26)，20.80(C-11)，19.02(C-21)，15.73(C-19)，12.59(C-18)；

C₂₇H₄₄O₂Na(M+Na)⁺HRMS计算值423.3233，实测值423.3239。

从此反应获得副产物B-降胆甾-3，5-二烯-6-甲醛12a，为白色固体(27mg，60％)：

                                                ¹H NMR(CDCl₃)δ10.017(s，1H，CHO)，6.919(d，J＝10.2Hz，1H，H-4)，6.225(m，1H，H-3)，2.675(dd，J＝10.8，10.8Hz，1H，H-8)，0.950(d，J＝6.9Hz，3H，CH₃-21)，0.914(s，3H，CH₃-19)，0.882(d，J＝6.8Hz，3H，CH₃)，0.877(d，J＝6.8Hz，3H，CH₃)，0.769(s，3H，CH₃-18)；¹³C NMR(CDCl₃)δ189.41(C-7)，163.33(C-5)，138.18(C-6)，135.75(C-3)，120.68(C-4)，59.54(C-9)，55.41(C-17)，54.30(C-14)，45.47(C-8)，45.08(C-10)，44.72(C-13)，39.79(C-12)，39.55(C-24)，36.27(C-22)，35.65(C-20)，34.18(C-1)，28.62(C-16)，28.09(C-25)，26.72(C-15)，24.00(C-23)，23.96(C-2)，22.90(C-27)，22，64(C-26)，20.72(C-11)，19.03(C-21)，14.87(C-19)，12.62(C-18)；

C₂₇H₄₃O(M+H)⁺HRMALDITOFMS计算值383.3308，实测值383.3309。

酮醛4a与氨基酸的羟醛缩合。在典型的方法中，将酮醛4a(2mg，4.8μmol)溶于NMR管中的DMSO-d₆(800μl)和D₂O(80μl)。向此溶液加入1当量的任一：a)L-脯氨酸、b)甘氨酸、c)盐酸L-赖氨酸或d)二盐酸L-赖氨酸乙酯。样品在各时间点进行¹H NMR分析。通过监测许多共振的变化，例行观察反应。

¹H NMR(DMSO-d₆)¹H NMR 5a显示δ9.527(d，J＝3.2Hz，1H，CHO)，3.876(m，1H，H-3)，0.860(d，J＝6.4Hz，3H，CH₃-21)，0.772(d，J＝6.8Hz，3H，CH₃)，0.767(d，J＝6.8Hz，3H，CH₃)，0.771(s，3H，CH₃-19)，0.642(s，3H，CH₃-18).¹H NMR 4a显示δ9.518(s，1H，CHO)，4.223(m，1H，H-3)，2.994(dd，J＝12.8，4.0Hz，1H，H-4e)，0.858(d，J＝6.8Hz，3H，CH₃)，0.842(s，3H，CH₃-19)，0.811(d，J＝6.8Hz，3H，CH₃)，0.807(d，J＝6.4Hz，3H，CH₃-21)，0.615(s，3H，CH₃-18).

在这些条件下，在DMSO-d₆(800μl)和D₂O(80μl)中没有发生4a的羟醛缩合。

断酮醛4a与动脉粥样硬化的动脉部分和血液部分的羟醛缩合。在典型的方法中，将酮醛4a(5mg，0.0012mmol)溶于DMSO-d₆(800μl)和D₂O(80μl)中。向此溶液加入任一a)动脉粥样硬化的动脉(2.1mg)，其已在组织均质机中均质于PBS(1ml)中并冻干，b)冻干的人血液(1ml)，c)冻干的人血浆(1ml)或d)冻干的PBS(1ml)。在各时间点抽取样品进行¹H NMR分析(见上文)。在这些条件下，在冻干的PBS存在时没有发生4a的羟醛缩合。

用4a和5a进行生物研究

已描述了某些由体内胆甾醇氧化产生的氧甾醇。E.Lund，I.Bjrkhem，Acc.Chem.Res.28，241(1995)。此外，已从海绵Stellettahiwasaensis分离出只在胆甾烷(cholestan)侧链上存在结构差异的5a类似物，作为对细胞毒性天然产物的全面筛选的一部分。T.Miyamoto，K.Kodama，Y.Aramaki，R.Higuchi，R.W.M.Van Soest，Tetrahedron Lett.42，6349(2001)；B.Liu，Z.Weishan，Tetrahedron Lett.43，4187(2002)。但是，在人类中，如在甾醇4a和5a中类甾醇核被破坏的衍生物以前并没有报告。

细胞毒性测定。WI-L2人B-淋巴细胞系、HAAE-1人腹腔主动脉内皮细胞系、MH-S鼠肺泡巨噬细胞系和J774A.1鼠组织巨噬细胞系从ATCC获得。人主动脉内皮细胞(HAEC)和人血管平滑肌细胞(VSMS)从Cambrex Bio Science获得。Jurkat E6-1T-淋巴细胞由J.Kaye博士(TheScripps Research Institute)惠赠。细胞在含10％胎牛血清的ATCC推荐培养基中培养。细胞在37C、5或7％CO₂的控制气氛下温育。对于乳酸脱氢酶(LDH)释放测定，通过添加0.05％胰蛋白酶/EDTA或通过刮取来收获贴壁细胞。将获得的细胞接种在96孔微量滴定板上(25,000个细胞/孔)，让其复原24-48小时。轻轻洗涤细胞，培养基用含5％胎牛血清的新鲜培养基置换。用3、4a或5a(0-100μM)处理两份重复的或者更多的细胞样品18小时。然后通过测量培养物中从细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)，来确定细胞毒性。简单的说，用CytoTox 96非放射性细胞毒性测定(Promega，USA)，测量96孔板中培养的细胞在酮醛4a、羟醛5a或胆甾醇3处理结束时细胞上清液中的LDH活性。100％细胞毒性定义为如台盼蓝排斥试验所示死细胞释放的LDH最大量，或者细胞用0.9％Triton X-100裂解时检出的LDH最高量。通过用Macintosh上的Graphpad(版本3.0)软件，将浓度对细胞毒性(％)的原始双份重复数据进行非线性回归分析(Hill plot)，确定IC₅₀值。

Lipid-loading测定(泡沫细胞形成)。在37℃、5或7％CO₂的控制气氛下，将J774.1巨噬细胞在8孔腔式载玻片上温育于含10％胎牛血清的ATCC推荐培养基中。然后将细胞在含抗氧化剂2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚甲苯(100μM)、二亚乙基三胺五乙酸(100μM)以及LDL(100μg/mL)或者LDL(100μg/mL)与4a atheronal-A 4a(20μM)或者LDH(100μg/mL)和atheronal-B 5a(20μM)的相同培养基中温育72小时。结束时，用PBS(pH 7.4)洗涤细胞两次。然后用溶于PBS的6％(v/v)低聚甲醛固定细胞30分钟，用丙二醇漂洗2分钟，用5mg/ml油红O使脂质染色8分钟。用Harris苏木精复染细胞45秒钟，用6％低聚甲醛除去背景染色，然后在PBS中洗涤一次和在自来水中洗涤一次。用甘油将盖玻片放置在载玻片上，然后对玻片标本进行光学显微检查。记下每张载玻片的单个视野中所计数的总共至少100个细胞中富脂细胞的数目，将其表示为总细胞的百分数。以100x的放大倍数拍照。

圆二色性。在37℃下，在Aviv旋光分光计上恒温控制(±0.1℃)的0.1cm石英样品池中记录溶于PBS(pH 7.4，含1％异丙醇)的LDL(100μg/mL)、LDL(100μg/mL)与4a(10μM)和LDL(100μg/mL)与5a(10μM)的圆二色性(CD)谱。在肽的范围内(200-260nm)记录圆二色性谱。为提高信噪比，每次测量均取多个谱(三个)的平均值。用Dell PC计算机上的CDPro软件包(由科罗拉多州立大学的Narasimha Sreerama开发)，进行每次测量的摩尔椭圆度谱的去叠合。

实施例2：动脉粥样硬化斑块产生臭氧和胆甾醇臭氧解产物

使用上述方法，本实施例显示，通过颈动脉内膜切除术从15名人类患者(n＝15)获得的动脉粥样硬化组织可产生臭氧，臭氧可通过与靛蓝胭脂红1反应检出。

动脉粥样硬化斑块产生的臭氧对靛蓝胭脂红的漂白

本发明发明人先前发现，当在靛蓝胭脂红1(臭氧的化学阱)溶液中用蛋白激酶C激活物4-β-佛波醇12-十四烷酸13-乙酸酯(PMA)处理抗体包被的白细胞时，靛蓝胭脂红1的可见吸光度被漂白，靛蓝胭脂红1被转化成靛红磺酸2。参见例如P.Wentworth Jr.等，Science 298，2195(2002)；B.M.Babior，C.Takeuchi，J.Ruedi，A.Guitierrez，P.Wentworth Jr.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100，3920(2003)；P.Wentworth Jr等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100，1490(2003)。靛红磺酸2的结构在图1A中提供。当这些实验在H₂ ¹⁸O(＞95％¹⁸O)中进行时，观察到氧同位素掺入到靛红磺酸2的内酰胺羰基中(见上文)。这个方法将臭氧和¹O₂ ^*与也可氧化靛蓝胭脂红1的其他氧化剂区别开来，因为在据认为与炎症有关的氧化剂当中，只有臭氧氧化裂解靛蓝胭脂红1的双键，同时同位素(来自H₂ ¹⁸O中)掺入到靛红磺酸2的内酰胺羰基中(参见上文和图1A)。

如实施例1所述，通过颈动脉内膜切除术从15名据认为有成问题的动脉粥样硬化的人类患者获得斑块物质。将各斑分成两相等部分(约50mg湿重，悬浮于1mL PBS中)。将每部分斑物质加入到靛蓝胭脂红1(200μM)和牛过氧化物酶(50μg/mL)的磷酸缓冲盐水(PBS，pH 7.4，10mM磷酸盐缓冲液，150mM NaCl)溶液(1mL)中。通过将DMSO(10μL)或十四烷酸佛波醇酯(PMA，10μL，20μg/mL)的DMSO溶液加入到悬浮斑块物质的一个等分试样或另一个等分试样中，开始进行分析。

加入PMA时，在15个斑样品中观察到有14个出现1的可见吸光度的漂白(图1B)。经反相HPLC分析(图1A和C)确定，此漂白伴随靛红磺酸2的形成。取决于受试的分离斑或块，所形成的靛红磺酸2的量在1.0-262.1nmol/mg之间变动。由不同分离物产生的靛红磺酸2的平均量是72.62±21.69nmol/mg。

当在含H₂ ¹⁸O的PBS(＞95％¹⁸O)(n＝2)中与靛蓝胭脂红1(200μM)进行悬浮斑块物质的PMA活化时，如分离的裂解产物靛红磺酸2的质谱(图1D)中[M-H]^-228和230质量片段峰的相对强度所示，大约有40％的靛蓝胭脂红1内酰胺羰基氧掺入¹⁸O。

这些用靛蓝胭脂红1进行的研究表明，臭氧由活化的动脉粥样硬化斑块物质产生。

胆甾醇的臭氧解产物

动脉粥样硬化斑块中存在的一种主要脂质是胆甾醇3。D.M.Small，Arteriosclerosis 8，103(1988)。在化学模型研究中，研究者已显示，在一组氧化剂如³O₂、¹O₂ ^*、·O₂ ^-、O₂ ^2-、羟基自由基、O₃和·O₂ ⁺及臭氧O₃当中，只有臭氧使胆甾醇3的Δ^5，6双键裂解，产生5，6-断甾醇4a(图2A)。此观察结果与其他化学报告相一致，所述化学报告也指出，5，6-断甾醇4a是胆甾醇3臭氧解的主要产物。Gumulka等，J.Am.Chem.Soc.105，1972(1983)；Jaworski等，J.Org.Chem 53，545(1988)；Paryzek等，J.Chem.Soc.Perkin Trans.l，1222(1990)；Comforth等，Biochem.J.54，590(1953)。

因此，进一步的实验贯注在检测和鉴定5，6-断甾醇4a或胆甾醇的其他臭氧解产物是否存在于动脉粥样硬化斑块中。因此，调查了14名患者(n＝14)的人动脉粥样硬化斑块在PMA活化前后5，6-断甾醇4a的存在。

将Pryor与同事一起开发的改进分析方法用于这些研究中。参见K.Wang，E.Bermúdez，W.A.Pryor，Steroids 58，225(1993)。该改进方法涉及用有机溶剂(二氯甲烷，3×5mL)萃取均质斑块物质(约50mg湿重)的PBS(1mL，pH 7)悬浮液，然后在室温下用盐酸2，4-二硝基苯肼(DNPH HCl)的乙醇溶液(2mM于乙醇中，pH 6.5)处理有机部分2小时。通过HPLC(直接注射，360nm紫外检测)和线上负离子电喷射质谱法分析此反应混合物，寻找4b即臭氧解产物4a的2，4-二硝基苯腙衍生物的存在(图3)。于14个未活化斑块抽提物的11个中(6.8-61.3pmol/mg斑块)及所有的活化斑块抽提物中(1.4-200.6pmol/mg)检出腙4b。此外，由4b的平均量判断，用PMA活化时斑块物质中4a的量显著增加。具体地方说，当没有使用PMA时，4b的平均量是18.7±5.7pmol/mg。与此对照，当加入PMA时，4b的平均量是42.5±13.6pmol/mg(n＝14，p＜0.05)(图3A-B)。

在斑块抽提物的HPLC分析过程中，除4b之外，还观察到另外两个主要腙峰。第一个峰具有R_T～20.5分钟，[M-H]^-＝597，第二个峰具有R_T～18.0分钟，[M-H]^-＝579(图3A，B)。腙4b容易与这些峰相区别，因为它的保留时间约为13.8分钟(R_T～13.8分钟，[M-H]^-597)(图3A，B)。经与真实样品比较，R_T～20.8分钟的峰确定为羟醛缩合产物5a的腙衍生物5b(图2和3E)。在化学模式研究中，Pryor以前已提到4a的肼衍生化的主要副产物是羟醛缩合产物5a的腙衍生物5b，其相对含量是酸浓度和反应时间的函数。K.Wang，E.Bermúdez，W.A.Pryor，Steroids 58，225(1993)。

在所采用的衍生化条件下，在受试的4a浓度范围内(5-100μM)，4a转化成5b的程度约为20％。但是，往往观察到20％以上的转化率。超过斑块样品中存在的4a的20％的5a测定量很可能由3的臭氧解及随后的羟醛缩合而产生。

许多含有氨基或羧基的生化成分可催化羟醛缩合。这种组分存在于斑和血液中，可促进4a向5a的转化。进一步的实验表明，以下氨基酸和物质促进4a向5a的转化：L-Pro(2小时，完全转化)、Gly(24小时，完全转化)、L-Lys HCl(24小时，完全转化)、L-Lys (OEt)·2HCl(100小时，62％转化)以及来自动脉粥样化动脉的抽提物(22小时，完全转化)、全血(15小时，完全转化)、血浆(15小时，完全转化)和血清(15小时，完全转化)。相对于背景反应的速度，所有这些物质均加速4a向5a的转化。

如上所述，在PMA活化时斑块中酮醛4a的量增加。但是，PMA对5a形成的作用较不明晰。在某些情况下，在PMA活化后5a的水平提高(图5B，患者F和H)，而在其他情况下，在PMA活化后5a的水平下降(图5B，患者C、G和N)。

合成和分析了许多其2，4-二硝基苯腙衍生物在质谱中(图2B)具有[M-H]^-579峰的含羰基类甾醇衍生物6a-9a，以帮助鉴定18分钟处的[M-H]^-579峰(图3A，B)。经与真实样品的HPLC共注射、负离子电喷射质谱和紫外光谱比较，～18分钟处的峰确定为6b，即6a的腙衍生物和4a的A环脱水产物(图3D)。研究了所选的衍生化标准条件下4a向6b的转化程度。发现在受试的4a浓度范围内(5-100μM)此转化程度始终在2％以下。这些数据表明，斑块抽提物中存在的超过抽提物中酮醛4a量2％的6a量，在衍生化之前即存在，由臭氧解产物4a通过水的β消除而产生。

除了4b-6b这三种主要的腙产物外，还检出另一种产物7b，并确定为7a的腙衍生物和5a的A环脱水产物。此产物(7b)在几个斑抽提物中以痕量(＜5pmol/mg)存在，保留时间约为26分钟([M-H]^- 579，图4)。但是，斑块抽提物中7b的量接近所采用的HPLC测定的检出限，尚未对此化合物在所有斑样品中的存在或不存在进行过全面研究。

活化斑块物质氧化裂解靛蓝胭脂红1的双键(为臭氧的化学特征)，以及胆甾醇的Δ^5，6双键通过臭氧所独有的途径(根据已知化学原理)裂解的实验证据给出了有说服力的证据，动脉粥样硬化斑块可产生臭氧。此外，由于这些独特的胆甾醇臭氧化产物在斑活化前也存在，很可能在动脉粥样硬化斑块的发展过程中也产生臭氧。

现已确认，外源给予的臭氧在体内通过白介素(IL)-1α、IL-8、干扰素(IFN)-γ、血小板聚集因子(PAF)、生长相关的癌基因(Gro)-α、核因子(NF)-κB和肿瘤坏死因子(TNF)-α的活化而具有促炎作用。除了这些通常公知的臭氧在炎症中的作用之外，还存在动脉粥样硬化斑块所独有的情况，这种情况可加大内源产生的臭氧当在此部位产生时对疾病的引发和永存的病理学作用。胆甾醇的臭氧解可能是斑块所独有的，因为仅在这个部位出现需要的高浓度臭氧和胆甾醇，而可捕捉任何产生的臭氧的其他活性物质不存在。

只要动脉粥样硬化的动脉含有抗体和活化巨噬细胞和髓过氧化物酶形式的¹O₂ ^*产生系统，很可能动脉粥样硬化病变可通过抗体催化的水氧化途径产生O₃。的确，3的Δ^5，6双键裂解产生4a的观察结果是炎症中臭氧通过抗体催化而产生的进一步证据。已知许多氧甾醇在体内通过胆甾醇的氧化产生，且只在胆甾烷侧链上存在结构差异的5a类似物已从海绵Stelletta hiwasaensis分离出，作为对细胞毒性天然产物的全面筛选的一部分。T.Miyamoto，K.Kodama，Y.Aramaki，R.Higuchi，R.W.M.Van Soest，Tetrahedron Letter 42，6349(2001)；B.Liu，Z.Weishan，Tetrahedron Lett.43，4187(2002)。但是就我们所知，在人类中以前并没有报告如在甾醇4a-6a中类甾醇核被破坏的衍生物。因此，重要的是发起对其他这种类甾醇及其衍生物的搜寻，并研究它们的生物功能。

实施例3：胆甾醇臭氧解产物存在于动脉粥样硬化患者的血流中

本发明发明人在前面已证实，臭氧在抗体催化的水氧化途径中产生，而臭氧作为有效的氧化剂可在炎症中发挥作用。P.Wentworth Jr等，Science 298，2195(2002)；B.M.Babior，C.Takeuchi，J.Ruedi，A.Guitierrez，P.Wentworth Jr.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100，3920(2003)；P.Wentworth Jr等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100，1490(2003)。

炎症被认为是动脉粥样硬化发病机制中的因素。R.Ross，NewEngl.J.Med.340，115(1999)；G.K.Hansson，P.Libby，U.Schnbeck，Z.-Q.Yan，Circ.Res.91，281(2002)。但是，在本发明之前，不能获得可将炎性动脉疾病与其他炎性过程相区分的特异性非侵入性方法。动脉粥样硬化斑块的独特成分及动脉粥样硬化斑块释放到血流中的产物可提供这种方法。具体地说，动脉粥样硬化病变含有高浓度的胆甾醇。如本文所示，臭氧由动脉粥样硬化病变产生，且胆甾醇臭氧解产物如4a和/或其羟醛缩合产物5a也是由动脉粥样硬化病变产生。因此，进行了进一步的实验，以查明这种胆甾醇臭氧解产物是否可以作为炎性动脉疾病如动脉粥样硬化的标记。

分析了来自两组患者的血浆样品，以寻找4a或5a的存在。组A由动脉粥样硬化病况充分发展到有理由进行动脉内膜切除术的患者(n＝8)组成。组B患者是随机挑选的普通医学诊所的患者。在组A的8名患者中有6名检出羟醛5a，含量在70-1690nM的范围(此测定的检出限是～1-10nM)(图5A-C)。组B的15个血浆样品中只有一个可检出5a。在任何患者的血液样品中都没有检出酮醛4a(此测定的检出限是～1-10nM)。这些数据表明，要么是4a通过血液中所含催化剂转化成5a，要么是血浆中的成分对4a和5a具有差别性亲和力。

过去，由于胆甾醇自氧化问题，“氧甾醇”的血清分析困难重重。H.Hietter，P.Bischoff，J.P.Beck，G.Ourisson，B.Luu，Cancer Biochem.Biophys.9，75(1986)。但是，如本文所述，在所有通过胆甾醇3的生物相关性氧化作用产生的胆甾醇氧化产物当中，类甾醇4a和5a是臭氧所独有的产物。这些研究表明，血浆中缩醛产物5a(以其DNP腙衍生物5b而检出)的存在可作为动脉粥样硬化中晚期动脉炎症的标记。因此，臭氧的抗体催化产生可将胆甾醇积累、炎症、氧化和细胞损伤这些在其他方面表面看来无关的因素联系为导致动脉粥样硬化的病理级联。

一些研究表明，胆甾醇氧化产物拥有生物活性，如细胞毒性、致动脉粥样化性和免疫原性。H.Hietter，P.Bischoff，J.P.Beck，G.Ourisson，B.Luu，Cancer Biochem.Biophys.9，75(1986)；J.L.Lorenso，M.Allorio，F.Bernini，A.Corsini，R.Fumagalli，FEBS Lett.218，77(1987)；A.Sevanian，A.R.Peterson，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，4198(1984)。假定胆甾醇氧化产物4a和5a从未被认为在人体中出现，如下所述进一步研究这些化合物对动脉粥样化形成的关键方面的作用。

          实施例4：胆甾醇臭氧解产物的细胞毒性

有些胆甾醇氧化产物拥有生物活性，如细胞毒性、致动脉粥样化性和免疫原性。在本实施例中，分析了4a和5a对多种细胞系的细胞毒性作用。

在本研究中采用了以下细胞系：Levy等，Cancer 22，517(1968)中描述的人B淋巴细胞(WI-L2)；Weiss等，J.Immunol.133，123(1984)中描述的T淋巴细胞细胞系(Jurkat E6.1)；Folkman等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76，5217(1979)中描述的血管平滑肌细胞系(VSMC)和腹腔主动脉内皮细胞(HAEC)细胞系；Ralph等，J.Exp.Med.143，1528(1976)中描述的鼠组织巨噬细胞(J774A.1)；和Mbawuike等，J.Leukoc.Biol.46，119(1989)中描述的肺泡巨噬细胞细胞系(MH-S)。

化学合成的4a和5a对多种已知存在于动脉粥样硬化斑块的细胞类型——白细胞、血管平滑肌细胞和内皮细胞具有细胞毒性。结果在图6中和表3中显示。

                        表3

细胞系	4a的IC50	5a的IC50
			WIL2	10.9±1.6μM	17.7±2.3μM
Jurkat E6.11	15.5±1.7μM	12.6±1.9μM
			HAEC	24.6±3.2μM	18.2±1.9μM
VSMC	21.9±2.2μM	29.8±2.8μM
			J774A.1	15.6±2.1μM	26.1±2.8μM
MH-S	11.2±1.2μM	13.6±1.1μM

4a和5a对所有受试细胞系的IC₅₀值非常相似。此外，化合物4a和5a对受试细胞系的细胞毒性曲线非常相似。鉴于4a和5a之间显著的结构差异，这些结果是不寻常的。但是，4a和5a在由细胞成分如氨基酸促进的过程中的确相互平衡(见上)，4a和5a在细胞毒性测定的时间期限内可相互处于平衡状态。因此，化合物4a和5a在体内可具有相似的细胞毒性。

本发明发明人使用类似的方法证实，化合物6a、7a、7c、10a、11a和12a对白细胞细胞系有细胞毒性，断酮醛4a及其羟醛加合物5a对神经元细胞系有细胞毒性。

臭氧和胆甾醇的并列(juxtaposition)可引导毒性甾醇4a-6a，原位产生的4a-6a通过促进内皮或平滑肌细胞损伤或者通过引发上述动脉粥样化中炎症细胞的凋亡，在病变的发展中发挥重要作用。前述晶体态动脉粥样硬化中胆甾醇的臭氧解可促使斑块不稳定，这被认为是动脉闭塞前的最后步骤。

       实施例5：胆甾醇臭氧解产物促进泡沫细胞形成

          和改变LDL与脱辅基蛋白质B₁₀₀的结构

提高低密度脂蛋白致动脉粥样化性的低密度脂蛋白(LDL)修饰被认为是心血管疾病发展中的关键事件。D.Steinberg，J.Biol.Chem.272，20963(1997)。例如，通过CD36和其他巨噬细胞清除受体提高巨噬细胞摄取LDL的LDL或脱辅基蛋白质B₁₀₀(apoB-100，LDL的蛋白质组分)氧化修饰，被认为是动脉粥样硬化发作中的决定性病理原因事件。本实施例描述的实验显示，胆甾醇臭氧解产物4a和5a可促进泡沫细胞从巨噬细胞的形成，并可修饰LDL和apoB-100的结构。

如实施例1所述，在未活化的鼠巨噬细胞(J774.1)存在下，将LDL(100μg/mL)与4a或5a一起温育。这些巨噬细胞暴露于4a或5a之后，开始脂质负荷，泡沫细胞开始在反应容器中出现(图7)。

此外，圆二色性(图8B，C)检测显示，人LDL(100μg/mL)与4a和5a(10μM)一起温育导致apoB-100的结构发生时间依赖性变化。无4a和5a时总LDL的圆二色性分析揭示，在实验的持续时间内(48小时)，LDL的二级结构通常保持稳定(图8A)。如图8A所示，正常LDL的蛋白内含物有较大比例的α螺旋结构(～40±2％)和较少量的β结构(～13±3％)、β转角(～20±3％)和无规卷曲(27±2％)。但是，当LDL与4a和5a一起温育时，虽然其谱图形状仍与天然LDL保持某些相似(图8B和C)，但其二级结构有相当大的损失，主要是α螺旋结构的损失(4a～23±5％；5a～20±2％)，相应地无规卷曲的百分比提高(4a～39±2％；5a 32±4％)。因此，4a和5a胆甾醇臭氧解产物似乎破坏LDL的结构完整性。

为修饰LDL结构，在4a和5a胆甾醇臭氧解产物的醛部分与apoB-100赖氨酸残基的ε-氨基侧基之间可发生共价反应，形成席夫碱或烯胺中间体，其与以前在丙二醛和4-羟基壬烯醛与apoB-100之间的反应所观察到的化合物类似。Steinbrecher等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，3883(1984)；Steinbrecher等，Arteriosclerosis 1，135(1987)；Fong等，J.Lipid.Res.28，1466(1987)。这种席夫碱或烯胺中间体可具有明显半寿期，可使衍生化的LDL变成能被巨噬细胞清除受体识别的形式。因此，4a和5a胆甾醇臭氧解产物与apoB-100-LDL之间的共价反应可产生衍生化的apoB-100-LDL复合物，其可被巨噬细胞清除受体识别并以较高的速度摄取，从而产生图7中所观察到的泡沫细胞。

唯一已知的含醛成分的胆甾醇氧化形式是4a和5a臭氧解产物。因此，这种胆甾醇衍生物与LDL/apoB-100之间的反应可提供此时以前一直未知的胆甾醇、泡沫细胞形成和动脉斑块形成之间的关系。因此，患者血流中高水平的4a和5a臭氧解产物的检测可提供这些患者患动脉粥样硬化的程度的直接量度。

         实施例6：产生针对胆甾醇臭氧化产物的抗体

本实施例描述为针对式13a、14a或15a半抗原而产生的可与胆甾醇臭氧化产物和腙产物反应的抗体。式13a、14a和15a半抗原的结构如下所示：

化合物13a是4-[4-甲酰-5-(4-羟基-1-甲基-2-氧代-环己基)-7a-甲基-八氢-1H-茚-1-基]戊酸。

方法

制备化合物13a、14a和15a的KLH缀合物。用这些KLH缀合物以标准方法免疫小鼠。从小鼠移取脾脏并分散，获得作为抗体产生细胞的脾细胞。

将脾细胞和源自小鼠骨髓瘤的SP2/0-Ag14细胞(ATCC CRL-1581)共悬浮于预热至37℃的无血清RPMI-1640培养基(pH 7.2)，细胞密度分别为3×10⁴个细胞/ml和1×10⁴个细胞/ml。离心悬浮液，收集沉淀。在1分钟内向此沉淀滴加1ml含50w/v％聚乙二醇的无血清RPMI-1640培养基(pH 7.2)，然后在37℃下温育所得混合物1分钟。进一步向混合物中滴加无血清RPMI-1640培养基(pH 7.2)，至最终体积为50ml，离心收集沉淀。将沉淀悬浮于HAT培养基，分成200μl的等分试样，每个等分试样加入到96孔微量滴定板的一个孔。将微量滴定板在37℃下温育一个星期，结果形成约1,200种类型的杂交瘤。通过免疫测定与胆甾醇臭氧化产物的结合，分析得自杂交瘤的上清液。

按照布达佩斯条约的条款，于2003年8月29日将针对式15a化合物而产生的杂交瘤KA1-11C5和KA1-7A6保藏美国典型菌种保藏中心(10801 University Blvd.，Manassas，Va.，20110-2209 USA(ATCC))，ATCC保藏编号为PTA-5427和PTA-5428。按照布达佩斯条约的条款，同样于2003年8月29日将针对式14a化合物而产生的杂交瘤KA2-8F6和KA2-1E9保藏于ATCC，ATCC保藏编号为ATCC PTA-5429和PTA-5430。

产生单克隆抗体制品KA1-7A6:6和KA1-11C5:6(为针对半抗原15a的KLH缀合物而产生)及KA2-8F6和KA2-1E9(为针对半抗原14a的KLH缀合物而产生)的库(pool)。通过ELISA测定KA1-7A6:6和KA1-11C5:6单克隆抗体(由15a产生)对臭氧化产物5a和胆甾醇半抗原3c的结合滴度。还进行ELISA测定，以确定KA2-8F6:4和KA2-1E9:4抗体(由臭氧化产物5a产生)对13b、14b和胆甾醇半抗原3c的结合滴度。

以下提供胆甾醇半抗原3c的结构。

如下进行ELISA测定。分别将13a、14a、3c、13b、14b或15a的BSA缀合物加入到高结合(hi-bind)96孔微量滴定板(FischerBiotech.)，让其在4℃下静置过夜。用PBS将板彻底洗涤，然后加入乳溶液(1％w/v于PBS中，100μL)。让板在室温下静置2小时，然后用PBS洗涤。用PBS系列稀释含不同抗体制品的培养物，将50μL的各稀释液分别加入到各排的第一个孔中。混合和稀释后，让板在4℃下静置过夜。用PBS将板洗涤后，加入山羊抗小鼠辣根过氧化物酶缀合物(0.01μg，5μL)。将板在37℃下温育2小时。将板洗涤后，加入底物溶液(50μL)3，3′，5，5′-四甲基联苯胺[0.1mg于10mL的乙酸钠(0.1M，pH6.0)和过氧化氢(0.01％％w/v)中]。使板在暗处显色30分钟。加入硫酸(1.0M，50μL)猝灭反应，在450nm处测量光密度。

报告的滴度是对应于最大光密度的50％的血清稀释度。数据用Graphpad Prism(3.0版本)分析，并报告为至少两次重复测量的平均值。

结果

ELISA试验的结果在表4和表5中显示。

表4：抗15a抗体KA1-7A6:6和KA111C5:6对15a、臭氧化产物5a

            和胆甾醇半抗原3c的结合滴度

抗体	15a	5a	3c
				KA1-7A6:6	32,000	32,000	16,000
				KA111C5:6	64,000	64,000	16,000

^*通过ELISA测量对15a、5a和3c的BSA缀合物的滴度。绝对值是当结合时对应于最大吸光度50％的抗体组织培养上清溶液的稀释倍数。

如表4所示，如上所述测量的表观结合亲和力几乎完全相同。

表5：KA2-8F6:4和KA2-1E9:4抗体(由5a产生)对15b、14b和胆甾醇

                 半抗原3c的结合滴度

抗体	15b	14b	3c
				KA2-8F6:4	32,000	32,000	16,000
				KA2-1E9:4	64,000	64,000	16,000

^*通过ELISA测量对15b、14b和胆甾醇半抗原3c的BSA缀合物的滴度。绝对值是当结合13b、15b和胆甾醇半抗原3c的缀合物时，对应于最大吸光度50％的抗体组织培养上清溶液的稀释倍数。

这些结果表明，可针对胆甾醇臭氧化产物产生高亲和力抗体制品。

        实施例7：另外的胆甾醇臭氧化产物检测方法

本实施例说明胆甾醇臭氧化产物可通过多种方法检测，包括通过将这些臭氧化产物上的游离醛基缀合到荧光部分和通过使用与这些臭氧化产物反应的抗体。

                     材料和方法

一般方法

除非另有指定，所有反应均用干燥试剂、溶剂和火焰干燥的玻璃器具进行。除非另有指定，原料购自Aldrich Chemical Company，并按获得时原样使用使用。胆甾醇-[26，26，26，27，27，27-D₆]购自MEDICALISOTOPES INC.。快速柱色谱均使用硅胶60(230-400目)来进行。胆甾醇臭氧化产物4a和5a及臭氧化产物4a和5a的2，4-二硝基苯腙(分别为4b和5b)按前述实施例的描述进行合成。薄层层析(TLC)使用Merck(0.25mm)涂铺硅胶Kieselgel 60 F₂₅₄板来进行，用对茴香醛染色来显色。¹H NMR谱在Bruker AMX-600(600MHz)波谱计上记录。¹³CNMR谱在Bruker AMX-600(150MHz)波谱计上记录。化学位移以相对于外标的百万分之一(ppm)以δ标度来报告。

3β-羟基-5-氧代-5，6-断胆甾烷-6-醛的丹磺酰腙(4d)的合成

将丹磺酰肼(50mg，0.17mmol)和对甲苯磺酸(1mg，0.0052mmol)加入到胆甾醇臭氧化产物4a(65mg，0.16mmol)的乙腈溶液(8ml)中。在室温氩气氛下搅拌反应混合物2小时，真空蒸发至干。残余物溶于二氯甲烷(10ml)并用水(2×10ml)洗涤。有机部分用硫酸镁干燥，真空浓缩。粗黄色油通过硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(1∶1；7∶3)]纯化，得到标题化合物4d(70mg，68％)，为几何异构体的混合物(顺式∶反式8∶92)：

                                                     ¹H NMR(CDCl₃)δ9.341(s，1H)，8.567(d，J＝8.4Hz，1H)，8.358(dd，J＝7.2，1.2Hz，1H)，8.290(d，J＝8.4Hz，1H)，7.550(dd，J＝8.4，7.6Hz，1H)，7.539(dd，J＝8.4，7.6Hz，1H)，7.167(d，J＝7.6Hz；1H)，7.000(t，J＝4.0Hz，0.92H trans)，6.642(dd，J＝6.8，2.8Hz，0.08H cis)，4.273(bs，1H)，3.045(dd，J＝13.6，3.4Hz，1H)，2.869(s，6H)，2.233(d，J＝13.6Hz，1H)，2.097(dt，J＝18，4.4Hz，1H)，1.162(s，3H)，0.904(d，J＝6.4Hz，3H)，0.899(d，J＝6.8Hz，3H)，0.892(d，J＝6.4Hz，3H)，0.513(s，3H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ209.66，151.77，149.49，133.52，131.20，130.99，129.64(2C)^*，128.52，123.25，118.83，115.25，71.07，56.20，52.68，52.56，47.10，45.40，42.32，40.81，39.82，39.48，36.51，36.05，35.79，34.39，31.05，28.02，27.74，27.30，24.27，24.13，22.99，22.84，22.56，18.53，17.45，11.31；

C₃₉H₅₉N₃O₄SNa(M+Na)HRMALDIFTMS计算值688.4118，实测值688.4152；R_f 0.43[乙酸乙酯-己烷(7∶3)]。^*2C表示此信号被认为对应于来自丹磺酰部分的两个碳信号(C₀按gHSQC)。

3β-羟基-5β-羟基-B-降胆甾烷-6β-甲醛的丹磺酰腙(5c)的合成

向胆甾醇臭氧化产物5a(30mg，0.072mmol)的四氢呋喃(5ml)溶液加入丹磺酰肼(25mg，0.08mmol)和盐酸(浓，0.05ml)。通过加水(0.2ml)将立即形成的白色沉淀溶解。均匀的反应混合物在室温氩气氛下搅拌3小时后，蒸发至干。将红色残余物溶于乙酸乙酯(10ml)并用水(2×10ml)洗涤。有机部分用硫酸镁干燥，真空浓缩。粗黄色油首先通过硅胶色谱[乙酸乙酯-二氯甲烷(1∶4-1∶1)]纯化，然后通过制备HPLC(C18 Zorbax21.22mm和25cm，100％乙腈)纯化，得到标题化合物化合物5c(14.5mg，30％)，为几何异构体的混合物(顺式∶反式17∶83)：

                                ¹H NMR(CDCl₃)δ8.557(d，J＝8.8Hz，1H)，8.372(dd，J＝7.2，1.2Hz，1H)，8.300(d，J＝8.8Hz，1H)，8.084(s，1H)，7.575(dd，J＝8.8，7.6Hz，1H)，7.554(dd，J＝8.8，7.6Hz，1H)，7.197(d，J＝7.6Hz，1H)，7.057(d，J＝7.2Hz，0.84H trans)，6.517(d，J＝5.2Hz，0.16H cis)，4.229(m，0.17H cis)，4.004(m，0.83H trans)，2.905(s，6H)，2.379(bm，4H)，1.913(dd，J＝9.6，7.2Hz，2H)，0.886(d，J＝6.8Hz，3H)，0.879(d，J＝6.4Hz，3H)，0.841(d，J＝6.8Hz，3H)，0.691(s，3H)，0.393(s，3H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ154.081，133.425，131.367，130.912，129.695，128.611，123.350，115.121，83.268，70.469，67.079，55.773，55.677，55.280，51.652，45.429，45.038，44.372，43.129，42.443，39.488，36.143，35.585，28.580，28.458，27.984，27.766，23.850，22.825，22.549，21.389，18.659，18.063，12.192；

C₃₉H₅₉N₃O₄SNa(M+Na)HRMALDIFTMS计算值688.4118，实测值688.4118；R_f 0.41[乙酸乙酯-二氯甲烷(1∶1)]。

3β-羟基-5-氧代-5，6-断[26，26，26，27，27，27-D₆]-胆甾烷-6-醛(D₆-4a)的合成

在-78℃下，将臭氧在氧气中的气相混合物吹入D₆-胆甾醇(50mg，0.13mmol)的5mL氯仿-甲醇(9∶1)溶液1分钟，此时溶液变成浅蓝色。蒸发反应混合物，在室温下与Zn粉(40mg，0.61mmol)在2.5mL乙酸-水(9∶1)中搅拌3小时。用二氯甲烷(10mL)稀释此不均匀混合物，并用水(3×5mL)和盐水(5mL)洗涤。有机部分用硫酸镁干燥并蒸发。残余物用硅胶色谱(用己烷-乙酸乙酯5∶1、3∶1和2∶1洗脱)纯化，得到标题化合物，为白色固体(44mg，0.104mmol)，得率：81％。

                              ¹H NMR 600MHz(δ，ppm，CDCl₃)：9.61(s，1H)，4.47(s，1H)，3.09(dd，1H，J＝13.6Hz，4.0Hz)，2.25-2.40(m，3H)，2.15-2.19(m，1H)，1.01(s，3H)，0.88(d，3H，J＝6.1Hz)，0.67(s，3H).¹³CNMR 150MHz(δ，ppm，CDCl₃)：217.5，202.8，71.0，56.1，54.2，52.6，46.8，44.1，42.5，42.1，39.8，39.3，35.9，35.7，34.7，34.0，27.8，27.7，27.5，25.3，23.7，23.0，18.5，17.5，11.5.

3β-羟基-5β-羟基-B-降胆甾醇-[26，26，26，27，27，27-D₆]-6β-甲醛(D₆-5a)的合成

向D₆-4a(26mg，0.061mmol)的乙腈-水(20∶1，5mL)溶液加入L-脯氨酸(11mg)。在室温下搅拌反应混合物2.5小时，真空蒸发。残余物溶于乙酸乙酯(10mL)，用水(2×5mL)和盐水洗涤。有机部分用硫酸镁干燥，蒸发，留下分析纯的白色固体(26mg，0.061mmol，得率：100％)，供进行NMR。

                                                         ¹HNMR 600MHz(δ，ppm，CDCl₃)：9.69(s，1H)，4.11(s，1H)，2.23(dd，1H，J＝9.2Hz，3.0Hz)，0.91(s，3H)，0.90(d，3H，J＝6.6Hz)，0.70(s，3H)；¹³C NMR150MHz(δ，ppm，CDCl₃)：204.7，84.2，67.3，63.9，56.1，55.7，50.4，45.5，44.7，44.2，40.0，39.7，39.3，36.1，35.6，28.3，27.9，27.5，26.7，24.5，23.8，21.5，18.7，18.4，12.5.

4-(5-(4-羟基-1-甲基-2-氧代环己基)-7α-甲基-4-(2-氧代乙基)-八氢-1H-茚-1-基)戊酸15a的合成。按对D₆-5a所述进行3β-羟基胆甾-5-烯-24-酸3c的臭氧解。

                                                             ¹HNMR 400MHz(δ，ppm，CDCl₃)：9.60(s，1H)；4.47(s，1H)，3.40(dd，J＝13.6Hz，4Hz，1H)；1.00(s，1H)，0.91(d，J＝6.4Hz，3H)，0.67(s，3H).¹³C NMR 100MHz(δ，ppm，CDCl₃)：218.7，202.9，179.8，70.9，55.5，54.1，52.5，46.4，44.0，42.4，42.1，39.6，35.1，34.5，34.0，30.8，30.4，27.5，27.3，25.1，22.8，17.9，17.4，11.4.

胆甾醇臭氧化产物的抽提

用改进的Bligh和Dyer方法从血液样品和组织样品抽提总脂质。参见Bligh EG，D.W.Can J Biochem Physiol 1959，37，911-17。将收集于Vacutainer管并保藏于4℃的含柠檬酸或EDTA作为抗凝剂的人血浆(200μL)加入到加盖玻璃管中的磷酸二氢钾(KH₂PO₄，0.5M，300μL)中。加入甲醇(500μL)，短暂漩涡搅拌样品。加入氯仿(1mL)，漩涡搅拌样品2分钟。以3000rpm离心5分钟，移取有机层。重复氯仿加入、漩涡搅拌和离心这个过程。合并有机层，真空蒸发。从根据常规指征进行颈动脉动脉内膜切除术的患者获得动脉内膜切除术标本。TheScripps Green Hospital Institutional Review Board批准了人类对象方案。标本在分析前冷冻并在-70℃下保藏。为进行分析，让组织样品升温至室温，然后用组织均质机(Tekmar)均质于含水缓冲液(KH₂PO₄，0.5M，1-2mL)中。将均质液加入到甲醇∶氯仿(1∶3，6mL)溶液中，以3000rpm离心5分钟。收集有机部分。将氯仿(6mL)加入到剩余的含水可混部分，离心样品(3000rpm，5分钟)。然后真空蒸发合并的有机部分。

抽提的胆甾醇臭氧化产物的丹磺酰肼衍生化和HPLC分析

将蒸发后的血液抽提物或组织抽提物(见上)重新悬浮于含丹磺酰肼(200μM)和H₂SO₄(100μM)的异丙醇(200μL)中，于37℃温育48小时。分析方法包括，以等度洗脱流动相乙腈∶水(90∶10，0.5mL/分钟)，使用荧光检测(激发波长360nm，发射波长450nm)，在与Vydec C-18RP柱相连的Hitachi D-7000 HPLC系统上进行HPLC分析。臭氧化产物5a的丹磺酰衍生物(5c)的保留时间(RT)为约8.1分钟。5a的肼衍生物(5b)的保留时间为约10.7分钟。通过使用Macintosh PC计算机和Prism(版本4.0)软件，参考真实标准品，通过计算峰面积按常规确定浓度。

气相色谱-质谱

将蒸发后的标本重建于二氯甲烷中至1mL体积，并通过将含1％三甲基氯硅烷的100uL吡啶和100uL N，O-双(三甲基甲硅烷基)-三氟乙酰胺加入到浓缩的斑块抽提物中，进行甲硅烷化。将样品中37℃下温育2小时，然后旋转蒸发至干。各样品在分析前重新悬浮于100uL二氯甲烷中。通过不分流进样(Agilent 7673自动进样器)将2.5ul样品注射到HP-5ms柱上，膜厚30m×0.25mm ID×0.25um，流速1.2ml/分钟，注射器温度290℃，温度程序从50℃开始，保持5分钟，然后以20℃/分钟升温，直到300℃，保持12分钟。用Agilent model 5973 inert进行质量分析，扫描范围50-700m/z，然后通过选择离子检测(SIM)扫描m/z 354和360。MS四极温度为150℃，MS源温度为280℃。

半抗原15a偶联到载体蛋白KLH和BSA

将盐酸1-乙基-3，3′-二甲基氨基丙基-碳二亚胺(EDC，1.5mg，0.008mmol)和磺基N-羟基琥珀酰亚胺(1.8mg，0.008mmol)溶于0.01mL H₂O中，并加入到半抗原(2.5mg，0.006mmol)的0.1mL DMF溶液中。漩涡搅拌混合物，在室温下保持24小时，然后在4℃下加入到BSA(5mg，于PBS缓冲液(0.9ml，0.05mM，pH＝7.5)中)中。将此最终混合物在4℃下保持24小时后，在-20℃下保藏。涉及合成化合物15a的KLH或BSA缀合物的反应如下图示。

反应a如上所述涉及用O₃/O₂臭氧解化合物3c。反应b涉及用EDC和HOBt(于DMF中)处理化合物15a过夜，然后与BSA或KLH一起在磷酸缓冲盐水(PBS)，pH 7.4中温育。

单克隆抗体生产按标准方法进行。如下进行8周龄129GIX+小鼠的免疫：每只小鼠用10ug KLH-15a缀合物(于50uL PBS中)，所述PBS与等体积的RIBI佐剂混合，每隔3天腹膜内注射一次，共5次免疫。通过ELISA测定血清滴度。30天后，在尾侧静脉中静脉内注射(IV)最后的50ug KLH-15a缀合物(于100uL PBS中)。3天后，处死动物，取出脾脏，以供融合。将来自免疫动物的脾细胞与X63-Ag8.653骨髓瘤细胞以5∶1在RPMI培养基中混合，离心，在37℃下重新悬浮于1mLPEG 1500中。所述PEG在3分钟内用9mL RPMI稀释，在37℃下温育10分钟，然后离心，重新悬浮于培养基中后，平板接种于15×96孔板中。进行ELISA，筛选结合胆甾醇臭氧化产物4a或5a但不结合胆甾醇的抗体。选出的杂交瘤亚克隆2代，以保证单克隆性。

从ApoE敲除小鼠的主动脉上升段制备组织切片

使标本在液氮中急冻。获取10微米切片，放在载玻片上。通过将标本依次浸没在1∶1乙醇∶二乙醚20分钟，100％乙醇10分钟和95％乙醇10分钟进行固定。在PBS中洗涤后，施与对胆甾醇臭氧化产物有特异性的抗体的1∶200稀释液，并与组织一起温育1小时。用FITC标记的山羊抗小鼠IgG(Calbiochem)的40∶1稀释液进行二次标记。用optronics microfire数字照相机获得影像，用Adobe Photoshop处理。

                        结果

胆甾醇臭氧化产物丹磺酰腙的荧光检测。

如前面的实施例所述，可用K.Wang，E.Bermúdez，W.A.Pryor，Steroids 58，225(1993)的化学研究中开发的分析方法的改进方法，体内检测胆甾醇臭氧化产物。这个改进方法涉及将均质斑块物质(～50mg湿重)的PBS(1mL)pH 7.4悬浮液抽提到有机溶剂(二氯甲烷，3×5mL)中，在室温下用盐酸2，4-二硝基苯肼(DNPH HCl)(2mM，pH 6.5)的乙醇溶液处理有机可溶级分2小时。通过反相HPLC(直接注射，360nm处紫外检测)和线上负离子电喷射质谱分析所得反应混合物，分析4b即4a的2，4-二硝基苯腙(2，4-DNP)衍生物和5b即5a的2，4-DNP衍生物的存在。这种技术既快速又高度灵敏。但是，这种测定法当应用于生物样品时有许多限制。这些限制包括：在360nm处有紫外吸收的其他生物化合物的干扰，缀合反应过程中4b转化成5b，以及在低浓度胆甾醇臭氧化产物下缀合反应效率下降。

因此，测试了新的方法，以确证是否可以提高测试灵敏度。该方法涉及将胆甾醇臭氧化产物缀合到具有荧光生色团的肼，然后进行荧光检测和HPLC分析。所选的荧光生色团是丹磺酰基团。这个测定法涉及在上述的酸性条件下用丹磺酰肼使抽提的胆甾醇臭氧化产物衍生化。丹磺酰肼与胆甾醇臭氧化产物4a反应的产物是如下图示的4d。

丹磺酰肼与胆甾醇臭氧化产物5a反应的产物是如下图示的5c。

在多种溶剂中评估了丹磺酰肼衍生化的反应效率，所述溶剂如己烷、甲醇、氯仿、四氢呋喃、乙腈和异丙醇(IPA)。由此分析确认，就反应效率和胆甾醇臭氧化产物4a自发发生羟醛缩合生成5a的速率最低而言，IPA是最佳溶剂。用化学合成的真实丹磺酰腙标准品4d和5c(图9)，通过HPLC来定量反应效率。37℃下，胆甾醇臭氧化产物4a与丹磺酰肼(200μM)和硫酸(100μM)于IPA中衍生化48小时，形成保留时间(R_T)为约11.2分钟的4a腙衍生物4d，其效率是86.0±8.0％。重要的是，在衍生化过程中，只有1.3％的5c由4a或4d的羟醛缩合所形成。在0.01-100μM的5a浓度范围内，5a转化成其丹磺酰腙衍生物5c(R_T～19.4分钟)的效率是83±11％。丹磺酰腙4d和5c的灵敏度水平为～10nM.

为确定4a和5a胆甾醇臭氧化产物从血浆样品抽提并被衍生化的效率，使人血浆样品掺加5a，然后抽提，用2，4-DNP或丹磺酰肼缀合。两种方法检出的缀合腙的含量没有显著差异；有37.5±1.9％衍生为丹磺酰腙5c，有31±8.9％以2，4-DNP腙5b回收。

同位素稀释-气相色谱与线上质谱联用(ID-GCMS)

目前，大多数测定富胆甾醇组织如血液(血浆)和动脉粥样硬化动脉中的氧甾醇的分析方法，是基于带火焰离子化检测(FID)或选择离子检测(SIM)的GC。SIM法优于FID法的优点在于检测的特异性。在生物基质中分析氧甾醇要求有这种特异性。SIM策略的关键性方面在于内标的使用。最常用的是5α-胆甾烷。参见Jialil，I.；Freeman，D.A.；Grundy，S.M.Aterioscler.Thromb.1991，11，482-488；Hodis，H.N.；Crawford，D.W.；Sevanian，A.Atherosclerosis 1991，89，117-126。但是，优选的方法是使用氘标记内标的GC-MS，因为它既灵敏又有特异性，可针对不同分析物的不同回收率进行校正。Dzeletovic，S.；Brueuer，O.；Lund，E.；Diszfalusy，U.Analytical Biochem.1995，225，73-80。氘化内标的作用有两重。首先，它们通过使同位素丰度与浓度建立关联，使得可以进行定量。其次，在抽提程序前加入已知量的氘化分子使得可以评估胆甾醇臭氧化产物的抽提效率。Leoni，V.；Masterman，T.；Patel，P.；Meaney，S.；Diczfalusy，U.；Bjrkhelm，I.J.Lipid.Res.2003，44，793-799。

如下所示从[26，26，26，27，27，27-D]-胆甾醇(氘代3c)制备六氘代胆甾醇臭氧化产物D₆-4a和D₆-5a。

在合成的第一步(a)中，在78℃下将臭氧吹入D₆-3c的氯仿-甲醇(9∶1)溶液中，产生D₆-4a。在第二步(b)中，将D₆-4a溶于DMSO中，在室温下与脯氨酸反应2.5小时，产生D₆-5a。

D₆-4a和D₆-5a用作内标，在内部Agilent GC/MS上测试GC/MS方法的灵敏度。在典型的方法中，通过在37℃氩气氛下用吡啶和BSTFA处理2小时，使真实胆甾醇、4a、5a、D₆-胆甾醇、D₆-4a和D₆-5a的样品转化成它们的三甲基甲硅烷醚。真空除去挥发物后，将残余物溶于二氯甲烷中，然后转移到自动进样器小瓶中。

然后在连接到5973 Inert MSD的Agilant Technologies 6890 GC(带分流/不分流进样系统和7683自动注射器组件)上进行GC-MS。在完全离子扫描模式下操作质谱仪。观察到的保留时间(RT)和M⁺离子如下：臭氧化产物4a和5a(R_T＝29.6分钟，M⁺354)；D₆-4a和D₆-5a(R_T＝29.6分钟，M⁺360)；胆甾醇(R_T＝27.2分钟，M⁺329)，D₆-胆甾醇(R_T＝27.2分钟，M⁺335)。GC-MS中胆甾醇臭氧化产物4a和5a的推导片段如下所示。

如上所示，胆甾醇臭氧化产物4a和5a都产生M⁺约354的片段。氘化(D₆)4a和5a胆甾醇臭氧化产物产生M⁺约360的片段。

因此，在GC-MS测定中没有观察到胆甾醇臭氧化产物4a和5a之间的差别，可能因为在甲硅烷化步骤中胆甾醇臭氧化产物4a转化成5a。因此，M⁺354(或360)的量是真实4a和5a胆甾醇臭氧化产物的浓度的量度。354离子峰的面积与浓度成线性关系，对于胆甾醇臭氧化产物，至今为止测出的较低水平的灵敏度是10fg/μL(相当于前面实施例中描述的LC/MS测定的检出限提高约2-对数)。

通过从临床切除的颈动脉斑块物质抽提胆甾醇臭氧化产物，进一步验证GCMS测定。从进行颈动脉动脉内膜切除术的患者获得用于常规分析的颈动脉动脉内膜切除术组织(n＝2)，用组织均质机均质10分钟(在氩气下)，然后抽提到CHCl₃/MeOH中。如上所述将抽提物甲硅烷化，然后进行GC-MS分析(图10和11)。离子丰度对时间的GC-MS迹线表明，存在许多仍有待明确的氧甾醇。但是，可清楚分辨合并的臭氧解产物4a和5a(R_T＝22.49分钟)。

这些数据明确证实了进行整体抽提和GC-MS测定以分析生物样品中4a和5a胆甾醇臭氧化产物的可行性，并验证了前面实施例中所述的关于动脉粥样硬化斑块物质分析的结果。

胆甾醇臭氧化产物4a和5a的免疫组织化学定位

如上所述，用化合物15a的KLH缀合物(为胆甾醇臭氧化产物4a类似物)免疫小鼠。单克隆抗体通过杂交瘤方法产生。11C5和7A7这两种单克隆抗体对胆甾醇臭氧化产物5a有良好的结合亲和力(＜1μM)，对胆甾醇有极好的特异性(亲和力低1000倍)。

针对4a类似物半抗原的抗5a抗体的产生毫不奇怪，因为如上显示，胆甾醇臭氧化产物4a加入到血液中导致其立即转化成5a。

来自ApoE缺陷型小鼠的主动脉冷冻固定切片用抗体11C5和FITC标记的抗IgG第二抗体进行免疫组织化学染色，当其与用非特异性鼠抗体染色的连续切片相比时，证实胆甾醇臭氧化产物5a定位于血管内膜下层中的动脉粥样硬化区域。抗体与可溶性胆甾醇的吸附并不消除血管内膜下层的荧光。

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本文参考或提及的所有专利和出版物表示本发明所属领域的技术人员的技术水平，这种参考专利或出版物的每一项通过引用结合到本文中，其程度如同它通过单独引用整体结合到本文中或者整体在本文中提出。本发明申请人保留将来自任何这种引用专利或出版物的任何和所有材料和信息完全结合到本说明书中的权利。

本文描述的具体方法和组合物代表优选的实施方案，且只是示例性的，并不意在限制本发明的范围。在研究本说明书时，其他目标、方面和实施方案对本领域技术人员是显而易见的，它们也包括在权利要求书的范围所定义的本发明精神中。对本领域技术人员显而易见的是，可以对本文公开的本发明作出各种取代和修改而不背离本发明的范围和精神。本文说明性描述的本发明可在不存在本文中没有明确公开为必要的任何要素或限制条件下，适当地实施。本文说明性描述的方法和过程可按不同的步骤顺序适当地实施，所述步骤顺序不一定限于本文中或权利要求书中指出的步骤顺序。本文和后附权利要求书中使用的单数形式包含复数含义，除非上下文清楚地规定了另外的情况。因此，例如提到“宿主细胞”时包括多个这种宿主细胞(例如培养物或群)，依此类推。在任何情况下本发明都不可被解释为限于本文明确公开的具体实施例或实施方案或方法。在任何情况下本发明都不可被解释为受限于专利和商标局的任何审查员或任何其他官员或雇员所作的陈述，除非这种陈述被本发明申请人在回复文书中明确地和不带条件或保留地特意采纳。

已采用的术语和表达用作描述性用语而不是限制性用语，且并非意图使用这种术语和表达来排除所显示和描述的特征或其部分的任何等价物，不过应认识到，在要求保护的本发明范围内可能有各种修改方案。因此，应当理解，尽管本发明已通过优选实施方案和任选特征明确地公开，本领域技术人员可采用本文公开的概念的修改或变化，并且这种修改或变化被认为落入后附权利要求书所定义的本发明范围内。

本文已对本发明作了明白和一般的描述。落入种类公开内容的各更窄种类和亚种类组也构成本发明的一部分。这包括带有将任何对象主题排除出种类的前提条件或否定性限制的本发明种类描述，不管被排除的物质是否在本文中明确列举。

其他实施方案落入以下权利要求书中。此外，在本发明特征或方面以马库什组方式描述的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明也因此以马库什组的任何单个成员或成员子集的方式来描述。

Claims (51)

1.一种可对原核或真核细胞具有细胞毒性的分离的胆甾醇臭氧化产物。

2.权利要求1的臭氧化产物，其可引起巨噬细胞脂质的吸收或从巨噬细胞形成泡沫细胞。

3.权利要求1的臭氧化产物，其可改变低密度脂蛋白中蛋白质的二级结构。

4.权利要求3的臭氧化产物，其中所述蛋白质为脱辅基蛋白B₁₀₀。

5.权利要求1的臭氧化产物，所述臭氧化产物具有式4a：

6.权利要求1的臭氧化产物，所述臭氧化产物具有式5a：

7.权利要求1的臭氧化产物，所述臭氧化产物具有下式6a-15a或7c的任一结构式或其组合：

8.一种组合物，其包含载体和可对原核或真核细胞具有细胞毒性的分离的胆甾醇臭氧化产物。

9.权利要求8的组合物，其中所述臭氧化产物具有下式4a：

10.权利要求8的组合物，其中所述臭氧化产物具有下式5a：

11.权利要求8的组合物，其中所述臭氧化产物包含下式6a-15a或7c的任一结构式或其组合：

12.一种分离的结合实体，所述结合实体可与胆甾醇臭氧化产物结合。

13.权利要求12的结合实体，其中所述胆甾醇臭氧化产物为式4a化合物：

14.权利要求12的结合实体，其中所述胆甾醇臭氧化产物为式5a化合物：

15.权利要求12的结合实体，其中所述抗体也可与具有式6a、7a、7c、8a、9a、10a、11a、12a、13a、14a或15a的任一化合物结合：

16.权利要求12的结合实体，其中所述结合实体是对抗具有式13a、14a或15a的半抗原所产生：

17.权利要求12的结合实体，其中所述结合实体是一种抗体。

18.权利要求17的结合实体，其中所分离的抗体源自具有ATCC保藏编号PTA-5427和PTA-5428的杂交瘤KA1-11C5或KA1-7A6。

19.权利要求17的结合实体，其中所分离的抗体源自具有ATCC保藏编号PTA-5429和PTA-5430的杂交瘤KA2-8F6或KA2-1E9。

20.权利要求12的结合实体，其中所述结合实体与治疗剂连接。

21.权利要求20的结合实体，其中所述治疗剂可降低动脉粥样硬化病变或者预防动脉的进一步梗塞。

22.权利要求20的结合实体，其中所述治疗剂是一种抗氧化剂、抗炎剂、药物、小分子、肽、多肽或核酸。

23.一种与胆甾醇臭氧化产物连接的结合实体，其中所述胆甾醇臭氧化产物对原核或真核细胞具有细胞毒性。

24.权利要求23的结合实体，其中所述结合实体为一种抗体。

25.权利要求23的结合实体，其中所述胆甾醇臭氧化产物为任一式4a-15a或7c的化合物：

26.一种治疗或预防动脉粥样硬化病变的标志物，其包含具有式4a或式5a的胆甾醇臭氧化产物：

27.一种治疗患者动脉粥样硬化的方法，其包含给予该患者与胆甾醇臭氧化产物结合的结合剂。

28.权利要求27的方法，其中所述胆甾醇臭氧化产物为具有任一式4a-15a或7c的化合物：

29.权利要求27的方法，其中结合剂不产生活性氧形式。

30.权利要求27的方法，其中所述结合实体与治疗剂连接。

31.权利要求30的方法，其中所述治疗剂可帮助减慢动脉粥样硬化病变的扩大或者减小动脉粥样硬化病变的体积。

32.权利要求30的方法，其中所述治疗剂是一种抗氧化剂、抗炎剂、药物、小分子、肽、多肽或核酸。

33.一种杀死患者靶细胞的方法，该方法包括给予该患者可与所述靶细胞结合的结合剂，其中所述结合剂与胆甾醇臭氧化产物连接。

34.权利要求33的方法，其中所述结合实体是一种抗体。

35.权利要求33的方法，其中所述抗体能产生活性氧形式。

36.权利要求33的方法，其中所述抗体也与能产生单线态氧的化合物连接。

37.权利要求36的方法，其中所述能产生单线态氧的化合物是一种内过氧化物。

38.权利要求36的方法，其中所述能产生单线态氧的化合物是一种蒽-9，10-二丙酸内过氧化物。

39.权利要求36的方法，其中所述能产生单线态氧的化合物是蝶呤、黄素、血卟啉、四(4-磺化苯基)卟啉、联吡啶基钌(II)复合物、玫瑰红染料、醌、罗丹明染料、酞菁染料、竹红菌甲素、rubrocyanin、频哪氰醇或别菁。

40.一种从哺乳动物中除去细胞毒性的胆甾醇臭氧化产物的方法，该方法包括采用能与胆甾醇臭氧化产物结合的结合实体或抗体，从哺乳动物的体液中分离出细胞毒性的胆甾醇臭氧化产物。

41.权利要求40的方法，其中所述胆甾醇臭氧化产物为式4a的化合物：

42.权利要求40的方法，其中所述胆甾醇臭氧化产物为式5a的化合物：

43.权利要求40的方法，其中所述胆甾醇臭氧化产物为任一式6a-15a或7c化合物：

44.权利要求40的方法，其中所述臭氧化产物从哺乳动物的循环血液中除去。

45.权利要求40的方法，其中所述臭氧化产物从哺乳动物的血液中体外除去。

46.权利要求40的方法，其中所述结合实体或抗体以局部方式给予局部组织。

47.一种治疗或预防哺乳动物癌症的方法，该方法包括给予该哺乳动物可与细胞毒性的胆甾醇臭氧化产物连接的抗体，其中所述抗体能与癌细胞结合。

48.一种治疗或预防哺乳动物的不适当的免疫反应的方法，该方法包括给予该哺乳动物可与细胞毒性的胆甾醇臭氧化产物连接的抗体，其中所述抗体能与涉及所述不适当的免疫反应的免疫细胞结合。

49.一种鉴定可调节抗体中活性氧形式产生的药物的方法，该方法包括：

(a)使抗体与候选药物结合；

(b)测定形成的活性氧形式的量；和

(c)将形成的活性氧形式的量与通过测定无候选药物的抗体中形成的活性氧形式的量所得到的标准值相比较。

50.权利要求49的方法，其中所述活性氧形式为臭氧。

51.权利要求47-49中任一项的方法，其中所述抗体可与具有任一式4a-15a或7c的胆甾醇臭氧化产物结合

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