CN1738898A

CN1738898A - 产生活性氧类的抗体的抗微生物活性

Info

Publication number: CN1738898A
Application number: CNA2003801087163A
Authority: CN
Inventors: P·温特沃斯; R·A·莱纳
Original assignee: Novartis AG; Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 2002-11-14
Filing date: 2003-11-13
Publication date: 2006-02-22
Also published as: US20070009537A1; EP1563062A1; WO2004044191A1; BR0316245A; JP2006506419A; AU2003288057A1; CA2505932A1

Abstract

本发明提供了具有当暴露于单线态氧时能够产生活性氧类的抗体的组合物，以及使用该组合物例如治疗微生物感染的方法。

Description

产生活性氧类的抗体的抗微生物活性

本申请要求2001年11月14日申请的临时申请系列号60/426,242的优先权。本申请与2001年9月17日申请的PCT申请号PCT/US01/29165、2001年8月29日申请的临时申请系列号60/315,906、2000年9月26日申请的临时申请系列号60/235,475、以及2001年9月15日申请的临时申请系列号60/232,702相关。

政府支持

致力于本发明的研究得到来自国立卫生研究所，GM43858，PO1CA277489的资助。因此，美国政府可以享有本发明中的某些权利。

发明领域

本发明涉及抗体介导的从单线态氧(singlet oxygen)产生活性氧类并涉及治疗组合物和通过使用此类抗体治疗微生物感染的方法。

背景

整个上世纪的研究已经形成了关于抗体在免疫系统中的作用的一致认识。该认识的本质是抗体分子不直接杀死其靶标或者产生能够逆向影响其靶标的产物。相反，抗体分子已经被当作一种结合分子，它仅标记其靶标或者仅活化其它分子或者活化生物系统以应答抗体-抗原复合体。因此，已经认为抗体自身不具有任何破坏能力而仅用来标记外源物质以通过补体积联反应和/或吞噬作用进行去除(Arlaud等，Immunol.Today，8，106-111(1987)；Sim和Reid，Immunol.Today，12，307-311(1991))。

然而，具有催化活性能够直接破坏其靶标的抗体将可用于许多应用，例如，用于直接杀死微生物。

发明概述

本发明提供了利用最新发现的抗体产生活性氧类的能力的方法。根据本发明，抗体能够通过将单线态氧(¹O₂*)转化为活性氧类而杀死微生物。抗体实现此种转化不需要免疫系统的任意其它成分，也就是说，不需要补体积联反应或吞噬作用。

因此，根据本发明，作为产生强活性氧类的结果抗体具有抗微生物活性，强活性氧类包括但不限于超氧自由基(O₂ ^-)、羟自由基(OH^●)、过氧化氢H₂O₂或臭氧(O₃)。此种活性存在于抗体和抗体覆盖的哺乳动物粒性白细胞例如嗜中性粒细胞。

因此，本发明针对基本上由可药用载体和能够结合至微生物的经分离抗体组成的抗微生物组合物，其中当存在单线态氧(¹O₂)时抗体能够产生活性氧类。抗微生物组合物也能够包含能够产生单线态氧(¹O₂)的敏化分子。在一些实施方案中，当存在光时此类敏化剂能够产生单线态氧(¹O₂)。敏化分子的例子包括蝶呤、黄素、血卟啉、四(4-磺化苯基)卟啉、二吡啶基钌(II)复合体、玫瑰红染料、醌、若丹明染料、酞菁、竹红菌甲素(hypocrellin)、玉红花青苷(rubrocyanin)、喹哪啶蓝(pinacyanol)、别花青苷(allocyanin)或二氢卟酚(chlorin)。此类敏化分子能够附着至抗体上。在一些实施方案中，抗体是人抗体或人源化抗体。

由本发明抗体产生的活性氧类包括超氧自由基、羟自由基、过氧化氢、臭氧和其它活性氧类。在一些实施方案中，活性氧类是臭氧。

本发明还提供了利用抗体从单线态氧产生活性氧类以治疗感染、疾病以其它疾病的方法。本发明还涉及包含能够抗击微生物感染的抗体组合物的治疗组合物。此类抗体组合物能够设计成呈现增强的氧化功能。

例如，在一些实施方案中，本发明针对在哺乳动物中治疗微生物感染的方法，该方法涉及将基本上由能够结合至微生物的抗体和可药用载体组成的抗微生物组合物施用于哺乳动物，其中当存在单线态氧(¹O₂)时抗体能够产生活性氧类。该组合物也能够包含能够产生单线态氧(¹O₂)的敏化分子。如上所述，此类敏化分子能够附着至抗体上。

在其它实施方案中，本发明针对产生活性氧类以抑制微生物生长的方法，该方法涉及将微生物与能够结合到微生物上的抗体和单线态氧(¹O₂)源相接触。在一些实施方案中，单线态氧(¹O₂)源是敏化分子。如上所述，此类敏化分子能够附着至抗体上。

附图简述

图1图解说明吞噬细胞的氧依赖性杀微生物作用。标出了¹O₂和O₂ ^●-的互变。

图2图解说明参与除臭剂红(amplex red)测定的化学转化步骤。抗体(在该图式附图中鉴定为IgG)将¹O₂转化为O₂ ^●-，O₂ ^●-能够自发形成过氧化氢。存在辣根过氧化物酶时，过氧化氢脱乙酰化并氧化除臭剂红底物，从而产生在587nm处发射荧光的分子。

图3显示存在(□)或缺乏(△)鼠单克隆抗体IgG EP2-19G2(20μM)时PBS(pH 7.4)中H₂O₂产生的最初时间过程。误差线表示数据偏离平均值的范围。

图4显示紫外线照射后鼠抗体1D4 Fab片段单晶体的荧光显微照片和使用除臭剂红试剂检测H₂O₂。

图5说明抗体-介导的活性氧类催化作用的时间过程和所需要的反应条件。图5A提供了当存在(○)或缺乏(◆)31127抗体(马IgG，20μM)时，使用血卟啉(40μM)和可见光在PBS(pH 7.4)中形成H₂O₂的时间过程。图5B提供了当存在31127抗体(马IgG，6.7μM)时在无添加物的PBS(pH 7.4)(□)或含NaN₃的PBS(pH7.4)(O，100μM)或PBS(pH7.4)的D₂O溶液(◇)中使用血卟啉(40μM)和可见光产生H₂O₂的时间过程。图5C图解说明了抗体蛋白质浓度(31127，马IgG)对H₂O₂形成速率的影响。图5D图解说明氧浓度对通过31127抗体(马IgG，6.7μM)产生H₂O₂的速率的影响。全部点为至少两次重复测定的平均值。误差线是实验测量值偏离平均值的范围。

图6是显示所测得的一组蛋白质的最初H₂O₂形成速率的条形图并与抗体相比较(数据来自表1)。全部点为至少两次重复测定的平均值。误差线是实验测量值偏离平均值的范围。OVA，鸡蛋卵清蛋白；SOD，超氧化物歧化酶。

图7A说明PBS(pH 7.4)中UV照射马IgG(6.7μM)H₂O₂的形成速率。图7B说明与H₂O₂形成测量同时进行马IgG在326nm(激发＝280nm)处的荧光发射。

图8表明在多种条件下通过抗体生产H₂O₂。

图8A说明通过免疫球蛋白和非免疫球蛋白的H₂O₂的产生。测定是通过对透照灯(Fischer Biotech)上的密封玻璃瓶管内磷酸缓冲盐(PBS)[10mM磷酸钠，150mM NaCl(pH 7.4)]中的单种抗体/蛋白质样品(100μL，6.7μM)在20EC的环境氧条件下进行近紫外照射(312nm，800μWcm^-2)来实现的。在整个测定过程中以一定的时间间隔取出个等份(10μL)。通过除臭剂红方法测定H₂O₂浓度。每个数据点报道为至少两次重复测量的平均值±SEM：●多克隆(poly)免疫球蛋白(Ig)G，人；○ poly-IgG，马；□poly-IgG，绵羊；单克隆(m)IgG(WD1-6G6)，鼠；△ poly-IgM，人；◇ mIgG(92H2)，鼠；■β-半乳糖苷酶(β-gal)；▲鸡卵清蛋白(OVA)；α-乳清蛋白(α-lact)；◆牛血清清蛋白(BSA)。

图8B说明通过绵羊poly-IgG(6.7μM，200μL)长期产生H₂O₂。在96-孔石英板的一个密封孔内的PBS中近紫外照射8小时。H₂O₂浓度如图8A所述进行测定。

图8C表明过氧化氢酶随着时间对抗体催化的H₂O₂产生的影响。鼠单克隆抗体PCP-21H3(IgG)(6.7μM，200μL)溶液，在96-孔石英板的一个密封孔内的PBS中被照射510分钟。通过除臭剂红方法测定H₂O₂并且然后通过加入固化于Eupergit C上的过氧化氢酶(10mg，288mU)将H₂O₂破坏掉。通过过滤将过氧化氢酶去除并将抗体溶液再次照射420分钟。形成速率(0-510分钟)＝0.368μM分钟^-1(r²＝0.998)；形成速率(511-930分钟)＝0.398μM分钟^-1(r²＝0.987)。

图8D表明H₂O₂浓度对马poly-IgG抗体催化的最大形成速率百分比的影响。此图可以确定H₂O₂对马poly-IgG光致H₂O₂产生的IC₅₀。用多种浓度H₂O₂(0-450μM)孵育马IgG溶液(6.7μM)并且如图8A中所述测定H₂O₂的起始形成速率。该图是H₂O₂形成速率对H₂O₂浓度的曲线图并显示IC₅₀为225μM。

图8E表明H₂O₂对H₂O₂的抗体光致产生的长期抑制作用和去除H₂O₂后其活性的完全重建。分析涉及马poly-IgG(6.7mM在PBS pH 7.4中)在H₂O₂(450μM)存在下的持续360分钟的起始U.V.照射。H₂O₂随后被过氧化氢酶(固定化于Eupergit C)去除并且poly-IgG样品用UV线再次进一步照射480分钟。在每个测定中的H₂O₂的形成用除臭剂红测定法进行测定。

图8F表明过氧化氢酶对H₂O₂产生的影响。如图8C所述αβ-TCR(6.7μM，200μL)溶液被照射360、367和389分钟。测定了每次照射所产生的H₂O₂并且如图8C所述将产生的H₂O₂破坏掉。形成速率(0-360分钟)＝0.693μM分钟^-1(r²＝0.962)。在发展曲线中高于200μM的曲率与预期的被H₂O₂的抑制一致(见后)；形成速率(361-727分钟)＝0.427μM分钟^-1(r²＝0.987)；形成速率(728-1117分钟)＝0.386μM分钟^-1(r²＝0.991)。

图9表明天然4C6 Fab(彩图中的浅蓝和粉红)和H₂O₂存在时的4C6Fab(彩图中的深蓝和红色)叠置。

对于图9A，将天然4C6晶体在4mM H₂O₂中浸泡3分钟，并且立即速冻以在SSRL BL 9-1上收集数据。在H₂O₂存在时清楚地保存了二级和三级结构的整体结构完整性(RMSD Cα＝0.33，侧链＝0.49)。在CNS中计算RMSD。

图9B说明苯甲酸结合到Fab 4C6。高分辨率X射线结构显示Fab 4C6可与苯甲酸进行交叉反应。有和没有H₂O₂的4C6结合位点的叠置表明甚至结合位点内的侧链构象也是保守的(在彩图中亮色和暗色侧链分别对应+和-H₂O₂)。而且，苯甲酸的清晰电子密度表明Fab 4C6的结合特性在4mMH₂O₂中保持不变。电子密度图是在1.5σ处所描绘的2f_o-f_cσ加权图，并且在Bobscript中产生图。

图10A显示用二极管阵列HP8452A分光光度计于Abs_max 280nm处测量的马多克隆IgG的吸收光谱。

图10B提供了马多克隆IgG的作用光谱，在波长260和320nm之间的作用光谱表明H₂O₂形成的最大活性在280nm处。重复进行测定并且该测定涉及将抗体溶液[6.7μM溶于PBS(pH 7.4)]加入到石英管中，然后将该石英管放置于SLM荧光分光光度计的氙弧灯和单色器所产生的光束中1小时。通过除臭剂红测定法测量H₂O₂浓度。

图11A说明随着时间由色氨酸(20μM)产生H₂O₂。产生条件和测定步骤如图8A所述。

图11B提供了氯离子对抗体-介导的光致H₂O₂产生的影响。将绵羊poly-IgG■(6.7μM，200μL)或马poly-IgG▲(6.7μM，200μL)的溶液冻干至干燥并且然后将其溶于去离子水或NaCl(水溶液)中，以至于氯离子的终浓度为0-160mM。然后将样品在20EC环境氧条件下于透照灯(800μWcm^-2)的密封玻璃管内进行照射并重复。在整个测定过程中取出多个等份(10μL)并通过除臭剂红测定法测定H₂O₂浓度。H₂O₂形成速率描绘为每种抗体样品对[NaCl]的平均值±S.E.M.。

图11C说明在含EDTA缓冲液中的透析对抗体介导的光致产生H₂O₂的影响。将在含EDTA(20mM)的PBS中透析之前和之后的两个抗体制剂即鼠单克隆抗体PCP21H3和马多克隆IgG的光致产生H₂O₂进行比较。产生条件和测定步骤如图8A所述。每个数据点报道为至少重复测量的平均值±SEM：[●透析之前鼠mIgG PCP21H3；■透析之后鼠mIgG PCP21H3；▲透析之前马poly-IgG；◆透析之后马poly-IgG]。

图12提供了用含¹⁶O的H₂O₂或用含¹⁸O的H₂O₂对底物三羧乙基膦(TCEP)的氧化作用的质谱。ESI(阴极)质谱被作为H₂O₂氧化作用后的TCEP[(M-H)^-249]及其氧化物[(M-H)^-265(¹⁶O)和(M-H)^-267(¹⁸O)]的质谱。

图12A提供了在H₂ ¹⁸O(98％ ¹⁸O)PB中¹⁶O₂有氧条件下照射绵羊poly-IgG(6.7/μM)后TCEP及其氧化物的质谱。产生了含¹⁶O的TCEP(在265处较大的峰)和含¹⁸O的TCEP(在267处较小的峰)的混合物。

图12B提供了在H₂ ¹⁶OPB中富含¹⁸O₂(90％ ¹⁸O)有氧条件下照射绵羊poly-IgG(6.7μM)后TCEP及其氧化物的质谱。产生了含¹⁶O的TCEP(在265处较小的峰)和含¹⁸O的TCEP(在267处较大的峰)的混合物。

图12C提供了在H₂ ¹⁶OPB中¹⁶O₂有氧条件下进行poly-IgG照射后TCEP及其氧化物的质谱。测定条件和步骤如方法和材料(实施例II)中所述，除了由H₂ ¹⁶O替换H₂ ¹⁸O。仅观察到含¹⁶O的TCEP(在265处的大峰)。

图12D提供了在20EC于H₂ ¹⁸OPB中缺氧条件下(脱气并在氩气条件下)照射绵羊poly-IgG(6.7μM)和H₂ ¹⁶O₂(200μM)后TCEP及其氧化物的质谱。TCEP的加入如方法和材料(实施例II)中所述。仅观察到含¹⁶O的TCEP(在265处的大峰)。

图12E提供了在H₂ ¹⁸OPB中¹⁶O₂有氧条件下照射3-甲基吲哚(500μM)后TCEP及其氧化物的质谱。仅观察到含¹⁶O的TCEP(在265处的大峰)。测定条件和步骤如方法和材料(实施例II)中所述，除了由于3-甲基吲哚的分子量太小而不进行大小排除过滤之外。因此，将TCEP加入至含3-甲基吲哚的PB溶液中。

图12F提供了在H₂ ¹⁸OPB中¹⁶O₂有氧条件下照射β-gal(50μM)后TCEP及其氧化物的质谱。仅观察到含¹⁶O的TCEP(在265处的大峰)。测定条件和步骤如方法和材料(实施例II)中所述。

图13显示如材料和方法(实施例II)中所述的抗体4C6内的Xe结合位点。

图13A提供了彩图中以粉色的轻链和蓝色的重链表示的Fab 4C6 Cα示踪的标准侧视图。使用在5σ处描绘的最初F_o-F_c电子密度图显示三个结合的氙原子(彩图中的绿色)。

图13B提供了保守的氙位点1周围的Fab 4C6和2C αβ TCR(PDB/TCR)的覆盖面图。V_L(彩图中的粉色)和侧链(彩图中的黄色)的示踪骨架C_α与2C αβ TCR相应的V_α(彩图中的红素和金色)是重叠的(使用Insight2000产生的图)。

图14图解说明通过抗体杀死细菌。

图14A提供了显示在不同实验条件下大肠杆菌XL1-blue和O112a，c菌株的存活率的柱形图。存活率报道为恢复的菌落形成单位(CFU)，以实验开始(t＝0分钟)处的CFU的百分数表示。黑色柱和浅灰色柱对应相同实验条件，除了浅灰色组(2，4，6，8，10和12)暴露于可见光(2.7mWcm^-2)60分钟，而黑色组(1，3，5，7，9和11)放置于黑暗60分钟。细菌细胞密度为大约10⁷个细胞/mL。所报道的每个数据点是在以下条件下大肠杆菌XL1-blue(组1-6)和O112a，c(组7-12)的平均值±S.E.M.(n＝6)。组1-2XL1-blue细胞置于PBS中，pH 7.4，4℃。组3-4HPIX(40μM)，PBS中的XL1-blue细胞，pH 7.4，4℃。组5-6XL1-blue-特异单克隆抗体(25D11，20μM)、血卟啉IX(40μμM)、XL1-blue细胞置于PBS，pH 7.4，4℃。组7-8O112a，c细胞置于PBS，pH 7.4，4℃。组9-10HPIX(40°M)，O112a，c细胞置于PBS，pH 7.4，4℃。组11-12O112a，c-特异单克隆抗体(15404，20μM)、血卟啉IX(40μM)、O112a，c细胞置于PBS，pH7.4，4℃。

图14B图解说明抗体浓度对大肠杆菌O112a，c存活率的影响。所用抗体为O112a，c-特异单克隆抗体15404。所报道的每个数据点是平均值±S.E.M(n＝3)。对应50％细胞杀伤(EC₅₀)的15404抗体浓度为81±6nM。

图14C图解说明照射时间对大肠杆菌XL1-blue-特异鼠单克隆抗体12B2的杀菌作用的影响。该图提供了当存在血卟啉IX(40μM)和12B2(20μM)时大肠杆菌XL1-blue的存活率与照射时间(2.7mW cm^-2)的关系。所报道的每个数据点是平均值±S.E.M(n＝3)。对应50％细胞杀伤的照射时间为30±2分钟。

图14D说明抗体驱动杀菌作用对血卟啉IX浓度的依赖性。所用抗体为大肠杆菌XL1-blue-特异鼠单克隆抗体25D11。该图提供了暴露于一定血卟啉IX浓度范围与大肠杆菌XL1-blue的存活率的关系。使用了以下条件：XL1-blue细胞置于PBS，pH7.4，4℃，黑暗60分钟(＞)。XL1-blue细胞置于PBS，pH 7.4，4℃，白光(2.7mW cm^-2)(Δ)。25D11(20μM)，XI1-blue细胞置于PBS，pH 7.4，4℃，黑暗60分钟(◆)。25D11(20μM)，XL1-blue细胞置于PBS，pH 7.4，4℃白光(2.7mW cm^-2)照射60分钟(◇)。

图15提供了大肠杆菌O112a，c细胞暴露于置于PBS中的抗原特异的鼠单克隆IgG(15404，20μM)、血卟啉IX(40μM)并可见光4℃照射1小时(＜5％存活)后，大肠杆菌O112a，c细胞的电子显微镜照片。为了看到抗体吸附的位点，在完成杀菌测定之后加入金标记的山羊抗鼠抗体。观察到抗原非特异性抗体的杀菌活性潜能与抗原特异性抗体非常相似。一般在该测定系统中20μM抗体(非特异)杀菌率为＞95％。

图16A-C提供了大肠杆菌XL-1blue细胞暴露于PBS中的非特异性鼠单克隆IgG抗体(84G3，20μM)、血卟啉IX(40μM)并可见光4℃照射1小时(1％存活)后，大肠杆菌XL-1blue细胞的电子显微镜照片。图16A中的箭头指向细胞膜与细胞质内含物的初步分离。图16D提供了血清型大肠杆菌O112a，c细胞暴露于PBS中的抗原特异的鼠单克隆IgG(15404，20μM)、血卟啉IX(40μM)并可见光室温照射1小时(＜5％存活)后，血清型大肠杆菌O112a，c细胞的电子显微镜照片。使用本领域中可用的方法进行金标记。

图17A说明了过氧化氢酶对抗体针对大肠杆菌XL1-blue的杀菌作用的影响[报道为恢复的菌落形成单位(CFU)，以实验开始(t＝0分钟)时CFU的百分数表示]。过氧化氢酶将H₂O₂转化为水(H₂O)和分子氧(O₂)。每组用白光(2.7mW cm^-2)4℃照射60分钟。细菌细胞密度为～10⁷个细胞/mL。实验组(1-7)处理如下：组1大肠杆菌XL1-blue细胞和血卟啉IX(40μM)置于PBS(pH 7.4)。组2大肠杆菌XL1-blue细胞和非特异鼠单克隆抗体84G3(20μM)置于PBS(pH 7.4)。组3大肠杆菌XL1-blue细胞、血卟啉IX(40μM)和单克隆抗体84G3(20μM)置于PBS(pH 7.4)。组4大肠杆菌XL1-blue细胞、血卟啉IX(40μM)、单克隆抗体84G3(20μM)和过氧化氢酶(13mU/mL)置于PBS(pH 7.4)。组5大肠杆菌XL1-blue细胞和特异兔多克隆抗体(20μM)置于PBS(pH 7.4)。组6大肠杆菌XL1-blue细胞、血卟啉IX(40μM)和特异兔多克隆抗体(20μM)置于PBS(pH 7.4)。组7大肠杆菌XL1-blue细胞、血卟啉IX(40μM)、特异兔多克隆抗体(20μM)和过氧化氢酶(13mU/mL)置于PBS(pH 7.4)。每个点报道为多次实验(n＝6)的平均值±S.E.M.。符号**表示在相同时间点相对对照p值＜0.01。在任意黑暗对照中均没有观察到杀菌活性(数据未显示)。

图17B说明H₂O₂对大肠杆菌XL1-blue和O112a，c血清型的浓度依赖性毒性。垂直带阴影的线是使用上述用于图14和Hofman等，Infect.Immun.68，449(2000)中的条件在60分钟的孵育过程中通过抗体产生的预期H₂O₂的浓度。35±5μM H₂O₂的值是由至少两次重复的12个不同单克隆抗体的测定所确定的平均值。

图18说明存在或缺乏过氧化氢酶时在u.v.照射(312nm，0.8mW cm^-2)PBS(pH 7.4)中的抗体期间自靛蓝胭脂红1(1mM)光致产生磺酸靛红2的过程。Steinbeck等，J.Biol.Chem.267，13425(1992)。每个点报道为至少两次重复测定的平均值±S.E.M.。使用Graphpad Prism v.3.0软件进行线性回归分析。在以下条件下观察了磺酸靛红2(v)的形成速率：绵羊多克隆IgG(20μM)(●)v＝34.8±1.8nM/分钟；鼠单克隆抗体33F12(20μM)(□)v＝40.5±1.5nm/分钟；绵羊多克隆IgG(20μM)和可溶过氧化氢酶(13mU/mL)(△)v＝33.5±2.3nM/分钟；鼠单克隆抗体33F12(20μM)和可溶过氧化氢酶(13mU/mL)()v＝41.8±1.2nM/分钟。

图19A-C提供了在不同条件下室温于H₂ ¹⁸O(＞95％¹⁸O)磷酸盐缓冲液(PB，100mM，pH7.4)中靛蓝胭脂红1(1mM)氧化期间所产生的磺酸靛红2[(MH)-226，(M-H)-228(¹⁸O)和(M-H)-(2×¹⁸O)]的电喷射离子化作用(阴极)质谱。图19A提供了在通过化学臭氧分解作用5分钟氧化靛蓝胭脂红1(600μM于PB中)期间所产生的磺酸靛红2的质谱。图19B提供了在通过用白光(2.7mW cm^-2)照射血卟啉IX(40μM)和绵羊poly-IgG(20μM)4小时氧化靛蓝胭脂红1期间所产生的磺酸靛红2的质谱。图19C提供了通过用白光(2.7mW cm^-2)照射血卟啉IX(40μM)4小时氧化靛蓝胭脂红1期间所产生的磺酸靛红2的质谱。

图20A说明通过用PBS(pH 7.4)中的肉豆蔻酸佛波酯(1μg/mL)在37℃活化人嗜中性粒细胞(PMN，1.5×10⁷个细胞/mL)而氧化靛蓝胭脂红1(30μM)(＞)和形成2(□)的时间过程。使用未活化的PMN时无靛蓝胭脂红1氧化作用发生(数据未显示)。如前所述制备嗜中性粒细胞。次氯酸(HOCl)是已知的由嗜中性粒细胞所产生的氧化剂。在我们的实验中，PBS(pH 7.4)中的NaOCl(2mM)氧化1(100μM)但不断裂1的双键以产生磺酸靛红2。

图20B说明在图20A中所述条件下，通过活化人嗜中性粒细胞氧化靛蓝胭脂红1期间所产生的磺酸靛红2的阴离子电喷射质谱。

图21A-B提供了图解说明鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)特异抗体6B5的杀菌活性的柱形图。显示了在零时间(t＝0，蓝色)和在不同条件下用6B5抗体制剂孵育活鼠伤寒沙门氏菌一小时(t＝1小时，红紫色)之后的平均菌落形成单位(n＝3)。

图21A显示使用白光照射(1.5mWcm^-2光通量)进行实验的结果。测定包括：仅有沙门氏菌(salmonella)细胞；沙门氏菌细胞和血卟啉IX(HP)(120μM)；沙门氏菌细胞和6B5抗体(40μM)；沙门氏菌细胞、6B5抗体(5μM)和血卟啉IX(120μM)；沙门氏菌细胞、6B5抗体(10μM)和血卟啉IX(120μM)；沙门氏菌细胞、6B5抗体(20μM)和血卟啉IX(120μM)；沙门氏菌细胞、6B5抗体(30μM)和血卟啉IX(120μM)；沙门氏菌细胞、6B5抗体(40μM)和血卟啉IX(120μM)。

图21B显示在黑暗中(零光通量)进行实验的结果。测定包括：仅有沙门氏菌(salmonella)细胞；沙门氏菌细胞和血卟啉IX(HP)(120μM)；沙门氏菌细胞和6B5抗体(40μM)；沙门氏菌细胞、6B5抗体(5μM)和血卟啉IX(120μM)；沙门氏菌细胞、6B5抗体(10μM)和血卟啉IX(120μM)；沙门氏菌细胞、6B5抗体(20μM)和血卟啉IX(120μM)；沙门氏菌细胞、6B5抗体(30μM)和血卟啉IX(120μM)；沙门氏菌细胞、6B5抗体(40μM)和血卟啉IX(120μM)。

发明详述

本发明涉及抗体作为一类分子具有将单线态氧转化为活性氧类能力的发现。根据本发明，此类活性氧类能够杀死微生物。由抗体产生的活性氧类的例子包括但不限于臭氧(O₃)、超氧自由基(O₂ ^-)、过氧化氢(H₂O₂)或羟自由基(OH^●)。

不管抗体的来源或抗体的抗原特异性如何，抗体将单线态氧转化为活性氧类的能力将先前鉴定的抗体结合特性与破坏其靶标的能力联系起来。因此本发明提供了抑制微生物生长的方法，该方法涉及将微生物与能够产生活性氧类的抗体相接触。

定义

缩略语：(HP)血卟啉；(PBS)磷酸缓冲盐；(OVA)鸡蛋卵清蛋白；(SOD)超氧化物歧化酶；(PO)过氧化物酶；(phox)吞噬细胞氧化酶；(HRP)辣根过氧化物酶；(MS)质谱分析；(AES)ICP-原子发射光谱法；(MS)质谱；(QC)量子化学。

此处术语“试剂”用于指化学化合物，化学化合物的混合物，生物大分子，或由生物材料诸如细菌、植物、真菌或动物(尤其是哺乳动物)的细胞或组织制备的提取物。通过此处所述的筛选测定法对试剂作为抗体或嗜中性粒细胞调节剂的潜在活性进行了评价。

如此处所用的术语“有效量”、“有效降低量”、“有效改善量”、“有效杀菌量”、“有效组织损伤抑制量”、“治疗有效量”等等术语是鉴定足以获得预期生物学效应例如疾病、失调、病症等等的治疗或疾病、失调、病症等等的症状的减轻的量。在治疗方法中抗体的此种有效量是导致降低、逆转、改善或抑制微生物感染的量。

“工程抗体分子”是已经通过重组技术所产生的多肽。此类分子可包括能够催化从单线态氧产生至少一种活性氧类的活性中心。此类工程抗体分子可具有包含于多肽结构内的活性吲哚基。此种分子的吲哚基可以作为色氨酸残基存在。工程抗体分子还可以包含非天然氨基酸和连接体以及模拟肽。工程抗体分子还包括进行了修饰以去除活性中心以致于其基本上不能够产生活性氧类的抗体。

如此处所使用，术语“表位”意思是指抗原中能与抗体的互补位结合的任何抗原决定簇。表位决定簇通常由诸如氨基酸或糖侧链分子的化学活性表面基团组成并且通常具有特异的三维结构特性以及特异的电荷特性。抗原可包括多肽、脂肪酸、脂蛋白、脂类、化学品、激素等等。在一些实施方案中，抗原包括，但不限于，来自诸如细菌的微生物或者诸如人免疫缺陷病毒、流感病毒、疱疹病毒、乳头瘤病毒、人T-细胞白血病病毒等等病毒的蛋白质。在其它实施方案中，抗原包括，但不限于，表达于癌细胞例如肺癌、前列腺癌、结肠癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、膀胱癌、骨癌、白血病、淋巴瘤、脑癌等等的蛋白质。本发明抗原还包括化学品例如乙醇、四氢大麻酚、LSD、海洛因、可卡因等等。

术语“调节”是指增强或抑制本发明抗体或工程抗体分子的功能特性的能力。此种调节可以增加或降低通过抗体、嗜中性粒细胞或工程抗体分子所产生的至少一种活性氧类。

“非天然”氨基酸包括D-氨基酸和天然情况下不存在的氨基酸，以4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰蛋氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸和其它此类氨基酸和亚氨基酸为例进行说明。

术语“模拟肽”或“肽模拟物”描述肽类似物，例如那些通常作为非肽药物用于制药工业的肽类似物，其特性与模板肽的特性相似。(Fauchere，J.，Adv.Drug Res.，15：29(1986)和Evans等，J.Med.Chem.，30：1229(1987))。通常，模拟肽与示例多肽(即具有生物化学特性或药理学活性的多肽)在结构上是相似的，但具有一个或多个通过本领域已知的方法任选地由连接键例如--CH₂NH--、--CH₂S--、--CH₂--CH₂--、--CH＝CH--(顺式或反式)、--COCH₂--、--CH(OH)CH₂--和--CH₂SO--所替换的肽键。肽模拟物较天然多肽具有的优点可以包括生产更加经济、更大的化学稳定性、可改变的特异性、降低的抗原性和增强的药理学特性，例如半寿期、吸收、潜能和效力。

如此处所使用，术语“可药用”、“生理可耐受”及其它们的语法学上的变体，当它们指组合物、载体、稀释剂和试剂时，可互换使用并代表能够施用至或于哺乳动物且不产生诸如恶心、头晕、胃不舒服等等的不良生理效应的物质。

术语“蛋白质”和“多肽”用于描述天然蛋白质、肽、蛋白质片段或者蛋白质或多肽的类似物。这些术语可互换使用。

如此处所使用术语“活性氧类”意思是指抗体产生的氧类。这些活性氧类可以具有一个或多个不成对电子，或者因为它们易于与其它分子发生反应而是有活性的。此种活性氧类包括但不限于超氧自由基、过氧化氢、羟自由基、过氧自由基、臭氧和其它短寿命的与臭氧有着相同化学标记的三氧加合物。

抗体的催化活性

根据本发明，抗体，不管其来源或抗原特异性，能够将单线态氧转化为诸如臭氧(O₃)、超氧自由基(O₂ ^-)、过氧化氢(H₂O₂)、过氧自由基或羟自由基(OH^●)的活性氧类。此种酶促作用，结合抗体的高亲和性靶向能力，使得这些抗体成为独特的能够有效破坏其靶标的实体。因此更全面地认识到抗体是一种值得注意的衍接分子，其正在被发展成为具有在脊椎动物防御外来入侵者的前沿所发生的靶向和催化两种功能。

从单线态氧产生活性氧类的能力存在于完整的免疫球蛋白和诸如Fab、F(ab′)₂和Fv片段的抗体片段(见实施例)。这种活性不存在于包括RNaseA、超氧化物歧化酶和可以被氧化的包曼-毕尔克(Bowman-Birk)抑制剂蛋白质在内的其它分子(实施例1和表1)。同样，该活性与分子中二硫化物的存在无关，即使此种二硫化物富含能够被氧化的电子(Bent等，J.Am.Chem.Soc.，87：2612-2619(1975))。

如果抗体是变性的则抗体从单线态氧产生活性氧类的能力将消失。这表明抗体的三维结构与产生活性氧类的还原过程有关。

以一种有效并且长期的方式从单线态氧产生活性氧类的能力存在于免疫球蛋白和T细胞受体(实施例II，图1F)。T细胞受体与抗体享有结构相似性，包括排列的免疫球蛋白折叠结构域(Garcia等，Science，274：209(1996))。然而，拥有这种结构基序对于赋予蛋白质产生活性氧类的能力似乎不是必需的。β₂-巨球蛋白是具有该结构基序的免疫球蛋白超家族的一员，不能够产生过氧化氢(Welinder等，Mol.Immunol.，28：177(1991))。

结构研究还表明，在T细胞受体中发现的保守色氨酸残基存在于与在抗体中所发现的结构域相似的结构域中。而抗体和T细胞受体都具有此种色氨酸。β₂-巨球蛋白，其缺乏该保守色氨酸残基，不具有产生臭氧、超氧化物或过氧化氢的能力。在抗体和T细胞受体中高度保守的该色氨酸残基周围的序列和结构表明那些周围的结构也可能在允许将单线态氧转化为过氧化氢、臭氧和/或超氧化物的催化作用中起作用。

当存在¹O₂*时抗体杀菌活性的发现是当缺乏补体或吞噬细胞时抗体能够破坏其抗原靶标的第一直接证据。这是抗体可以在宿主防御细菌或微生物感染中起作用的第一证据。

单线态氧的内源性产生

最近公开的抗体的化学势在体内的作用依赖于关键底物¹O₂*的可得性。然而，¹O₂*会在多种生理事件中产生并且在体内也是可得的。参见J.F.Kanofsky Chem.-Biol.Interactions 70，1(1989)以及其中的参考文献。例如，包括再灌注会产生¹O₂*。X.Zhai和M.Ashraf Am.J.Physiol.269(Heart Circ.Physiol.38)H1229(1995)。在吞噬作用过程中嗜中性粒细胞的活化也产生¹O₂*。J.R.Kanofsky，H.Hoogland，R.Wever，S.J.Weiss J.Biol.Chem.263，9692(1988)；Babior等，Amer.J.Med.，109：33-34(2000)。通过照射存在于卟啉症患者皮肤中的无金属卟啉前体也产生单线态氧(¹O₂)。

此外，底物¹O₂*可以通过吞噬作用或再灌注入足以使抗体产生可检测水平活性氧类的量的方式产生。例如，吞噬体的体积大约1.0×10^-15升。因此，此处所鉴定的反应不需要高度有效，因为在如此小的体积内仅有几百个分子具有微摩尔浓度。实际上，吞噬体内¹O₂*的浓度计算为高达摩尔浓度。E.P.Reeves等，Nature 416，291(2002)。关于抗体分子的数量，通过用细菌和荧光标记抗体进行滴定和免疫金研究能够得出相同的估计(图2)。这些分析表明大约有10⁵个抗体分子结合到每个细菌上并且此数量将相当于吞噬体中毫摩尔的抗体浓度。因此，通过甚至最保守的估计，吞噬体内¹O₂*和抗体的浓度也远远超过那些用于此处所提供的作为例证的实施例中的量。

单线态分子氧(¹O₂)也可以在杀微生物过程中以直接和间接方式产生。单线态分子氧(¹O₂)可以直接通过例如黄素蛋白氧化酶的作用产生(Allen，R.C.，Stjernholm，R.L，Benerito，R.R.和Steele，R.H.，著者Cormier，M.J.，Hercules，D.M.和Lee，J.(Plenum，New York)，498-499页(1973)；Klebanoff，S.J.在《在寄主抗性中的吞噬细胞》(National Institute ofChild Health and Human Development，Orlando，FL)(1974))一书中。作为选择，¹O₂可以在杀微生物过程中间接产生，例如象在吞噬体发现的那样在低pH的溶液中O₂ ^●-的非酶歧化作用(Stauff，J.，Sander，U.和Jaeschke，W.，化学发光和生物发光，著者，Williams，R.C.和Fudenberg，H.H.(Intercontinental Medical Book Corp.，New York)，131-141页(1973)；Allen，R.C.，Yevich，S.J.，Orth，R.W.t和Steele，R.H.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，60，909-917(1974))。

因为¹O₂具有如此高的反应性，因此以前认为它在氧清除剂的级联反应中是一个终点。然而，已经发现抗体，作为一类蛋白质，具有中途拦截¹O₂并且有效地将其还原成活性氧类的能力，因此提供了一种在吞噬细胞作用中能够使¹O₂被拯救并再循环的机制，并从而使免疫系统的杀菌作用成为可能。

治疗方法

本发明提供了当其产生被认为是正当时，例如用于抑制微生物感染、促进创伤愈合、溶解细菌、清除病毒、靶向癌细胞用于氧化剂诱导的裂解等等过程，而产生活性氧类的方法。例如，本发明提供了抗体介导的活性氧类的产生以补充吞噬性嗜中性粒细胞所产生的过氧化物局部浓度并抗击细菌感染或病毒感染。活性氧类作为抗微生物剂来消灭细菌、病毒或其它微生物。因此，为了增强该过程，人们将使用本发明的方法以提供抗体组合物到该区域导致局部活性氧类浓度提高。

A.提供抗体活性

本发明涉及的治疗方法基于使用能够产生活性氧类的抗体，包括1)抑制微生物的增殖、或靶向和杀死患者体内的微生物，当抗体识别微生物表达的抗原并与其起免疫反应时，2)抑制癌细胞的增殖、或者靶向和杀死患者体内癌细胞，当抗体识别癌细胞表达的抗原并与其起免疫反应时，3)抑制患者体内与嗜中性粒细胞介导的炎症反应相关的组织损伤，例如当炎症反应起因于细菌感染或病人患有自身免疫性疾病时，4)增强患者体内吞噬细胞的杀菌效果，5)促进具有开放性创伤的患者伤口的愈合，当活性氧类刺激成纤维细胞的增殖和/或免疫反应进一步包括淋巴细胞的增殖时，6)刺激细胞增殖，例如刺激患者伤口的成纤维细胞增殖，以及相似情形。

在一些实施方案中，本发明提供了用于治疗微生物感染和其它疾病的的治疗方法，这些方法得益于诸如超氧自由基、羟自由基、臭氧或过氧化氢的活性氧类增强的产生。此种方法在正当需要此种活性氧类产生的情况下能够使用任何抗体产生活性氧类。在一些实施方案中，特异性靶向结合至微生物，从而定位活性氧类的产生。

而且，此类方法能够应用已经进行工程化以产生水平增加的活性氧类的抗体，例如，因为抗体具有一个将单线态氧转化为活性氧类的额外反应位点。当需要诸如超氧自由基、羟自由基、臭氧或过氧化氢的活性氧类的增强产生时，与具有两个保守色氨酸残基的非工程化抗体相比具有两个以上还原中心的工程化抗体分子的使用是正当需要的。

也在另一方面，抗体是如此处描述所提供的重组抗体或者，可选择地，从递送至细胞的表达载体表达的重组抗体。在本文中表达载体还能够表达敏化分子(见下)。

由抗体产生活性氧类的最低需求是存在氧，即有氧条件是普遍要求的。单线态氧到活性氧类的生物学转化发生于光，包括可见光、红外线和紫外照射条件下。当使用可见光条件时，单线态氧的产生能够使用其它能够提供单线态氧源的分子进行增强。产生单线态氧的分子包括产生单线态氧不需要其它因子或诱导剂的分子和暴露于诱导剂后能够产生单线态氧的“敏化剂”分子。不需要其它因子或诱导剂就能够产生单线态氧的分子的例子包括，但不限于，内过氧化物。在一些实施方案中，所使用的内过氧化物可能是蒽-9，10-二丙酸内过氧化物。敏化分子的例子包括，但不限于，蝶呤、黄素、血卟啉、四(4-磺化苯基)卟啉、二吡啶基钌(II)复合体、玫瑰红染料、醌、若丹明染料、酞菁、竹红菌甲素、玉红花青苷、喹哪啶蓝或别花青苷。

当暴露于诱导剂时能够诱导敏化分子产生单线态氧。一种此种诱导剂是光。根据敏化剂的类型和结构，此种光能够是可见先、紫外光或红外线。

本发明进一步涉及将抗体治疗性用于在需要此类活性氧类或非常缺乏此类活性氧类的环境中产生臭氧、过氧化物、羟自由基或过氧化氢。在一个实施方案中，本发明涉及用于抑制微生物生长的方法，其中微生物与包括能够从单线态氧产生此类活性氧类的抗体的组合物相接触。当使用非特异性或免疫特异性(抗原结合)的完整抗体或抗体片段时，该方法是成功的。此种抗体片段包括单链抗体和此处所述的工程化分子和抗体。然而，当期望针对微生物的局限活性时，抗体可以是对与微生物相关的抗原特异的。例如，抗体能够选择性结合到微生物表面的抗原上。

抗体组合物可以在体内递送到受到微生物感染或其它疾病或能够从暴露于活性氧类而受益的其它疾病的病人中。优选的体内递送方法包括静脉内给药、局部给药、吸入给药、插管给药、腔内给药、肌内给药、经皮给药、皮下给药或通过含有抗体的脂质体给药。

作为例证的细胞表面抗体浓度范围为0.01-50微摩尔。然而，浓度会依赖所希望的结果而变化，此时所提供抗体的量是足以得到预期生理效应即产生诸如过氧化氢、臭氧、超氧自由基或其衍生氧化物的活性氧类以产生氧化应激的抗体的量。用抗体组合物进行治疗处理的剂量和时间与下面描述的用于抗氧化剂的相一致。

本发明的方法进一步涉及在产生抗体介导的诸如过氧化氢、臭氧、超氧自由基或其衍生氧化物的活性氧类的方法中将抗体或抗体-抗原复合物暴露于紫外线、红外线或可见光的照射下。

为了增强活性氧类的产生，敏化剂例如光敏剂的活性氧类产生量能够用于此处所述的治疗方法中。如此处所定义，敏化剂是任意诱导或增加单线态氧浓度的分子。敏化剂能够用于存在照射的情况下，该过程包括暴露于紫外线、红外线或可见光下足以活化敏化剂的一段时间。作为例证的暴露时间和条件在实施例中进行描述。

敏化剂的活性氧类产生量是足以得到预期生理效应的敏化剂的量，预期生理效应即在正当需要此种活性氧类和其衍生物的多种情况下通过抗体介导从单线态氧产生诸如过氧化物、臭氧或过氧化氢的活性氧类。在一些实施方案中，敏化剂被偶联到抗体上。偶联至敏化剂上的抗体通常能够结合到抗原上，即抗体仍保留有效的抗原结合位点，从而允许发生抗原识别和结合。

作为例证的敏化剂包括但不限于蝶呤、黄素、血卟啉、四(4-磺化苯基)卟啉、二吡啶基钌(II)复合体、玫瑰红染料、醌、罗丹明染料、酞菁和竹红菌甲素。

在进一步的实施方案中，通过施用增强单线态氧产生的方法来增强活性氧类的产生。还原的单线态氧是诸如过氧化氢、臭氧、超氧自由基或其衍生氧化物的活性氧类的来源。一种增强单线态氧产生的方法是使用包括对产生单线态氧有用的任何分子、化合物或试剂在内的前体药物。如此处所描述，此种前体药物在将抗体施用于预期靶细胞、组织或器官或将抗体与其相接触的同时，或在此种施用或接触之后，进行施用。当在抗体施用之后施用前体药物时，抗体已经有机会与其靶抗原进行免疫反应并形成抗体-抗原复合体。然后增强单线态氧产生的方法能够在抗体-抗原识别位点增强诸如过氧化氢、臭氧、超氧自由基或它们的衍生氧化物的活性氧类的产生。该实施方案具有特别的优点，例如，在目的位点或位置产生治疗上希望有的过氧化物、臭氧或过氧化氢的增强的局部积累的能力。

优选的前体药物是内过氧化物，例如，浓度大约1微摩尔至大约50微摩尔的内过氧化物。在抗体-抗原复合体位点所能达到的优选的内过氧化物浓度为大约10微摩尔。

本发明中抗体的抗原靶可以是本领域技术人员已知的或可得到的任何抗原。抗原可以是存在于细胞、组织或器官上或内的任何抗原，在那里活性氧类的存在和抗体介导的产生该性活氧类的过程是所期望的。抗原可以存在于溶液中，例如存在于细胞外液中。抗原可以是，例如，蛋白质、肽、脂肪酸、低密度脂蛋白、与炎症反应相关的抗原、癌细胞抗原、细菌抗原、病毒抗原或相似分子。

抗原相关的细胞包括但不限于微生物、内皮细胞、间质细胞、上皮细胞、肌肉细胞、吞噬细胞、血细胞、树突状细胞、结缔组织和神经系统细胞。

因此，例如，使用本发明的抗体能够治疗下列靶微生物的感染：气单胞菌属(Aeromonas spp.)、芽胞杆菌属(Bacillus spp.)、拟杆菌属(Bacteroides spp.)、弯曲杆菌属(Campylobacter spp.)、梭菌属(Clostridiumspp.)、肠杆菌属(Enterobacter spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、埃希氏菌属(Escherichia spp.)、腹螺菌属(Gastrospirillum sp.)、缠绕杆菌属(Helicobacter spp.)、克雷伯氏菌属(Klebsiella spp.)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、弧菌属(Vibriospp.)、耶尔森氏菌属(Yersinia spp.)等等。使用本发明的抗体能够治疗的感染包括那些与葡萄球菌感染(金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus))、斑疹伤寒(伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi))、食物中毒(诸如O157：H7的大肠杆菌)、杆菌性痢疾(痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteria))、肺炎(铜绿假单胞菌(Psuedomonas aerugenosa)和/或洋葱假单胞菌)、霍乱(霍乱弧菌(Vivrio cholerae))、溃疡(幽门螺旋杆菌)和其它相关的感染。大肠杆菌血清型O157：H7涉及腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒性综合征(HUS)和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)的发病机理。本发明的抗体对于耐药的和多药耐药的细菌菌株，例如金黄色葡萄球菌的多抗药性菌株和屎肠球菌和粪肠球菌的万古霉素抗性菌株，也是有效的。

在一些实施方案中，本发明的抗微生物组合物用来抵抗革兰氏阴性细菌。在其它实施方案中，抗微生物组合物能够用于抵抗埃希氏菌属物种、假单胞菌属物种和/或沙门氏菌属物种。例如，抗微生物组合物能够用于抵抗不同类型的大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌和其它相关细菌。

本发明的抗微生物组合物对于抗病毒也是有效的。术语“病毒”指的是DNA和RNA病毒、类病毒和朊病毒。病毒包括包膜和无包膜病毒，例如，甲型肝炎病毒(hepatitis A virus)、乙型肝病毒(hepatitis B virus)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus)、人免疫缺陷症病毒(humanimmunodeficiency virus)(HIV)、痘病毒(poxviruses)、疱疹病毒(herpesviruses，)、腺病毒(adenoviruses)、乳多空病毒(papovaviruses)、细小病毒(parvoviruses)、呼肠孤病毒(reoviruses)、环状病毒(orbiviruses)、细小核糖核酸病毒(picornaviruse)、轮状病毒(rotaviruses)、甲病毒(alphaviruses)、风疹病毒(rubivirues)、A型和B型流感病毒(influenzavirus type A and B)、黄病毒(fiaviviruses)、冠形病毒(coronaviruses)、副粘病毒(paramyxoviruses)、麻疹病毒(morbilliviruses)、肺病毒(pneumoviruses)、弹状病毒(rhabdoviruses)、狂犬病病毒(lyssaviruses)、正粘液病毒(orthmyxovirus)、布尼亚病毒(bunyaviruses)、白蛉病毒(phleboviruses)、纳伊罗病毒(nairoviruses)、嗜肝DNA病毒(hepadnaviruses)、沙粒病毒(arenaviruses)、逆转录病毒(retroviruses)、肠病毒(enteroviruses)、鼻病毒(rhinoviruses)或线状病毒(filovirus)。

可受益于在细胞、组织或器官以及细胞外区室中活性氧类产生或增强的其它治疗性疾病对本领域普通技术人员是熟知的。例如此类疾病进一步描述于McCord，Am.J.Med.，108：652-659(2000)，其所公开的内容此处引用作为参考。

使用本领域技术人员可得到的方法可以对针对这些微生物品种的抗微生物活性进行评价。抗微生物活性通过例如鉴定本发明的抗体阻止特定微生物物种生长的的最低抑菌浓度(MIC)而进行确定。在一个实施方案中，抗微生物活性是当使用标准剂量或剂量反应方法测量时能够杀死50％微生物的抗体的量。

评估用此处所述的抗体治疗微生物感染时治疗有效剂量的方法包括测定抗体制备物的最低抑菌浓度，在此浓度下基本上没有微生物能够体外生长。此种方法允许计算单位体积中为了抑制微生物生长或杀死50％微生物所需要的大约抗体量。例如，通过标准的微稀释法能够测定此种数量。例如，制备了一系列含有相同体积培养基和基本上相同量的微生物的微生物培养管，并且加入一份抗体。每一份包含不相同量的抗体于相同体积的溶液中。将微生物培养相应于一至十代的时间段并且测定培养基中微生物的数量。

培养基的光密度值也能够用于评价是否已经发生了微生物生长-如果光密度没有明显的增加，则没有发生明显的微生物生长。然而，如果光密度增加了，就已经发生了微生物的生长。为了确定当暴露于抗体之后有多少微生物细胞仍然活着，可以在抗体加入的时刻(时间0)和此后有规律的间隔取出一小份培养基。将小份涂布微生物培养板，将平板在易于微生物生长的条件下进行培养，当出现克隆时，计算那些克隆数量。

B.抑制不需要的氧化

本发明还提供了改善抗体介导的活性氧类产生的负面影响的方法。

影响抗体介导的活性氧类产生的分子的用途可用于任何其中不期望的、有害的、损坏通过抗体产生的活性氧类产生的情况。在这些情况中有用的分子通常称为“抗氧化剂”，定义为对氧化剂具有拮抗剂作用的任意分子。如此定义的抗氧化剂包括1)抗体-介导的过氧化物产生的抑制剂，2)抗体-介导的过氧化氢产生的抑制剂，3)抗体-介导的臭氧产生的抑制剂，4)将过氧化氢转化为衍生活性氧化剂的反应的抑制剂；和5)活性氧类自身的抑制剂。

此类抗氧化剂包括那些抑制产生活性氧化剂的氧的活化的抗氧化剂和那些中和已经形成的氧化剂的抗氧化剂。通过包括催化作用的任意机制能够发生抗氧化剂作用。抗氧化剂作为一类分子包括氧清除剂或自由基清除剂。抗氧化剂可以是不同的类型从而如果或当需要时它们是可获得的。考虑到整个需氧有机体都存在氧，抗氧化剂在不同的细胞、组织、器官和细胞外区室都是可获得的。后者包括细胞外液空间、眼内液、滑液、脑脊液、胃肠分泌液、组织液、血液和淋巴液。抗氧化剂存在于有机体内但也可以通过补充日常饮食和通过使用本发明的方法进行提供。在一些实施方案中，所使用的抗氧化剂包括但不限于抗坏血酸、α-生育酚、γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸、γ-谷氨酰转肽酶、α-硫辛酸、二氢硫辛酸、Bacetyl-5-甲氧色胺、黄酮、黄酮烯(flavonenes)、黄烷醇、过氧化氢酶、过氧化物酶、过氧化物歧化酶、金属硫蛋白和丁羟甲苯。在其它实施方案中，在本发明方法中具有行使抗氧化剂功能的分子是工程化抗体，其中从还原性单线态氧产生超氧自由基的能力是降低的或优选地完全缺乏。此类抗体分子在此处进行描述。

抗氧化剂的用途针对一些这样的情况，其中需要抗氧化剂用来阻止、控制、最小化、降低、或抑制氧化剂或活性氧产物的损伤。因此，本发明涉及抗氧化剂用于降低抗体介导的组织例如抗体治疗位点周围的健康组织中活性氧类的产生的用途。在此类情况下，如果没有干扰，细胞损伤可以导致，例如，炎性疾病、创伤、器官移植等等。

在使用工程化抗体作为抗氧化剂的情况下，抗体由于其缺乏还原单线态氧的还原中心而已经降低或基本上不具有产生诸如过氧化物、臭氧或过氧化氢的活性氧类的能力，提供了促进目的免疫反应而不诱导过量过氧化物产生导致的额外组织损伤的治疗益处。工程化治疗抗体组合物能够保留其抗原结合位点从而靶向特定抗原，这与目的治疗利益是一致的。

本发明进一步涉及改善受试者中的氧化应激和缓解受试者症状的方法，其中症状与氧化剂的产生有关。其中使用本发明抗氧化剂抑制抗体介导的活性氧类产生的作为例证的疾病包括但不限于抑制异常平滑肌失调、抑制肝疾病、癌细胞增殖、抑制接受放射治疗的癌症患者体内的炎症反应、炎性疾病(关节炎、血管炎、肾小球肾炎、系统性红斑狼疮和成人呼吸性窘迫综合症)、缺血性疾病(心脏病、中风、肠局部缺血和再灌注损伤)、血色素沉着病、获得性免疫缺陷综合征、肺气肿、器官移植、胃溃疡、高血压、先兆子痫、神经学疾病(多发性硬化症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏疾病、肌萎缩性脊髓侧索硬化和肌肉萎缩症)、酒精中毒和吸烟相关疾病。

其中氧化应激对其是有害的细胞包括但不限于内皮细胞、间质细胞、上皮细胞、肌肉细胞(平滑肌、骨骼肌或心肌)、吞噬细胞(包括嗜中性粒细胞和巨噬细胞)、白细胞、树突状细胞、结缔组织和神经系统细胞。受影响的组织包括但不限于肌肉、神经、皮肤、腺体、间充质、脾脏、实体的、上皮的和内皮的组织。

描述抗氧化剂和氧清除剂用于治疗氧化应激所诱导的多种状况，而不描述与通过如本发明中所述的抗体产生氧化剂相关状况的有用的参考文献包括美国专利5,362,492；5,599,712；5,637,315；5,647,315；5,747,026；5,848,290；5,994,339；6,030,611和6,040,611的公开，其专利的公开此处引用作为参考。此类参考文献支持本发明中抗氧化剂的治疗用途。

抗体

本发明提供了治疗性抗体。所有的抗体分子属于称为免疫球蛋白的血浆蛋白质家族。它们基本的结构单元免疫球蛋白折叠或结构域以多种形式用于免疫系统和其它生物识别系统中的许多分子。典型的免疫球蛋白具有四条多肽链，包含称作可变区的抗原结合区，并且包含称作恒定区的非可变区域。考虑用于本发明的抗体能够是多种形式中的任何一种，包括完整免疫球蛋白、Fv、Fab、F(ab′)₂其它片段、或包括可变结构域互补决定区(CDR)的单链抗体或其它形式。所有这些术语均包括于如此处所使用广义的术语“抗体”范围内。本发明涉及任何特异性的抗体、多克隆或单克隆的用途，并且不限于那些识别特异抗原并与其起免疫反应的抗体。在优选的实施方案中，在此处所述的治疗和筛选方法内容中，使用了对抗原是免疫特异性的抗体或其片段。

如用于本发明的术语“抗体”包括完整分子及其片段，例如能够结合表位的Fab，F(ab′)₂和Fv。这些抗体片段保留了一些与其抗原或受体选择性结合的能力并且定义如下：

(1)Fab，该片段包含抗体分子的单价抗原结合片段，能够通过用木瓜蛋白酶消化整个抗体以产生完整的轻链和一条重链的一部分而产生；

(2)Fab’，能够通过用胃蛋白酶处理完整抗体，随后进行还原，以产生完整的轻链和一部分重链所得到的抗体分子的片段；从每个抗体分子得到两个Fab’片段；

(3)F(ab′)₂，经用胃蛋白酶处理完整抗体但随后不进行还原处理所得到的抗体片段；F(ab′)₂是通过二硫键结合在一起的两个Fab’片段的二聚体；

(4)Fv，定义为包含表达为两条链的轻链可变区和重链可变区的遗传工程片段；和

(5)单链抗体(“sFv”)，定义为包含轻链可变区，重链可变区，并用一个适当的多肽接头连接在一起作为遗传学融合单链分子的遗传工程分子。

多克隆抗体的制备对于本领域那些技术人员而言是众所周知的。参见，例如，Green等，多克隆抗血清的产生，于：免疫化学方法(Manson，编辑)，1-5页(Humana出版社)；Coligan等，在兔、大鼠和仓鼠中多克隆抗血清的产生，于：免疫学最新方法，第2.4.1节(1992)，这些都此处引用作为参考。

单克隆抗体的制备也是常规的。参见，例如，Kohler和Milstein，Nature，256：495(1975)；Coligan等，第2.5.1-2.6.7节；和Harlow等，于：抗体：实验室手册，726页(冷泉港出版社(1988))，这些都此处引用作为参考。单克隆抗体能够通过多种良好建立的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化得到。此类分离技术包括使用蛋白A琼脂糖凝胶的亲和层析、大小排阻色谱法和离子交换层析。参见，例如，Coligan等，第2.7.1-2.7.12节和第2.9.1-2.9.3节；Barnes等，免疫球蛋白G(IgG)的纯化，于：分子生物学方法，第10卷，79-104页(Humana出版社(1992)。

本发明还涉及工程化治疗性分子，包括已经改变为含有额外还原中心的工程化抗体。当不存在足够量的抗体或活性氧类时能够使用此类工程化抗体分子。此类工程化治疗性分子能够进行设计以具有相对于在分子或抗体中天然存在的那些还原中心而言数量增加的还原中心。

工程化分子或抗体中的还原中心的导入是通过本领域每个普通技术人员众所周知的方法实现的。先前已经描述了包括重组表达方法和直接蛋白质合成方法在内的优选方法。方法的选择必须依赖于进行工程化的分子的长度。不管所用的方法，工程化还原中心的位置即定位是基于工程化分子呈现对单线态氧的还原活性的能力。优选地是，对掺入的还原中心进行定位以至于它们深深地埋入折叠的分子中因此保留并提高活性氧类的产生。在一个实施方案中，工程化抗体保留抗原结合功能，并且工程化还原中心的定位靠近于可变结合结构域。在某些方面，涉及到一个还原中心。在其它方面，涉及两个还原中心。然而，在其它方面，还涉及三个以上还原中心。优选地是，还原中心包含吲哚。还涉及到具有诸如存在于色氨酸残基内的具有吲哚部分的还原中心。涉及到用于本发明的将此类还原中心设计入分子或抗体内的任意技术。在优选的实施方案中，通过对编码工程化抗体的核苷酸序列进行定点突变从而使取代的核苷酸在编码分子中的预定位置编码色氨酸残基而进行还原中心的导入。

在制备诸如抗体的工程化分子使其包含目的还原中心的实施方案中，通过重组技术产生的分子也被考虑以融合结合物的形式存在，其中结合物能够提供如此处所述的敏化分子用于如此处所述的治疗方法。

工程化抗体或其它分子，它们可以是含有根据本发明方法行使功能的还原中心的任意蛋白质或多肽和/或敏化分子，也考虑用于如此处所述的任意方法。

体内或体外操作单克隆抗体的方法是本领域技术人员众所周知的。一种特定的操作涉及通过重组方式人源化单克隆抗体产生含有人特异的且可识别序列的抗体的方法。参见，如综述，Holmes等，J.Immunol.，158：2192-2201(1997)和Vaswani等，Annals Allergy，Asthma & Immunol.，81：105-115(1998)。

制备抗体片段的方法是本领域已知的(参见例如，Harlow和Lane，抗体：实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，(1988)，此处引用作为参考)。通过抗体的蛋白水解作用或通过在大肠杆菌中表达编码片段的DNA能够制备本发明的抗体片段。通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗体的常规消化方法能够获得抗体片段。例如，通过用胃蛋白酶酶裂解抗体提供表示为F(ab’)₂的5S片段能够产生抗体片段。该片段能够使用巯基还原剂和任选地来自二硫键断裂的巯基阻断基进行进一步裂解，以产生3.5S Fab’单价片段。另外，使用胃蛋白酶的酶裂解直接产生两个单价Fab’片段和一个Fc片段。这些方法描述于例如美国专利4,036,945和4,331,647中和其中引用的参考文献。这些专利作为整体此处引用作为参考。

也可以使用其它裂解抗体的方法，例如分离重链形成单价轻-重链片段、进一步裂解片段、或其它酶学、化学或遗传学技术，只要片段结合至通过完整抗体所识别的抗原。例如，Fv片段包含V_H和V_L链的联合体。这种联合可以是非共价的或者可变链能够通过分子间二硫链连接或通过诸如戊二醛的化合物进行交联。优选地是，Fv片段包含由肽接头连接的V_H和V_L链。这些单链抗原结合蛋白质(sFv)是通过构建包含编码由寡核苷酸连接的V_H和V_L结构域的DNA序列的结构基因进行制备的。将结构基因插入表达载体，随后将其导入诸如大肠杆菌的宿主细胞。重组体宿主细胞合成具有跨接两个V结构域的接头肽的单一多肽链。产生sFv的方法描述于例如Whitlow等，方法：酶学方法指南，第2卷，97页(1991)；Bird等，Science，242：423-426(1988)；Ladne等，美国专利No.4,946,778；和Pack等，Bio/Technology，11：1271-77(1993)。

抗体片段的另一种形式是编码单一互补性决定区(CDR)的肽。CDR肽(“最小识别单位”)能够通过构建编码目的抗体的CDR的基因获得。例如，通过利用聚合酶链式反应从产抗体细胞的RNA合成可变区制备此类基因。参见，例如，Larrick等，方法：酶学方法指南，第2卷，106页(1991)。

本发明涉及非人(例如鼠)抗体的人或人源化形式。此类人源化抗体是含有来源于非人免疫球蛋白的最低限度序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)₂或抗体的其它抗原结合亚序列)。人源化抗体的绝大部分是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体互补决定区(CDR)的残基由来自诸如小鼠、大鼠或兔且具有预期特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体)CDR的残基所代替。

在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv骨架残基是由相应的非人残基替换的。而且，人源化抗体可以包含既没在受体抗体中发现也没在导入的CDR或构架序列中发现的残基。进行这些修饰以进一步精细和最适化抗体特性。一般而言，人源化抗体将基本上包含全部至少一个，并且一般为两个可变结构域，其中全部或基本上全部CDR区对应非人免疫球蛋白的CDR区并且全部或基本上全部FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体也将最适地包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)、一般为人免疫球蛋白的恒定区。对于进一步的细节，参见：Jones等，Nature321，522-525(1986)；Reichmann等，Nature 332，323-329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2，593-596(1992)；Holmes等，J.Immunol.，158：2192-2201(1997)和Vaswani等，Annals Allergy，Asthma & Immunol.，81：105-115(1998)。

本发明还提供了突变抗体以最适化其亲和力、选择性、结合强度、活性氧类产生或其它预期特性的方法。突变体抗体指抗体的氨基酸序列变体。一般而言，突变体抗体中一个或多个氨基酸残基不同于存在于参照抗体中的氨基酸残基。此类突变体抗体必须与参照氨基酸序列具有少于100％的序列同一性或相似性。一般而言，突变体抗体与参照抗体重链或轻链可变结构域的氨基酸序列具有至少75％的氨基酸序列同一性或相似性。优选地为，突变体抗体与参照抗体重链或轻链可变域的氨基酸序列具有至少80％，更加优选地为至少85％，甚至更加优选地为至少90％，和最优选地为至少95％的氨基酸序列同一性或相似性。

突变抗体的一种方法涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。使用噬菌体展示的亲和力成熟是指描述于Lowman等，Biochemistry 30(45)：10832-10838(1991)中的方法，也参见Hawkins等，J.Mol Biol.254：889-896(1992)。尽管不严格限制于以下描述，但该方法能够简单描述为：为了在每个位点产生全部可能的氨基酸替换，在多个不同位点突变几个抗体高变区。如此所产生的抗体突变体以单价形式显示为来自丝状噬菌体颗粒的融合蛋白质。融合物通常制备成M13基因III产物。噬菌体表达的多种突变体能够通过几轮对于目的性状例如结合亲和力或选择性的筛选进行循环。将目的突变体进行分离并测序。此类方法更加详细地描述于美国专利5,750,373、美国专利6,290,957和Cunningham，B.C.等，EMBO J.13(11)，2508-2515(1994)。

本发明治疗性抗体(或其片段)的制备能够通过重组表达技术和蛋白质合成实现，其方法是本领域每个普通技术人员众所周知的。对于重组体方法，能够通过多种方法建立编码抗体或其片段的核酸的突变体，但是最常规地是使用诱变寡核苷酸构建，该方法设计为在预定位点处导入突变，然后其将在所表达的分子中编码改变的氨基酸序列。此类改变包括特定核苷酸序列替换、添加和/或删除，这些改变后的序列同样编码所编码的氨基酸残基序列的替换、添加和/或删除。定点诱变(也称为寡核苷酸靶向诱变及其它形式)和所改变基因的随后克隆是众所周知的技术(Sambrook等，分子克隆：实验室手册，第2版，第15章，冷泉港实验室出版社，(1989))。另一种重组方法包括通过组合长寡核苷酸链并随后将其退火转化为适于克隆和表达的双链DNA来合成编码本发明治疗分子的基因(Ausebel等，分子生物学最新方法，第10和15单元，Wiley and Sons，Inc.(2000))。此类技术能够用于产生含有还原中心的工程化分子并能够从单线态氧产生过氧化氢或超氧化物。关于过氧化氢，认为此类工程化分子能够基于抗体结构和T-细胞受体进行设计。

因此，本发明涉及已经进行工程化以在预期位点产生更多超氧自由基、臭氧或过氧化氢。将抗体进行工程化以含有额外的还原中心，如此处实施例I和II所述，还原中心增加单线态分子氧还原为超氧自由基或过氧化氢。本发明还涉及已经进行工程化使其具有至少一种已降低的从单线态氧产生超氧自由基或过氧化氢的能力的抗体。在后一情况下，抗体缺乏至少一个其还原中心并且优选地为基本上无还原中心。使用本领域普通技术人员众所周知的方法能够容易地制备此类抗体组合物。

如果期望，能够将制备用作治疗组合物或用于本方法的多克隆或单克隆抗体进一步纯化，例如，通过结合至基质并从基质上洗脱，其中在基质上结合了引起抗体产生的多肽或肽。本领域的技术人员将知道免疫学领域中通常用于纯化和/或浓缩多克隆抗体和单克隆抗体的各种技术(Coligan等，第9单元，免疫学最新方法，Wiley Interscience，(1991))。

组合物

本发明的抗体、抗氧化剂和氧清除剂可以制成多种适当的组合物。此类药物组合物能够以多种适合于所选择的施用途径，即口服或肠胃外施用，通过静脉内注射、肌内注射、局部或皮下途径。

当化合物例如抗氧化剂和氧清除剂化合物足够碱或酸以形成稳定无毒酸或碱盐情况下，将此类化合物作为盐进行施用是适当的。可药用盐的例子是由能形成生理上可接受阴离子的酸形成的有机酸加成盐，例如甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐和α-甘油磷酸酯。也可以形成合适的无机盐，包括盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、重碳酸盐和碳酸盐。

使用本领域熟知的标准程序，例如将诸如胺的足够碱的化合物与提供可生理用阴离子的适当酸进行反应，可以得到可药用盐。也可以制备碱金属(例如钠、钾或锂)或碱土金属(例如钙)的羧酸盐。

从而，本发明的抗体和化合物可以进行全身性的施用，例如与诸如惰性稀释剂或可同化可食用载体的可药用赋形剂组合口服。它们可以包封在硬的或软的明胶胶囊外壳中，可以压制成片剂，或直接掺入到病人的食物中。对于口服治疗给药，抗体、抗氧化剂和氧清除剂可以与一种或多种赋形剂结合并以可吸收的片剂、含片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬液、糖浆剂、糯米纸囊剂等等形式使用。此类组合物和制剂应该包含至少0.1％的活性化合物。此类组合物和制剂当然可以是可变的并且方便的在给定单位剂型重量的大约2％至大约60％之间。在此种治疗上有用的组合物中抗体、抗氧化剂和氧清除剂的量是那些可以得到有效剂量水平的量。

片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等等还可以包含以下可以加入的成分：诸如西黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶的粘合剂；诸如磷酸氢二钙的赋形剂；诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等等的崩解剂；诸如硬脂酸镁的润滑剂；和诸如蔗糖、果糖、乳糖或天冬酰苯丙氨酸甲酯的甜味剂或诸如薄荷、冬青油或樱桃调味料的调味剂。当单位剂型是胶囊时，除了上述类型的物质外，它可以含有诸如植物油或聚乙二醇的液态载体。其它多种物质可以作为包衣存在或改变固体单位剂型的物理形状。例如，可以将片剂、丸剂或胶囊剂用明胶、蜡、虫胶或糖等等包衣。糖浆或酏剂可包含活性化合物、作为甜味剂的蔗糖或果糖、作为防腐剂的羟苯甲酸甲酯和羟苯甲酸丙酯、诸如樱桃或橙香味的染料和调味料。当然，用于制备任何单位剂型的任何材料都应当是可药用的并且所使用的量基本上是无毒的。此外，活性成分可以掺入到持续释放的制剂或设备中。

对于创伤的治疗，可以采用对受试者的创伤进行局部应用。含有抗体的组合物能够直接应用于伤口或者先施用于绷带上然后应用于伤口上。

活性化合物还可以通过灌注或注射从静脉内或腹膜内施用。活性化合物或其盐的溶液可以制备于水中，任选地与无毒的表面活性剂混合。分散体还能够制备于甘油、液体聚乙二醇、醋酸甘油和其混合物中和油中。在通常的储存和使用条件，这些制剂包含阻止微生物生长的防腐剂。

适于注射或灌注的药物剂型可以包括包含活性成分的无菌水溶液或分散剂或无菌粉剂，这些活性成分适于临时制备无菌注射或灌注溶液或分散剂，任选地包封于脂质体中。在所有情况下，在制造和储存的条件下最终的剂型应该是无菌的、流质的和稳定的。液态载体或媒介物可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等等)、植物油、无毒甘油酯和其适当混合物的溶剂或液体分散介质。其适当的流动性可以通过，例如，脂质体的形成、在分散剂中维持所需颗粒大小或者使用表面活性剂来维持。通过多种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、三梨酸、硫柳汞等等能够阻止微生物的作用。在许多情况下，包括等渗试剂，例如糖、缓冲液或氯化钠将是优选的。通过在可注射的组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶，能够引起对可注射组合物的延长吸收。

通过将抗体、抗氧化剂或氧清除剂以需要的量掺入到具有如上述列举的其它成分的合适溶剂中，根据需要，然后过滤除菌来制备无菌可注射溶液。至于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，该技术产生抗体、抗氧化剂或氧清除剂加上存在于先前过滤灭菌溶液中的任何额外目的成分的粉末。

对于局部施用，可以将抗体、抗氧化剂或氧清除剂以纯化形式，即其为液体时，进行施用。然而，它们通常期望作为组合物或制剂，与可以是固体或液体的皮肤可接受的载体组合在一起施用于皮肤上。

有用的固体载体包括诸如滑石粉、粘土、维晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等等细的固体。有用的液体载体包括水、醇类或乙二醇或水-醇/乙二醇混合物，其中本发明的抗体、抗氧化剂或氧清除剂能够以有效水平进行溶解或分散，任选地借助于无毒表面活性剂。为了优化用于特定用途的特性，可以添加例如芳香剂的佐剂和额外的抗微生物剂。所得到的液体组合物可以从用于浸透绷带和其它敷料的吸收剂垫中应用，或使用泵型或气雾剂型喷雾器喷雾于受影响区域。

为了直接施用于使用者的皮肤，诸如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、修饰的纤维素或修饰的矿物材料的增稠剂也可以与液体载体一起使用以形成可以被涂开的糊剂、凝胶、软膏等等。

能够用于将本发明抗体、抗氧化剂或氧清除剂递送到皮肤的有用的皮肤病用组合物的例子是本领域熟知的；例如，参见Jacquet等(美国专利No.4,608,392)，Geria(美国专利No.4,992,478)，Smith等(美国专利No.4,559,157)和Wortzman(美国专利No.4,820,508)。

本发明抗体、抗氧化剂或氧清除剂的有用剂量能够通过比较其体外活性和在动物模型内的体内活性来确定。在小鼠和其它动物中的有效剂量外推至人的方法是本领域熟知的；例如，参见美国专利No.4,938,949。

一般而言，在诸如洗剂的液体组合物中本发明的抗体、抗氧化剂或氧清除剂的浓度可以为大约0.1-25重量％，优选地为大约0.5-10重量％。在诸如凝胶或粉末的半固体或固体组合物中浓度将为大约0.1-5重量％，优选地为大约0.5-2.5重量％。

用于治疗所需的抗体、抗氧化剂或氧清除剂、或其活性盐或衍生物的量不但随着所选定的特定盐而变化，而且随着施用途径、被治疗病情的性质和病人的年龄和病情而变化并且最终由主管医师或临床医师作出判断。

然而，一般而言，适当剂量将在从大约0.5到大约100mg/kg范围内，即从每天大约10到大约75mg/kg体重，例如每天3到大约50mg每公斤受试者体重，优选地在6-90mg/kg/天范围内，最优选地在15-60mg/kg/天范围内。

抗体、抗氧化剂或氧清除剂以单位剂型方便地进行施用；例如，含有5-1000mg，适当地为10-750mg，最适当地为50-500mg活性成分/单位剂型。

理想地为，抗体、抗氧化剂或氧清除剂将施用至达到活性化合物血浆浓度峰值从大约0.5到大约75μM，优选地为，大约1-50μM，最优选地为，大约2到大约30μM。这可以通过，例如，静脉内注射0.05-5％的抗体、抗氧化剂或氧清除剂溶液，任选地以盐形式，或者作为含有大约1-100mg抗体、抗氧化剂或氧清除剂的大丸剂口服施用而达到。通过连续输注以提供大约0.01-5.0mg/kg/小时或者通过周期性灌注含有大约0.4-15mg/kg抗体、抗氧化剂或氧清除剂来维持预期血液浓度水平。

目的剂量可以方便地以单一剂量呈现或者作为以适当的间隔施用的例如每天2、3、4或更多亚剂量的分份剂量呈现。亚剂量本身可以进一步再分，例如，分成大量不连续宽间隔给药，例如从吸入器多次吸入或向眼应用多滴滴剂。

在优选的实施方案中，抗氧化剂进入细胞并与活性氧类反应，从而降低细胞中活性氧类的浓度。在另一个实施方案中，抗氧化剂进入细胞或存在于周围的细胞外环境中并与活性氧类产生的氧化剂反应。

本发明的治疗组合物，此处所述的抗氧化剂，将抗体(其包括工程化抗体的抗体和此处所述用于促进抗体活性的额外还原中心的其它分子)以与剂型相一致的模式和治疗有效剂量进行施用。施用量和周期取决于接受治疗的受试者、受试者身体利用活性成分的能力和所预期的治疗效果的程度。需要施用的活性成分的精确数量依赖于从业者的判断并且对每一个个体都是特殊的。然而，用于不同应用类型的适宜剂量范围依赖于施用途径。对于施用的适宜给药方案也是可变的，但是典型的是初次施用后接着在一定时间间隔重复剂量施用以致于达到治疗处理所期望的结果。

考虑用于本发明的抗体、抗氧化剂或氧清除剂能够以诸如脂质体的组合物形式递送至目的位点以介导预期结果，脂质体的制备对于脂质体介导递送领域的每个普通技术人员是众所周知的。其它递送方式包括但不限于静脉内施用、局部、口服、通过吸入、通过插管、腔内、肌内、经皮和皮下施用。

本发明的治疗组合物包含与此处所述抗氧化剂一起的可药用载体和此处所述用于提供抗体活性的抗体，它们作为活性成分溶解或分散于其中。在一个优选地实施方案中，当为了治疗目的施用于哺乳动物或人类患者时治疗组合物不具有免疫原性。

包含溶解或分散于其中的活性成分的药物组合物制剂是本领域众多周知的并且不需要根据剂型加以限制。一般此类组合物制备成可注射的液体溶液或混悬液，然而，也可以制备成适用于溶液或混悬液的在使用前溶于液体的固体形式。制剂也可以是乳化的。

可以将活性成分与可药用的且与活性成分相容的赋形剂相混合，并且以适宜的量用于此处所述的治疗方法。合适的赋形剂是，例如，水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，如果期望，组合物可以含有微量辅助物质诸如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂等等，以增强活性成分的效力。

本发明的治疗组合物可以包括其中的可药用盐组分。可药用盐包括与诸如盐酸或磷酸的无机酸或诸如乙酸、酒石酸、扁桃酸等等的有机酸形成的酸加成盐(与多肽的游离氨基形成)。与游离羧基形成的盐还可以从例如钠、钾、铵、钙或氢氧化铁的无机碱，和诸如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等的有机碱得到。

生理可耐受的载体在本领域是熟知的。作为例证的液体载体是除了活性成分和水外不含其它物质的水溶液，或含有诸如在生理pH值的磷酸钠的缓冲液、生理盐水或两者例如磷酸缓冲盐水的水溶液。更进一步，液体载体可以包含一种以上缓冲盐、以及诸如氯化钠和氯化钾的盐、右旋糖、聚乙二醇和其它溶质。

液体组合物还可以包含除了水外的并且与水不相容的液相。此种额外液相的例子是甘油、例如棉子油的植物油和水-油乳剂。

可受益于抗氧化剂对细胞、组织、或器官和细胞外区室中抗体介导的氧化剂产生的抑制作用的其它治疗疾病是本领域那些普通技术人员众所周知的，并且已经由McCord，Am.J.Med.，108：652-659(2000)和Babior等，Am.J.Med.，109：33-44(2000)进行综述，其公开此处引用作为参考。

通过参考下面的非限定性实施例来进一步详细描述本发明。当以其某些优选的实施方案作为参考进行详细描述本发明时，可以认识到修饰和变化处于所描述和要求保护的精神和范围内。

实施例I

具有内在破坏抗原能力的抗体材料和方法

抗体：下面完整抗体均从PharMingen获得：49.2(小鼠IgG_2b κ)，G155-178(小鼠IgG_2a κ)，107.3(小鼠IgG₁ κ)，A95-1(大鼠IgG_2b)，G235-2356(仓鼠IgG)，R3-34(大鼠IgG κ)，R35-95(大鼠IgG_2a κ)，27-74(小鼠IgE)，A110-1(大鼠IgG₁ λ)，145-2C11(仓鼠IgG1κ)，M18-254(小鼠IgA κ)和MOPC-315(小鼠IgA λ)。下面抗体从Pierce获得：31243(绵羊IgG)，31154(人IgG)，31127(马IgG)和31146(人IgM)。

下面的F(ab’)₂片段从Pierce获得：31129(兔IgG)，31189(兔IgG)，31214(山羊IgG)，31165(山羊IgG)和31203(小鼠IgG)。A蛋白，G蛋白，胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶抑制剂(包曼-毕尔克抑制剂)，β-乳球蛋白A，α-乳清蛋白，肌红蛋白，β-半乳糖苷酶，鸡卵清蛋白，抑酶肽，胰蛋白酶原，凝集素(花生)，凝集素(Jacalin)，牛血清白蛋白，超氧化物歧化酶和过氧化氢酶从Sigma获得。核糖核酸酶IA从Amersham Pharmacia得到。以下的免疫球蛋白是使用杂交瘤技术内部获得：OB2-34C12(小鼠IgG₁κ)，SHO1-41G9(小鼠IgG₁ κ)，OB3-14F1(小鼠IgG_2a κ)，DMP-15G12(小鼠IgG_2a κ)，AD1-19G1(小鼠IgG_2b κ)，NTJ-92C12(小鼠IgG₁ κ)，NBA-5G9(小鼠IgG₁ κ)，SPF-12H8(小鼠IgG_2a κ)，TIN-6C11(小鼠IgG_2a κ)，PRX-1B7(小鼠IgG_2a κ)，HA5-19A11(小鼠IgG_2a κ)，EP2-19G2(小鼠IgG₁ κ)，GNC-92H2(小鼠IgG₁ κ)，WD1-6G6(小鼠IgG₁ κ)，CH2-5H7(小鼠IgG_2b κ)，PCP-21H3(小鼠IgG₁ κ)和TM1-87D7(小鼠IgG₁ κ)。DRB多克隆(人IgG)和DRB-b12(人IgG)由Dennis R.Burton(Scripps研究所)提供。1D4 Fab(结晶的)由Ian A.Wilson(Scripps研究所)提供。

所有的测定方法都是在PBS(10mM磷酸盐/160mM氯化钠，pH 7.4)中进行的。根据需要，商品化的蛋白质溶液样品在PBS中进行透析。除臭剂红过氧化氢测定试剂盒(A-12212)从Molecular Probes得到。

抗体/蛋白质照射。除非特别说明，测定溶液(100μl，6.7μM蛋白质溶于PBS，pH 7.4)加入到玻璃瓶中，用螺旋帽密封并用紫外(312nm，8000μWcm^-2Fischer-Biotech透照灯)或可见光进行照射。

过氧化氢的定量测定。将一份(20μl)从蛋白质溶液中取出并加入到含有反应缓冲液(80μl)的96-孔微孔板(Costar)的一个孔中。然后加入工作液(100μl/400μM除臭剂红试剂1/2单位/毫升辣根过氧化物酶)并且在暗处孵育30分钟。然后使用CytoFluor微孔板阅读仪(4000型，PerSeptive Biosystems，Framingham，MA；激发/发射：530/580nm)测定孔中组分的荧光。使用标准曲线确定过氧化氢的浓度。所有实验重复进行，并且形成速率以至少两次测量的平均值来提供。

敏化作用和猝灭测定。将溶于PBS(pH 7.4，4％二甲基甲酰胺)中31127溶液(100μl马IgG，6.7μM)和血卟啉IX(40μM)放置于近光带处。如此处所描述对过氧化氢浓度进行测定。测定还在D₂O中有NaN₃(100mM)或PBS存在的情况下进行。

氧依赖。使用冻/融方法在氩环境下将溶于PBS(pH 7.4)中的31127(1.6mi，马IgG，6.7μM)溶液严格除气。通过注射器将一份(100μl)导入已经用适当O₂/Ar混合物(0-100％)清除的用隔封闭的玻璃瓶中。用Orion862A溶解氧测量计测定溶解氧含量。将这些溶液剧烈涡旋混匀，放置20分钟，然后再次涡旋混匀。在实验过程中使用含必需O₂/Ar混合物的注射器以维持大气压。用气体密闭的注射器取出一份(20μl)并用此处所述的方法测定过氧化氢的浓度。用酶动力学(Enzyme Kinetics)v1.1计算机程序(用于确定参数V_max和K_m)将三次单独实验取得的数据进行比较和分析。

使用化学¹O₂源，在黑暗中由抗体产生过氧化氢.将溶于PBS(pH 7.4)中的绵羊IgG 31243(100μl，20μM)溶液和3，3N-(1，4-亚萘基)二丙酸二钠(25mM溶于D₂O)内过氧化物置于黑暗的温室中(37EC)30分钟。用此处所述的方法测定过氧化氢浓度。

通过Fab1D4晶体的过氧化氢形成。将1D4 Fab片段的晶体混悬液(2μl)用PBS(198μl，pH 7.4)进行稀释并轻轻地涡旋混匀。离心之后，将上情液取出，并且进一步重复2次洗涤步骤。然后将所剩余的晶体混悬液用PBS，pH 7.4(100μl)进行稀释，并且加入到石英ELISA板的一个孔中。在紫外线照射30分钟后，加入除臭剂红工作溶液(100μl)，并且在荧光显微镜上察看混合物。

抗体荧光与过氧化氢形成。将溶于PBS(pH 7.4)的31127(1.0ml马IgG，6.7μM)溶液置于石英容器中并且用紫外光照射40分钟。以10分钟的间隔，用SPF-500C荧光分光光度计(SLM-Aminco，Urbana，IL；激发/发射，280/320)测定溶液的荧光。在同一时间点，取出一份(20μl)溶液，并且用此处所述的方法测定过氧化氢的浓度。

通过过氧化氢酶对过氧化氢的消耗。将EP2-19G12溶液(100μl小鼠IgG，以20μM的浓度溶于PBS，pH 7.4)用紫外光照射30分钟，在此时间之后用结合试验(stick test)(EM Quant Peroxide Test Sticks)确定过氧化氢的浓度为2毫克/升。加入过氧化氢酶[1μl，Sigma，3.2M(NH₄)₂SO₄，pH 6.0]，并且1分钟后发现H₂O₂的浓度达到0毫克/升。

变性。将Eppendorf管中的IgG 19G12(100μl，6.7μM)加热至100EC 2分钟。将最终的溶液转移至玻璃的、螺口小瓶中并且用紫外线照射30分钟。30分钟后测定H₂O₂的浓度。

结果和讨论

通过一组完整免疫球蛋白和抗体片段的过氧化氢起始形成速率的测量值收集于表1。据信Ig-产生的O₂ ^●-可以发生自发岐化作用变成H₂O₂，然后H₂O₂和N-乙酰基-3，7-二羟基吩嗪1(除臭剂红)作为协同底物被辣根过氧化酶利用，以产生高荧光的9-羟基-3-异吩噁唑酮2(最大激发563nm，最大发射587nm)(图2)(Zhou，M.，Diwu，Z.，Panchuk-Voloshina，N.和Haugland，R.P.，Anal.Biochem.，253，162-168(1997))。为了证实对缓冲液的照射不能够产生O₂ ^●-并且抗体不是简单地充当蛋白质歧化酶而起作用(Petyaev，I.M.和Hunt，J.V.，Redox Report，2，365-372(1996))，将过氧化物歧化酶在PBS中被照射。在这些条件下，过氧化氢的产生速率与单独PBS照射情况下的相同。

表1.通过免疫球蛋白产生过氧化氢*

条目	克隆	来源	同种型	形成速率，^Hnmol/分钟/毫克
条目	克隆	来源	同种型	形成速率，^Hnmol/分钟/毫克	123456789101112131415161718192021	CH25H7WD16G6SHO-141G9OB234C12OB314F1DMP15G12AD19G1NTJ92C12NBA5G9SPF12H8TIN6C11PRX1B7HA519A492H219G2PCP-21H3TM1-87D749.227-74M18-254MOPC-315	小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠	IgG2b，κIgG1，κIgG1，κIgG1，κIgG2a，κIgG2a，κIgG2b，κIgG1，κIgG1，κIgG2a，κIgG2a，κIgG2a，κIgG1，κIgG1，κIgG1，κIgG1，κIgG1，κIgG2b，κIgE，标准同种型IgA，κIgA，λ	0.250.240.260.220.230.180.220.170.170.290.240.220.200.410.200.970.280.240.360.390.39

条目	克隆	来源	同种型	形成速率，^Hnmol/分钟/毫克
条目	克隆	来源	同种型	形成速率，^Hnmol/分钟/毫克	222324252627282930313233343536373839	31203b12多克隆3115431146R3-34R35-95A95-1A110-1G235-2356145-2C113124331127多克隆31229311893121431165	小鼠人人人人大鼠大鼠大鼠大鼠仓鼠仓鼠绵羊马马兔兔山羊山羊	F(ab’)₂IgGIgGIgGIgMIgG1，κIgG2a，κIgG2bIgG1，λIgGIgG，gp1，κIgGIgGIgGF(ab’)₂F(ab’)₂F(ab’)₂F(ab’)₂	0.210.450.340.180.220.270.170.150.340.240.270.200.180.340.190.140.240.25

*测定条件在材料和方法中描述。

^H至少2次测定的平均值。在PBS中H₂O₂的背景形成速率是0.005nmol/分钟并且在有SOD存在时在PBS中H₂O₂的背景形成速率是0.003nmol/分钟。

至于在环境条件下(275μM)PBS中的氧浓度，对于超过10％的反应过氧化氢形成速率是线性的。在得到足够氧的情况下，每个抗体分子可以产生至少40当量H₂O₂而活性上或结构片段上没有明显的减少。在存在或缺乏抗体19G2时过氧化氢形成的起始时间过程的例子示于图3A。随后通过加热使得蛋白质变性该活性丧失了。

表1中的数据显示抗体从¹O₂产生H₂O₂的普遍的能力。好像多种物种共享此种功能并且该种能力不依赖于所研究重链和轻链组分或抗原特异性。对于完整抗体的过氧化氢形成的起始率是高度保守的，在整组中变化从0.15纳摩尔/分钟/毫克[克隆A95-1(大鼠IgG2b)]到0.97纳摩尔/分钟/毫克(克隆PCP-21H3，鼠单克隆IgG)。虽然可得到的信息更加局限于组分抗体片段，该活性好像在Fab和F(ab’)₂片段中均存在。

如果该活性是由于污染造成的，那么活性将存在于从不同来源得到的所有抗体或抗体片段。然而，为了进一步排除污染，从中得到高分辨率x-射线结构(在1.7D)的鼠抗体1D4 Fab晶体被用来研究它们产生H₂O₂的能力(图4)。在这些晶体中清晰地观察到了¹O₂的还原。

对此种抗体转化的研究支持单线态氧作为中间体被还原。无论是存在还是不存在紫外线照射，抗体在缺氧条件下不会发生过氧化氢的形成。而且，在环境有氧条件下而没有照射时过氧化氢的产生不会发生。在水溶液中存在已知的³O₂的光敏剂血卟啉(HP)(Kreitner，M.，Alth，G.，Koren，H.，Loew，S.和Ebermann，R.，Anal.Biochem.，213，63-67(1993))的情况下用可见光照射抗体导致过氧化氢的形成(图5A)。所观察到的形成速率曲线存在弯曲是因为在测定混合物中存在氧的消耗。对光激发的HP和氧的相互作用会导致O₂ ^●-的形成(Beauchamp，C.和Fridovich，I.，Anal.Biochem.，44，276-287(1971)；Srinivasan，V.S.，Podolski，D.，Westrick，N.J.和Neckers，D.C.，J.Am.Chem.Soc.，100，6513-6515(1978))的担心可以通过使用只有敏化剂的适当背景实验而大大消除(数据示于图5A)。使用HP和可见光使得H₂O₂有效形成再次肯定了¹O₂的中间体地位并且表明对于Ig实现该还原功能而言紫外线照射不是必需的。

此外，将绵羊抗体31243在黑暗中37EC条件下与¹O₂的化学源[内过氧化物3N，3N-(1，4-亚萘基)二丙酸盐]进行孵育导致过氧化氢的形成。

通过可见光下的马IgG和HP(40μM)的H₂O₂的形成速率随着D₂O存在而增加并且随着¹O₂淬灭剂NaN₃(40mM)存在而降低(图5B)(Hasty，N.，Merkel，P.B.，Radlick，P.和Kearns，D.R.Tetrahedron Lett.，49-52(1972))。已知用D₂O替代H₂O会通过对¹O₂增加大约10倍的寿命而促进¹O₂介导的过程(Merkel，P.B.，Nillson，R.和Kearns，D.R.，J.Am.Chem.Soc.，94，1030-1031(1972))。

过氧化氢形成速率与IgG浓度在0.5和20μM之间成比例但是在较高浓度时开始弯曲(图5C)。由于存在反应的可能，蛋白质溶液中¹O₂的寿命预期低于在纯水中的。因此可以认为所观察到的弯曲可能是由于因为与抗体发生反应而使得¹O₂寿命降低造成的。

很明显，氧浓度对所观察到的H₂O₂产生速率的影响表明大约200μM氧的明显饱和状态(图5D)。因此，还原机制可能涉及抗体分子中一个或多个氧结合位点。通过对原始形成速率数据进行非线性回归处理并且通过拟合Michaelis-Menten方程，得到K_mapp(O₂)为187μM和V_maxapp为0.4纳摩尔/分钟/毫克。这种抗体的速率等同于所观察到的线粒体酶在体内还原分子氧的速率。

抗体还原¹O₂的机制仍处于被确定中。然而，因为在含有EDTA(4mM)的PBS中彻底透析之后抗体的活性保持不变所以金属介导的氧化还原过程的参与被大大降低了。这是抗体自身氨基酸组成的内在能力。芳香族氨基酸例如色氨酸(Trp)可以通过电子转移被¹O₂氧化(Grossweiner，L.I.，Curr.Top.Radiat.Res.Q.，11，141-199(1976))。此外，二硫化物富含能够被氧化的足够的电子(Bent.D.V.和Hayon，E.，J.Am.Chem.Soc.，87，2612-2619(1975))。因此，这里存在一种潜在的可能性，即色氨酸残基和/或所有抗体同源的链内或链间二硫键负责¹O₂的还原。为了研究抗体的这种能力在什么程度上被其它蛋白质所共享和调查还原的机制，研究了一组其它蛋白质(图6)。

与抗体相反，虽然其它蛋白质能转化¹O₂成为O₂ ^●-，但这决不是一个普遍的特性。不含有Trp残基而含有几个二硫键的RNA酶A和超氧化物歧化酶不能够还原¹O₂。相似地，含有七个二硫键而不含有Trp残基的包曼-毕尔克抑制剂(Voss，R.-H.，Ermler，U.，Essen，L.-O.，Wenzl，G.，Kim，Y.-M.和Flecker，P.，Eur.J.Biochem.，242，122-131(1996)；Baek，J.和Kim，S.，Plant Physiol.，102，687(1993))不能够还原¹O₂。相反，只含有2个Trp残基的鸡卵清蛋白(Feldhoff，R.和Peters，T.J.，Bioehem.J.，159，529-533(1976))是最有效的还原¹O₂的蛋白质之一。

考虑到当变性后抗体活性会丧失，好像关键残基在蛋白质的位置比它们的绝对数量更关键。因为为了促进结构的稳定性，蛋白质中大多数芳香族残基普遍地埋藏在内部(Burley，S.K.& Petsko，G.A.，Science，229，23-28(1985))，所以用荧光淬灭实验以表面和隐蔽的残基相对贡献的方式探究了还原过程的性质。通过吸收紫外线，特别是有致敏剂例如分子氧或臭氧存在的情况下，蛋白质中的芳香族氨基酸被修饰了(Foote，C.S.，Science，162，963-970(1968)；Foote，C.S.，Free Radicals Biol.，2，85-133(1976)；Gollnick，K.，Adv.Photochem.，6，1-122(1968))。通过[2+2]环加成作用色氨酸与¹O₂发生反应产生N-甲酰犬尿氨酸或犬尿素，已知它们都能明显淬灭所埋藏色氨酸残基的发射光(Mach，H.，Burke，C.J.，Sanyal，G.，Tsai，P.-K，Volkin，D.B.和Middaugh，C.R.蛋白质和多肽的形成和递送，著者Cleland，J.L.和Langer，R.(美国化学会，Denver，CO)(1994))。在40-分钟的照射过程中，马IgG的内在荧光快速淬灭到其原始数值的30％，然而过氧化氢的产生自始至终是线性的(r²＝0.998)(图7)。如果单线态氧的还原是由于抗体色氨酸残基，那么暴露于溶剂中的色氨酸好像比隐藏色氨酸残基的贡献程度要小。这种因素有助于解释为什么这种能力在抗体中是高度保守的。在多于99％的已知抗体中，存在2个色氨酸残基，并且都是深埋在内部的：色氨酸36和色氨酸47(Kabat，E.A.，Wu，T.T.，Perry，H.M.，Gottesman，K.S.和Foeller，C.，与免疫有关蛋白质的序列(U.S.Department of Health and human Services，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD)(1991))。

在整个自然界，生物体自身通过产生相对简单化学物质的方式进行防御。在单分子水平，这种机制被认为随着在脊椎动物中免疫系统的出现而大部被抛弃。据认为一旦靶向设施得到进化则杀灭机制就移到别处。当前的结果使得对于一些分子内的杀灭作用进行重新认识。在一定意义上，这种化学免疫系统，除了加入了更加复杂和多样的靶向成分外，类似于低等生物体内的纯化学防御机制。

考虑到理想的杀灭系统必须使用宿主分子并以降低自身损伤的局部方式进行的这样一种限制，人们很难想象到比¹O₂更公正的选择。因为既然存在了该反应分子，一个要问的重要问题就是抗体对其进一步转化的优点是什么。关键的问题是通过将暂时的单线态氧(寿命4μs)转化成更稳定的O₂ ^●-，它现在才能接近过氧化氢和它能产生的所有毒性产物。此外，超氧化物是唯一一个等同于氧清除级联反应中残留的分子氧。因此，这种“再循环”可能作为加强杀微生物过程的关键机制。单分子氧的另一个益处是它只存在于当宿主受到攻击时，因此使它成为“事件-触发的”底物。并且由于存在用于抵御的使用附属系统的可选择的途径，在许多情况下免疫系统的这种化学武器功能可能是沉默的。然而，这就是说这里会有很多疾病状态，此种状态下发现抗体和单线态氧是并列的，从而导致了细胞和组织的损伤。考虑到人类多种事件导致单线态氧的产生，抗体对其的激活可能导致从自身免疫到再灌注损伤和动脉粥样硬化的很多种疾病(Skepper等，Microsc.Res.Tech.，42，369-385(1998))。

实施例II

抗体催化水的氧化

方法和材料

结晶学：使用标准程序用木瓜蛋白酶消化IgG 4C6并且将Fab’片段进行纯化(Harlow和Lane)。将Fab’从13-18％ PEG 8K，0.2M ZnAc，0.1M二甲砷酸盐，pH 6.5中进行结晶。将晶体在氙气存在下200psi加压2分钟(Soltis等，J.Appl.Cryst.，30，190，(1997))并且随后用液氮瞬间冷却。在SSRL BL9-2上以2.0的分辨率收集数据。使用坐标通过分子置换从天然4C6结构中计算结构，并且氙原子位点从不同Fourier图上的强峰中鉴定出来。在CNS(Brünger等，Acta.Crystallogr.，D54，905(1998))中做出精细结构至最终R＝23.1％和R_free＝25.7％。当将它们的B值固定于高出环境蛋白质的B值50％之后两个氙原子的占据位点被精确定下来。在Bobscript(R.M.Esnouf，Acta Crystallog.，D55，938(1999))中产生图。

Kabat数据库扫描：为了决定在它们的结构中Trp，Tyr，Cys，Met的数目分析了人和小鼠序列的Kabat数据库。如果有太多的残基删除或缺少片段则淘汰该序列。这允许对可得的3894序列的2068条进行高度确定性分析。数值报道为C_H、V_H、C_L和V_L(κ和λ.)区域：Trp 15.5(14-31)，Tyr 30.4(13-47)，Cys 19.3(15-29)，Met 11.6(7-32)，His 13.3(8-28)的括弧内范围的平均总数。总计＝90.1(49-167)。

电感耦合等离子体原子发射光谱学：在Varian，Axial VistaSimultaneous ICP-AES光谱仪上进行mAb PCP21H3的电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)实验。将小鼠单克隆抗体(PCP21H3)完全透析入含有20mM EDTA的磷酸钠缓冲盐水(PBS，50mM pH 7.4)中。在典型的测定中，将300μL10.5％ HNO₃溶液加入到100μL10mg/mL的抗体溶液中并在70℃孵育14小时。然后用MQH₂O将该溶液稀释至2mL并且然后对照标准进行分析。ICP-AES分析结果报道为百万分之几(μg/mL)：Ag0.0026(每个抗体分子0.0072个原子)；Al 0.0098(每个抗体分子0.113个原子)；As 0.0062(每个抗体分子0.025个原子)；Ba在检测水平以下；Ca 0.0355(每个抗体分子0.266个原子)。

所观察的高Ca浓度是用于我们测定系统的磷酸盐缓冲系统的污染的结果。为了观察Ca(II)对抗体-介导的H₂O₂速率的影响，使用图8A图解说明中概括的测定过程通过加入多种浓度的CaCl₂(0-100μM)进行抗体样品的照射。发现该过程不依赖于Ca(II)浓度；Cd 0.0007(每个抗体分子0.0187个原子)；Ce 0.0012(每个抗体分子0.003个原子)；Co 0.0013(每个抗体分子0.007个原子)；Cr 0.0010(每个抗体分子0.006个原子)；Cu 0.0014(每个抗体分子0.007个原子)；Fe 0.0089(每个抗体分子0.048个原子)；Gd0.0008(每个抗体分子0.001个原子)；K 0.0394(每个抗体分子0.302个原子)；La0.0007(每个抗体分子0.002个原子)；Li 0.0013(每个抗体分子0.056个原子)；Mg 0.0027(每个抗体分子0.033个原子)；Mn 0.0007(每个抗体分子0.004个原子)；Mo 0.0023(每个抗体分子0.007个原子)；Na 102.0428(每个抗体分子1332个原子)；Ni 0.0007(每个抗体分子0.004个原子)；P14.3521(每个抗体分子138.9个原子)；Pb低于检测水平；Rb 0.0007(每个抗体分子0.002个原子)；Se低于检测水平；V 0.0109(每个抗体分子0.019个原子)；W 0.0119(每个抗体分子0.019个原子)；Zn 0.0087(每个抗体分子0.040个原子)。

氧同位素实验：在典型的实验中，将抗体(6.7μM，100μL)或非免疫球蛋白的蛋白质(50μM，100μL)在PB(160mM磷酸盐，pH 7.4)中的溶液冷冻干燥并且然后溶于H₂O₂(100μL，98％)中。在MS中要将氯化钠排除以使信号抑制降至最低。在MS测定中，为了产生可检测数量的H₂O₂，有必要使用较高浓度的非免疫球蛋白蛋白质。在密封石英试管内饱和¹⁶O₂需氧条件下用UV-透照灯20EC照射蛋白质溶液8小时。8小时后使用除臭剂红测定法测定H₂O₂浓度(Zhou等，Anal.Biochem.，253，162(1997))。然后通过离心过滤样品使其通过microcon(大小排阻过滤器)以去除蛋白质并重新测定H₂O₂浓度。加入TCEP(新鲜制备的20mM于H₂ ¹⁸O中的原液)(约相对H₂O₂2mol当量)并将其静置于37℃15分钟，这段时间后全部H₂O₂已经进行了反应。每个测定之前新鲜制备H₂ ¹⁸O中的TCEP溶液，因为¹⁸O慢慢掺入TCEP的羧酸(超过几天的时间)。在测定时间过程期间，由于该途径而没有¹⁸O掺入发生。而且，没有¹⁸O从H₂ ¹⁸O掺入¹⁶O氧化膦。249m/z处的峰是TCEP的(M-H)^-。由于在测定中使用了相对H₂O₂过量的TCEP(两倍)，在所有MS中均观察到249处的峰。

将来自蛋白质样品的重复比率的¹⁶O/¹⁸O冷冻干燥在一起是合理的(±10％)。然而，在冷冻干燥过程中去除蛋白质结合水分子的问题意味着来自不同批的冷冻干燥样品之间所观察到的比率可能是变化的，变化多至2∶1到4∶1(当从H₂ ¹⁶O冷冻干燥时)。因此，如下严格的冷冻干燥和除气操作是重要的。在这方面，由于相对易于去除蛋白质结合氧分子，¹⁸O₂和H₂ ¹⁶O实验呈现出远低于测定间的变异性。

来自不同物种的抗体在实验系统给出了相似比率，描述如下：¹⁶O∶¹⁸O：WD1-6G6 mIgG(鼠)2.1∶1；poly-IgG(马)2.2∶1；poly-IgG(绵羊)2.2∶1；EP2-19G2 mIgG(鼠)2.1∶1；CH2-5H7 mIgG(鼠)2.0∶1；poly-IgG(人)2.1∶1。比率基于两次重复实验的平均值，除了poly-IgG(马)以外，该值是10次测量的平均值。所有测定和条件如上所述。

在典型的实验中，将绵羊或马poly-IgG(6.7μM，100μL)的PB(160mM磷酸盐；pH 7.4)溶液在氩条件下脱气30分钟。然后用¹⁸O₂(90％)饱和该溶液并按如上所述进行照射。然后如文中所述进行测定和操作。

通过血卟啉IX的³O₂致敏作用测定H₂O₂的产生与¹O₂形成效率的关系：测定法是H.Sakai和共同研究者，Proc.SPIE-Int.Soc.Opt.Eng.，2371，264(1995)所研发的方法的修改方法。简而言之，使用透照灯的白光照射在PBS(50mM，pH 7.4)溶液中的马poly-IgG(1mg/mL)和血卟啉IX(40μM)。取出等份(50μL)并同时测定H₂O₂和3-氨基邻苯二甲酸的浓度。通过除臭剂红法测定H₂O₂的浓度(Zhou等，Anal.Biochem.，253，162(1997))。在使用Adsorbosphere-C18柱子的Hitachi D4000系列仪器上通过反相HPLC测定3-氨基邻苯二甲酸的浓度，UV分光光度检测器在254nm处，并且乙腈/水(0.1％ TFA)18∶82的流动相流速为1mL/分钟(鲁米诺保留时间＝7.4分钟且3-氨基邻苯二甲酸保留时间3.5分钟)。通过与对照样品比较峰高和峰面积进行比较测定鲁米诺和3-氨基邻苯二甲酸的浓度。实验数据产生了由血卟啉IX形成的¹O₂的量(直接与所形成的3-氨基邻苯二甲酸的量成比率)和由抗体形成的H₂O₂的量。在白光下不含血卟啉IX的抗体不形成有意义量的¹O₂。

对除臭剂红测定可以测定除了H₂O₂之外的蛋白质-过氧化物衍生物的担心减少，因为使用该方法测定的表观H₂O₂浓度不依赖于是否从样品中去除照射的蛋白质(通过大小排阻过滤)。

量子化学方法：全部QC计算是使用Jaguar[Jaguar 4.0，Schrdinger，有限公司，Portland，Oregon，1998.见B.H.Greeley，T.V.Russo，D.T.Mainz，R.A.Friesner，J.-M.Langlois，W.A.Goddard III，R.E.Donnelly，J.Chem.Phys.，101，4028(1994)]利用密度功能理论(DFT)的B3LYP flavor进行的[J.C.Slater于分子和固体的量子理论，第4卷：分子和固体的自相一致的场，McGraw Hill，New York，(1974)]，其包括泛化的梯度近似值和精确的互变。6-31G**基础设定用于全部原子。所有几何图完全最适化。计算震动频率以保证每个最小值是真实的局域极小值(仅阳性频率)并保证过渡态(TS)仅具有单一虚频率(Hessian阴性特征值)。此类QC计算已经证明对于简单有机分子具有～3kcal/mol的精确度。非闭合外壳分子例如O₂和³O₂预期具有较大误差。然而，此类误差预期是系统的从而QC结果的机械函式将是正确的。全部能量学报道为未进行零点能量或温度校正的kcal/mol。

结果和讨论

抗体能够从单线态分子氧(¹O₂)产生过氧化氢(H₂O₂)。然而，直到此处所报道才知道该过程是催化性的。目前显示抗体作为一类蛋白质是唯一的，因为当存在任意可辨别的辅因子和电子供体时，它们能够从¹O₂产生多至500摩尔当量的H₂O₂，而不降低速率。基于同位素掺入试验和动力学数据，提出了抗体能够促进无先例地将H₂O加入¹O₂产生H₂O₃，作为反应级联中的第一个中间体H₂O₃最终导致形成H₂O₂。使用氙的X射线结晶学研究指出抗体折叠中保守的氧结合位点，在这里能够起始该化学作用。这些发现暗示出免疫球蛋白针对¹O的独特的保护功能并且提出这样一个问题，是否需要解毒^tO₂在免疫球蛋白折叠的进化中起到的决定性作用。

抗体，不管来源或抗原特异性，都能够从单线态分子氧(¹O₂)产生过氧化氢(H₂O₂)从而潜在调整防御性识别和在相同分子内杀伤(Wentworth等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，97，10930(2000))。根据该发现的潜在化学和生物学上的意义，已经观察了该过程中抗体的机械基础和结构定位。这些组合的研究揭示，与其它蛋白质相比，抗体可以催化水和单线态氧之间无先例的一组化学反应。

动力学研究：长期UV照射研究揭示抗体-介导的H₂O₂产生是比非免疫球蛋白蛋白质情况下更加有效的过程(图8A)。一般，抗体呈现速率开始逐渐降低之前H₂O₂形成线性增加至40摩尔当量H₂O₂(图8B)。相比之下，非免疫球蛋白蛋白质显示短“脉冲”式H₂O₂产生随后随着光氧化作用发生而淬灭(图8A)。

与其它蛋白质相比，如鼠单克隆IgG PCP21H3所示(图8C)的、如果在测定中使用过氧化氢酶将产生的H₂O₂去除，抗体则能够以与实验起始的速率一样的速率重新进行H₂O₂的光产生。过氧化氢介导的H₂O₂损坏后的这种H₂O₂连续线性产生曲线对于所测定的所有抗体是保守的。因此，在过程中积累的H₂O₂正在抑制其自身的形成(可逆的)。表观IC₅₀估计为225μM(图8D)。

通过底物、过渡态类似物、或反应产物对酶催化功能的抑制作用通常作为活性位点现象强有力的证据。已经注意到抗体-介导的光致产生H₂O₂是使用分子氧可饱和的(K_mapp(O₂ 187μM)(Wentworth等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，97，10930(2000))。H₂O₂的这种形式产物抑制作用提供了此种结合位点现象的进一步证据。

关于通过抗体光产生H₂O₂的早期报道没有使用探测到能够产生的H₂O₂最大量(Wentworth等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，97，10930(2000))。通过反复循环UV照射抗体样品随后通过过氧化氢酶去除产生的H₂O₂已经检测了这一问题(图8C显示两个此类循环)。在一系列实验中，UV-照射和加入过氧化氢酶的循环进行多至10次循环(马poly IgG的PBS溶液，pH 7.4)。在这些实验期间产生了＞500摩尔当量(equiv.)的H₂O₂，而观察到仅轻微降低了初始速率。除了抗体之外，迄今为止所发现的能以此种有效且长期方式产生H₂O₂的唯一其它蛋白质是αβT细胞受体(αβTCR)(图8F)。有意思的是，αβTCR的免疫球蛋白折叠结构域享有与抗体相似的排列(Garcia等，Science，274，209(1996))。然而，象β₂-微球蛋白所显示的那样，拥有这种结构基序好像对蛋白质的H₂O₂产生能力不是必需的，纵使β₂-微球蛋白是免疫球蛋白超家族的一员但它不能够产生H₂O₂(Welinder等，Mol.Immunol.，28，177(1991))。

抗体结构对抗H₂O₂的氧化效应明显没有活性。当在H₂O₂存在下暴露于标准紫外线照射条件下6小时(以足以完全抑制H₂O₂产生的浓度)，一旦通过过氧化氢酶破坏掉抑制性的H₂O₂，多克隆马IgG抗体样品变得完全活化(图8E)。甚至在暴露于H₂O₂之后，以一恒定速率、在较长时间段内持续产生H₂O₂的能力，揭示抗体的结构折叠对化学品的抗性和其它蛋白质所遭受的光氧化修饰的抗性是明显的，并且是至今未引起注意的。对在标准条件下UV照射8小时后的抗体样品进行SDS-PAGE凝胶分析后显示抗体分子既没有明显的片段化也没有凝聚。

为了确定在H₂O₂存在的条件下蛋白质结构没有变化(它可能促成了H₂O₂的明显抑制效应)，甚至在侧链位置的水平也没有变化，在存在和不存在H₂O₂的情况下测定了Fab 4C6的x-射线晶体结构。之所以选择Fab4C6是因为它的天然晶体的衍射分辨率高于任何其它公开的抗体(～1.3D)。对于用3mM H₂O₂浸泡之前和之后4C6结构的关键结构参数均方根差(RMSD)进行了比较。所用原子的RMSD＝0.412D，Cα原子的RMSD＝0.327D，主链原子的RMSD＝0.328D，侧链原子的RMSD＝0.488D。鼠Fab4C6(Li等，J.Am.Chem.Soc.，117，3308(1995))的天然结构和H₂O₂处理后的结构叠置是可以重叠的，因此强化了抗体折叠对H₂O₂稳定性的证据(图9)。

将抗体介导的光致产生H₂O₂的作用谱和抗体蛋白质对相应的相同波长范围(260-320nm)的吸收谱并列列于图10。两个谱实际上与在蛋白质中色氨酸最大UV吸收相同的激发波长时所观察到的H₂O₂产生的最大效率是可重叠的。

检测通过马IgG产生H₂O₂的效率与通过用血卟啉IX敏化³O₂(_A＝0.22在磷酸缓冲液pH 7.0中)和可见光下而导致¹O₂形成效率的关系，表明对于每275±25摩尔当量的通过敏化作用产生的¹O₂，通过抗体分子产生1摩尔当量H₂O₂(Wilkinson等，J.Phys.Chem.Ref.Data，22，113(1993)；Sakai等，Proc.SPIE-Int.Soc.Opt.Eng.，2371，264(1995))。

电子源的问题。由抗体介导的从单线态氧产生H₂O₂所引出的机制问题不得不严格的划分为两个下列问题：一个是关于该过程中的电子源问题并且另一个是关于该过程的化学机制问题。考虑到从¹O₂到H₂O₂的转化过程中需要2摩尔当量电子，每个抗体分子当量能够产生＞500H₂O₂当量的事实提出了一个尖锐的电子储备问题。对于电子来源研究开始于最不同的可能性。通过蛋白质的电子转移极其容易地并且显著大距离地发生(Winkler等，Pure & Appl.Chem.，71，1753(1999)；Winkler，Curr.Opin.Chem.Biol.，4，192(2000))。考虑的第一个电子源是涉及到在正常的蛋白质光氧化过程中引用的、一般作为电子供体的残基的集合体。在照射和过氧化氢酶处理的重复循环中通过抗体和αβ-TCR产生的几乎恒定的H₂O₂产生速率(图8C和8E)则与此种机制相背，因为能够被氧化的残基变得逐渐耗尽使得在H₂O₂的产生中将不得伴随着速率的显著降低。这种速率的降低将进一步加重因为由于蛋白质变得具有更多正电荷使得剩余的未氧化残基的氧化还原电位将不得不提高。

正常的蛋白质光氧化过程是一个复杂的级联过程，该过程导致¹O₂和其它活性氧类(ROS)例如超氧负离子(O₂ ^●-)、过氧自由基(HO₂ ^●)和H₂O₂的产生(Foote，Science，162，963(1968))。当前对机制的思考将蛋白质对光氧化的敏感性与多达五种氨基酸：色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(和胱氨酸)、蛋氨酸(Met)和组氨酸(His)联系起来(Straight和Spikes，在Singlet O₂，A.A.Frimer，著者(CRC Press，Inc.，Boca raton，Florida，1985)，IV9卷，91-143页；Michaeli和Feitelson，Photochem.Photobiol.，59，284(1994))。通过Trp和分子氧光致产生H₂O₂是一个已进行很好表征的过程，该过程涉及，至少部分涉及，从¹O₂到能够自发歧化成H₂O₂和³O₂的O₂ ^●的形成和还原(McMormick和Thompson，J.Am.Chem.Soc.，100，312(1978))。由于色氨酸能够转化为对近UV(λ_max 320nm)敏化剂特别有效的N，N-甲酰犬尿氨酸(NFK)，因此色氨酸，不论是作为单个氨基酸还是作为蛋白质的成分，在有氧条件下对近UV照射(300-375nm)特别敏感(Walrant和Santus，Photochem.Photobiol.，19，411(1974))。然而，在近UV照射(图11A)过程中Trp光氧化伴随着H₂O₂的亚化学计量的产生(约0.5摩尔当量)(McMormick和Thompson，J.Am.Chem.Soc.，100，312(1978))并且在光致产生H₂O₂中最有效的非免疫球蛋白的蛋白质β-半乳糖苷酶从其39Trp残基中只产生5.9mol当量的H₂O₂(图8A)(Fowler和Zabin，J.Biol.Chem.，253，5521(1978))。

对人和小鼠抗体重链和轻链序列Kabat数据库的扫描(对3894个序列的2068个序列进行了分析)显示在其完整结构中抗体很少有超过15个Trp残基的(平均值＝15.5，范围为14-31个Trp残基)(Kabat等，免疫相关的蛋白质的序列(US Department of Health and人Services，PublicHealth Service，NIH，第5版，1991)；Martin，蛋白质：结构，功能和遗传学，25，130(1996))。实际上，即使将涉及上文的蛋白质光氧化过程的所有氨基酸全体参与抗体介导的H₂O₂产生，这些残基(平均＝90.1，范围为49-167个反应残基)还是达不到产生500摩尔当量H₂O₂的足够数量。

考虑到氯离子是已知的通过蒽醌三激发态而光致产生H₂O₂的适宜电子源(Scharf和Weitz，Symp.Quantum Chem.Biochem.，Jerusalem 12卷(Catal.Chem.Biochem.：Theory Exp.)，355-365页(1979))，接下来研究了作为还原等价物的氯离子(以150mM存在于PBS)的电势。当发现通过免疫球蛋白的H₂O₂产生速率不依赖于氯离子浓度时(图11B)，这种可能性很快就大打折扣。

研究了金属离子的可能的作用。虽然此类离子很难以此种可以作为电子源的数量存在于抗体中，痕量的它们可能会作为催化氧化还原中心起着中心作用。为了所有的实践目的，开展了允许在此过程中涉及的微量金属被排除的实验。例如，在将抗体样品用含EDTA的缓冲液完全透析之前和之后抗体介导的光致产生H₂O₂的速率没有发生变化(图11C)。将抗体样品用EDTA处理后，ICP-原子发射光谱分析(AES)显示剩余的微量金属离子存在的数量远远低于百万分率。对于该反应中涉及的微量金属，它对于所有的抗体都是普遍的因为所分析的所有抗体都有这种内在能力。人们普遍接受结合金属不是抗体的一个内在的特征并且这与我们对抗体晶体还有在Brookhaven数据库中可得到的大约300种抗体结构的分析相一致。

因此所有的观察强制性的指向了鉴定电子源的需要，这种电子源并不意味着蛋白质晶体的失活并且解释了高转化数量和因此解释了类似的非限制性的电子源。

对¹O₂的化学电位作了更广的考虑。从先前的报道中可以清楚地推断出在抗体介导的机制中存在分子氧的高能态的参与(Wentworth等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，97，10930(2000))。简言之，抗体介导的光致产生H₂O₂速率在D₂O中提高了并且在¹O₂猝灭剂叠氮化纳存在的情况下降低了。此外，抗体还表现出通过使³O₂在可见光下对血卟啉IX敏化，并且在黑暗中对内过氧化物3N，3N-(1，4-亚萘基)二丙酸二钠(一种化学¹O₂源)敏化而产生H₂O₂。¹O₂的参与还与抗体介导的H₂O₂产生的作用光谱和抗体成分色氨酸的吸收光谱的紧密相似性相一致(图10)。

考虑到¹O₂的已知化学作用使其具有作为超-亲电子试剂“二噁乙烯”的化学作用的概念(Foote，Acc.Chem.Res.，1，104(1968)，迄今未知的可能性认为是：在抗体存在的情况下，水分子能作为亲核试剂加到¹O₂上并且形成作为中间体的H₂O₃。因此，正在变成被氧化至H₂O₂的水能够实现电子源的作用。

为了验证通过¹O₂抗体催化H₂O的光氧化的假设，进行了通过确定H₂O₂中氧的来源的氧同位素实验。使用经过修改的标准H₂O₂检测方法(Han等，Anal.Biochem.，234，107(1996))测定了H₂O₂中¹⁶O/¹⁸O的含量。简单的说，这种方法包括用三羟乙基膦(TCEP)的还原，然后对相应的氧化膦用质谱(MS)分析(图12)。

这些实验显示抗体的UV照射，在氧存在时，导致在从水到H₂O₂的过程中有氧的掺入(图12A和12B)。在H₂ ¹⁸O(98％¹⁸O)磷酸盐缓冲液(PB)中¹⁶O₂浓度饱和的条件下，绵羊poly-IgG被照射后，在氧化膦的MS分析中所观察到¹⁶O/¹⁸O比率的相对丰度是2.2±0.2∶1(图12A)。当用H₂ ¹⁶OPB中¹⁸O富含的分子氧混合物(90％¹⁸O)进行反向的实验时，观察到了相反的比率(1∶2.0±0.2)(图12B)。这些比率的数值呈现出很好的可重复性(+10％，n＝10)并且发现于所研究的所有抗体中。

开展了下述的对照实验。首先，在¹⁶O₂和H₂ ¹⁶O的条件下，照射poly-IgG(马)产生H₂ ¹⁶O₂(图12C)。当将H₂ ¹⁶O₂(400μM于PB，pH 7.0)自身在H₂ ¹⁸O中照射4小时后没有¹⁸O的掺入。这种结果减轻了顾虑，即¹⁸O掺入到H₂O₂中可能通过酸催化的与水的交换而发生或者通过一种涉及H₂ ¹⁶O₂的均裂和与来源于水的H¹⁸O^●的重组的机制而发生。为了检查抗体能够催化H₂ ¹⁶O₂产生和催化其与H₂ ¹⁸O发生酸催化交换的可能性，观察了在惰性气体中UV照射后的在绵羊poly-IgG(6.7μM)存在的情况下H₂ ¹⁶O₂(200μM)在H₂ ¹⁶O₂(98％¹⁸O)PB中的同位素交换。观察到只有微量的¹⁸O掺入到H₂ ¹⁶O₂中(图12D)。

对β-半乳糖苷酶(在产生H₂O₂方面最有效的非免疫球蛋白蛋白质)和3-甲基吲哚也进行了同位素实验。在该两种情况下，光氧化导致了¹⁸O以可以忽略不计的量掺入到H₂O₂中(图12E和12F)，说明在该蛋白质中吲哚环自身和色氨酸残基仅作为¹O₂的还原剂起作用的观点。

这种观点通过观察进一步得到支持，观察发现照射3-甲基吲哚产生不包括从H₂ ¹⁸O而来的氧掺入的H₂O₂。用色氨酸进行的相同实验的确发生了以¹⁶O/¹⁸O比率为1.2∶1的交换。这种结果被认为是由于铵作为分子内广义酸起作用，质子化3′-氢过氧化物的非对映混合物的内部氧。应该注意虽然从化学的观点看是它是有趣的，但它不能解释通过抗体的催化产生H₂O₂，因为它是一个化学当量的过程并且蛋白质中的Trp残基不含有游离铵基。

化学机制。所研究的所有抗体能够通过单线态氧催化水的氧化。对于通过¹O₂进行H₂O的氧化过程中反应物和产物的热力学平衡(反应热，ΔH_r＝+28.1kcal/mol)(D.R.Lide，在化学和物理学手册，第73版，(CRC，1992))需要化学计算，其中在其转化入两个H₂O₂分子的过程中，一个以上的¹O₂分子将不得不参加到每个氧化的水分子中。化学计算假定在涉及从三氧产生单氧之间没有其它光能参与该过程。对假想机械途径的定量化学推理和热力学考虑一起使得有可能如用方程1b或者c进行全部化学计算(全部能量是从气相实验生成热计算得到的并报道为kcal/mol)：

； ΔH_r°＝28.1(1a)

； ΔH_r°＝5.6(1b)

；ΔH_r°＝-16.9(1c)

最近关于通过碲-介导的氧化还原过程进行金属催化¹O₂和水转化成过氧化氢的过渡态的报道(Detty和Gibson，J.Am.Chem.Soc.，112，4086(1990))，为¹O₂和H₂O能够被转化为H₂O₂的过程提供了实验证据并且，因此能够克服该过程的能量需求。认为抗体-介导的光氧化过程机理涉及将一分子水加成到一分子¹O₂形成三氧化二氢作为H₂O₂形成途径中第一个中间体。抗体作为催化剂的功能将不得不提供特殊分子环境，该环境将稳定有关其可逆形成的关键中间体并且，或者，将通过多渠道化其转化为H₂O₂加速中间体的消耗。此种环境的基本特征可以包括在由抗体特异性环境所提供的活化部位所组成的水分子的特殊相互影响因素。

由于H₂O₃在生物系统中还未检测到，其在体内的化学作用相当程度上来自推测，并且其体外特性已经成为大量实验和理论处理的论题(C.Deby，La Recherche，228，378(1991)；Sawyer，氧化学(Oxford UniversityPress，Oxford，1991)；Cerkovnik和Plesnicar，J.Am.Chem.Soc.，115，12169(1993)；Vincent和Hillier，J.Phys.Chem.，99，3109(1995)；Plesnicar等，Chem.Eur.J.，6，809(2000)；Corey等，J.Am.Chem.Soc.，108，2472(1986)；Koller和Plesnicar，J.Am.Chem.Soc.，118，2470(1996)；Cacace等，Science，285，81(1999))。Plesnicar和其共同研究者们已经表明H₂O₃(从臭氧还原产生的)分解为H₂O和¹O₂(Koller和Plesnicar，J.Am.Chem.Soc.，118，2470(1996))。应用微观可逆性的原则，推测逆向反应将也是由一个或多个水分子所催化的。为了描绘此过程似乎合理的反应途径和能量学，如此处所述首先使用了量子化学(QC)方法原理(B3LYP密度功能理论)。结果说明于方程式2a-c(全部能量报道为kcal/mol)：

(2a)

0.0 69.5 15.5

(2b)

0.0 31.5 15.5

(2c)

0.0 15.5 15.5

水和¹O₂产生H₂O₃的直接反应是非常不利的，它具有70kcal/mol的激活势垒(方程式2a)。然而，随着加入第二或第三个水分子，发现一个协调的过程分别将激活势垒降低至31.5和15.5kcal/mol。事实上这些加入的水确实具有催化剂的作用(在方程式2b中第2个水的H进入产物HOOOH，同时用第一个水的H代替它)。与水的第一个HO键能(119kcal/mol)和¹O₂的键能(96kcal/mol)相比，这些势垒是小的。注意到方程式2b和方程式2c中的逆反应分别仅具有15.5或0kcal/mol的势垒，表明大体积水和富含水的系统中H₂O₃是不稳定的。因此，对于产生和利用H₂O₃的抗体结构内最佳位点预期是位于紧靠没有此种水的疏水区的、其中定位有水和水二聚体的位点。

来源于抗体催化的水光氧化的氧化膦内的¹⁶O/¹⁸O比率明显地限制反应过程的选择，通过该过程这种初级中间物H₂O₃将被转化成终产物H₂O₂。对化学上参与从2摩尔H₂O产生2摩尔H₂O₂并通过此种过程的机理细节的¹O₂的分子的数量来初步测定比率。2.2∶1的比率准确地符合从特定机制中预测的值，在该机制中两分子¹O₂和两分子H₂O被转化成两分子H₂O₂和一分子的分子氧(由于热力学反应其也许是³O₂)。此种机制的例子是两分子H₂O₃到H₂O₄和H₂O₂的S_N2类型的歧化反应，然后是前者分解成H₂O₂和³O₂。使用量子化学方法(B3LYP密度功能理论)在系统方法中解决了复杂的问题，该复杂问题就是对于有或没有¹O₂参与的从H₂O₃到H₂O₂的转化的理论可行反应途径的限定。这些研究表明H₂O₃的广泛对接(docking)计算和对于大量蛋白质其形成和转化成H₂O₂的过渡态。的确在抗体(和αβ-T细胞受体)的区域中一个具有分离的水并接近疏水区的区域内存在一个稳定该种种类的独特位点。这种广泛的研究表明对于从H₂O₃到H₂O₂的转化的理论可行化学途径的整个范围的潜在存在。

结合到抗体的氙的结构研究。对于抗体，不论是起源或抗原特异性，或αβ-TCR介导此种反应的保守能力，开展了X-射线结构研究以寻找这些免疫球蛋白折叠蛋白质内的可能的保守反应位点。对于潜在位点的关键性限制是分子氧(¹O₂或者三线态氧，具有接近的潜在敏化残基，优选的是色氨酸)和水必须是能够共定位的并且沿着该途径过渡态和中间物在该位点内或其附近必须是稳定的。

有强有力的证据支持Xe和O₂共定位于蛋白质内相同空穴内的观点(Tilson等，J.Mol.Biol.，199，195(1988)；Schoenborn等，Nature，207，28(1965))。因此，氙气用作重原子示踪物以定位鼠单克隆抗体4C6内可能易于进入分子氧的空穴(Li等，J.Am.Chem.Soc.，117，3308(1995))。

已鉴定了三个氙位点(图13A)，并且如在蛋白质中其它氙-结合位点内所观察到的一样全部占据疏水空穴(Scott和Gibson，Biochemistry，36，11909(1997)；Prangé等，蛋白质：结构、功能和遗传学，30，61(1998))。精细的天然结构和氙-衍生结构的重叠显示除了加入氙以外，在蛋白质骨架或构想侧链内或者结合水分子的位点内几乎不具有可以辨别的改变。

在这里已经更加详细地分析了氙I结合位点(Xe1位点)，因为在所有抗体和αβTCR内它都是保守的(图13B)。Xe1位于离不变Trp距离为7

的V_L的β-片层之间高度保守区的中间。Xe1位点夹在两个β-片层之间，包含V_L的免疫球蛋白折叠，大约距离外部分子表面5 。Xe1位点2(Xe2)位于抗原结合袋的基底处，正好在几个高度保守的残基上面，这在抗体的重链和轻链之间形成了结构上保守的界面(图13A)。V_LV_H界面内的残基主要是疏水的并且包括保守的芳香族侧链，例如Trp^H109。

Fab 4C6中用于Xe1的接触侧链是Ala^L19、Ile^L21、Leu^L73和Ile^L75，它们是所有抗体中高度保守的脂肪族侧链(Kabat等，免疫相关的蛋白质的序列分析(美国卫生和人类服务部，Public Health Senvice，NIH，第5版，1991))。因此，在全部所检测抗体的该区域内仅观察到轻微的结构改变。值得注意的是，几个其它高度保守且不变的残基位于该氙位点紧密相邻的位置，包括Trp^L35、Phe^L62、Tyr^L86、Leu^L104，以及Cys^L23和Cys^L88之间的二硫键。Trp^L35堆叠抵抗二硫键并距氙原子仅7 。在该结构中，由于Trp^L35是Xe1最靠近的Trp，Trp^L35可以是假定的分子氧敏化剂。将2CαβTCR结构与全部可获得的TCR结构进行比较表明该Xe1疏水袋在TCR中也是高度保守的(图5B)(Garcia，Science，274，209(1996))。

人β₂-微球蛋白，其不产生H₂O₂，不具有限定抗体Xe1结合袋的相同精细结构特征，尽管其总体上的免疫球蛋白折叠。同样，β₂-微球蛋白不舍有在抗体和TCR中都存在的保守的Trp残基。如果Trp^L35(抗体)或Trp^α34(TCR)是氧敏化剂，在β₂-微球蛋白中缺乏相应的Trp可以与其不催化水的氧化反应的发现相关。

因此，氙实验已经鉴定了至少一个既易进入分子氧也位于不变Trp附近的保守区(V_L)内的位点；一个等同的保守位点也可能位于V_H折叠内。在V_H结构域内通过使V_L与V_H相关的假性2折叠旋转轴几乎可以精确再现Xe1位点周围的结构和序列。尽管氙结合位点不定位于该结构域，认为分子氧仍然能够进入相应的V_H空穴内。可能还没有发现所提出的重链氙位点，因为仅对结晶施压作用2分钟，这2分钟时间可能不足以建立完全的平衡，或者仅仅因为与氧比较对于V_H侧面上相应的空穴而言氙太大，或者由于晶体管壳(crystal packing)。在其它抗体实验中，仅在不对称单元的两个分子中的一个分子内发现了氙结合位点，这表明晶体管壳能够调节Xe进入晶体。对这些位点周围的序列和结构进行的分析显示在抗体和TCR中它们都是高度保守的，因此提供了对为什么抗体和TCR中的Ig-折叠能够参与这种不寻常化学作用的一种可能的理解。

因其催化地将¹O₂转化为H₂O₂的能力，抗体在蛋白质中是独特的。认为该过程参与通过H₂O₂产生相关事件进行杀伤。另外，抗体能够执行使有机体抵抗¹O₂的功能。这将需要通过过氧化氢酶进一步将过氧化氢加工成水和三线态氧。

实施例III：抗体的抗微生物活性

本实施例表明针对细菌的抗体能够通过产生活性氧类杀死那些细菌。

材料和方法

抗体和细胞制备

从Pierce获得绵羊(31243)和马(31127)多克隆抗体并直接使用，不进行进一步纯化。大肠杆菌O112a，c-特异的鼠单克隆抗体(15404)从QEDbiosciences获得并直接使用，不进行进一步纯化。大肠杆菌非特异鼠单克隆抗体33F12和84G3从Scripps Hybridoma实验室获得并在＞98％纯度(基于SDS-PAGE分析)时使用。单克隆抗体33F12是催化醛醇反应的鼠单克隆IgG。Wagner等，Science 270，1797(1995)。大肠杆菌XL1-B从Stratagene获得。大肠杆菌O112a，c(ATCC 12804)是肠侵染性大肠杆菌，能够感染营养不良和免疫功能不佳的个体。L.Siegfried，M.Kmetove，H.Puzova，M.Molokacova，J.Filka，J.Med.Microbiol.41，127(1994)。

以下抗体制备是通过以下方法在室内进行制备的。

大肠杆菌XL-1blue特异的兔多克隆IgG

在免疫的当天(第0天)，将新西兰白兔(2.5kg)从每只耳朵预先放血10ml并且然后用加热杀死(65℃，15分钟)的化学感受态大肠杆菌XL-1(OD₆₀₀＝1)(650μl和350μl磷酸盐缓冲生理盐水，PBS ph 7.4)进行皮下注射。免疫后14天(第14天)，白兔以与第一次相同的方式接受第二次注射。免疫后28天(第28天)，白兔以与第一次和第二次注射相同的方式接受第三次注射。在免疫后35天(第35天)，将白兔从耳朵放血50ml。在免疫后42天(第42天)，将白兔从耳朵放血50ml。

血清允许在室温静置1-2小时，然后放置于4℃过夜并以2500-3500转每分旋转15分钟。将上清转移至新的园底管(50ml)中并在9-10K转每分旋转15分钟。将这些上清液转移至干净的圆锥形管(50ml)中并储存于-10℃。然后通过ELISA(见下)测试血清，1∶1稀释于PBS并且然后滤过0.2μM的滤器。测定血清样品的蛋白质浓度(Abs₂₈₀)。然后将血清样品装到蛋白G柱子(Amersham Gamma-Bind G，10mg蛋白质/ml珠子)上。用3倍柱体积的PBS pH 7.4洗涤所结合的抗体并且然后2倍柱体积的醋酸(0.1M，pH 3.0)进行洗脱。用Tris缓冲液(1M，pH 9.0)中和洗脱峰(每4ml级分加0.5ml)并且然后透析回PBS。

大肠杆菌XL-1blue特异的鼠单克隆IgG

在第0天，129只Gix+小鼠(6-8周，每组4只)接受腹膜内注射加热杀死(65℃，15分钟)的化学感受态大肠杆菌XL-1，溶于含50μl磷酸盐缓冲生理盐水，PBS ph 7.4的150μl体积，OD₆₀₀＝1。在第14天时，小鼠以与第一次相同的方式接受第二次注射。在第28天时，小鼠以与第一次和第二次注射相同的方式接受第三次注射。在第35天时，将小鼠通过眼球内穿刺取血。

使用标准方法制备了12株XL-1blue特异的单克隆抗体。通过硫酸铵沉淀然后通过装入蛋白G柱子(Amersham Gamma-Bind G，10mg蛋白质/ml珠子)纯化抗体制剂。用3倍柱体积的PBS pH 7.4洗涤所结合的抗体并且然后2倍柱体积的醋酸(0.1M，pH 3.0)进行洗脱。用Tris缓冲液(1M，pH 9.0)中和洗脱峰(每4ml级分加0.5ml)并且然后透析回PBS。

用于确定抗体结合至活的或杀死的大肠杆菌的通用ELISA方法

读取大肠杆菌XL1-blue冷冻甘油储存液的OD₆₀₀并将活细菌储存液稀释于PBS至OD₆₀₀＝1.0。将25微升一份的细菌放置于96-孔高结合(hi-bind)ELISA板内并使其在37℃过夜干燥。轻轻用dH2O洗板两次。用BLOTTO(50μl/孔)在室温包被板子各孔30分钟并且通过震荡去除该包被液。然后将所测定的含抗体的样品稀释于BLOTTO并将25μl该溶液加入每个孔。在保温盒内将板子在37℃孵育1小时，用dH₂O(10x)轻轻洗板并在每个孔中加入25μl溶于BLOTTO的第二抗体(HRP-山羊抗兔结合物，1∶2000)。在保温盒内将板子在37℃孵育1小时并用dH₂O(10x)轻轻洗板。加入显色底物(50μl/孔)并于30分钟后在450nm读取数值。

死细菌样品也用于ELISA分析。以上述相同的方式处理样品，但在加入并吸附于ELISA微孔板之前，将大肠杆菌加热处死(65℃，15分钟)。

杀菌试验

在典型的实验中，重复沉淀(3×3,500转每分)大肠杆菌培养物(在对数生长期，OD₆₀₀＝0.2-0.3)并重悬于PBS(pH 7.4)。然后将PBS悬浮的细胞加入玻璃瓶管中并冷却至4℃。加入血卟啉IX(40μM)和抗体(20μM)并将玻璃瓶管或放置于看片灯上(可见光，2.8mW cm^-2)或放置于4℃黑暗并孵育1小时。通过琼脂板上菌落形成单位(CFU)的恢复率测定存活率。每个试验至少重复进行两次。

显微镜研究

如下述制备样品用于电子显微镜观察。用溶于二甲砷酸盐(0.1M)的多聚甲醛(2％w/v)、戊二醛(2.5％w/v)在0℃固定细胞1.75小时然后进行沉淀。将细胞沉淀重悬于溶于二甲砷酸盐(0.1M)的OsO₄(1％w/v)，使其静置30分钟并且然后进行沉淀。然后连续用乙醇和环氧丙烷将沉淀脱水，包埋于树脂并且然后进行切片。用醋酸双氧铀和柠檬酸铅将切片染色。对于金标记研究，所用步骤如上详述并补充以下步骤。第一，将样品沉淀并用新鲜的等渗缓冲液洗涤以去除未结合的一级抗体。第二，将样品重悬于已经用12nm的金颗粒共价修饰的山羊抗小鼠抗体溶液中，并孵育90分钟。

在水溶液条件下O₃的分解

通过以下方法测定在所用的水溶液条件下O₃的分解速率。将臭氧(通过使氧穿过Polymetrics臭氧发生器产生)在室温使其通过石英管(1cm²)中的磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)溶液进行冒泡2分钟。然后在装备有22℃恒温箱架的Hitachi紫外/可见分光光度计上测定260nm(ε＝2,700M^-1cm^-1)处光密度时间依赖性改变至少5个半寿期。参见Takeuchi等，Anal.Chim.Acta.230，183(1990)。然后使用Graphpad Prism V 3.0软件从OD对时间曲线上图解确定O₃的半寿期(数据为显示)。通过分光光度计限定测定的灵敏性精确至为t＝0时OD的±0.1％(～1μM)。

臭氧测定

在典型的实验中，当存在或缺乏含有或不含过氧化氢酶(13mU/mL)的抗体(20μM)时在透照灯(312nm，0.8mWcm^-2)上室温照射石英微孔板内的靛蓝胭脂红1(1mM)的PBS(pH 7.4)溶液(终体积200μl)，重复两次。在不同时间点取出样品(20μL)并浸入磷酸盐缓冲液(100mM，pH 3.0，180μL)淬灭。在微孔板读值器(Spectramax)中测定610nm处的OD值。通过LC-MS(连接到Hitachi M-8000离子收集器电喷射质谱仪上的HitachiD-7000HPLC(阴离子检测模式))测定靛红磺酸2的产生。LC条件是球形填料RP-C18柱子和乙腈水(30∶70)流动相流速1mL/分钟。机内分离器用于将0.2mL/分钟柱流出物传送入MS。靛红磺酸2RT＝3.4分钟，[MH]-226。

对多种活性氧类进行测试以确定靛蓝胭脂红1是否能够通过其它活性氧类而不是臭氧转化成为靛红磺酸2。

表2：所观察到的通过不同活性氧类的靛蓝胭脂红1^a的氧化作用和¹⁸O同位素掺入环状α-酮酰胺2^b。

氧化剂	反应形成2	¹⁸O掺入2
氧化剂	反应形成2	¹⁸O掺入2	O₃ ^c	是	是
¹O₂ ^*d	是	否	O₃ ^c	是	是
¹O₂ ^*d	是	否	H₂O₃ ^e	是	否
HO₂●/O₂●^-f	否	_h	H₂O₃ ^e	是	否
HO₂●/O₂●^-f	否	_h	H₂O₂ ^g	否	_h
HOClⁱ	否	_h	H₂O₂ ^g	否	_h

^a氧化作用是在所指定的条件下将各个氧化剂加入靛蓝胭脂红1(1mM)的磷酸盐缓冲液(PB，pH 7.4)之前或之后通过室温在微孔板读值器内以下610nm处吸光度的改变进行测定的。

^b18O掺入是通过在每种氧化剂特定的条件下用H₂ ¹⁸O(＞95％标记的)进行PB(100mM，pH 7.4)中的靛蓝胭脂红1氧化作用和通过阴离子电喷射质谱测定法监测环状α-酮酰胺2的同位素谱确定的。在测定条件下已装入α-酮酰胺2的酰胺羰基的标记物不与水发生互换。

^c将靛蓝胭脂红(1，1mM)加入到臭氧(～600μM)PB(100mM，pH 7.0)溶液中。

^d通过用可见光(2.7mW/cm^-2)照射血卟啉IX(40μM)溶液和1(1mM)的PB溶液1小时观察¹O₂*的作用。

^e参见参考文献42。

^f将溶于DMSO的过氧化钾(10mM)加入1的PB(100mM，pH 7.0)溶液中以至于最终有机共溶剂为5％。

^gPB中终浓度为2mM。

^h未检测。

ⁱ将靛蓝胭脂红(1，1mM)加入到NaOCl(20mM)的PBS(pH 7.4)溶液中并且在完全漂白溶液之后通过HPLC测定环状α-酮酰胺2的形成。

初步研究揭示了，当存在紫外光(312nm，0.8mW cm^-2)时环状α-酮酰胺2内酰胺羰基氧与水发生快速和可逆的互换。然而，用白光照射时在实验过程中不发生可辨别的互换。因此，全部¹⁸O同位素掺入试验使用血卟啉IX(40μM)和白光(2.7mW cm^-2)作为¹O₂*来源而进行。

使用以下含有正常碳-碳双键的额外化学探针进行进一步研究。

3-乙烯基3 3-羧基5a 3-环氧乙烷基6a

4 乙烯基4 4-羧基5b 4-环氧乙烷基6b

通过其水溶液溶解度结合易于通过HPLC检测而指导探针3-和4-乙烯基苯甲酸(分别为3和4)的选择。在典型的实验中，当存在或缺乏抗体4C6或绵羊多克隆抗体(20μM)时，将3-乙烯基苯甲酸3(1mM)或4-乙烯基苯甲酸4(1mM)的PBS(pH 7.4)溶液在室温进行照射(312nm，0.8mW/cm^-2)。定时取出等份(20μL)并1∶3稀释于乙腈∶水(1∶1)。通过反相HPLC测定产物组合物。

3-乙烯基苯甲酸3(1mM)PBS(pH 7.4)溶液的室温常规臭氧分解作用导致苯甲醛衍生物5a的产生，同时伴有比率为～10∶1的小量相应环氧化物6a的产生。同样，在上述相同条件下4的臭氧分解作用导致以～9∶1的比率形成4-羧基苯甲醛5b和对应的环氧乙烷5b。在典型的实验中，在室温将3或4(1mM)的PBS(pH 7.4)溶液加入到O₃PBS(600μM)溶液中并使其静置5-10分钟。以该种方式而不是通过使O₃/O₂混合物穿过反应水溶液进行3和4的臭氧分解作用以阻止3和4的进一步氧化作用，进一步氧化会导致芳族环的羟基化作用和片段化。通过反相HPLC阐明产物混合物和底物转化。在Hitachi D-7000机器上使用Spherisorb RP-18柱子进行HPLC分析并且流动相为乙腈和水(0.1％TFA)(30∶70)流速为1mL/分钟。通过紫外检测(254nm)(RT3＝7.84分钟；RT5a＝4.02分钟；RT6a＝3.82分钟；RT48.50分钟；RT5b＝3.72分钟；RT6b＝4.25分钟)进行定位。通过与标准曲线比较将峰面积转化为浓度。

嗜中性粒细胞上的抗体检测

已知在嗜中性粒细胞的表面具有抗体。荧光激活细胞分选术用于测定在静息或活化条件下每个细胞存在的免疫球蛋白分子的数量。在静息条件下每个细胞大约有50,000个抗体分子，当活化后将增加到每个细胞大约65,000个抗体分子。

结果

抗体的抗微生物活性

如上所说明，通过经由三氧化二氢(H₂O₃)中间体的过程，抗体可催化从单线态氧(¹O₂*)和水产生过氧化氢(H₂O₂)。该实施例中提供的结果说明抗体能够利用该过程有效地杀死细菌。

最初的杀菌研究利用两株革兰阴性菌大肠杆菌菌株(XL1-blue和O-112a，c)。大肠杆菌XL1-B从Stratagene获得。大肠杆菌O112a，c(ATCC12804)是能够感染营养不良和免疫反应不佳个体的肠侵染性大肠杆菌菌株。Siegfried等，J.Med.Microbiol.41，127(1994)。

¹O₂*离子具有杀菌作用。Berthiaume等，Biotechnology 12，703(1994)。然而，通过抗体起始H₂O₂产生需要暴露于底物¹O₂*。Wentworth等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97，10930(2000)。因此，仅使用¹O₂*产生系统自身将不会杀死大肠杆菌。抗体能够利用分别由内源性或外源性敏化剂或化学材料，使用紫外光或白光，或高温分解诸如蒽-9，10-二丙酸内过氧化物，所产生的¹O₂*。因此，仅通过实验思路例如反应效率和细胞或底物对照射的敏感性可以指导¹O₂*产生系统的选择。在这些试验中，选择血卟啉IX(HPIX，40μM)作为有效的³O₂敏化剂。Wilkinson等，J.Phys.Chem.Ref.Data 22，113(1993)。当在磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)中在4±1℃用白光(光通量2.7mW cm^-2)照射1小时时，对于两种大肠杆菌血清型(～10⁷个细胞/mL)血卟啉IX具有可忽略的杀菌活性。

在典型的实验中，通过沉淀(3×3,500转每分)细胞并将其重悬于PBS(pH 7.4)重复用PBS洗涤大肠杆菌培养物(处于对数生长期，OD₆₀₀＝0.2-0.3)。然后将PBS重悬的细胞加入到玻璃瓶管中并冷却至4℃。加入血卟啉IX(HPIX，40μM)和抗体(20μM)并将玻璃瓶管或放置于看片灯(可见光，2.8mW cm^-2)上或放置于黑暗4℃并孵育1小时。通过琼脂糖平板上菌落形成单位(CFU)确定存活率。每个试验至少重复进行两次。

将单克隆抗体(20μM)加入血卟啉IX和细菌的混合物导致杀死＞95％的细菌(图14A)。抗体的杀菌活性是抗体浓度的函数。例如，使用10μM抗原特异性鼠单克隆抗体15404能够获得O112a，c细胞＞95％的杀伤。这些数据表明杀死50％细胞的有效抗体浓度(EC₅₀)是81±6nM(图14B)。对于针对XL1-blue大肠杆菌菌株的单克隆抗体(25D11)也观察到相似的浓度对杀伤依赖性，观察到在大约10μM处最大杀伤为＞95％。

抗体-介导的杀菌活性作为照射时间的函数而增加(图14C)并随着增加血卟啉IX的浓度而增加(光通量固定于2.7mW cm-2)(图14D)。抗体-介导的细菌杀伤与血卟啉IX浓度和光照射成比例关系的观察结果表明在该过程中¹O₂*和水氧化途径都具有关键作用。关键地是，当缺乏¹O₂*时，免疫球蛋白对大肠杆菌的存活具有可忽略的影响。

对照显示冷休克和血卟啉IX毒性不影响菌落形成单位(CFU)的明显损失。而且，共聚焦显微镜实验显示抗体介导的细菌细胞聚集也不助于抗体处理组中CFU的缺乏。细菌细胞的荧光分析表明在血卟啉IX处理的大肠杆菌细胞中膜相关敏化剂的量不通过抗体结合而增加。最后，由于难以排除微量金属在抗体杀菌作用中的潜在作用，所以EDTA(2mM)的存在对所使用的测定系统中细菌的存活没有影响。

抗体的杀菌潜能表现为一般现象。进行测试的所有12株鼠单克隆抗体(1x κγ、7x κγ2a、3x κγ2b、1x κγ3同种型)和一株兔多克隆抗体(滴度120,000)样品都是杀菌的。非特异抗体也能够产生杀菌剂。仅¹O₂*是水氧化途径活化所必需的—此种活化不依赖于抗体-抗原联合体。关于这方面，研究了对大肠杆菌细胞表面抗原没有特异性的10个非特异鼠单克隆抗体、一个非特异绵羊抗体制剂和一个马多克隆IgG样品并且全部具有杀菌活性。观察到抗原非特异抗体的杀菌活性潜能与抗原特异性抗体非常相似。在测定系统中一般20μM抗体(非特异)具有＞95％的杀菌性。抗体的杀菌作用不仅仅是非特异蛋白质作用，因为在该测定系统中牛血清白蛋白(BSA，20μM)呈现出无细菌杀伤性。

为了能够洞察所观察的细菌杀伤的特性，通过电子显微镜研究了所杀死的细菌的形态学。金标记二级抗体用于使形态学损伤与细菌细胞壁上抗体结合的位点相关。

杀伤与在细菌细胞壁中抗原-抗体联合体位点处孔洞的产生相关(图15)。由呈现于细菌样品内的形态学的排列证明该过程表现为一种逐渐的过程。在杀菌途径中具有清楚的阶段，其中氧化损伤导致细胞壁和质膜对水的渗透性增加。

细菌处于大约30大气压的内压力下，因此膜的任意衰弱都能够导致灾难性的破裂。该过程显示首先在细胞壁和细胞质之间的界面处观察到轻微的破坏(图16A)，随着细胞壁从细胞质内含物清楚地分离该破坏变得更加严重(图16B)。持续的水流入导致细菌细胞结构严重畸形和残缺(图16C)，最终导致在抗体吸附位点处细胞壁和质膜的破裂和细胞质内含物的喷出(图16D)。在这方面，有趣的是所观察到的由抗体-介导的杀伤所诱导的形态学改变与当细菌被吞噬作用所破坏时所见到的改变相似。Hofman等，Infect.Immun.68，449(2000)。

杀菌剂的化学特性

如果H₂O₂是抗体催化的水氧化途径的最终产物(Wentworth等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97，10930(2000)；P.Wentworth，Jr.等，Science 293，1806(2001))，那么仅H₂O₂将可作为杀伤剂。通过过氧化氢酶，该酶将H₂O₂转化为水(H₂O)和分子氧(O₂)，提供针对非特异性抗体杀菌活性的完全保护的观察(图17A)强化了该结论。

由非特异性抗体所产生的H₂O₂的量是35±5μM。由特异性抗体所产生的H₂O₂的量是可变的。距离接近的问题使得直接进行溶液中H₂O₂与复杂细菌膜表面上所产生的H₂O₂的效果之间的比较。例如，研究了过氧化氢酶(13mU/mL)对11种大肠杆菌抗原特异性鼠单克隆抗体和11种大肠杆菌非特异性鼠单克隆抗体的杀菌活性的保护效应。在所有具有非特异性抗体的情况下，过氧化氢酶完全减弱了杀菌活性。然而对于抗原特异性抗体，通过过氧化氢酶保护作用的程度依赖于所使用的单克隆抗体并且在很大范围内变化。因此，H₂O₂产生(直接产生于细菌膜表面或溶液内)的距离影响由过氧化氢酶所提供的保护的程度。因此，仅将溶液中H₂O₂的效应与抗原非特异性抗体所产生的H₂O₂进行了比较。

在4℃使用可见光(2.7mW cm^-2)照射PBS(pH 7.4)含有血卟啉IX(40μM)的混合物1小时期间由非特异性抗体(20μM)所产生的H₂O₂的形成平均速率(35±5μM/小时)是高度保守的。该平均值是从10种鼠单克隆IgG和一种绵羊和一种马多克隆IgG(n＝12)确定的。

然而，当将H₂O₂对两种大肠杆菌细胞系的毒性进行定量时，由非特异性抗体所产生的H₂O₂的量35±5μM单独不能够解释杀菌活性的潜能就变得很明显了(图17B)。该数值为低于杀死50％细菌所必需的量的1到4个数量级之间，这取决于细胞系是否分别是XL1-blue或O112a，c。

H₂O₂与抗体组合和/或H₂O₂与血卟啉IX组合并不比单独H₂O₂对细菌更有毒性。对这些变量进行测定以确定在H₂O₂和测定中负责杀菌活性潜能的其他成分之间是否可以发生相互作用。具体而言，对于针对大肠杆菌O112a，c的杀菌活性测试了以下情况的组合：

1.H₂O₂(2mM)和非特异性抗体(20μM)；

2.H₂O₂(2mM)和抗原特异性抗体(20μM)；和

3.H₂O₂(2mM)和HPIX(40μM)。

每组使用可见光(2.7mW cm^-2)4℃照射1小时。对于这些组合的任意一项与单独H₂O₂(2mM)相比没有观察到杀伤的增强。

H₂O₂对大肠杆菌的毒性低于抗体所产生的毒性的发现使得有必要重复检验使用过氧化氢酶的实验。一种可能性是H₂O₂与也由抗体所产生的一些其它种类化学品起反应，产生其它杀菌分子并且因此，通过破坏H₂O₂，过氧化氢酶可阻止其它种类化学品的形成。另一种可能性是处于形成H₂O₂途径上的杀菌剂同时也是过氧化氢酶的底物。

进一步实验表明臭氧(O₃)是由抗体产生的。在所使用的水溶液条件下，臭氧是非常长寿的(t1/2＝66秒)。因此，臭氧是长寿的足以通过诸如靛蓝胭脂红1(一种用于检测水溶液系统中O₃的敏感试剂)这一化学探针进行检测。Takeuchi等，Anal.Chem.61，619(1989)；Takeuchi等，Anal.Chim.Acta.230，183(1990)。水溶液中靛蓝胭脂红1的常规臭氧分解作用导致靛蓝胭脂红1的特征吸光度(γ_max 610nm，ε＝20,000LM^-1cm^-1)的褪色(bleaching)和环状α-酮酰胺2的形成(图18A)。

为了证明臭氧是由抗体产生的，进行了以下实验。在不存在抗体时使用紫外光(312nm，0.8mW cm^-2)照射靛蓝胭脂红1的PBS(pH 7.4)溶液。没有观察到褪色。然而，当在存在绵羊多克隆抗体(20μM)或鼠单克隆抗体33F12(20μM)条件下进行相同实验时观察到靛蓝胭脂红1的褪色(图18B)。电喷射质谱测定法和HPLC分析证实在该过程中形成了环状α-酮酰胺2。照射(312nm，0.8mW cm^-2)靛蓝胭脂红1(1mM)2小时后绵羊多克隆抗体和单克隆抗体33F12分别产生4.1μM和4.9μM环状α-酮酰胺2。抗体介导的靛蓝胭脂红1转化为环状α-酮酰胺2的最初速率是线性的，不依赖于抗体制剂(绵羊多克隆IgG＝34.8±1.8nM/分钟，33F12＝40.5±1.5nM/分钟)(图18B)。

靛蓝胭脂红1C＝C双键的氧化断裂是臭氧检测的敏感探针。Takeuchi等，Anal.Chem.61，619(1989)；Takeuchi等，Anal.Chim.Acta.230，183(1990)。然而，此种断裂不是对臭氧特异的。在特定条件下进行使用表2中列出的氧化剂的进一步实验以测试那些氧化剂是否也能够氧化靛蓝胭脂红1。此种实验证实单线态氧(¹O₂)能够通过氧化性双键断裂褪色靛蓝胭脂红1溶液形成环状α-酮酰胺2。当紫外照射时通过抗体产生¹O₂*。Wentworth等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97，10930(2000)；Wentworth等，Science 293，1806(2001)。因此寻找了由¹O₂*氧化断裂靛蓝胭脂红1形成环状α-酮酰胺2与由O₃形成之间的分析差别。

进一步实验显示当臭氧是氧化剂时，通过观察¹⁸O掺入环状α-酮酰胺2的内酰胺羰基能够将通过O₃断裂与通过¹O₂*断裂区别开来。当¹O₂*是氧化剂时，不发生此种¹⁸O掺入到环状α-酮酰胺2的内酰胺羰基内。因此在含有磷酸盐缓冲液(PB，100mM，pH 7.4)的H₂ ¹⁸O(＞95％¹⁸O)内进行了同位素掺入实验(表2和图19)，通过使用可见光(2.7mW cm^-2)照射血卟啉IX(40μM)产生了¹O₂*。预实验确定了在¹⁸O-水中靛蓝胭脂红1和2都进行缓慢但自发的同位素掺入到中靛蓝胭脂红1和2的酮-羰基基团，但是不掺入到2的内酰胺羰基基团。因此，2质谱中的诊断标记是由对应¹⁸O掺入的双同位素掺入到2的酮和内酰胺羰基基团内所产生的[M-H]-230片段。因此，在氧化产物的质谱中，当在H₂ ¹⁸O中通过化学臭氧分解作用进行靛蓝胭脂红1的氧化(图19B)时，而不是通过¹O₂*氧化靛蓝胭脂红1(图19C)时，观察到了质量峰[M-H]-230。参见Gorman等，于Singlet OxygenChemistry，205(1988)。

当存在绵羊IgG(20μM)和血卟啉IX(40μM)使用可见光(2.8mW cm^-2)照射靛蓝胭脂红1(100μM)时，形成了氧化产物2且其质谱证明水¹⁸O交换入内酰胺羰基(图19A)。这些数据表明当存在抗体时臭氧是靛蓝胭脂红1的氧化剂。

为了进一步证实臭氧是由抗体产生的，测试了以下额外的包含正常碳-碳双键的化学探针。

3-乙烯基3 3-羧基5a 3-环氧乙烷基6a

4 乙烯基4 4-羧基5b 4-环氧乙烷基6b

在典型的实验中，当存在或缺乏抗体4C6或绵羊多克隆抗体(20μM)时在室温照射(312nm，0.8mW/cm^-2)3-乙烯基苯甲酸3(1mM)或4-乙烯基苯甲酸4(1mM)的PBS(pH 7.4)溶液。定时取出等份(20μL)并1∶3稀释于乙腈∶水(1∶1)。通过反相HPLC确定产物组合物。

当存在绵羊多克隆IgG(20μM)时使用紫外光(312nm，0.8mW cm^-2)照射化合物3和4(1mM)溶液，导致分别形成3-羧基苯甲醛5a和3-环氧乙烷基苯甲酸6a(比率为15∶1，3小时后转化3的1.5％)和4-羧基苯甲醛5b和4-环氧乙烷基苯甲酸6b(比率为10∶1，3小时后转化4的2％)。当化合物3和4以常规方式进行臭氧化时也观察到这些产物。而且，这些结果与存在绵羊多克隆抗体或鼠单克隆抗体33F12使用紫外光照射靛蓝胭脂红1时的那些观察结果相似，其中观察到靛蓝胭脂红1的褪色(图18B)。另外，如果不存在抗体，不能观察到褪色，但存在抗体时观察到指示臭氧的氧化产物。

形成明显对照的是，在相似条件下由血卟啉IX(40μM)和可见光(2.7mW cm^-2)所产生的¹O₂*不引起任意可检测的3或4的氧化。因此，3-乙烯基苯甲醛3和4-乙烯基苯甲醛4对臭氧具选择性，并且臭氧必须是通过反应中所存在的抗体产生。

由活化的嗜中性粒细胞产生臭氧的证据

嗜中性粒细胞是宿主抵抗细茵的重要部分并且已知在其细胞表面具有抗体，而且当活化时，产生包括¹O₂*在内的强氧化剂的混合物。Steinbeck等，J.Biol.Chem.267，13425(1992)；Steinbeck et al.，J.Biol.Chem.268，15649(1993)。因此，这些细胞提供了非光化学、生物来源的¹O₂*和能够将该底物通过水氧化途径进行加工的抗体。机体的大部分区域不能利用光化学能量。因此，如果嗜中性粒细胞提供细胞来源的¹O₂，对活化后由抗体包被的嗜中性粒细胞所释放出的氧化剂进行分析能够提供关于由此类抗体所产生的臭氧或H₂O₂是否可以具有生理学相关性的指示。

如M.Markert，P.C.Andrews和B.M.Babior Methods Enzymol.105，358(1984)所述制备人嗜中性粒细胞。肉豆蔻酸佛波酯(1μg/mL)活化后，嗜中性粒细胞(1.5×10⁷个细胞/mL)产生将靛蓝胭脂红1氧化断裂成靛红磺酸2(图19和图20B)的氧化剂。虽然次氯酸(HOCl)是已知由嗜中性粒细胞产生的氧化剂，但PBS(pH 7.4)中NaOCl(2mM)的测试表明氧化靛蓝胭脂红1(100μM)但不断裂靛蓝胭脂红1的双键以产生靛红磺酸2。当在¹⁸O水中进行靛蓝胭脂红1氧化作用时，发现50％的内酰胺羰基氧由¹⁸O组成，正如由所分离的断裂产物靛红磺酸2的质谱中[M-H]-230质谱峰的强度所显示(图20B)。该¹⁸O掺入表明臭氧是由抗体包被的嗜中性粒细胞所产生的。

图20A图解说明通过已经用PBS(pH 7.4)中的肉豆蔻酸佛波酯(1μg/mL)在37℃活化的人嗜中性粒细胞(PMN，1.5×10⁷个细胞/mL)氧化靛蓝胭脂红1(30μM)(＞)和形成靛红磺酸2(□)的时间过程。有意思的是，在嗜中性粒细胞级联反应中观察到来自靛蓝胭脂红1的靛红磺酸2的几乎50％的可能产量(潜在60μM的25.1±0.3μM)，显示了在该氧化途径中负责该转化的氧化剂的有效浓度。

实施例IV：通过抗体对抗沙门氏菌的杀微生物作用

该实施例表明针对鼠伤寒沙门氏菌的抗体能够通过产生活性氧类而杀死那些细菌。

方法

鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 12804)从ATCC得到。沙门氏菌非特异鼠单克隆抗体33F12和84G3从Scripps Hybridoma lab得到并且使用的是＞98％纯度的(基于SDS-PAGE分析)。

所产生的用于杀菌研究的鼠单克隆抗体

6-8周龄的Gix+小鼠用来产生针对热杀死(65℃，15分钟)的鼠伤寒沙门氏菌的抗体。采用了下述的免疫程序。

第0天，129只Gix+小鼠(每组4只)每只接受一次热杀死的、化学上有活性的鼠伤寒沙门氏菌(OD₆₀₀＝1)(150μl细菌和50μl磷酸缓冲盐PBS，pH 7.4)的腹腔内注射。

第14天，小鼠接受同样细菌溶液的第二次注射。

第28天，小鼠接受同第一和第二次注射同样的第三次注射。

第35天，通过眼球内穿刺从小鼠取血。

使用标准程序按照这些免疫程序制备单克隆抗体。这些抗体的纯化包含硫酸铵沉淀和随后结合到蛋白G柱子上(Amersham Gamma-Bind G，10mg蛋白质/ml珠)。用3倍柱体积的PBS pH 7.4洗涤结合的抗体并且随后用2倍柱体积的醋酸(0.1M，pH 3.0)进行洗脱。用Tris缓冲液(1M，pH 9.0)中和洗脱峰(在4ml级分中加入0.5ml)并且然后透析返回至PBS中。

抗体结合活的或杀死的鼠伤寒沙门氏菌的ELISA测定

活细菌：用鼠伤寒沙门氏菌冻存甘油储液的OD₆₀₀估计细菌细胞的浓度并用PBS将细菌混悬液稀释至OD₆₀₀＝1.0。将稀释的细菌混悬液等量加入到(25μl/孔)96孔高结合ELISA板中并且37℃过夜至干燥。用稀释液轻轻将板子洗涤两次并用BLOTTO(50μl/孔)室温封闭30分钟。通过摇动去除BLOTTO。然后加入含有抗体样本的BLOTTO(25μl/孔)并且在湿盒中37℃孵育1小时。用蒸馏水将孔洗涤10次并加入置于BLOTTO中的二级抗体(偶联HRP的山羊抗兔抗体，1∶2000，25μl/孔)。然后将板子置于37℃的湿盒中孵育1小时并用蒸馏水轻轻洗涤10次。然后加入显色底物(50μl/孔)。30分钟后读取450nm下的数值。

死细菌：对于死细菌使用上述相同的程序，但是在加入到ELISA板之前将细菌进行热杀死(65℃，15分钟)。

杀菌测定

在一个典型的实验中，将对数生长期OD₆₀₀＝0.2-0.3的鼠伤寒沙门氏菌的培养物重复进行沉淀(3×3,500转每分)并且重悬于PBS(pH 7.4)中。然后将PBS重悬的细胞加入到玻璃瓶中并冷却至4℃。加入血卟啉IX溶液(40μM)和抗体(20μM)。将玻璃管置于有光的盒子中(可见光，2.8mWcm^-2)或者4℃下黑暗处。孵育1小时。通过琼脂平板上菌落形成单位(CFU)确定存活率。每次实验至少用两份样本进行。

结果

制备了一组鼠伤寒沙门氏菌特异的鼠单克隆抗体，并检验了它们的杀菌活性。只要抗体以大于5μM存在时，所检查的每一个抗体均是杀菌的，表现出在血卟啉IX溶液中(120μM)照射一小时后高于50％的鼠伤寒沙门氏菌被杀死(图21)。抗体-浓度研究显示杀菌活性的最大效率出现在抗体大约为20μM时。例如，当6B5为20μM时可以达到高于95％的细菌细胞被杀死(见图21)。

对照表明冷休克和血卟啉IX的毒性不是CFU出现明显损失的原因。而且，共聚焦显微镜显示在抗体处理组，抗体介导的细菌细胞的聚集不能够促成CFU的缺乏。细菌细胞的荧光分析表明在血卟啉IX处理的大肠杆菌细胞中膜结合敏化剂的量没有通过抗体结合而增加。抗体的杀菌作用不是非特异蛋白质效应因为在测定中牛血清白蛋白(BSA，20μM)不表现出杀菌活性。最后，在上面详细描述的测定系统中，EDTA(2mM)的存在对细菌的存活没有影响。

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此处所参考或提到的所有专利和出版物指示了本发明所属领域技术人员的技术水平，并且每一个此种参考的专利或出版物因此以与下述相同的程度引入作为参考，该程度即分别全部或将文中指出的全部内容引入作为参考。申请者保留从任何此种引用的专利或出版物中向本说明书添加任何和所有的材料和信息的和权利。

此处所描述的特定方法和组合物代表着优选的实施方案并且是可效仿的并且不是对本发明范围的限制。其它的目标、方面和实施方案会使本领域技术人员在考虑本说明书时想到，并且包含于如权利要求范围所限定的本发明的精神之内。本领域技术人员很容易理解在不脱离本发明范围和精神的前提下可以对此处所公开的本发明进行多种可变的替代和修饰。此处所述的适当说明的本发明可以在没有任何成分或多种成分，或限制或多种限制下实施，此处它不是一种作为必要的特定的公开。此处所述的适当说明的方法和过程可以在不同顺序步骤下实施，并且它们没必要限定于此处或权利要求中所指出的步骤地顺序。如此处和附加的权利要求中所使用，除非上下文清楚的指明，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数形式。因此，例如，谈及“一种宿主细胞”包括此种宿主细胞的多数(例如，培养物或种群)等等。在任何情况下，本专利也不会解释为局限于此处所公开的特定实施例或实施方案或特定的方法。在任何情况下，本专利也不会解释为局限于专利和商标局的审查者或任何其他职员或雇员所作的任何陈述，除非在申请者所做应答的书写材料中此种陈述是专门的并且没有条件或保留的清楚地采用。

所采用的术语和表达作为对术语的描述而不是对术语的限制而使用，并且在使用此种术语和表达时不是有意排除所示和所述特征的等同物或其部分，但是应该认识到如权利要求的那样多种变化可能处于本发明的范围之内。因此，可以理解为虽然本发明通过优选的实施方案和可选择的特征已经进行特定的公开，此处所公开的概念的改变和变化可能是本领域技术人员的手段，并且此种改变和变化认为是位于附加权利要求定义的本发明的范围之内。

此处已经对本发明进行了广泛的和总体上的描述。处于公开的属范围内的每一个更窄的种和亚属分类也形成本发明的部分。这包括本发明的附带条件的或从属中除去任一主题的消极限制的属的描述，不管被排除的材料是否在此处被特异的描述。

其它实施方案在下面的权利要求之内。此外，当本发明的特征或方面以马库什方式描述时，那些本领域技术人员认识到本发明因此也以马库什组中的任何单一成员或亚组成员的方式描述。

Claims

1.基本上由能够结合微生物的抗体和可药用载体组成的抗微生物组合物，其中当存在单线态氧(¹O₂)时抗体能够产生活性氧类。

2.权利要求1的抗微生物组合物，其进一步包含能够产生单线态氧(¹O₂)的敏化分子。

3.权利要求2的抗微生物组合物，其中敏化分子是蝶呤、黄素、血卟啉、四(4-磺化苯基)卟啉、二吡啶基钌(II)复合体、玫瑰红染料、醌、若丹明染料、酞菁、竹红菌甲素、玉红花青苷、喹哪啶蓝、别花青苷或二氢卟酚。

4.权利要求2的抗微生物组合物，其中敏化分子附着至抗体。

5.权利要求2的抗微生物组合物，其中敏化分子在暴露于光时能够产生单线态氧。

6.权利要求1的抗微生物组合物，其中抗体是人抗体或人源化抗体。

7.权利要求1的抗微生物组合物，其中抗体是Fab、Fab’、F(ab′)₂、Fv或sFv片段。

8.权利要求1的抗微生物组合物，其中活性氧类是超氧自由基、羟自由基或过氧化氢。

9.权利要求1的抗微生物组合物，其中活性氧类是臭氧。

10.权利要求1的抗微生物组合物，其中微生物是革兰氏阴性细菌。

11.权利要求1的抗微生物组合物，其中微生物是气单胞菌属(Aeromonas spp.)、芽胞杆菌属(Bacillus spp.)、拟杆菌属(Bacteroidesspp.)、弯曲杆菌属(Campylobacter spp.)、梭菌属(Clostridium spp.)、肠杆菌属(Enterobacter spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、埃希氏菌属(Escherichia spp.)、腹螺菌属(Gastrospirillum sp.)、缠绕杆菌属(Helicobacter spp.)、克雷伯氏菌属(Klebsiella spp.)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、弧菌属(Vibriospp.)或耶尔森氏菌属(Yersinia spp.)。

12.权利要求1的抗微生物组合物，其中微生物为与葡萄球菌感染、斑疹伤寒、食物中毒、杆菌性痢疾、肺炎、霍乱、溃疡、腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒性综合征或血栓性血小板减少性紫癜有关的微生物。

13.权利要求1的抗微生物组合物，其中微生物是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、大肠杆菌O157:H7、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteria)、铜绿假单胞菌(Psuedomonasaerugenosa)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、霍乱弧菌(Vivriocholerae)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、金黄色葡萄球菌多抗性菌株、屎肠球菌(Enterococcus faecium)万古霉素抗性菌株或粪肠球菌(Enterococcus faecalis)万古霉素抗性菌株。

14.权利要求1的抗微生物组合物，其中微生物是埃希氏菌属、假单胞菌属或沙门氏菌属。

15.权利要求1的抗微生物组合物，其中微生物是大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌或铜绿假单胞菌。

16.权利要求1的抗微生物组合物，其中微生物是病毒。

17.权利要求16的抗微生物组合物，其中病毒是DNA病毒。

18.权利要求16的抗微生物组合物，其中病毒是RNA病毒。

19.权利要求16的抗微生物组合物，其中病毒是类病毒或朊病毒。

20.权利要求16的抗微生物组合物，其中病毒是甲型肝炎病毒、乙型肝病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、乳多空病毒、细小病毒、呼肠孤病毒、环状病毒、细小核糖核酸病毒、轮状病毒、甲病毒、风疹病毒、A型流感病毒、B型流感病毒、黄病毒、冠形病毒、副粘病毒、麻疹病毒、肺病毒、弹状病毒、狂犬病病毒、正粘液病毒、布尼亚病毒、白蛉病毒、纳伊罗病毒、嗜肝DNA病毒、沙粒病毒、逆转录病毒、肠病毒、鼻病毒或线状病毒。

21.治疗哺乳动物体内微生物感染的方法，其包括将基本上由能够结合微生物的抗体和可药用载体组成的抗微生物组合物施用于哺乳动物，其中当单线态氧(¹O₂)存在时抗体能够产生活性氧类。

22.权利要求21的方法，其中组合物进一步包含能够产生单线态氧(¹O₂)的敏化分子。

23.权利要求22的方法，其中敏化分子是蝶呤、黄素、血卟啉、四(4-磺化苯基)卟啉、二吡啶基钌(II)复合体、玫瑰红染料、醌、若丹明染料、酞菁、竹红菌甲素、玉红花青苷、喹哪啶蓝、别花青苷或二氢卟酚。

24.权利要求22的方法，其中敏化分子附着至抗体上。

25.权利要求21的方法，其中抗体是人抗体或人源化抗体。

26.权利要求21的方法，其中抗体是Fab、Fab’、F(ab′)₂、Fv或sFv片段。

27.权利要求21的方法，其中活性氧类是超氧自由基、羟自由基或过氧化氢。

28.权利要求21的方法，其中活性氧类是臭氧。

29.权利要求21的方法，其中微生物是革兰氏阴性细菌。

30.权利要求21的方法，其中微生物是气单胞菌属、芽胞杆菌属、拟杆菌属、弯曲杆菌属、梭菌属、肠杆菌属、肠球菌属、埃希氏菌属、腹螺菌属、缠绕杆菌属、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、弧菌属或耶尔森氏菌属。

31.权利要求21的方法，其中微生物是与葡萄球菌感染、斑疹伤寒、食物中毒、杆菌性痢疾、肺炎、霍乱、溃疡、腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒性综合征或血栓性血小板减少性紫癜有关的微生物。

32.权利要求21的方法，其中微生物是金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、大肠杆菌O157:H7、痢疾志贺氏菌、铜绿假单胞菌、洋葱假单胞菌、霍乱弧菌、幽门螺旋杆菌、金黄色葡萄球菌多抗性菌株、屎肠球菌万古霉素抗性菌株或粪肠球菌万古霉素抗性菌株。

33.权利要求21的方法，其中微生物是埃希氏菌属、假单胞菌属或者沙门氏菌属。

34.权利要求21的方法，其中微生物是大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌或铜绿假单胞菌。

35.权利要求21的方法，其中微生物是病毒。

36.权利要求35的方法，其中病毒是DNA病毒。

37.权利要求35的方法，其中病毒是RNA病毒。

38.权利要求35的方法，其中病毒是类病毒或朊病毒。

39.权利要求35的方法，其中病毒是甲型肝炎病毒、乙型肝病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、乳多空病毒、细小病毒、呼肠孤病毒、环状病毒、细小核糖核酸病毒、轮状病毒、甲病毒、风疹病毒、A型流感病毒、B型流感病毒、黄病毒、冠形病毒、副粘病毒、麻疹病毒、肺病毒、弹状病毒、狂犬病病毒、正粘液病毒、布尼亚病毒、白蛉病毒、纳伊罗病毒、嗜肝DNA病毒、沙粒病毒、逆转录病毒、肠病毒、鼻病毒或线状病毒。

40.产生活性氧类以抑制微生物生长的方法，该方法包括将微生物与能够结合微生物的抗体和单线态氧(¹O₂)源相接触。

41.权利要求40的方法，其中单线态氧(¹O₂)源是敏化分子。

42.权利要求41的方法，其中敏化分子是蝶呤、黄素、血卟啉、四(4-磺化苯基)卟啉、二吡啶基钌(II)复合体、玫瑰红染料、醌、若丹明染料、酞菁、竹红菌甲素、玉红花青苷、喹哪啶蓝、别花青苷或二氢卟酚。

43.权利要求41的方法，其中敏化分子附着至抗体上。

44.权利要求40的方法，其中抗体是人抗体或人源化抗体。

45.权利要求40的方法，其中抗体是Fab、Fab’、F(ab′)₂、Fv或sFv片段。

46.权利要求40的方法，其中活性氧类是超氧自由基、羟自由基或过氧化氢。

47.权利要求40的方法，其中活性氧类是臭氧。