JP2006506419A - 活性酸素種を産生する抗体の抗微生物活性 - Google Patents

活性酸素種を産生する抗体の抗微生物活性 Download PDF

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Abstract

本発明は、一重項酸素に暴露したときに活性酸素種を産生できる抗体を有する組成物、ならびにその組成物の、例えば、微生物感染を処置するための使用を提供する。

Description

発明の詳細な説明
本出願は２００１年１１月１４日出願の仮出願第６０／４２６,２４２号を優先権主張している。本出願は２００１年９月１７日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／２９１６５、２００１年８月２９日出願の仮出願第６０／３１５,９０６号、２０００年９月２６日出願の仮出願第６０／２３５,４７５号および２００１年９月１５日出願の仮出願第６０／２３２,７０２号の関連出願である。
政府の支援
本発明に寄与した研究は国立衛生研究所(National Institutes of Health)から、助成金ＧＭ４３８５８、ＰＯ１ＣＡ２７７４８９で支援された。したがって、米国政府は本発明に一定の権限を有する。
本発明は、一重項酸素からの活性酸素種の抗体介在産生、および、このような抗体を使用した微生物感染のための組成物および方法に関する。
前世紀中の研究は、免疫系における抗体の役割に関して意見の一致を見ている。この一致意見の本質は、抗体分子がその標的を直接殺し、その他不利に影響し得る産物を産生するのではないということである。そうではなくて、抗体分子は、単にその標的を標識するか、または抗体−抗原複合体に応答して他の分子もしくは生物学的システムを活性化する結合分子として理解されている。故に、抗体それ自体いかなる破壊能力も有さず、補体カスケードおよび／または食作用により除去するために外来物質を標識するだけであるとして認識されている(Arlaud et al., Immunol. Today, 8, 106−111(1987); Sim & Reid, Immunol. Today, 12, 307−311(1991))。
しかしながら、直接その標的を破壊できる触媒活性を有する抗体は、例えば、直接微生物を殺すための、多くの適用のための有用性を有するであろう。
本発明は、活性酸素種を産生する抗体の新たに発見された能力を利用する方法を提供する。本発明により、抗体は一重項酸素(１Ｏ２ ＊)を活性酸素種に変換することにより微生物を殺すことができる。抗体は、このような変換を免疫系の他のいかなる構成要素も必要とせずに、すなわち、補体カスケードまたは食作用を必要とせずに行う。
故に、本発明により、抗体は、スーパーオキシドラジカル(Ｏ２ −)、ヒドロキシルラジカル(ＯＨ●)、過酸化水素Ｈ２Ｏ２またはオゾン(Ｏ３)を含むがこれらに限定されない強力な活性酸素種の産生の結果として抗微生物活性を有する。このような活性は抗体中および好中球のような抗体に覆われた哺乳類白血球に存在する。
このように、本発明は、本質的に薬学的に許容される担体と微生物と結合できる単離された抗体を含み、その抗体が一重項酸素(１Ｏ２)が存在するとき活性酸素種を産生できる抗微生物組成物に関する。抗微生物組成物はまた一重項酸素(１Ｏ２)を産生できる増感分子を含み得る。ある態様において、このような増感剤は光の存在下で一重項酸素(１Ｏ２)を産生できる。増感分子の例は、プテリン、フラビン、ヘマトポルフィリン、テトラキス(４−スルフォナートフェニル)ポルフィリン、ビピリジルルテニウム(II)錯体、ローズベンガル色素、キノン、ローダミン色素、フタロシアニン、ヒポクレリン、ルブロシアニン、ピナシアノール、アロシアニンまたはクロリンを含む。このような増感分子は抗体に結合できる。ある態様において、抗体はヒトまたはヒト化抗体である。
本発明の抗体により産生される活性酸素種は、スーパーオキシドラジカル、ヒドロキシルラジカル、過酸化水素、オゾンおよび他の活性酸素種を含む。ある態様において、活性酸素種はオゾンである。
本発明はまた感染、疾患および他の状態を処置するために、一重項酸素から活性酸素種を産生するために抗体を利用する方法を提供する。本発明はまた微生物感染を制御することができる抗体組成物を含む治療組成物も意図する。このような抗体組成物は増強された酸化機能を示すよう加工され得る。
例えば、ある態様において、本発明は、哺乳類に、本質的に微生物と結合できる抗体と薬学的に許容される担体を含み、その抗体が一重項酸素(１Ｏ２)が存在するとき活性酸素種を産生できる抗微生物組成物を投与することを含む、哺乳類における微生物感染の処置法に関する。組成物はまた一重項酸素(１Ｏ２)を産生できる増感分子を含み得る。上記のように、このような増感分子は抗体と結合できる。
他の態様において、本発明は、微生物と、微生物と結合できる抗体および一重項酸素(１Ｏ２)の供給源を接触させることを含む、微生物の増殖を阻害するための活性酸素種を産生する方法に関する。ある実施態様において、一重項酸素(１Ｏ２)の供給源は増感分子である。上記のように、このような増感分子は抗体と結合できる。
図面の簡単な説明
図１は、食細胞の酸素依存的殺菌作用を図解する。１Ｏ２とＯ２ ●−の相互変換が示されている。
図２は、amplex red assayが関与する化学変換段階を図説する。抗体(このスキームではＩｇＧとして記載)は１Ｏ２をＯ２ ●−に変換し、これは過酸化水素から自発的に発生し得る。ホースラディッシュペルオキシダーゼ存在下で、過酸化水素がamplex red基質を脱アセチル化および酸化し、それにより５８７nmの蛍光を発する分子を産生する。
amplex red assayを示す。
図３は、マウスのモノクローナルＩｇＧ ＥＰ２−１９Ｇ２(２０μＭ)の存在下(□)または非存在下(△)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)中でのＨ2Ｏ2産生の初期時間経過を示す。エラーバーは、平均値からのデータ範囲を示す。
図４は、ＵＶ照射し、amplex red試薬でＨ２Ｏ２検出した後のマウス抗体１Ｄ４ Ｆａｂフラグメントの一つの結晶の蛍光顕微鏡写真を示す。
図５は活性酸素種の抗体介在触媒に必要な時間経過および反応条件を説明する。図５Ａは、ＰＢＳ(ｐＨ７.４)中のヘマトポルフィリン(４０μＭ)と可視光による、３１１２７抗体(ウマＩｇＧ、２０μＭ)の存在下(Ｏ)または非存在下(◆)でのＨ２Ｏ２形成の時間経過を提供する。図５Ｂは、３１１２７抗体(ウマＩｇＧ、６.７μＭ)存在下の、他に何も添加しないＰＢＳ(ｐＨ７.４)(□)または、ＮａＮ３を添加したＰＢＳ溶液(ｐＨ７.４)(Ｏ、１００μＭ)もしくはＰＢＳのＤ２Ｏ溶液(ｐＨ７.４)(◇)中、ヘマトポルフィリン(４０μＭ)と可視光によるＨ２Ｏ２形成の時間経過を説明する。図５Ｃは抗体タンパク質濃度(３１１２７、ウマＩｇＧ)のＨ２Ｏ２形成速度における影響を説明する。図５Ｄは酸素濃度の、３１１２７抗体(ウマＩｇＧ、６.７μＭ)によるＨ２Ｏ２形成速度における影響を説明する。全測定点は少なくともデュプリケートの実験測定の平均値である。エラーバーは実験的に測定した値の平均からの範囲である。
図６は、タンパク質の一団に関して測定したＨ２Ｏ２形成の初期速度と抗体(データは表１由来)との比較を示す棒グラフである。全測定点は少なくともデュプリケートの実験測定の平均値である。エラーバーは実験的に測定した値の平均からの範囲である。ＯＶＡ、鶏卵オバルブミン；ＳＯＤ、スーパーオキシドジスムターゼ。
図７Ａは、ＰＢＳ(ｐＨ７.４)中のウマＩｇＧ(６.７μＭ)のＵＶ照射によるＨ２Ｏ２形成速度を説明する。図７Ｂは、Ｈ２Ｏ２形成と同時に測定した、ウマＩｇＧの３２６nm(励起＝２８０nm)での蛍光放出を説明する。
図８は種々の濃度の抗体下のＨ２Ｏ２形成を示す。
図８Ａは、免疫グロブリンおよび非免疫グロブリンタンパク質によるＨ２Ｏ２の産生を説明する。アッセイは、環境酸素条件下、２０ＥＣでトランスイルミネーター(Fischer Biotech)上、密封ガラスバイアル中でリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)[１０mM リン酸ナトリウム、１５０mM ＮａＣｌ(ｐＨ７.４)]中の個々の抗体／タンパク質サンプル(１００μＬ、６.７μＭ)の近ＵＶ照射(３１２nm、８００μＷcm−２)により行った。アリコート(１０μＬ)をアッセイを通して、一定間隔で除いた。Ｈ２Ｏ２濃度をamplex red法により測定した。各データ点を、少なくともデュプリケートの測定の平均±ＳＥＭとして報告する：●ポリクローナル(ポリ)免疫グロブリン(Ｉｇ)Ｇ、ヒト；Ｏポリ−ＩｇＧ、ウマ；□ポリ−ＩｇＧ、ヒツジ；▽モノクローナル(ｍ)ＩｇＧ(ＷＤ１ ６Ｇ６)、マウス；△ポリ−ＩｇＭ、ヒト；◇ｍＩｇＧ(９２Ｈ２)、マウス；■β−ガラクトシダーゼ(β−ｇａｌ)；▲鶏オバルブミン(ＯＶＡ)；▼αラクトアルブミン(αｌａｃｔ)；◆ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)。
図８Ｂは、ヒツジポリ−ＩｇＧ(６.７μＭ、２００μＬ)によるＨ２Ｏ２の長期産生を説明する。８時間の９８ウェル石英プレートの密封ウェルにおけるＰＢＳ中の近ＵＶ照射。Ｈ２Ｏ２濃度は図８Ａに記載のように測定した。
図８Ｃは経時的なＨ２Ｏ２の抗体触媒産生におけるカタラーゼの効果を説明する。マウスモノクローナル抗体ＰＣＰ−２１Ｈ３(ＩｇＧ)の溶液(６.７μＭ、２００μＬ)を、９６ウェル石英プレートの密封ウェル中、ＰＢＳ中で５１０分照射した。Ｈ２Ｏ２をamplex red assayによりアッセイし、次いで、Eupergit C上に固定化したカタラーゼ(１０mg、２８８mU)の添加により破壊した。カタラーゼを濾過により除去し、抗体溶液を４２０分再照射した。速度(０−５１０分)＝０.３６８、μＭ分−１(ｒ２＝０.９９８)；速度(５１１−９３０分)＝０.３９８μＭ分−１(ｒ２＝０.９８７)。
図８Ｄは、ウマポリ−ＩｇＧ抗体による触媒の最大の速度の存在下のＨ２Ｏ２濃度における効果を説明する。このようなグラフは、ウマポリ−ＩｇＧによるＨ２Ｏ２の光産生におけるＨ２Ｏ２のＩＣ５０の決定を可能にする。ウマＩｇＧ(６.７μＭ)の溶液を種々の濃度のＨ２Ｏ２(０−４５０μＭ)とインキュベートし、図８Ａに記載のようにＨ２Ｏ２形成の最初の速度を測定した。グラフはＨ２Ｏ２形成の速度対Ｈ２Ｏ２濃度のプロットであり、２２５μＭのＩＣ５０を明らかにする。
図８Ｅは、Ｈ２Ｏ２によるＨ２Ｏ２の抗体光産生の長期阻害およびＨ２Ｏ２除去後の活性の完全な回復を説明する。アッセイは、Ｈ２Ｏ２(４５０μＭ)存在下、３６０分のウマポリ−ＩｇＧ(ＰＢＳ中６.７mM、ｐＨ７.４)の最初のＵＶ照射を含んだ。Ｈ２Ｏ２を次いでカタラーゼ(Eupergit Cに固定化)により除去し、ポリ−ＩｇＧサンプルをさらに４８０分ＵＶ光で照射した。アッセイを通したＨ２Ｏ２形成をamplex red assayにより測定した。
図８ＦはＨ２Ｏ２産生におけるカタラーゼの効果を説明する。αβ−ＴＣＲ(６.７μＭ、２００μＬ)の溶液を図８Ｃで記載のように３６０、３６７および３８９分照射した。各照射中に産生したＨ２Ｏ２を、図８Ｃに記載のようにアッセイし、破壊した。速度(０−３６０分)＝０.６９３μＭ分−１(ｒ２＝０.９６２)。２００μＭを超える増加曲線(progress curve)における曲率は、Ｈ２Ｏ２による予測される阻害と一致する(下記参照)；速度(３６１−７２７分)＝０.４２７μＭ分−ｌ(ｒ２＝０.９８７)；速度(７２８−１１１７分)＝０.３８６μＭ分−１(ｒ２＝０.９９１)。
図９は、天然４Ｃ６ Ｆａｂ(カラー写真では薄青色およびピンク色)およびＨ２Ｏ２存在下の４Ｃ６ Ｆａｂ(カラー写真では濃青色および赤色)の重ね合わせを説明する。
図９Ａに関して、天然４Ｃ６結晶を３分、４mM Ｈ２Ｏ２に浸し、直ぐにＳＳＲＬ ＢＬ ９−１でのデータ収集のために急速冷凍した。二次および三次構造の全体的構造完全性は、Ｈ２Ｏ２の存在下で明らかに保たれた(ＲＭＳＤ Ｃα＝０.３３Å、側鎖＝０.４９Å)。ＲＭＳＤはＣＮＳで計算した。
図９Ｂは、Ｆａｂ ４Ｃ６への安息香酸の結合を説明する。高解像度Ｘ線構造は、Ｆａｂ ４Ｃ６が安息香酸と交差反応性であることを示す。Ｈ２Ｏ２有りまたは無しの４Ｃ６連結部位の重ね合わせは、結合部位中の側鎖立体構造が維持が保たれることを証明する(カラー写真における薄いおよび濃い色の側鎖が、各々＋および−Ｈ２Ｏ２に対応する)。さらに、安息香酸の明らかな電子密度が、Ｆａｂ ４Ｃ６の結合特性が４mM Ｈ２Ｏ２中で変化しないままであるということを強調する。電子密度地図は１.５σに合わせた２ｆｏ−ｆｃシグマ加重マップであり、図はBobscriptに作った。
図１０Ａは、ダイオード・アレイＨＰ８４５２Ａ分光光度計、Ａｂｓmax ２８０nmで測定したウマポリクローナルＩｇＧの吸光度スペクトルを示す。
図１０Ｂは、ウマポリクローナルＩｇＧの、波長２６０と３２０nmの間の作用スペクトルを提供し、２８０nmでＨ２Ｏ２形成の最大活性が示される。アッセイをデュプリケートで行い、抗体溶液[ＰＢＳ中６.７μＭ(ｐＨ７.４)]を石英試験管に添加し、次いでそれをキセノンアークランプの光線およびＳＬＭ分光螢光計のモノクロメーターに１時間置いた。Ｈ２Ｏ２濃度をamplex red assayにより測定した。
図１１Ａは、トリプトファン(２０μＭ)によるＨ２Ｏ２の経時的産生を説明する。条件およびアッセイ法は図８Ａに記載の通りである。
図１１Ｂは、Ｈ２Ｏ２の抗体介在光産生におけるクロライドイオンの効果を提供する。ヒツジポリ−ＩｇＧ■(６.７μＭ、２００μＬ)またはウマポリ−ＩｇＧ▲(６.７μＭ、２００μＬ)の溶液を凍結乾燥して乾燥し、次いで脱イオン水またはＮａＣｌ(ａｑ.)に、クロライドイオンの最終濃度が０−１６０mMとなるように溶解した。サンプルを、環境酸素条件下、２０ＥＣでトランスイルミネーター(８００μＷcm−２)上、密封ガラスバイアル中でデュプリケートで照射した。アリコート(１０μＬ)をアッセイを通して除去し、Ｈ２Ｏ２濃度をamplex red assayにより測定した。Ｈ２Ｏ２形成の割合を、各抗体サンプルで平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ.対[ＮａＣｌ]としてプロットした。
図１１Ｃは、Ｈ２Ｏ２の抗体介在光産生におけるＥＤＴＡ含有緩衝液中の透析の効果を説明する。二つの抗体調製物である、マウスモノクローナル抗体ＰＣＰ２１Ｈ３およびウマポリクローナルＩｇＧによるＨ２Ｏ２の光産生を、ＥＤＴＡ(２０mM)含有ＰＢＳでの透析前と後で比較した。条件およびアッセイ法は図８Ａに記載の通りであった。各データ点は少なくともデュプリケートの測定の平均±ＳＥＭとして報告する：[●透析前のマウスｍＩｇＧ ＰＣＰ２１Ｈ３；■透析後のマウスｍＩｇＧ ＰＣＰ２１Ｈ３；▲透析前のポリ−ＩｇＧ、ウマ；◆透析後のポリ−ＩｇＧ、ウマ。
図１２は、基質トリスカルボキシエチルホスフィン(ＴＣＥＰ)と、１６Ｏ含有Ｈ２Ｏ２または１８Ｏ含有Ｈ２Ｏ２のいずれかによる酸化を説明するマススペクトルを提供する。ＥＳＩ(陰極性)マススペクトルを、Ｈ２Ｏ２での酸化後、ＴＣＥＰ[(Ｍ−Ｈ)−２４９]およびそのオキシド[(Ｍ−Ｈ)−２６５(１６Ｏ)および(Ｍ−Ｈ)−２６７(１８Ｏ)]として取った。
図１２Ａは、Ｈ２ １８Ｏ(９８％１８Ｏ)ＰＢ中、１６Ｏ２好気条件でヒツジポリ−ＩｇＧ(６.７／μＭ)で照射後のＴＣＥＰおよびそのオキシドのマススペクトルを説明する。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６５に小さなピーク)および１８Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６７に大きなピーク)の混合物を作る。
図１２Ｂは、Ｈ２ １６Ｏ ＰＢ中、富化された１８Ｏ２(９０％１８Ｏ)好気条件下のヒツジポリ−ＩｇＧ(６.７μＭ)の照射後のＴＣＥＰおよびそのオキシドのマススペクトルを提供する。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６５に小さいピーク)および１８Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６７に大きなピーク)の混合物を作る。
図１２Ｃは、Ｈ２ １６Ｏ ＰＢ中の１６Ｏ２好気濃度下行ったポリ−ＩｇＧの照射後のＴＣＥＰおよびそのオキシドのマススペクトルを提供する。アッセイ条件および方法は、Ｈ２ １６ＯをＨ２ １８Ｏに変えた以外、方法および材料(実施例II)と同じである。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６５に大きなピーク)のみが観察される。
図１２Ｄは、嫌気(脱気およびアルゴン下)条件下、Ｈ２ １８Ｏ ＰＢで８時間、２０ＥＣ下のヒツジポリ−ＩｇＧ(６.７μＭ)およびＨ２ １６Ｏ２(２００μＭ)照射後の、ＴＣＥＰおよびそのオキシドのマススペクトルを提供する。ＴＣＥＰの添加は、方法および材料(実施例II)に記載の通りであった。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６５に大きなピーク)のみが観察される。
図１２Ｅは、Ｈ２ １８Ｏ ＰＢ中の１６Ｏ２好気条件下の３−メチルインドール(５００μＭ)の照射後のＴＣＥＰおよびそのオキシドのマススペクトルを提供する。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６５に大きなピーク)のみが観察される。アッセイ条件および方法は、３−メチル−インドールが小さすぎる分子量であるため、サイズ排除濾過を行わなかった以外、方法および材料(実施例II)に記載の通りであった。したがって、ＴＣＥＰを３−メチル−インドール含有ＰＢ溶液に添加した。
図１２Ｆは、Ｈ２ １８Ｏ ＰＢ中１６Ｏ２好気条件下のβ−ｇａｌ(５０μＭ)の照射後の、ＴＣＥＰおよびそのオキシドのマススペクトルを提供する。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６５に大きなピーク)のみが観察される。アッセイ条件および方法は、方法および材料(実施例II)に記載の通りである。
図１３は、材料および方法(実施例II)に記載の抗体４Ｃ６におけるＸｅ結合部位を示す。
図１３Ａは、カラー写真で軽鎖がピンク色であり、重鎖が青色であるＦａｂ ４Ｃ６のＣαトレースの標準側面図を示す。３つの結合したキセノン原子(カラー写真で緑色)を、５σで合わせたＦｏ−Ｆｃ電子密度マップと共に示す。
図１３Ｂは、保存キセノン部位１の周りのＦａｂ ４Ｃ６および２Ｃ αβ ＴＣＲ(ＰＤＢ／ＴＣＲ)の重層を提供する。ＶＬ主鎖Ｃαトレース(カラー写真でピンク色)および側鎖(カラー写真で黄色)ならびに対応する２Ｃ αβ ＴＣＲのＶα(カラー写真で赤色および金色)を重ねる(図はInsight2000を使用して作った)。
図１４は抗体による細菌の殺菌を示す。
図１４Ａは、大腸菌ＸＬ１−ブルーおよびＯ１１２ａ,ｃ株の、異なる実験条件下での生存を示す棒グラフを提供する。生存は回復したコロニー形成単位(ＣＦＵ)として、実験開始時(ｔ＝０分)のＣＦＵの割合として報告する。黒色棒および薄灰色棒は、薄灰色グループ(２、４、６、８、１０および１２)が可視光(２.７mWcm−２)に６０分暴露され、黒色グループ(１、３、５、７、９および１１)が暗所に６０分置かれた以外、同じ実験条件に対応する。細菌細胞密度は１０７細胞／mLであった。報告した各データ点は、大腸菌ＸＬ１−ブルー(グループ１−６)およびＯ１１２ａ,ｃ(グループ７−１２)の、以下の条件下の平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ.(ｎ＝６)である。グループ１−２ ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃のＸＬ１−ブルー細胞。グループ３−４ ＨＰＩＸ(４０μＭ)、ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃のＸＬ１−ブルー細胞。グループ５−６ ＸＬ１−ブルー−特異的モノクローナル抗体(２５Ｄ１１、２０μＭ)、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)、ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃のＸＬ１−ブルー細胞。グループ７−８ ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃のＯ１１２ａ,ｃ細胞。グループ９−１０ ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃のＨＰＩＸ(４０μＭ)、Ｏ１１２ａ,ｃ細胞。グループ１１−１２ ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃のＯ１１２ａ,ｃ−特異的モノクローナル抗体(１５４０４、２０μＭ)、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)、Ｏ１１２ａ,ｃ細胞。
図１４Ｂは、大腸菌Ｏ１１２ａ,ｃの生存における抗体濃度の効果を説明する。用いた抗体はＯ１１２ａ,ｃ−特異的モノクローナル抗体、１５４０４であった。報告する各データ点は、平均値±Ｓ.Ｅ.Ｍ(ｎ＝３)である。５０％の細胞を殺すのに対応する１５４０４抗体の濃度(ＥＣ５０)は８１±６nMであった。
図１４Ｃは大腸菌ＸＬ１−ブルー−特異的マウスモノクローナル抗体１２Ｂ２の殺菌作用における照射時間の効果をグラフ的に説明する。グラフは照射時間(２.７mWcm−２)対ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)および１２Ｂ２(２０μＭ)存在下の大腸菌ＸＬ１−ブルーの生存を提供する。報告する各データ点は、平均値±Ｓ.Ｅ.Ｍ(ｎ＝３)である。５０％の細胞を殺すのに対応する照射時間は３０±２分であった。
図１４Ｄは、抗体誘発殺菌作用のヘマトポルフィリンIX濃度依存性を説明する。用いた抗体は大腸菌ＸＬ１−ブルー−特異的マウスモノクローナル抗体２５Ｄ１１であった。グラフは、大腸菌ＸＬ１−ブルーの生存対暴露したヘマトポルフィリンIX濃度を提供する。以下の条件を用いた：ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃、暗所、６０分のＸＬ１−ブルー細胞(＞)。ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃で白色光(２.７mWcm−２)下のＸＬ１−ブルー細胞(△)。ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃、暗所、６０分の２５Ｄ１１(２０μＭ)、ＸＬ１−ブルー細胞(◆)。ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃、白色光(２.７mWcm−２)下、６０分の２５Ｄ１１(２０μＭ)、ＸＬ１−ブルー細胞(◇)。
図１５は、抗原−特異的マウスモノクローナルＩｇＧ(１５４０４、２０μＭ)、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)のＰＢＳ溶液および可視光に１時間、４℃(＜５％生存可能)で暴露した後の大腸菌Ｏ１１２ａ,ｃ細胞の電子顕微鏡写真を提供する。抗体結合部位を可視化するために、金標識ヤギ抗マウス抗体を殺菌アッセイの完了後に添加した。抗原非特異的抗体の殺菌活性は、抗原−特異的抗体と比較して非常に小さいことが観察された。典型的に２０μＭの抗体(非特異的)が、本アッセイシステムで＞９５％殺菌性であった。
図１６Ａ−Ｃは、非特異的マウスモノクローナルＩｇＧ抗体(８４Ｇ３、２０μＭ)、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)のＰＢＳ溶液および可視光に１時間、４℃(１％生存可能)で暴露した後の大腸菌ＸＬ−１ブルー細胞の電子顕微鏡写真である。図１６Ａの矢印は細胞質含有物からの細胞膜の先だった分離を指す。図１６Ｄは、抗原−特異的マウスモノクローナルＩｇＧ(１５４０４、１０μＭ)、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)のＰＢＳ溶液および可視光に、１時間、室温(＜５％生存可能)で暴露後の血清型大腸菌Ｏ１１２ａ,ｃの電子顕微鏡写真を提供する。金標識を当業者に既知の方法を使用して行った。
図１７Ａは、大腸菌ＸＬ１−ブルーに対する抗体の殺菌作用におけるカタラーゼの効果を説明する[回復したコロニー形成単位(ＣＦＵ)として、実験開始時(ｔ＝０分)のＣＦＵの割合として報告する]。カタラーゼはＨ２Ｏ２を水(Ｈ２Ｏ)と酸素分子(Ｏ２)に変換する。各グループを白色光(２.７mWcm−２)で６０分、４℃で照射した。細菌細胞密度は〜１０７細胞／mLであった。実験グループ(１−７)を以下のように試験した：グループ１ 大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞およびヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液。グループ２ 大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞および非特異的マウスモノクローナル抗体８４Ｇ３(２０μＭ)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液。グループ３ 大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)およびモノクローナル抗体８４Ｇ３(２０μＭ)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液。グループ４ 大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)、モノクローナル抗体８４Ｇ３(２０μＭ)およびカタラーゼ(１３mU／mL)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液。グループ５ 大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞および特異的ウサギポリクローナル抗体(２０μＭ)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液。グループ６ 大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)および特異的ウサギポリクローナル抗体(２０μＭ)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液。グループ７ 大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)、特異的ウサギポリクローナル抗体(２０μＭ)およびカタラーゼ(１３mU／mL)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液。各点は複数の実験の平均値±Ｓ.Ｅ.Ｍ.として報告する(ｎ＝６)。記号＊＊は、同じ時点のコントロールと比較して＜０.０１のｐ値を意味する。殺菌活性は、いかなる暗所コントロールでも観察されなかった(データは示していない)。
図１７Ｂは、大腸菌ＸＬ１−ブルーおよびＯ１１２ａ,ｃ血清型の生存におけるＨ２Ｏ２の濃度依存的毒性を説明する。垂直の点線は、上記の図１４およびHofman et al., Infect. Immun. 68, 449(2000)に記載の条件を使用した６０分のインキュベーション中に抗体により産生されることが予期されるＨ２Ｏ２の濃度である。３５±５μＭ Ｈ２Ｏ２の値が、１２の異なるモノクローナル抗体の少なくともデュプリケートのアッセイから得られた平均値である。
図１８は、カタラーゼの存在下および非存在下の抗体のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液のＵＶ照射(３１２nm、０.８mWcm−２)中のインディゴカルミン１(１mM)からイサチンスルホン酸２への進行を説明する。Steinbeck et al., J. Biol. Chem. 267, 13425(1992)。各点は、少なくともデュプリケートの測定の平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ.として示す。線形回帰分析をGraphpad Prism v.3.0ソフトウェアで行う。イサチンスルホン酸２の形成速度(ν)は以下の条件下で観察した：ヒツジポリクローナルＩｇＧ(２０μＭ)(●)ν＝３４.８±１.８nM／分；マウスモノクローナル抗体３３Ｆ１２(２０μＭ)(□)ν＝４０.５±１.５nm／分；ヒツジポリクローナルＩｇＧ(２０μＭ)および可溶性カタラーゼ(１３mU／mL)(△)ν＝３３.５±２.３nM／分；マウスモノクローナル抗体３３Ｆ１２(２０μＭ)および可溶性カタラーゼ(１３mU／mL)(▽)ν＝４１.８±１.２nM／分。
図１９Ａ−Ｃは、Ｈ２ １８Ｏ(＞９５％１８Ｏ)リン酸緩衝液(ＰＢ、１００mM、ｐＨ７.４)中、室温で種々の条件下のインディゴカルミン１(１mM)の酸化中に産生されたイサチンスルホン酸２[(ＭＨ)−２２６、(Ｍ−Ｈ)−２２８(１８Ｏ)および(Ｍ−Ｈ)−(２×１８Ｏ)]の電子噴霧イオン化(陰極性)マススペクトルを提供する。図１９Ａは、５分の化学的オゾン分解(ＰＢ中６００μＭ)によるインディゴカルミン１の酸化の間に産生されたイサチンスルホン酸２のマススペクトルを提供する。図１９Ｂは、４時間、白色光(２.７mWcm−２)、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)およびヒツジポリ−ＩｇＧ(２０μＭ)での照射によるインディゴカルミン１の酸化の間に産生されたイサチンスルホン酸２のマススペクトルを提供する。図１９Ｃは、４時間、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)と白色光(２.７mWcm−２)での照射によるインディゴカルミン１の酸化の間に産生されたイサチンスルホン酸２のマススペクトルを提供する。
図２０Ａは、ミリスチン酸フォルボール(１μｇ／mL)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液中、３７℃で活性化したヒト好中球(ＰＭＮ、１.５×１０７細胞／mL)による、インディゴカルミン１(３０μＭ)の酸化(＞)および２の形成(□)の時間経過を説明する。インディゴカルミン１の酸化は、活性化していないＰＭＮでは起こらない(データは示していない)。好中球を先に記載のように調製した。次亜塩素酸(ＨＯＣｌ)は、好中球により産生されることが既知の酸化剤である。我々の手で、ＮａＯＣｌ(２mM)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液は１(１００μＭ)を酸化したが、１の二重結合を開裂し、イサチンスルホン酸２を産生しなかった。
図２０Ｂは、図２０Ａに記載の条件下で、活性化ヒト好中球によりインディゴカルミン１の酸化中に産生されたイサチンスルホン酸２の陰イオン電子噴霧マススペクトルである。
図２１Ａ−Ｂは、ネズミチフス菌−特異的抗体６Ｂ５の殺菌活性を説明する棒グラフを提供する。平均コロニー形成単位(ｎ＝３)を生存ネズミチフス菌と、異なる条件下で調製した６Ｂ５抗体のインキュベーションの０時間目(ｔ＝０、青色)および１時間後(ｔ＝１時間、マゼンタ色)で示す。
図２１Ａは、白色光照射(１.５mWcm−２光束)により行った実験の結果を示す。アッセイは：サルモネラ細胞単独；サルモネラ細胞およびヘマトポルフィリンIX(ＨＰ)(１２０μＭ)；サルモネラ細胞および６Ｂ５抗体(４０μＭ)；サルモネラ細胞、６Ｂ５抗体(５μＭ)およびヘマトポルフィリンIX(１２０μＭ)；サルモネラ細胞、６Ｂ５抗体(１０μＭ)およびヘマトポルフィリンIX(１２０μＭ)；サルモネラ細胞、６Ｂ５抗体(２０μＭ)およびヘマトポルフィリンIX(１２０μＭ)；サルモネラ細胞、６Ｂ５抗体(３０μＭ)およびヘマトポルフィリンIX(１２０μＭ)；サルモネラ細胞、６Ｂ５抗体(４０μＭ)およびヘマトポルフィリンIX(１２０μＭ)。
図２１Ｂは暗所(０光束)で行った実験の結果を示す。アッセイは：サルモネラ細胞単独；サルモネラ細胞およびヘマトポルフィリンIX(１２０μＭ)；サルモネラ細胞および６Ｂ５抗体(４０μＭ)；サルモネラ細胞、６Ｂ５抗体(５μＭ)およびヘマトポルフィリンIX(１２０μＭ)；サルモネラ細胞、６Ｂ５抗体(１０μＭ)およびヘマトポルフィリンIX(１２０μＭ)；サルモネラ細胞、６Ｂ５抗体(２０μＭ)およびヘマトポルフィリンIX(１２０μＭ)；サルモネラ細胞、６Ｂ５抗体(３０μＭ)およびヘマトポルフィリンIX(１２０μＭ)；サルモネラ細胞、６Ｂ５抗体(４０μＭ)およびヘマトポルフィリンIX(１２０μＭ)を含んだ。
発明の詳細な説明
本発明は、抗体が、一群の分子として、一重項酸素を活性酸素種に変換する能力を有するという発見に関する。本発明によれば、このような活性酸素種は微生物を殺すことができる。抗体により産生される活性酸素種の例は、オゾン(Ｏ３)、スーパーオキシドラジカル(Ｏ２ −)、過酸化水素(Ｈ２Ｏ２)またはヒドロキシルラジカル(ＯＨ●)を含むが、これらに限定されない。
抗体が一重項酸素を活性酸素種に変換する能力は、抗体の起源または抗原特異性と無関係に、抗体の予め認識された結合特性とその標的を破壊する能力を結びつける。本発明はしたがって、微生物を、活性酸素種を産生できる抗体と接触させることを含む、微生物増殖を阻害する方法を提供する。
定義
略語：(ＨＰ)ヘマトポルフィリン；(ＰＢＳ)リン酸緩衝化食塩水；(ＯＶＡ)鶏卵オバルブミン；(ＳＯＤ)スーパーオキシドジスムターゼ；(ＰＯ)ペルオキシダーゼ酵素；(ｐｈｏｘ)食細胞オキシダーゼ；(ＨＲＰ)ホースラディッシュペルオキシダーゼ；(ＭＳ)質量分光分析；(ＡＥＳ)ＩＣＰ原子発光分光法；(ＭＳ)マススペクトル、(ＱＣ)量子化学。
本明細書の“薬剤”なる用語は、化学化合物、化学化合物の混合物、生物学的巨大分子または細菌、植物、真菌または動物(特に哺乳類)細胞または組織から作った抽出物を意味するために使用する。薬剤は、抗体または好中球調節剤としての活性の可能性を、本明細書に記載のスクリーニングアッセイにより評価する。
本明細書で使用する“有効量”、“有効な減少量”、“有効な改善量”、“有効な殺菌量”、“有効な組織傷害阻害量”、“治療的有効量”などの用語は、所望の生理学的効果、例えば、状態、障害、疾患などの処置、または状態、障害、疾患などの症状の低減を得るのに十分な量を特定するために使用する。治療法の内容における抗体のこのような有効量は、微生物感染の減少、回復、改善、または阻害をもたらす量である。
“加工された抗体分子”は、組み換え法により製造されたポリペプチドである。このような分子は、少なくとも一つの活性酸素種を一重項酸素からの産生を触媒できる反応中心を含み得る。このような加工された抗体分子は、ポリペプチド構造内に包含された反応性インドールを有し得る。このような分子のインドールは、トリプトファン残基として存在し得る。加工された抗体分子はまた非天然アミノ酸および架橋ならびにペプチド模倣物を含み得る。加工された抗体分子はまた活性酸素種を実質的に産生できない反応中心を除くように修飾された抗体を含む。
本明細書で使用される“エピトープ”なる用語は、抗体のパラトープが結合する抗原の任意の抗原決定基を意味する。エピトープ性決定基は通常アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学に活性な表面配置を含み、通常特異的三次元構造特性ならびに特異的荷電特性を有する。抗原はポリペプチド、脂肪酸、リポタンパク質、脂質、化学物質、ホルモンなどを含み得る。ある実施態様において、抗原は、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスなどのような細菌またはウイルスのような微生物由来のタンパク質を含み得るが、これらに限定されない。他の実施態様において、抗原は、肺癌、前立腺癌、大腸癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、膀胱癌、骨癌、白血病、リンパ腫、脳腫瘍などのような癌細胞上に発現されるタンパク質を含むが、これらに限定されない。本発明の抗原はまたエタノール、テトラヒドロカンナビノール、ＬＳＤ、ヘロイン、コカインなどのような化学物質を含むが、これらに限定されない。
“調節”なる用語は、本発明の抗体または加工された抗体分子の機能的特性を増強または阻害する能力を意味する。このような調節はまた抗体、好中球または加工された抗体分子による少なくとも一つの活性酸素種の産生を増加または減少し得る。
“非天然”アミノ酸は、Ｄ−アミノ酸ならびに天然に存在しないアミノ酸、例えば、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシルシリンおよびたのこのようなアミノ酸およびイミノ酸を含む。
“ペプチド模倣物”または“ペプチドの模倣物”は、鋳型ペプチドと類似の特性を有する、非ペプチド薬物として医薬業界で通常使用されているようなペプチドアナログを含む。(Fauchere, J., Adv. Drug Res., 15: 29(1986) and Evans et al., J. Med. Chem., 30: 1229(1987))。一般に、ペプチド模倣物は模範ポリペプチド(すなわち、生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチド)と構造的に類似しているが、所望により−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−(ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ)、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２−および−ＣＨ２ＳＯ−のような架橋に、当分野で既知の方法で置換された一つまたはそれ以上の結合を有する。天然ポリペプチド実施態様を超えるペプチド模倣物の利点は、より経済的な製造、大きな化学安定性、変化した特異性、減少した抗原性ならびに半減期、吸収、効能および効果のような増強された薬理学的特性を含み得る。
本明細書で使用する“薬学的に許容される”、“生理学的に耐容性”およびそれらの文法的派生語は、組成物、担体、希釈剤および試薬に関して言及するとき、交換可能に使用され、このような物質が、悪心、めまい、胃の不調などのような望ましくない生理学的作用をもたらすことなしに哺乳類にまたは哺乳類に関係して投与できることを意味する。
“タンパク質”および“ポリペプチド”なる用語は、天然タンパク質、ペプチド、タンパク質フラグメントまたはタンパク質もしくはポリペプチドのアナログを述べるために使用する。これらの用語は相互交換的に使用し得る。
本明細書で使用する“活性酸素種”なる用語は、抗体が産生する酸素種を意味する。これらの活性酸素種は、一つまたはそれ以上の不対電子を有するか、そうでなければ他の分子と容易に反応するため反応性であり得る。このような活性酸素種はスーパーオキシドフリーラジカル、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、ペルオキシルラジカル、オゾンおよび他のオゾンと同じ化学特性の短寿命三酸素付加体を含むがこれらに限定されない。
抗体の触媒活性
本発明によると、抗体は、起源または抗原特異性と無関係に、一重項酸素を、オゾン(Ｏ３)、スーパーオキシドラジカル(Ｏ２ −)、過酸化水素(Ｈ２Ｏ２)またはヒドロキシルラジカル(ＯＨ●)のような活性酸素種に変換できる。このような酵素的作用は、抗体の高親和性ターゲッティング能力を併せ持って、その標的を有効に破壊できる単一の物質を形成する。抗体は、したがって、外来侵入物に対する脊椎動物防御の前線に配置される、ターゲティングおよび触媒機能の両方展開する、顕著なアダプター分子として、より適切に認識される。
活性酸素種を一重項酸素から産生する能力は完全な免疫グロブリンならびにＦａｂ、Ｆ(ａｂ')２およびＦｖフラグメントのような抗体フラグメントに存在する(実施例参照)。この活性は、ＲＮａｓｅＡ、スーパーオキシドジスムターゼ、および酸化され得るボーマン−ビルク(Bowman−Birk)インヒビタータンパク質のような他の分子には存在しない(実施例Ｉおよび表１)。また、この活性は分子内のジスルフィド結合の存在にも、このようなジスルフィド結合が酸化され得るのに十分電子に富んでいても、関係しない(Bent et al., J. Am. Chem. Soc., 87: 2612−2619(1975))。
抗体が活性酸素種を一重項酸素から産生させる能力は、抗体が変性したときになくなる。これは、抗体の三次元構造が活性酸素種の産生に使用する還元工程に関連していることを示唆する。
効率的で長期間活性酸素種を一重項酸素から産生するための能力は、免疫グロブリンおよびＴ細胞レセプターに存在する(実施例II、図１Ｆ)。Ｔ細胞レセプターは抗体と、免疫グロブリン折りたたみドメインの配置を含む構造類似性を有する(Garcia et al., Science, 274: 209(1996))。しかしながら、この構造モチーフの占有はタンパク質における活性酸素種産生能力に必ずしも寄与していないように見える。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである、この構造モチーフを有するβ２−マクログロブリンは過酸化水素を産生しない(Welinder et al., Mol. Immunol., 28: 177(1991))。
構造試験はまたＴ細胞レセプターで見られた保存されたトリプトファン残基が、抗体で見られたのと類似のドメインに存在することを示唆する。さらに抗体およびＴ細胞レセプターは両方ともこのようなトリプトファンを有する。この保存トリプトファン残基を欠くβ２−マクログロブリンは、オゾン、スーパーオキシドまたは過酸化水素を産生する能力を有しない。このトリプトファン残基を囲む配列および構造は、抗体とＴ細胞レセプターで非常に保存的であり、これらの周辺構造がまた一重項酸素から過酸化水素、オゾン、および／またはスーパーオキシドの触媒を可能にすることに役割を演じることを示唆する。
１Ｏ２ ＊存在下での抗体の殺菌活性の発見は、それらがその抗原標的を補体または食細胞の非存在下で破壊できるという最初の直接の証拠である。これは、抗体が細菌または微生物感染に対する宿主防御に役割を演じ得るという最初の証拠である。
一重項酸素の内因性産生
抗体のインビボでの新規に発見された化学ポテンシャルの役割は、重要な基質１Ｏ２ ＊の利用性に依存する。しかしながら、１Ｏ２ ＊は種々の生理学的事象中に産生され、インビボで利用可能である。J. F. Kanofsky Chem.−Biol. Interactions 70, 1(1989)およびその中の引用文献参照。例えば、１Ｏ２ ＊は再潅流においても産生される。X. Zhai and M. Ashraf Am. J. Physiol.269(Heart Circ. Physiol. 38)H1229(1995)。また、１Ｏ２ ＊は食作用中の好中球活性化において産生される。J. R. Kanofsky, H. Hoogland, R. Wever, S. J. Weiss J. Biol. Chem. 263, 9692(1988); Babior et al., Amer. J. Med., 109: 33−34(2000)。一重項酸素(１Ｏ２)はまたポルフィリン症に罹患している患者の皮膚に存在する無金属ポルフィリン前駆体の光の照射によりもたらされる。
さらに、基質１Ｏ２ ＊は、抗体が検出可能なレベルの活性酸素種を産生するのに十分な量で食作用または再潅流により産生される。例えば、ファゴソームの容量は約１.０×１０−１５リットルである。故に、本明細書で確認された反応は、僅か数百の分子が、マイクロモル濃度でこのような少ない容量に含まれるため、非常に効率的である必要はない。実際、１Ｏ２ ＊濃度はファゴソームにおけるのと同程度に高いモル濃度であると計算されている。E. P. Reeves et al., Nature 416, 291(2002)。抗体分子の数に関するいくつかの概算が、細菌と蛍光標識抗体分子の力価測定、および、免疫−金試験からなし得る(図２)。これらの分析は、約１０５抗体分子が各細菌に結合し、このような濃度は、ファゴソーム内のミリモル濃度の抗体濃度と対応することを示唆する。このように、ほとんどの保守的な概算でさえ、ファゴソーム内の１Ｏ２ ＊と抗体の濃度は本明細書に記載する説明的例に使用するものを遙かに超える。
一重項分子酸素(１Ｏ２)はまた直接的および間接的方法で、殺菌過程中に発生する。一重項分子酸素(１Ｏ２)は直接的に、例えば、フラビンタンパク質オキシダーゼの作用を介して産生される(Allen, R. C., Stjernholm, R. L., Benerito, R. R. & Steele, R. H., eds. Cormier, M. J., Hercules, D. M. & Lee, J. (Plenum, New York), pp. 498−499(1973); Klebanoff, S. J. in The Phagocytic Cell in Host Resistance(National Institute of Child Health and Human Development, Orlando, FL)(1974))。あるいは、１Ｏ２は、ファゴソームで見られるような、低いｐＨの溶液中のＯ２ ●−の非酵素的不均化のような殺菌過程中に間接的に産生し得る(Stauff, J., Sander, U. & Jaeschke, W., Chemiluminescence and Bioluminescence, eds., Williams, R. C. & Fudenberg, H. H. (Intercontinental Medical Book Corp., New York), pp. 131−141(1973); Allen, R. C., Yevich, S. J., Orth, R. W. & Steele, R. H., Biochem. Biophys. Res. Commun., 60, 909−917(1974))。
１Ｏ２が非常に反応性であるため、以前は酸素−除去薬剤のカスケードの終点と見なされていた。しかしながら、抗体が、タンパク質のクラスとして、１Ｏ２を妨害し、効率的にそれを活性酸素種に還元する能力を有することが判明し、したがって、１Ｏ２が植栽棒作用中に救済され、再使用され、それにより免疫系の殺菌活性が増強される機構を提供する。
治療法
本発明は、活性酸素種を、微生物感染を阻害するため、創傷治癒を促進するため、細菌を融解するため、ウイルスを除去するため、癌細胞をオキシダント誘導融解の標的とするためおよび類似の過程のように、その産生が正当化されるときに、産生する方法を提供する。例えば、本発明は、食細胞性好中球により産生されたスーパーオキシド濃度の局所濃度を補うため、および、細菌感染またはウイルス感染と戦うための、活性酸素種の抗体介在産生を提供する。活性酸素種は、細菌、ウイルスまたは他の微生物を破壊する抗微生物薬剤として働く。このように、このプロセスを増強するために、活性酸素種の局所濃度の増加をもたらすために、抗体組成物をその領域に提供するために本発明の方法を使用し得る。
Ａ. 抗体活性の提供
活性酸素種を産生できる抗体の使用に基づく、本発明により意図される治療法は、１)微生物の増殖を阻害するか、または抗体が微生物に発現されている抗原を認識し、免疫反応する場所である患者中の微生物を標的として殺す、２)癌細胞の増殖を阻害するか、または抗体が癌細胞に発現されている抗原を認識し、免疫反応する場所である患者中の癌細胞を標的として殺す、３)例えば、炎症が細菌感染によるものであるか、対象が自己免疫性疾患を有するときの、対象中の好中球介在炎症が関連する組織傷害を阻害する、４)対象中の食細胞の殺菌効果を増強する、５)活性酸素種が繊維芽細胞増殖を刺激するおよび／または免疫応答がさらにリンパ球増殖を含むときの開口創を有する対象における創傷治癒を促進する、６)対象の創傷および類似の状況における繊維芽細胞増殖の刺激のような、細胞増殖を刺激することを含む。
ある態様において、本発明は微生物感染および、スーパーオキシドラジカル、ヒドロキシルラジカル、オゾンまたは過酸化水素のような活性酸素種の増強された産生により利益を受ける他の疾患の治療法を提供する。このような方法は、このような活性酸素種の産生が正当化される状況で、活性酸素種を産生するための任意の抗体を使用することを含み得る。ある実施態様において、微生物と結合するように特異的に標的化され、活性酸素種の産生を局在化できるようにする。
さらに、このような方法は、例えば、抗体が一重項酸素を活性酸素種に変換するためのさらなる反応部位を有するため、増加したレベルの活性酸素種を産生できるように加工された抗体を使用できる。二つの保存トリプトファン残基を有する加工されていない抗体と比較して、二つ以上の還元中心を有する加工された抗体分子の使用は、スーパーオキシドラジカル、ヒドロキシルラジカル、オゾンまたは過酸化水素のような活性酸素種の増加した産生が必要であるときに、正当化される。
さらに別の態様において、抗体は、本明細書に記載のように提供された、または、それとは別に、細胞に送達された発現ベクターから発現された組み換え抗体を使用できる。この内容における発現ベクターはまた増感分子を発現できる(下記参照)。
活性酸素種の抗体による産生のための最低限の要求は、酸素の存在であり、すなわち、好気条件が一般に必要である。一重項酸素の活性酸素種への生物学的変換は、可視光、赤外線光を含む光中で、および紫外線照射条件下で起こる。可視光条件を用いるとき、一重項酸素は、一重項酸素の供給源を提供できる他の分子の使用により増強できる。一重項酸素を産生する分子は、他の因子またはインデューサーの必要性なしに一重項酸素を産生する分子ならびにインデューサーへの暴露後に一重項酸素を産生する“増感剤”分子を含む。一重項酸素を他の因子またはインデューサーの必要性なしに産生する分子の例は、エンドペルオキシドを含むが、これに限定されない。ある実施態様において、用いるエンドペルオキシドは、アントラセン−９,１０−ジプロピオン酸エンドペルオキシドであり得る。増感分子の例は、プテリン、フラビン、ヘマトポルフィリン、テトラキス(４−スルフォナートフェニル)ポルフィリン、ビピリジルルテニウム(II)錯体、ローズベンガル色素、キノン、ローダミン色素、フタロシアニン、ヒポクレリン、ルブロシアニン、ピナシアノールまたはアロシアニンを含むが、これらに限定されない。
増感分子は、インデューサーに暴露されたときに一重項酸素の産生を誘発できる。一つのこのようなインデューサーは光である。このような光は、増感剤のタイプおよび構造に依存して、可視光、紫外線光または赤外線光であり得る。
本発明はさらにオゾン、スーパーオキシド、ヒドロキシルラジカルまたは過酸化水素を、このような活性酸素種が必要であるか、またはこれらが実質的に存在していない環境で作るための、抗体の使用に関する。一つの実施態様において、本発明は、微生物がこのような活性酸素種を一重項酸素から産生できる抗体を含む組成物と接触させる、微生物の増殖を阻害する方法を意図する。方法は、非特異的または免疫特異的(抗原結合)、全体またはフラグメント抗体を使用したとき、成功する。このような抗体フラグメントは、本明細書に記載の一本鎖抗体ならびに加工された分子および抗体を含む。しかしながら、微生物に対する局所活性が望まれるとき、抗体は、微生物に関連する抗原に特異的であり得る。例えば、抗体は、微生物表面の抗原に選択的に結合できる。
抗体組成物は、インビボで、微生物感染または、活性酸素種の暴露により利益を受け得る他の疾患または状態の対象に送達できる。好ましいインビボ送達法は、静脈内投与、局所投与、吸入による、挿管による、腔内投与、筋肉内投与、経皮投与、皮下投与または抗体含有リポソームによる投与を含む。
細胞表面での抗体濃度の例は、０.０１から５０マイクロモル濃度の範囲である。しかしながら、濃度は、提供された抗体の量が、所望の生理学的効果を得るため、すなわち、酸化的ストレスを産生するための過酸化水素、オゾン、スーパーオキシドラジカルまたはその誘導体オキシダントのような活性酸素種の産生に十分である、所望の結果に依存し得る。抗体組成物での治療的処置の投与およびタイミングは、下記の抗酸化剤に関する記載と同等である。
本発明の方法は、さらに、過酸化水素、オゾン、スーパーオキシドラジカルまたはそのオキシダント誘導体のような抗体介在活性酸素種を産生する方法において、抗体または抗体−抗原複合体を紫外線、赤外線または可視光に暴露することを意図する。
活性酸素種の産生を増強するために、増感剤、例えば、光増感剤の活性酸素種産生量を、本明細書に記載の治療法に利用できる。本明細書で定義のように、増感剤は一重項酸素を誘導するか濃度を増加させる任意の分子である。増感剤は、増感剤を活性化させるのに十分な時間紫外線、赤外線または可視光に暴露する工程である、照射の存在下使用できる。例示的な暴露時間および条件は実施例に記載する。
増感剤の活性酸素種産生量は、所望の生理学的効果、例えば、スーパーオキシド、オゾンまたは過酸化水素のような活性酸素種の一重項酸素からの抗体により介在される産生を、このような活性酸素種およびその誘導体の存在が正当化される任意の状況下で得るのに十分な増感剤の量である。ある態様において、増感剤は抗体と結合している。増感剤と結合した抗体は一般に抗原と結合でき、すなわち、抗体は活性抗原結合部位を保持し、抗原認識および複合体形成が起こるのを可能にする。
増感剤の例は、プテリン、フラビン、ヘマトポルフィリン、テトラキス(４−スルフォナートフェニル)ポルフィリン、ビピリジルルテニウム(ruthemium)(II)錯体、ローズベンガル色素、キノン、ローダミン色素、フタロシアニンおよびヒポクレリンを含むが、これらに限定されない。
さらなる態様において、活性酸素種の産生は、一重項酸素の産生を増強するための手段の投与により増強される。減少した一重項酸素は、過酸化水素、オゾン、スーパーオキシドラジカルまたはそのオキシダント誘導体のような活性酸素種の供給源である。一重項酸素の産生を増強するための一つの手段は、一重項酸素の産生に有用なすべての分子、化合物または試薬を含む、プロドラッグである。このようなプロドラッグは、本明細書に記載のように、抗体の所望の標的細胞、組織または臓器への投与または接触と同時に、または、時間的に連続して投与される。プロドラッグを抗体投与後に投与するとき、抗体はすでにその標的抗原と免疫反応する機会を有し、すでに抗体−抗原複合体を形成している可能性がある。一重項酸素の産生を増強する手段は、次いで過酸化水素、オゾン、スーパーオキシドラジカルまたはそのオキシダント誘導体のような活性酸素種の産生を、抗体−抗原認識部位で増強できる。この実施態様は、特に、例えば、所望の部位または局所での治療的に望ましいスーパーオキシド、オゾンまたは過酸化水素の局所蓄積を増やす能力のために有利である。
好ましいプロドラッグは、例えば、約１マイクロモル濃度から約５０マイクロモル濃度のエンドペルオキシドである。抗体−抗原複合体形成部位で達成されるエンドペルオキシドの好ましい濃度は約１０マイクロモル濃度である。
本発明の抗体の抗原標的は、当業者に既知のまたは利用可能なすべての抗原であり得る。抗原は、活性酸素種の存在およびその抗体介在過程が正当化される細胞、組織または臓器に存在する如何なる抗原であってもよい。抗原は溶液、例えば、細胞外液中に存在し得る。抗原は、例えば、タンパク質、ペプチド、脂肪酸、低密度リポタンパク質、炎症と関連する抗原、癌細胞抗原、細菌性抗原、ウイルス性抗原または類似の分子であり得る。
抗原が結合している細胞は、微生物、内皮、間質、上皮、筋肉、食細胞、血液、樹状細胞、結合組織および神経系細胞を含むが、これらに限定されない。
それゆえに、例えば、以下の標的微生物の感染を本発明の抗体により処置できる：アエロモナス属、バチルス属、バクテロイデス属、カンピロバクター属、クロストリジウム属、エンテロバクター属、エンテロコッカス属、エシェリキア属、螺旋菌属、ヘリコバクター属、クレブシエラ属、サルモネラ属、シゲラ属、ブドウ球菌、シュードモナス属、ビブリオ属、エルシニア属など。本発明の抗体により処置できる感染は、ブドウ球菌感染(黄色ブドウ球菌)、チフス(チフス菌)、食中毒(Ｏ１５７：Ｈ７のような大腸菌)、細菌性赤痢(志賀菌)、肺炎(緑膿菌および／またはシュードモナス・セパシア)、コレラ(コレラ菌)、潰瘍(ピロリ菌)、ネズミチフス菌などによるものを含む。大腸菌血清型０１５７：Ｈ７は、下痢、出血性大腸炎、溶血性尿毒症症候群(ＨＵＳ)および血栓性血小板減少性紫斑病(ＴＴＰ)の病因と関係する。本発明の抗体は、細菌の薬剤耐性および多剤耐性株、例えば、黄色ブドウ球菌の多剤耐性株ならびにエンテロコッカス・フェシウムおよびエンテロコッカス・フェカーリスのバンコマイシン耐性株に対しても活性である。
ある態様において、本発明の抗微生物組成物はグラム陰性細菌に対して使用する。さらなる態様において、抗微生物組成物はエシェリキア属、シュードモナス属、および／またはサルモネラ属に対して使用できる。例えば、抗微生物組成物は大腸菌、ネズミチフス菌、緑膿菌および他の関連細菌の異なるタイプに対して使用できる。
本発明の抗微生物組成物はまたウイルスに対して有効である。“ウイルス”なる用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルス、ウイロイドおよびプリオンを意味する。ウイルスは、エンベロープおよび非エンベロープウイルスの両方、例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、パポーバウイルス、パルボウイルス、レオウイルス、オルビウイルス、ピコルナウイルス、ロタウイルス、アルファウイルス、ルビウイルス、Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、パラミクソウイルス、モルビリウイルス、ニューモウイルス、ラブドウイルス、リッサウイルス、オルトミクソウイルス、ブンヤウイルス、フレボウイルス、ナイロウイルス、ヘパドナウイルス、アレナウイルス、レトロウイルス、エンテロウイルス、リノウイルスおよびフィロウイルスを含む。
細胞、組織、臓器または細胞外コンパートメントにおける活性酸素種の産生または増強により利益を受ける他の治療的状態は、当業者には既知である。例えば、このような状態は、McCord, Am. J. Med., 108: 652−659(2000)に記載され、その記載を出典明示により本明細書に包含させる。
抗微生物活性はまた、これらの種々の微生物に対して、当業者が利用可能な方法を使用して評価できる。抗微生物活性は、例えば、特定の微生物種の増殖を防止する本発明の抗体の最小阻止濃度(ＭＩＣ)により測定する。一つの態様において、抗微生物活性は、標準用量または用量応答曲線を使用して測定したとき、微生物の５０％を殺す抗体の量である。
本明細書に記載の抗体で微生物感染を処置するための治療的有効量を評価する方法は、インビトロで実質的に微生物増殖がない、抗体調製物の最小阻止濃度の決定を含む。このような方法は、微生物の増殖を阻止するためにまたは微生物の５０％を殺すために必要な容量あたりの抗体のおおよその量の計算を可能にする。このような量は、例えば、標準微量希釈法により決定できる。例えば、同量の培地と実質的に同量の微生物を含む一連の微生物培養試験管を調製し、抗体のアリコートを添加する。アリコートは、同容量の溶液中に異なる量の抗体を含む。微生物を１代から１０代に対応する期間培養し、培養培地中の微生物の数を測定する。
培養培地の光学密度はまた微生物増殖が起こっているかの評価に使用できる−光学密度に顕著な上昇が起こらないなら、微生物の顕著な増殖は起こっていない。しかしながら、光学密度が上昇したなら、微生物増殖は起こっている。抗体に暴露した後、いくつの微生物細胞が生存し続けるかを測定するために、少ないアリコートの培養培地を、抗体を添加したとき(０時間)およびその後一定間隔で取ることができる。培養培地のアリコートを微生物培養プレートに広げ、プレートを微生物増殖を促す条件下でインキュベートし、コロニーが出現したときはこれらのコロニーの数を計数する。
Ｂ. 望ましくない酸化の阻害
本発明はまた活性酸素種の抗体介在産生のマイナス効果を軽減する方法を提供する。
活性酸素種の抗体介在産生に影響する分子の使用は、望ましくない、有害な、障害を与える活性酸素種が抗体により産生されるあらゆる状況で適用できる。これらの状況に有用な分子は、一般に“抗酸化剤”と呼ばれ、オキシダントに拮抗作用を有する任意の分子と定義される。このように定義された抗酸化剤は、１)抗体介在スーパーオキシド産生の阻害剤、２)抗体介在過酸化水素産生の阻害剤、３)抗体介在オゾン産生の阻害剤、４)過酸化水素を反応性オキシダント誘導体に変換する反応の阻害剤；そして５)活性酸素種そのものの阻害剤を含む。
このような抗酸化剤は、反応性オキシダントを産生する酸素の活性化を阻止するものならびにすでに形成されたものを中和するものを含む。抗酸化作用は、触媒作用を含むあらゆる機構により起こり得る。カテゴリーとしての抗酸化剤は、酸素スカベンジャーまたはフリーラジカルスカベンカーを含む。抗酸化剤は、それらが必要であるときに利用できるようにするために、種々のタイプであり得る。好気性生物全体に酸素が存在するということを考慮すれば、抗酸化剤は、種々の細胞、組織、臓器および細胞外コンパートメントで利用可能である。後者は、細胞外液空間、眼液、滑液、脳髄液、胃腸分泌物、間質液、血液およびリンパ液を含む。抗酸化剤は生物内に存在するがまた食事に補うことにより、および、本発明の方法の使用により提供できる。ある態様において、用いる抗酸化剤は、アスコルビン酸、α−トコフェロール、γ−グルタミルシステイニルグリシン、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、α−リポ酸、ジヒドロリポエート、Ｂアセチル−５−メトキシトリプタミン、フラボンフラボン、フラボネン、フラバノール、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、メタロチオネインおよびブチル化ヒドロキシトルエンを含むが、これらに限定されない。他の態様において、本発明の方法の意味で抗酸化剤として機能する能力を有する分子は、還元一重項酸素からスーパーオキシドフリーラジカルを産生する能力が減少した、または、好ましくは全く存在しない加工された抗体である。このような抗体分子は、本明細書に記載されている。
抗酸化剤の使用は、抗酸化剤がオキシダントまたは活性酸素産生物の障害を予防し、制御し、最小にし、減少し、または阻害するために必要な状況を対象とする。このように、本発明は、組織、例えば、抗体で処置する部位の周囲の健康な組織における活性酸素種の抗体介在産生の低減のための、抗酸化剤の使用を意図する。このような状況において、介入を行わなければ、細胞障害は、例えば、炎症性条件、外傷条件、臓器移植などでもたらされ得る。
加工された抗体を抗酸化剤として用いる状況下で、スーパーオキシド、オゾンまたは過酸化水素のような活性酸素種を産生する能力が減少したまたは実質的に有しない抗体は、一重項酸素を還元する還元中心を欠くため、過剰なスーパーオキシド産生によりもたらされるさらなる組織障害を誘発することなく、所望の免疫応答を促進することにおいて、治療的利益を提供する。加工された治療用抗体組成物は抗原結合部位を保持することができ、特定の抗原へのターゲティングが所望の治療的利点と合わせて達成される。
本発明はさらに対象における酸化的ストレスを軽減する方法および対象における症状がオキシダントの産生と関連している症状を軽減する方法を意図する。本発明の抗酸化剤により活性酸素種の抗体介在産生を阻害するのが治療法である状態の例は、異常な平滑筋障害の阻害、肝臓疾患の阻害、癌細胞の増殖、放射線療法を受けている癌患者における炎症の阻害、炎症性疾患(関節炎、脈管炎、糸球体腎炎、全身性エリテマトーデスおよび成人呼吸窮迫症候群)、虚血疾患(心臓疾患、卒中、腸虚血および再潅流傷害)、ヘモクロマトーシス、後天性免疫不全症候群、気腫、臓器移植、胃潰瘍、高血圧、子癇前症、神経疾患(多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症および筋ジストロフィー)、アルコール中毒および喫煙関連疾患を含むが、これらに限定されない。
酸化的ストレスが有害である細胞は、内皮、間質、上皮、筋肉(平滑筋、骨格筋または心筋)、食細胞(好中球およびマクロファージを含む)、白血球、樹状細胞（dendritic）、結合組織および神経系細胞を含むがこれらに限定されない。影響を受ける組織は、筋肉、神経、皮膚、腺、間充織、脾臓、硬結性、上皮および内皮組織を含むが、これらに限定されない。
本発明に記載の抗体によるオキシダントの産生に関係する以外の、酸化的ストレスにより誘発される種々の状態を処置するための抗酸化剤および酸素スカベンジャーの使用は、米国特許５,３６２,４９２；５,５９９,７１２；５,６３７,３１５；５,６４７,３１５；５,７４７,０２６；５,８４８,２９０；５,９９４,３３９；６,０３０,６１１および６,０４０,６１１に記載され、これらの特許の記載は出典明示により本明細書に包含させる。このような引用文献は、本発明の抗酸化剤の治療的使用をサポートする。
抗体
本発明は治療用抗体を提供する。血漿タンパク質のファミリーに属する全ての抗体分子を免疫グロブリンと呼ぶ。その構造基礎単位、免疫グロブリン折りたたみまたはドメインは、種々の形で、免疫系および他の生物学的認識系の多くの分子で使用される。典型的免疫グロブリンは４つのポリペプチド鎖を含み、可変領域として既知の抗原結合領域を含み、かつ定常領域として既知の変化しない領域を含む。本発明での使用を意図される抗体は、全免疫グロブリン、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ')２、他のフラグメント、および可変ドメイン相補性決定領域(ＣＤＲ)を含む一本鎖抗体または他の形を含む、任意の種々の形であり得る。これらの用語の全ては、本明細書で使用する“抗体”の広い範囲に入る。本発明は、ポリクロナールであれ、モノクロナールであれ、抗体のあらゆる特異性の使用を意図し、特異的抗原を認識し、免疫反応する抗体に限定されない。好ましい態様において、本明細書に記載の治療法およびスクリーニング法の両方で、抗原に対して免疫特異的である抗体またはそのフラグメントが使用される。
本発明で使用する“抗体”なる用語は、完全な分子だけでなく、エピトープを結合できるＦａｂ、Ｆ(ａｂ')２およびＦｖのようなそのフラグメントを含む。これらの抗体フラグメントは、その抗原またはレセプターと選択的に結合するある程度の能力を保持し、以下のように定義される：
(１)抗体分子の一価の抗原結合フラグメントを含有し、全抗体のパパイン酵素による消化により、完全な軽鎖と一つの重鎖の一部をって産生され得るフラグメントであるＦａｂ；
(２) 全抗体のペプシンによる処理およびそれに続く還元によって、完全な軽鎖および重鎖の一部をもって得られるフラグメントであるＦａｂ'であって、抗体１分子あたり２個のＦａｂ'フラグメントが得られる；
(３) 全抗体を酵素ペプシンで処理し、これに続く還元を行わないで得られる抗体のフラグメントである(Ｆａｂ')２であって、Ｆ(ａｂ')２は、２個のジスルフィド結合によって相互に結合された２個のＦａｂ'フラグメントのダイマーである；
(４)２個の鎖として発現される、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含有する遺伝子的に加工されたフラグメントとして定義されるＦｖ；および
(５)遺伝子的に融合された一本鎖分子として適当なポリペプチドリンカーによって結合された、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含有する遺伝子的に加工された分子として定義される１本鎖抗体(“ｓＦｖ”)。
ポリクローナル抗体の調製は、当業者には既知である。例えば：出典明示により本明細書の一部とするGreen, et al., Production of Polyclonal Antisera, in: Immunochemical Protocols(Manson, ed.), pages 1−5(Humana Press); Coligan, et al., Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats Mice and Hamsters, in: Current Protocols in Immunology, section 2.4.1(1992)を参照。
モノクローナル抗体の調製もまた慣用的である。例えば：出典明示により本明細書の一部とするKohler & Milstein, Nature, 256: 495(1975); Coligan, et al., sections 2.5.1−2.6.7; and Harlow, et al., in: Antibodies: Laboratory Manual, page 726(Cold Spring Harbor Pub. (1988))を参照。モノクローナル抗体は、種々の確立された技術によってハイブリドーマー培養物から単離し、精製され得る。このような単離技術は、プロテインＡセファロース、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを用いるアフィニティークロマトグラフィーを含む。例えばColigan, et al., sections 2.7.1−2.7.12 and sections 2.9.1−2.9.3; Barnes, et al., Purification of Immunoglobulin G(IgG), in: Methods in Molecular Biology, Vol. 10, pages 79−104(Humana Press(1992)参照。
本発明はまたさらなる還元中心を含むように変えられている加工された抗体を含む加工された治療用分子を含む。このような加工された抗体分子は、不十分な量の抗体または活性酸素種が存在するときに使用される。このように加工された治療用分子は、分子または抗体に天然に存在するものと比較して、増加した数の還元中心を有するように加工できる。
加工された分子または抗体への還元中心の挿入は、当業者に既知の方法により達成される。組み換え発現法ならびに直接タンパク質合成法を含む好ましい手段が、以前に記載されている。方法の選択は、加工された分子の長さに依らなければならない。用いる方法と無関係に、加工された還元中心の位置、すなわち、挿入場所は、加工された分子が一重項酸素に大して活性の減少を示す能力に基づいて決められる。好ましくは、導入された還元中心は、それらが折りたたまれた分子内に深く包埋され、かつそのために活性酸素種産生が維持され、または増強されるように位置させる。一つの態様において、加工された抗体は抗原結合機能を保持し、そして加工された還元中心の位置は、可変結合ドメインに隣接する。ある態様においては、１個の還元中心が意図される。他の態様においては、２個の還元中心が意図される。さらに、他の態様においては、３個以上の還元中心が意図される。好ましくは、還元中心はインドールを含む。また意図されるのは、トリプトファン残基に存在するようなインドール部分を有する還元中心である。このような還元中心を分子または抗体中に産生する任意の技術が、本発明での使用を意図される。好ましい実施態様において、置換ヌクレオチドが、コード分子の予定した位置でトリプトファン残基をコードするように、加工された抗体をコードするヌクレオチド配列の部位特異的変位誘発により還元中心を挿入する。
所望の還元中心を含む抗体のような加工された分子を調製する態様において、組み換え法により産生された分子もまた融合接合体の形であることが意図され、この場合、接合体は本明細書に記載の治療法に使用するために、本明細書に記載のような増感剤を提供できる。
本発明の方法にしたがい機能する還元中心を含む任意のタンパク質またはポリペプチドおよび／または増感分子であり得る加工された抗体または他の分子が、本明細書に記載の任意の方法のために意図されている。
モノクローナル抗体のインビトロおよびインビボの加工方法は、当業者には既知である。ひとつの特定の操作は、ヒト特異的で認識可能な配列を含有する抗体を産生するためにモノクローナル抗体を組換え手段によってヒト化する方法を含む。レビューのためにHolmes, et al., J. Immunol., 158: 2192−2201(1997)and Vaswani, et al., Annals Allergy, Asthma & Immunol., 81: 105−115(1998)参照。
抗体フラグメントを作成する方法は、当業者には既知である(例えば、出典明示により本明細書中の一部とするHarlow and Lane, Antibodies: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1988)を参照のこと)。本発明の抗体フラグメントは、抗体のタンパク質の加水分解、もしくは、そのフラグメントをコードするＤＮＡの大腸菌による発現によって調製し得る。抗体フラグメントは、ペプシンもしくはパパイン消化により慣用法で得られる。例えば、抗体フラグメントは、ペプシンを用いる酵素的開裂によって産生され、Ｆ(ａｂ')２と呼ばれる５Ｓフラグメントを提供し得る。このフラグメントは、チオール還元剤、および、所望により、ジスルフィド結合の開裂により生じるスルフィドリル基に対するブロッキング基を用いれば、３.５Ｓ Ｆab'一価フラグメントを得る。あるいは、ペプシンを用いる酵素的開裂は、２個の一価のＦab'フラグメントおよびＦｃフラグメントを直接産生する。これらの方法は、例えば；米国特許４,０３６,９４５および米国特許４,３３１,６４７に記載されている。これらの特許文献は出典明示により本明細書の一部とする。
そのフラグメントが元の抗体によって認識される抗原に結合する限り、抗体を開裂する他の方法、例えば、一価の軽−重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる開裂、または他の酵素的、化学的、もしくは遺伝子的技術も使用し得る。例えば、ＦｖフラグメントはＶＨおよびＶL鎖の会合を含む。この会合は非共有結合であり、または可変鎖が、分子間ジスルフィド結合によって結合されてもよく、または化学物質、例えばグルタルアルデヒドによって架橋されてもよい。好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーによって連結されるＶＨおよびＶL鎖を含む。これらの一本鎖抗原結合タンパク質(ｓＦｖ)は、オリゴヌクレオチドによって連結されるＶＨおよびＶLドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子は、発現ベクター中に挿入され、これは、次に宿主細胞、例えば大腸菌中に導入される。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインをつなぐリンカーペプチドとともに１本のポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖｓを産生する方法が、例えば、Whitlow, et al., Methods: Companion to Methods in Enzymology, Vol. 2, page 97(1991); Bird, et al., Science, 242: 423−426(1988); Ladner, et al, 米国特許４,９４６,７７８; およびPack, et al., Bio/Technology, 11: 1271−77(1993)に記載されている。
抗体フラグメントの別の形態は、１本の相補的な相補性決定領域(ＣＤＲ)をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド(“最小認識部位”)は、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得られ得る。このような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いることによって調製され、抗体産生細胞のＲＮＡからの可変領域を合成する。例えば、Larrick, et al., Methods: Companion to Methods in Enzymology, Vol. 2, page 106(1991)を参照。
本発明は、ヒトおよび非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形態を意図する。このようなヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント(Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２または抗体の他の抗原−結合部分配列)である。ほとんどの部分で、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種のＣＤＲ(ドナー抗体)由来の残基で置換されている、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。
いくつかの場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体でも挿入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列でも見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに改善し、最適化するために成す。一般に、ヒト化抗体は少なくとも１個の、そして典型的には２個の可変ドメインの実質的に全てを含み、この中で、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てまたは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列である。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含む。さらなる詳細のために：Jones et al., Nature 321, 522−525(1986); Reichmann et al., Nature 332, 323−329(1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593−596(1992); Holmes, et al., J. Immunol., 158: 2192−2201(1997) and Vaswani, et al., Annals Allergy, Asthma & Immunol., 81: 105−115(1998)参照。
本発明はまたその親和性、選択性、結合強度、活性酸素種産生または他の望ましい特性を最適化するために抗体を変異させる方法を提供する。変異体抗体は、抗体のアミノ酸配列変異体を意味する。一般に、変異体抗体中のアミノ酸残基の１個またはそれ以上が対応抗体に存在するものと異なる。このような変異体抗体は、対応アミノ酸配列と、必ず１００％より少ない配列同一性または類似性を有する。一般に、変異体抗体は、対応抗体の重または軽鎖可変ドメインのいずれかのアミノ酸配列と、少なくとも７５％アミノ酸配列同一性または類似性を有する。好ましくは、変異体抗体は、対応抗体の重または軽鎖可変ドメインのいずれかのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、よりさらに好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％アミノ酸配列同一性または類似性を有する。
抗体を変異させる一つの方法は、ファージ提示法を使用した親和性成熟を含む。ファージ提示法を使用した親和性成熟は、Lowman et al., Biochemistry 30(45): 10832−10838(1991), see also Hawkins et al., J. Mol Biol. 254: 889−896(1992)に記載の方法に対応する。以下の記載に厳密に限定されるものではないが、この方法は、各部位に全ての可能性のあるアミノ酸置換を産生することを目的とした、多くの数の異なる部位における数個の抗体超可変領域の変異を含むとして簡単に記載できる。このようにして産生した抗体変異体は、融合タンパク質として繊維状ファージ粒子から一価形態で提示される。融合は一般にＭ１３の遺伝子IIＩ産生物を作る。種々の変異体を発現するファージは、目的の性質、例えば結合親和性または選択性を選択するための数ラウンドを回転させ得る。目的の変異体を単離し、配列決定する。このような方法は、米国特許５,７５０,３７３、米国特許６,２９０,９５７およびCunningham, B. C. et al., EMBO J. 13(11), 2508−2515(1994)に詳述されている。
本発明の治療用抗体(またはそのフラグメント)の調製は、組換え体発現技術、タンパク質合成により達成でき、この方法は当分野の技術者には既知である。組換法によるためには、それらの抗体またはフラグメントをコードする核酸の変異が種々の手段によって行われ得るが、予定された部位に変異を挿入し、それが発現した分子において変化したアミノ酸配列をコードするように設計した変異オリゴヌクレオチドを用いてもっとも簡単に行われる。このような変更は、コードされたアミノ酸残基の配列の置換、付加、および／または欠失を同様にコードする特定のヌクレオチド配列の置換、付加、および／または欠失を含む。部位指定変異法はオリゴヌクレオチド指定変異法とも呼ばれ、それらの変法ならびにそれに続く変化した遺伝子のクローニングは、既知の技術である(Sambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual, 2nd ed., Chapter 15, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989))。別の組換え法は、長いオリゴヌクレオチド鎖を組み合わせ、続いてアニーリングし、そしてクローニングおよび発現するのに適当な２本鎖ＤＮＡに変換することによる、本発明の治療用分子をコードする遺伝子を合成することを含む(Ausebel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Units 10 and 15, Wiley and Sons, Inc. (2000))。このような技術を用いて、還元中心を含み、一重項酸素から過酸化水素またはスーパーオキシドを産生し得る加工された分子を作成することができる。このような加工された分子が、抗体構造に基づいて、そして過酸化水素の場合はＴ細胞レセプターに基づいて、設計され得ることが意図されている。
このように、本発明は、所望の位置において、より多くのスーパーオキシドフリーラジカル、オゾンままたは過酸化水素を産生するために加工された抗体を意図する。抗体は、本明細書中の実施例ＩおよびIIに記載の付加的還元中心を含有し、スーパーオキシドフリーラジカルまたは過酸化水素への一重項酸素の還元を増加するように加工される。また、本発明は、一重項酸素から、スーパーオキシドフリーラジカルまたは過酸化水素を産生する能力を少なくとも減少させるように加工した抗体も意図する。この意味で、この抗体は、少なくとも１つのその還元中心を欠き、好ましくは、還元中心を実質的に含まない。このような抗体組成物は、当分野の技術者には既知の方法によって容易に調製される。
所望により、治療用組成物として使用するために、または本発明方法において調製されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、当該ポリペプチドもしくは当該抗体から生じたペプチドと結合するマトリックスへの結合とそこからの溶出によりさらに精製されてもよい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の精製および／または濃縮のための免疫学的方法における一般的な種々の技術は、当業者には既知である(Coligan, et al., Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, (1991))。
組成物
本発明の抗体、抗酸化剤および酸素スカベンジャーは、種々の許容される組成物に製剤され得る。このような医薬組成物は、ヒト患者のような哺乳類宿主に、選択した投与経路、すなわち、経口的または非経腸的に、静脈内、筋肉内、局所または皮下経路により投与するのに適した形で投与できる。
化合物、例えば、抗酸化剤および酸素スカベンジャー化合物が、安定な非毒性酸または塩基塩を形成するために十分に塩基性または酸性である場合、このような化合物の塩としての投与が適当であり得る。薬学的に許容され得る塩の例示は、薬理学的に許容され得るアニオン、例えば、トシル酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、スクシン酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩およびα−グリセロホスフェートを形成する酸と形成された有機酸の付加塩である。適当な無機塩も形成でき、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩および炭酸塩を含む。
薬学的に許容され得る塩は、通常の当業者には既知の方法、例えば、生理学的に許容し得るアニオンを与える適当な酸と、アミンのような十分な塩基性化合物との反応による方法を用いて得られる。カルボン酸のアルカリ金属(例えば、ナトリウム、カリウムまたはリチウム)またはアルカリ土類金属(例えば、カルシウム)塩も作られる。
このように、本抗体および化合物は、全身的、例えば、経口的に、薬学的に許容され得る賦形剤、例えば、不活性希釈剤または同化性食用担体などを組み合わせて、投与され得る。それらは、硬質もしくは軟殻のゼラチンカプセルに封入されてもよく、錠剤に圧縮されてもよく、または患者の食事に直接混和されてもよい。経口治療的投与に関して、抗体、抗酸化剤および酸素スカベンジャーは、１つまたはそれ以上の賦形剤と組み合わせ、経口摂取用(ingestible)錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハーなどの形態で使用され得る。このような組成物および製剤は、少なくとも０.１％の活性化合物を含有するべきである。組成物および製剤のパーセンテージは、もちろん変化し、簡便には、提供される単位用量形態の約２から約６０重量％の間であり得る。このような治療的に有用な組成物中の抗体、抗酸化剤および酸素スカベンジャーの量は、有効な用量レベルが得られる量である。
また、錠剤、トローチ、ピル、カプセルなどは次のものを含有し得る：結合剤、例えばトラガカントガム、アカシアガム、コーンスターチまたはゼラチン；賦形剤、例えばリン酸二カルシウム；崩壊剤、例えばコーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸など；潤択剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム；および甘味剤、例えば、スクロース、フルクトース、ラクトースまたはアスパルテーム、または香味剤、例えば、ペパーミント、冬緑油またはチェリー香料を添加し得る。単位用量形態がカプセルであるとき、カプセルは、さらに上記のタイプの物質に加えて、液体担体、例えば、植物油またはポリエチレングリコールを含み得る。種々のその他の物質が、被覆剤として、またそうでなければ、固体単位用量形態の物理形態を修飾するために存在してもよい。例えば、錠剤、ピルまたはカプセルは、ゼラチン、ワックス、セラックまたは糖などで被覆され得る。シロップまたはエリキシルは、活性化合物、甘味剤としてスクロースまたはフルクトース、保存剤としてメチルおよびプロピルパラベン、着色剤およびチェリーまたはオレンジフレーバーなどの香味剤を含有し得る。もちろん、任意の単位用量形態を調製する際に使用される全ての物質は、用いた量で薬学的に許容され得、かつ実質的に非毒性であるべきである。さらに、活性化合物は、徐放性剤および装置に挿入されてもよい。
創傷治癒のために、対象の傷への局所適用を用いることができる。抗体を含む組成物を傷に直接適用でき、または、バンデージに塗ってそれを傷に当てることができる。
また、活性化合物は、輸液または注射によって、静脈内もしくは腹腔内に投与され得る。活性化合物またはその塩の溶液は、所望により、非毒性界面活性剤と混合した水で調製され得る。また、分散剤は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、およびそれらの混合物中、および油中で調製され得る。貯蔵および使用に関する通常の条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防御するために保存剤を含有する。
注射または輸液のために適当な医薬投与形態は、滅菌水性溶液または分散剤、または注射用または輸注用滅菌溶液または分散剤の即時調製製剤に適し、所望によりリポソームに封入された活性成分を含む滅菌粉末を含む。全ての例において、最終的な投与形態は、製造および貯蔵の条件下で、無菌、流体および安定であるべきである。液体担体または賦形剤は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど)、植物油、非毒性グリセリルエステルおよびそれらの適当な混合物を含む溶液または液体分散媒体であり得る。適当な流動性は、例えば、リポソームの形成によって、分散剤の例においては所望の粒子サイズの維持によってまたは界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロザールなどによって得られる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、緩衝液または塩化ナトリウムを含むのが好ましい。注射用組成物の延長した吸収時間は、吸収遅延剤、例えばステアリン酸アルミニウム(Ｉ)およびゼラチンの組成物中の使用によってもたらされ得る。
無菌注射用溶液は、必要に応じて上記した種々の他の成分と共に適当な溶媒中に、必要な量の抗体、抗酸化剤または酸素スカベンジャーを包含し、続いて滅菌濾過することにより調製する。無菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製のための好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これは、抗体、抗酸化剤または酸素スカベンジャーに加えて、予め濾過滅菌した溶液中に存在する全て所望の成分を粉末にする。
局所投与のために、抗体、抗酸化剤または酸素スカベンジャーは純粋形で、すなわち、それらが液体である場合には、適用し得る。しかしながら、一般に、組成物または製剤として、固体または液体であり得る皮膚科学的に許容される担体との組み合わせで、皮膚に投与するのが望ましい。
有用な固体担体は、粉砕された固体、例えば、タルク、クレイ、微結晶性セルロース、シリカ、アルミナなどを含む。有用な液体担体は、水、アルコールまたはグリコールまたは水−アルコール／グリコール混合物を包含し、この中に本発明の抗体、抗酸化剤または酸素スカベンジャーは、有効レベルで、所望により、非毒性界面活性剤の助けによって、溶解され得るか、分散され得る。香料などのアジュバンドおよび付加的抗菌剤は、所定の使用に対して特性を最適化するために添加できる。得られる液体組成物は、バンデージおよびその他の外傷用医薬材料を浸透するために使用して吸収パッドから適用されるか、または、ポンプタイプまたはエアゾールスプレーを用いて罹患箇所に噴霧され得る。
濃厚剤、例えば、合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩およびエステル、脂肪アルコール、修飾されたセルロースまたは修飾された鉱物を、使用者の皮膚に直接適用するために、伸展性のペースト、ゲル、軟膏、石鹸などを形成するように液体担体と共に用い得る。
本発明の抗体、抗酸化剤または酸素スカベンジャーを皮膚に送達するのに使用できる有用な皮膚科学的組成物の例は、当業者に既知である；例えば、Jacquet et al. (米国特許４,６０８,３９２)、Geria(米国特許４,９９２,４７８)、Smith et al. (米国特許４,５５９,１５７)およびWortzman(米国特許４,８２０,５０８)参照。
本発明の抗体、抗酸化剤または酸素スカベンジャーの有用な用量は、動物モデルにおけるそれらのインビボ活性およびインビトロ活性を比較することによって決定し得る。マウスおよび他の動物における有効用量のヒトへの外挿法は当業者に既知である；例えば、米国特許４,９３８,９４９参照。
一般に、ローションのような液体組成物中の本発明の抗体、抗酸化剤または酸素スカベンジャーの濃度は、約０.１−２５重量％、好ましくは約０.５−１０重量％である。ゲルまたは粉末のような半固体または固体組成物における濃度は、約０.１−５重量％、好ましくは約０.５−２.５重量％である。
処置において、処置に必要な抗体、抗酸化剤または酸素スカベンジャー、またはそれらの活性な塩または誘導体の量は、選択される特定の塩によってだけでなく、投与の経路、処置される症状の性質および患者の年齢および症状によっても変化し、そして最終的には担当医または臨床医が決定する。
しかしながら、一般的には、適当な用量は、１日あたり、約０.５から約１００mg／体重kg、例えば、１日あたり、約１０から約７５mg／患者の体重kg、例えば３から約５０mg／kg、好ましくは６から９０mg／kg／日、最も好ましくは１５から６０mg／kg／日の範囲である。
抗体、抗酸化剤または酸素スカベンジャーは簡便には単位用量形態で投与する；例えば、単位用量形態あたり、活性成分が５から１０００mg、有利には１０から７５０mg、最も有利には５０から５００mg存在する。
理想的には、抗体、抗酸化剤または酸素スカベンジャーは、約０.５から約７５μＭ、好ましくは約１から５０μＭ、最も好ましくは、約２から約３０μＭの活性化合物のピーク血漿濃度を達成するように投与すべきである。これは、例えば、０.０５から５％の抗体、抗酸化剤または酸素スカベンジャーの溶液の所望により生理食塩水の静脈注射によって達成されるか、または約１−１００mgの抗体、抗酸化剤または酸素スカベンジャーを含有するボーラスとして経口的に投与され得る。所望の血中レベルは、約０.０１−５.０mg／kg／時間を供する連続輸液によって維持されるか、約０.４から１５mg／kgの抗体、抗酸化剤または酸素スカベンジャーを含有する断続的な輸液によって維持される。
所望の用量は、単回用量、または適切な間隔、例えば１日あたり、２回、３回、４回以上の分割した用量として投与される分割用量として、適切に提供し得る。分割用量それ自身は、例えば、吸入器からの複数回吸入または眼への複数滴の投与のような一連の大まかな間隔をおいた投与にさらに分割し得る。
好ましい態様において、抗酸化剤は細胞に入り、そして過酸化水素と反応し、それによって、細胞中の過酸化水素濃度を減少させる。別の態様において、抗酸化剤は細胞に入るかまたは周囲の外部細胞環境中に存在し、過酸化水素から産生したオキシダントと反応する。
本発明の治療用組成物、本明細書中に記載のオキシダント、抗体(加工された抗体、および抗体活性を増進するために本明細書に記載のような付加的還元中心を含有する他の分子の両方を含む)を、投与製剤に適合する方法で、かつ治療上有効量で投与する。投与される量およびタイミングは、治療される対象、活性成分を利用する対象の全身的能力、および望まれる治療効果の程度に依存する。投与されるのに必要な活性成分の正確な量は医師の判断に依存し、各々個体について特異的である。しかし、種々のタイプの適用に関する適当な用量範囲は、投与経路に依存する。投与についての適当なレジメンは変えることが可能であるが、治療用処置の所望の結果を生じるように初回投与に続く間隔をおいての反復投与によって類型化される。
本発明における使用に対して意図された抗酸化剤または酸素スカベンジャーは、例えばリポソームのような組成物の形で、所望の結果を仲介するために目的の部位に送達でき、その製剤はリポソーム−介在送達に関する当分野の技術者には既知である。別の送達手段は、静脈的に、局所的に、経口的に、吸入によって、挿管によって、腹腔内に、筋肉内に、経皮的および皮下的に投与することを含むが、これに限定するものではない。
本発明の治療用組成物は、生理学的に許容できる担体と共に、その中に活性成分として溶解または分散した、本明細書に記載のような抗酸化剤、または本明細書に記載のような抗体を含有する。好ましい実施態様において、治療用組成物は、哺乳類またはヒト患者に医療目的のために投与されるとき、免疫原性ではない。
組成物中で溶解されるかまたは分散された活性成分を含有する医薬組成物の調製は、当分野では十分に理解されており、剤形によって限定される必要はない。典型的に、このような組成物は、液体溶液または縣濁液として、注射用に調製されるが、しかし、使用前に液体中で、溶液または懸濁液とするのに適した固体形態も調製され得る。また、該製剤は乳化され得る。
活性成分は、本明細書中に記載の治療法において使用するために適切な量で、医薬上許容し得るかつ活性成分と共存し得る賦形剤と共に混合され得る。適当な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、所望により、組成物は、活性成分の有効性を増強する少量の補助的物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などを含有し得る。
本発明の治療用組成物は、組成物中の成分の薬学的に許容され得る塩を包含し得る。薬学的に許容され得る塩は、無機酸(例えば、塩化水素またはリン酸)、有機酸(酢酸、酒石酸、マンデリン酸など)と形成される酸付加塩(ポリペプチドの遊離アミノ基で形成される)を含む。また、遊離カルボキシル基と形成された塩は、無機塩(例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは鉄水酸化物)、有機塩(例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど)から誘導され得る。
生理学的に許容され得る担体は当分野では既知である。液体担体の例示は、活性成分および水、または緩衝溶液、例えば、生理的ｐＨ値のリン酸ナトリウム、生理食塩水または両方、例えばリン酸緩衝生理食塩水以外に他の物質を含まないない滅菌水性溶液である。また、さらにまた、水性担体は、１つ以上の緩衝用塩ならびに例えば、ナトリウムおよびカリウムのような塩、デキストロース、ポリエチレングリコールおよび他の溶質を含有し得る。
また、液体組成物は、水に加えて、または水以外に液体相を含有し得る。このような負荷的な液体相の例は、グリセリン、綿実油のような植物油、水−油エマルジョンである。
細胞、組織または器官に加えて細胞外区画において、抗体介在オキシダント産生の抗酸化剤による阻害が利益となる他の治療的状態は、当分野の技術者には既知であり、出典明示により本明細書の一部とするMcCord, Am. J. Med., 108: 652−659 (2000)およびBabior et al., Am. J. Med., 109: 33−44 (2000)にレビューされている。
本発明は、下記の実施例を非限定的に引用してさらに詳細に説明される。本発明はそれらの好ましい特定の実施態様を引用して詳細に説明しているが、修飾および変法は明細書中に記載の精神および特許請求の範囲内であると解されるべきである。
実施例Ｉ：抗体は抗原を破壊する固有の能力を有する
材料および方法
抗体：下記の全抗体をPharMingenから得た：４９.２(マウスＩｇＧ２ｂκ)、Ｇ１５５−１７８(マウスＩｇＧ２ａκ)、１０７.３(マウスＩｇＧ１κ)、Ａ９５−１(ラットＩｇＧ２ｂ)、Ｇ２３５−２３５６(ハムスターＩｇＧ)、Ｒ３−３４(ラットＩｇＧκ)、Ｒ３５−９５(ラットＩｇＧ２ａκ)、２７−７４(マウスＩｇＥ)、Ａ１１０−１(ラットＩｇＧ１λ)、１４５−２Ｃ１１(ハムスターＩｇＧグループ１κ)、Ｍ１８−２５４(マウスＩｇＡκ)、ＭＯＰＣ−３１５(マウスＩｇＡλ)。下記を Pierce から得た：３１２４３(ヒツジＩｇＧ)、３１１５４(ヒトＩｇＧ)、３１１２７(ウマＩｇＧ)、３１１４６(ヒトＩｇＭ)。
以下のＦ(ａｂ’)２フラグメントをPierceから得た：３１１２９(ウサギＩｇＧ)、３１１８７(ウサギＩｇＧ)、３１２１４(ヤギＩｇＧ)、３１１６５(ヤギＩｇＧ)、３１２０３(マウスＩｇＧ)。タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、トリプシン−キモトリプシン阻害剤(Bowman−Birk阻害剤)、β−ラクトグロブリンＡ、α−ラクトアルブミン、ミオグロブリン、β−ガラクトシダーゼ、チキンエッグ・アルブミン、アプロチニン、トリプシノゲン、レクチン(ピーナッツ)、レクチン(Jacalin)、ＢＳＡ、スーパーオキシドディムスターゼ、カタラーゼをSigmaから得た。リボヌクレアーゼＩＡをAmersham Pharmaciaから得た。下記の免疫グロブリンをハイブリドーマ法により社内で作成した：ＯＢ２−３４Ｃ１２(マウスＩｇＧ１κ)、ＳＨＯ１−４１Ｇ９(マウスＩｇＧ１κ)、ＯＢ３−１４Ｆ１(マウスＩｇＧ２ａκ)、ＤＭＰ−１５Ｇ１２(マウスＩｇＧ２ａκ)、ＡＤ１−１９Ｇ１(マウスＩｇＧ２ｂκ)、ＮＴＪ−９２Ｃ１２(マウスＩｇＧ１κ)、ＮＢＡ−５Ｇ９(マウスＩｇＧ１κ)、ＳＰＦ−１２Ｈ８(マウスＩｇＧ２ａκ)、ＴＩＮ−６Ｃ１１(マウスＩｇＧ２ａκ)、ＰＲＸ−１Ｂ７(マウスＩｇＧ２ａκ)、ＨＡ５−１９Ａ１１(マウスＩｇＧ２ａκ)、ＥＰ２−１９Ｇ２(マウスＩｇＧ１κ)、ＧＮＣ−９２Ｈ２(マウスＩｇＧ１κ)、ＷＤ１−６Ｇ６(マウスＩｇＧ１κ)、ＣＨ２−５Ｈ７(マウスＩｇＧ２ｂκ)、ＰＣＰ−２１Ｈ３(マウスＩｇＧ１κ)、ＴＭ１−８７Ｄ７(マウスＩｇＧ１κ)。ＤＲＢポリクローナル(ヒトＩｇＧ)およびＤＲＢ−ｂ１２(ヒトＩｇＧ)はDennis R. Burton(The Scripps Research Insutitute)から提供された。１Ｄ４Ｆａｂ(結晶)はIan A. Wilson(The Scripps Research Insutitute)から提供された。
全てのアッセイをＰＢＳ(１０ｍＭリン酸／１６０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７.４)中で実施した。市販のタンパク質溶液は必要に応じてＰＢＳ中に透析した。Amplex Red過酸化水素アッセイキット(Ａ−１２２１２)をMolecular Probesから得た。
抗体／タンパク質照射：特記しない限り、アッセイ溶液(１００μl、６.７μＭタンパク質のＰＢＳ液、ｐＨ７.４)をガラスバイアルに入れ、ネジ蓋で密封し、ＵＶ(３１２nm、８０００μＷcm−２ Fischer−Biotechトランスイルミネーター)または可視光を照射した。
過酸化水素についての定量アッセイ：タンパク質溶液のアリコート(２０μl)を取り、反応緩衝液(８０μl)を含有する９６−ウェルマイクロタイタープレート(Costar)のウェルに加えた。作業溶液(１００μl／４００μＭ Amplex Red試薬１／２単位／mlホースラディッシュ・スパーオキシダーゼ)を加え、プレートを暗所で３０分間インキュベートした。ウェル成分の蛍光をCytoFluoru Multiwell Plate Reader(Series 4000, PerSeptive Biosystems, Framingham, MA; Ex/Em: 530/580nm)で測定した。過酸化水素濃度を標準曲線を使用して決定した。全ての実験をデュプリケートで行い、速度を少なくとも２回の測定の平均で表す。
増感および抑制アッセイ：３１１２７(１００μlのウマＩｇＧ、６.７μＭ)のＰＢＳ(ｐＨ７.４、４％ジメチルホルムアミド)溶液およびヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)を棒状蛍光灯の近くに置いた。過酸化水素濃度を記載のように測定した。アッセイをＤ２Ｏ中でＮａＮ３(１００ｍＭ)またはＰＢＳの存在で行った。
酸素依存性：３１１２７(１.６ｍｌのウマＩｇＧ、６.７μＭ)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液を、アルゴン下で凍結／融解法で厳密に脱気した。アリコート(１００μl)を、適当なＯ２／Ａｒ混合物(０−１００％)で予めパージした中隔密封（septum-sealed）ガラスバイアルにシリンジを介して導入した。溶解酸素濃度をOrion 862A溶解酸素計で測定した。これらの溶液を次いで激しく攪拌し、２０分間静置し、再び攪拌処理した。必要なＯ２／Ａｒ混合物を含有するシリンジを用いて、実験中、大気圧を保持した。アリコート(２０μl)を気密性シリンジを使用して取り出し、過酸化水素濃度を本明細書に記載のように測定した。３つの別個の実験からのデータを整理し、Enzyme Kinetics vl.1コンピューター・プログラムで分析した(ＶmaxおよびＫｍパラメーターの決定のために)。
化学的 １ Ｏ ２ 供給源を使用した、暗所での過酸化水素の抗体産生：ヒツジＩｇＧ３１２４３(１００μｌ、２０μＭ)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液および３,３Ｎ−(１,４−ナフチリデン)ジプロピオン酸二ナトリウム塩のエンドペルオキシド(Ｄ２Ｏ中２５mM)を暖かい部屋(３７ＥＣ)に３０分、暗所で置いた。過酸化水素濃度を、本明細書に記載のように測定した。
Ｆａｂ１Ｄ４結晶による過酸化水素の形成：１Ｄ４のＦａｂフラグメント結晶の懸濁液(２μl)をＰＢＳ(１９８μl、ｐＨ７.４)に希釈し、緩やかに攪拌処理した。遠心後、上清を除去し、洗浄工程をさらに２回繰り返した。残った結晶懸濁液をＰＢＳ、ｐＨ７.４(１００μl)に希釈し、石英ＥＬＩＳＡプレートのウェルに加えた。ＵＶ照射を３０分間行った後、Amplex Red 作業溶液(１００μl)を加え、混合物を蛍光顕微鏡で観察した。
抗体蛍光対過酸化水素形成：３１１２７(１.０ｍｌのウマＩｇＧ、６.７μＭ)のＰＢＳ溶液(ｐＨ７.４)を石英キュベットに入れ、ＵＶ光で４０分間照射した。１０分間隔で、溶液の蛍光をＳＰＦ−５００Ｃ分光蛍光計(SLM−Aminco, Urbana, IL; Ex/EM, 280/320)で測定した。同じ時点に、溶液のアリコート(２０μl)を取り出し、過酸化水素濃度を本明細書に記載のように測定した。
カタラーゼによる過酸化水素の消費：ＥＰ２−１９Ｇ１２の溶液(１００μlのマウスＩｇＧ、２０μＭのＰＢＳ溶液、ｐＨ７.４)をＵＶ光で３０分間照射し、その後過酸化水素濃度をスティック試験(EM Quant Peroxide Test Sticks)で測定すると、２mg／Ｌであった。カタラーゼ［１μl、Sigma、３.２Ｍ(ＮＨ４)２ＳＯ４、ｐＨ６.０］を加え、１分後でＨ２Ｏ２濃度は０mg／Ｌであった。
変性：ＩｇＧ１９Ｇ１２(１００μl、６.７μＭ)をエッペンドルフ管中で２分間１００ＥＣに加熱した。得た溶液をガラスのスクリューキャップバイアルに移し、ＵＶ光で３０分間照射した。Ｈ２Ｏ２濃度を３０分後に測定した。
結果と考察
１群の完全な免疫グロブリンおよび抗体フラグメントによる過酸化水素の形成の初期速度の測定した値を表１に集める。Ｉｇ産生Ｏ２ ●−が自発的にＨ２Ｏ２に不均化され、これが、次いで、ホースラディッシュペルオキシダーゼのためのＮ−アセチル−３,７−ジヒドロキシフェナジン１(Amplex Red)との共基質として利用され、非常に蛍光性のレゾルフィン２(励起最大５６３nm、放出最大５８７nm)を形成すると考えられている(図２)(Zhou, M., Diwu, Z., Panchuk-Voloshina, N. & Haugland, R. P., Anal. Biochem., 253, 162-168(1997))。緩衝液の照射がＯ２ ●−を産生しないこと、および抗体がタンパク質ジスムターゼとして単純に作用しないこと(Petyacev, I. M. & Hunt, J. V., Redox Report, 2, 365−372 (1996))を確認するために、酵素スーパーオキサイドジスムターゼをＰＢＳ中で照射した。これらの条件下で、過酸化水素産生の速度はＰＢＳ単独の照射の場合と同じである。
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 ＊アッセイ条件は材料および方法に記載する。
Ｈ少なくとも二つの独立した測定の平均値。Ｈ２Ｏ２形成のバックグラウンド値はＰＢＳ中で０.００５nmol／分およびＰＢＳ中でＳＯＤと共に０.００３nm／分である。
過酸化水素形成の速度は、環境条件でのＰＢＳ中の酸素濃度(２７５μＭ)に関して反応の１０％以上について直線的であった。十分な利用可能な酸素で、抗体は、タンパク質分子に対し少なくとも４０当量のＨ２Ｏ２を、有意な活性低下や構造的フラグメント化なしに産生する。抗体１９Ｇ２の存在下および非存在下での最初の経時的過酸化水素形成の例を図３Ａに示す。この活性は加熱によるタンパク質の変性後になくなる。
表１中のデータは、抗体が１Ｏ２からＨ２Ｏ２をつくる一般的な能力を表す。この機能は種にまたがって共有されるようであり、検討した重鎖および軽鎖の組成や抗原の特異性に無関係である。完全な抗体についての過酸化水素形成の初速度は高度に保存的であり、一群すべてを通して０.１５nmol／分／mg［クローンＡ９５−１(ラットＩｇＧ２ｂ)］から０.９７nmol／分／mg(クローンＰＣＰ−２１Ｈ３、マウスモノクローナルＩｇＧ)の間にある。当該成分抗体フラグメントについて利用可能な情報は僅かであるが、その活性はＦａｂおよびＦ(ａｂ')２フラグメントの両方に存在するようである。
この活性が汚染物由来のものであるならば、種々の起源から得たすべての抗体およびそのフラグメント中に存在するはずである。しかし、汚染物由来を除外するために、高分解能Ｘ線構造が得られている(１.７Ｄで)マウス抗体１Ｄ４Ｆａｂの結晶について、Ｈ２Ｏ２を産生する能力を調べた(図４)。１Ｏ２の還元が、これらの結晶において明らかに認められる。
この抗体変換についての検討は、還元される中間体としての一重項酸素の存在を支持する。抗体による過酸化水素の形成は、嫌気条件では、ＵＶ照射の存在下または非存在下のいずれにおいても起きない。さらに、過酸化水素の産生は環境的好気性条件で照射なしには起きない。３Ｏ２の既知光増感剤ヘマトポルフィリン(ＨＰ)水溶液の存在における可視光での抗体の照射(Kreitner, M., Alth, G., Koren, H., Loew, S. & Ebermann, R., Anal. Biochem., 213, 63−67 (1993))は、過酸化水素の形成をもたらす(図５Ａ)。観察された比率の曲がりは、アッセイ混合物中からの酸素の消費による。光励起ＨＰと酸素との相互作用がＯ２ ●−形成をもたらすとの懸念(Beauchamp, C & Fridovich, I., Anal. Biochem., 44, 276−287 (1971); Srinivasan, V. S., Podolski, D., Westrick, N. J. & Neckers, D. C., J. Am. Che. Soc., 100, 6513−6515 (1978))は、増感剤単独の適当なバックグラウンド実験によってほとんどなくすることができる(データを図５Ａに示す)。ＨＰおよび可視光の両方での過酸化水素の効率的な形成は１Ｏ２の仲介を意味し、Ｉｇがこの還元をなすのにＵＶ照射が必要でないことを示す。
さらに、ヒツジ抗体３１２４３を暗所３７ＥＣで１Ｏ２の化学供給源［３',３'−(１,４−ナフチリデン)ジプロピオン酸のエンドペルオキシド］と共にインキュベートすると、過酸化水素が形成する。
可視光中で、ＨＰ(４０μＭ)でのウマＩｇＧによるＨ２Ｏ２の形成比率は、Ｄ２Ｏの存在で増加し、１Ｏ２抑制剤(quencher)ＮａＮ３(４０ｍＭ)で減少する(図５Ｂ)(Hasty, N., Merkel, P. B., Radilick, P. & Kearns, D. R. Tetrahedron Lett., 49−52 (1972))。Ｄ２ＯのＨ２Ｏでの置換は、その寿命の期間を通じて、１０倍の増加を介して、１Ｏ２仲介プロセスを増強することが知られている(Merkel, P. B., Nillson, R. & Kearns, D. R., J. Am. Chem. Soc., 94, 1030−1031 (1972))。
過酸化水素の形成速度は、ＩｇＧ濃度に０.５から２０μＭの間で比例するが、より高い濃度で曲線となり始める(図５Ｃ)。タンパク質溶液における１Ｏ２の寿命は、反応の機会を考慮すると、純水中よりも低いと思われる。したがって、観測された曲率は抗体との反応による１Ｏ２寿命の低下に起因するのであろう。
明らかに、Ｈ２Ｏ２産生の観測速度に対する酸素濃度の作用は、約２００μＭの酸素の有意の飽和を示す(図５Ｄ)。したがって、還元メカニズムは、抗体分子中に１つ以上の酸素結合部位を含み得る。速度の生データを非直線的回帰分析で処理し、Michaelis−Mentenの式に適合することにより、１８７μＭのＫｍａｐｐ(Ｏ２)および０.４nmol／分／mgのＶmaxａｐｐを得る。この抗体速度はインビボで分子酸素を還元するミトコンドリア酵素について観測されるものと等しい。
抗体が１Ｏ２を還元するメカニズムはすでに観測されている。しかし、金属介在酸化還元プロセスの関与は、ＥＤＴＡ含有のＰＢＳ(４ｍＭ)での徹底的な透析後も抗体の活性が変化せずに留まるため、ほとんど除外されている。これは、抗体自体のアミノ酸組成物の固有の能力を残す。トリプトファン(Ｔｒｐ)のようなの芳香族アミノ酸は電子転移を介して１Ｏ２により酸化され得る(Grossweiser, L. I., Curr. Top. Radiat. Res. O., 11, 141−199 (1976))。加えて、ジスルフィドも酸化され得るのに十分な電子に富んでいる(Bent, D. V. & Hayon, E., J. Am. Chem. Soc., 87, 2612−2619 (1975))。したがって、Ｔｒｐ残基が存在し、および/またはすべての抗体に相同の鎖内または鎖間のジスルフィド結合が１Ｏ２還元の原因である可能性がある。この抗体の能力が他のタンパク質にどの程度共有されているか、および、還元メカニズムをプローブするための両方を検討するために、他のタンパク質の一段を調べた(図６)。
他のタンパク質は１Ｏ２をＯ２ ●−に変換できるが、抗体と異なり、これは決して普遍的な性質ではない。ＲＮａｓｅＡおよびスーパーオキシドジスムターゼは、Ｔｒｐ残基を保持しないが、いくつかのジスルフィド結合を有し、１Ｏ２を還元しない。同様に、７つのジスルフィド結合を有し、Ｔｒｐ残基のないBownman−Birk阻害タンパク質(Voss, R.−H., Ermler, U., Essen, L.−O., Wenzl, G., Kim, Y.−M. & Flecker, P., Eur. J. Biochem., 242, 122−131 (1996); Baek, J. & Kim, S., Plant. Physiol., 102, 687 (1993))は、１Ｏ２を還元しない。一方、鶏オバルブミンは、２Ｔｒｐ残基のみを有し(Feldhoff, R. & Peters, T. J., Biochem, J., 159, 529−533 (1976))、１Ｏ２の還元における最も効率的なタンパク質のひとつである。
変性による抗体活性の失活を考慮して、タンパク質における重要な残基の位置がその絶対数よりも重要なようである。タンパク質における芳香族残基の大部分が一般的に埋没して構造的安定性を促進するので(Burley, S. K. & Petsko, G.A., Science, 229, 23−28 (1985))、還元過程の本質を、消光実験により表面および埋没残基の相対的関与について調べた。タンパク質中の芳香族アミノ酸は、特に分子酸素やオゾンなどの増感剤の存在下、紫外線の吸収により改変される(Foote, C.S., Science, 162, 963−970 (1968); Foote, C.S., Free Radicals Biol., 2, 85−133(1976); Gollnick, K., Adv. Photochem., 6, 1−122 (1968)。Ｔｒｐは１Ｏ２と［２＋２］シクロ付加を介して反応し、Ｎ−ホルミルキヌレニンまたはキヌレニンを産生し、これらは、埋没Ｔｒｐ残基の放出を有意に消光することが知られている(Mach, H., Burke, C.J., Sanyal, G., Tsai, P.−K, Bvolkin, D.B. & Middangh, C,R. in Formulation and Delivery of Proteins and Peptides, eds. Cleland, J.L. & Langer, R.(American Chemical Society, Denver, CO)(1994))。ウマＩｇＧの固有の蛍光は４０分間の照射中に元の値の３０％に速やかに消光するが、一方、過酸化水素の産生は直線的である(γ２＝０.９９８)(図７)。一重項酸素の還元が抗体Ｔｒｐ残基によるものであると仮定すれば、溶媒曝露Ｔｒｐが埋没のものより低い程度で関与しているようである。この因子は、なぜこの能力が抗体中に非常に高く保存されているのかを説明するのに役立ち得る。既知の抗体の９９％以上において２つの保存Ｔｒｐ残基：Ｔｒｐ−３６およびＴｒｐ−４７が存在し、両者とも深く埋没している(Kabat, E.A., Wu, T. T., Perry, H.M., Gottesman, K.S. & Foeller, C., Sequences of Proteins of Immunological Interest (U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)(1991))。
自然の中で、生体は自分自身を比較的単純な化学物質の産生により保護している。単一分子レベルで、このメカニズムは、脊椎動物の免疫系の出現とともに大部分が放棄されたと考えられている。ターゲティング・デバイスが発達すると、殺傷機構が他所に移動したと考えられている。本発明の結果は同じ分子内での認識と殺作用を再編する。ある意味で、この化学的免疫系は、さらに精密かつ雑多なターゲティング・エレメントが加わる以外、低級生物の純粋に化学的な防御メカニズムに匹敵する。
理想的な殺作用系が自己傷害を最小にしながら局所的に宿主分子を利用しなければばならないとの拘束を考慮して、１Ｏ２以上の妥当な選択を考え得ない。すでにこのような活性分子を有しているので、抗体によるそのさらなる変換の利益が何であるかを問うことが重要である。重要な問題は、一過性一重項酸素分子(寿命４μｓ)のさらに安定なＯ２ ●−への変換により、それが産生できる過酸化水素およびすべての毒性産物に接近していることである。さらに、スーパーオキシドが、酸素除去カスケードの終了時に残存する唯一の分子酸素同等物である。したがって、この“リサイクリング”が殺微生物プロセスの強化のため主要なメカニズムとして働き得る。一重項分子酸素の他の利点は、この分子が、宿主が攻撃されたときに存在するのみであり、それによってこの分子を“事象誘発性”基質となし得ることである。また、補助系を用いて防御する別の方法があるため、免疫系のこの化学的アームは多くの状況で沈黙しているのであろう。しかし、抗体と一重項酸素ががそれら自体並置的に存在し、それが細胞および組織の傷害をもたらす、疾患状態があり得る。ヒトにおける様々な事象が一重項酸素の産生をもたらすことから、抗体によるその活性化は、自己免疫から再潅流傷害およびアテローム性動脈硬化症に至るまでの種々の疾患を起こし得る(Skepper et al., Microsc. Res. Tech., 42, 369−385 (1998))。
実施例II：抗体が水の酸化を触媒する
方法および材料
結晶グラフ：ＩｇＧ４Ｃ６をパパインで消化し、Ｆａｂ'フラグメントを標準的プロトコールで精製した(Harlow and Lane)。Ｆａｂ'を１３−１８％ＰＥＧ８Ｋ、０.２ＭのＺｎＡｃ、０.１Ｍカコジレート、ｐＨ６.５で結晶化した。結晶をキセノン気体２００ｐｓｉで２分間加圧し(Soltis et al., J, Appl. Cryst., 30, 190, (1997))、液体窒素で急速に冷やした。データをSSRL BL9-2での２.０Å分解まで収集した。構造を、天然４Ｃ６構造からのコオーディネートを用いる分子置換により解明し、キセノン原子部位を差異フーリエ・マップ中の強いピークから同定した。構造の精密化をＣＮＳ(Bruenger et al., Acta. Crystallogr., D54, 905 (1998))において、最終Ｒ＝２３.１％およびＲｆｒｅｅ＝２５.７％まで行った。２つのキセノン原子の占有率を、そのＢ値をタンパク質を直ぐに取り囲むＢ因子より５０％高く設定した後に精密化した。図をBobscript(R.M. Esnouf, Acta Crystllog., D55, 938 (1999))で作成した。
Ｋａｂａｔデータベースの走査：ヒトおよびマウスの配列のＫａｂａｔデータベースを分析して、その構造中のＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔの数を決定した。残基欠失または欠損フラグメントが多すぎるときは、配列を除いた。このことで利用可能な３８９４配列のうち２０６８について高度の分析が可能になった。この値を、全ての平均としてＣＨ、ＶＨ、ＣＬ、ＶＬ(κおよびλ)の括弧内の範囲と共に報告する：Ｔｒｐ１５.５(１４−３１)、Ｔｙｒ３０.４(１３−４７)、Ｃｙｓ１９.３(１５−２９)、Ｍｅｔ(７−３２)、Ｈｉｓ１３.３(８−２８)、総計＝９０.１(４９−１６７)。
誘導結合プラズマ原子発光分光分析：ｍＡｂ ＰＣＰ２１Ｈ３の誘導結合プラズマ原子発光分光分析(ＩＣＰ−ＡＥＳ)を、Varian, Axial Viata Simultaneous ICP−AES分光分析計で行った。マウスモノクローナル抗体(ＰＣＰ２１Ｈ３)を２０ｍＭ ＥＤＴＡ含有リン酸ナトリウム緩衝液(ＰＢＳ、５０ｍＭ、ｐＨ７.４)中で徹底的に透析した。典型的なアッセイにおいて、３００μＬの１０.５％ＨＮＯ３溶液を１００μＬの１０mg／mL抗体溶液に加え、７０℃で１４時間インキュベートした。この溶液をＭＱＨ２Ｏで２mLに希釈し、標準との比較により解析した。ＩＣＰ−ＡＥＳ分析結果を百万分の１(μｇ／mL)で報告する：Ａｇ０.００２６(抗体分子当り０.００７２原子)；Ａｌ０.００９８(抗体分子当り０.１１３原子)；Ａｓ０.００６２(抗体分子当り０.０２５原子)；Ｂａ検出レベル以下；Ｃａ０.０３５５(抗体分子当り０.２６６原子)。
高いＣａ濃度はこのアッセイで用いたリン酸緩衝液の汚染による。抗体介在Ｈ２Ｏ２の速度に対するＣａ(II)の作用を調べるために、抗体サンプルの照射を行った。それには、図８Ａで概略説明したアッセイ法を用い、種々の濃度のＣａＣｌ２(０−１００μＭ)を加えた。このプロセスはＣａ(II)濃度と無関係であることがわかった：Ｃｄ０.０００７(抗体分子当り０.０１８７原子)；Ｃｅ０.００１２(抗体分子当り０.００３原子)；Ｃｏ０.００１３(抗体分子当り０.００７原子)；Ｃｒ０.００１０(抗体分子当り０.００６原子)；Ｃｕ０.００１４(抗体分子当り０.００７原子)；Ｆｅ０.００８９(抗体分子当り０.０４８原子)；Ｇｄ０.０００８(抗体分子当り０.００１原子)；Ｋ０.０３９４(抗体分子当り０.３０２原子)；Ｌａ０.０００７(抗体分子当り０.００２原子)；Ｌｉ０.００１３(抗体分子当り０.０５６原子)；Ｍｇ０.００２７(抗体分子当り０.０３３原子)；Ｍｎ０.０００７(抗体分子当り０.００４原子)；Ｍｏ０.００２３(抗体分子当り０.００７原子)；Ｎａ１０２.０４２８(抗体分子当り１３３２原子)；Ｎｉ０.０００７(抗体分子当り０.００４原子)；Ｐ１４.３５２１(抗体分子当り１３８.９原子)；Ｐｂ検出レベル以下；Ｒｂ０.０００７(抗体分子当り０.００２原子)；Ｓｅ検出レベル以下；Ｖ０.０１０９(抗体分子当り０.０１９原子)；Ｗ０.０１１９(抗体分子当り０.０１９原子)；Ｚｎ０.００８７(抗体分子当り０.０４０原子)。
酸素同位体実験：典型的な実験において、抗体(６.７μＭ、１００μＬ)または非免疫グロブリンタンパク質(５０μＭ、１００μＬ)のＰＢ溶液(１６０ｍＭリン酸塩；ｐＨ７.４)を凍結乾燥して乾固し、次いでＨ２Ｏ２(１００μＬ、９８％)中に溶解した。塩化ナトリウムを排除して、ＭＳ中のシグナル抑制を最小にした。高濃度の非免疫グロブリンタンパク質がＭＳアッセイのため検出可能量のＨ２Ｏ２をつくるのに必要であった。このタンパク質溶液にＵＶトランスイルミネーター上、飽和１６Ｏ２好気条件下、密封石英キュベット中で８時間２０ＥＣで照射した。Ｈ２Ｏ２濃度を８時間後にAmplex Redアッセイ(Zhou et al., Anal. Biochem., 253, 162 (1997))を使用して測定した。次いでサンプルを遠心分離でマイクロコン(サイズ排除フィルター)を介して濾過し、タンパク質を除去し、Ｈ２Ｏ２濃度を再度測定した。ＴＣＥＰ(新たに調製したＨ２ １８Ｏ中の２０ｍＭストック)を加え(Ｈ２Ｏ２に対して約２モル当量)、溶液を３７℃に１５分間置くと、すべてのＨ２Ｏ２が反応した。１８ＯがＴＣＥＰのカルボン酸に徐々にとりこまれるため(数日をかけて)、ＴＣＥＰのＨ２ １８Ｏ溶液をすべてのアッセイ前に新たに調製した。アッセイの時間経過中、この経路による１８Ｏ取り込みは起きない。さらに、Ｈ２ １８Ｏからの１８Ｏの１６Ｏホスフィン酸化物への取り込みはない。２４９ｍ／ｚでのピークはＴＣＥＰの(Ｍ−Ｈ)−である。２４９ｍ／ｚでのピークは、Ｈ２Ｏ２に対して過剰のＴＣＥＰ(２倍)をアッセイで使用するため、すべてのＭＳで観察される。
一緒に凍結乾燥されたタンパク質サンプルからの１６Ｏ／１８Ｏ比の再現性は合理的であった(±１０％)。しかし、凍結乾燥過程中のタンパク質結合水分子の除去についての問題は、観測された比率が異なる凍結乾燥バッチ由来のサンプル間で２.１−４.１と大きく変わり得ることを意味する(Ｈ２ １６Ｏから凍結乾燥したとき)。したがって、厳格な凍結乾燥および脱気工程が続くことが大切である。この点について、１８Ｏ２およびＨ２ １６Ｏ実験が、タンパク質結合酸素分子が相対的に容易に除去されるため、アッセイ間のはるかに少ない多様性を示す。
異なる種からの抗体が次に詳記する実験的制約内で類似の比率を与える：１６Ｏ／１８Ｏ比：ＷＤ１−６Ｇ６ｍＩｇＧ(マウス)２.１：１；ポリＩｇＧ(ウマ)２.２：１；ポリＩｇＧ(ヒツジ)２.２：１；ＥＰ２−１９Ｇ２ｍＩｇＧ(マウス)２.１：１；ＣＨ２−５Ｈ７ｍＩｇＧ(マウス)２.０：１；ポリＩｇＧ(ヒト)２.１：１。比率は、１０回の測定の平均値であるポリＩｇＧ(ウマ)以外、２回の測定の平均値に基づいた。すべてのアッセイおよび条件は上述のとおりであった。
典型的な実験において、ヒツジまたはウマのポリＩｇＧ(６.７μＭ、１００μＬ)のＰＢ(１６０ｍＭリン酸塩；ｐＨ７.４)溶液をアルゴン雰囲気中で３０分間脱気した。この溶液を１８Ｏ２(９０％)で飽和し、上記のように照射した。次いで、アッセイおよび手法は本明細書に記載の通りである。
ヘマトポルフィリンIXでの ３ Ｏ ２ 感作による １ Ｏ ２ 形成の効率の関数としてのＨ ２ Ｏ ２ 産生についてのアッセイ：このアッセイは、H. Sakaiおよび共同研究者(Proc. SPIE−Int. Soc. Opt. Eng., 2371, 264 (1995))により開発された手法の変法である。簡単に、ウマポリＩｇＧ(１mg／mL)のＰＢＳ(５０ｍＭ、ｐＨ７.４)溶液およびヘマトポルフィリンIXをトランスイルミネーターからの白色光で照射した。アリコート(５０μＬ)を取り出し、Ｈ２Ｏ２および３−アミノフタル酸の濃度を同時に測定した。Ｈ２Ｏ２濃度をamplex redアッセイ(Zhou et al., Anal. Biochem., 253, 162 (1997))で測定した。３−アミノフタル酸の濃度は、Adsorbsphere−Ｃ１８カラム、２５４nmでのＵＶ検出計、１mL／分の流速のアセトニトリル／水(０.１％ＴＦＡ)の１８：８２の移動相を有するHitachi D4000系で逆相ＨＰＬＣにより測定した(保持時間、ルミノール＝７.４分、３−アミノフタル酸＝３.５分)。ルミノールと３−アミノフタル酸の濃度をコントロールサンプルに対するピークの高さと面積により決定した。実験データは、ヘマトポルフィリンIX(形成された３−アミノフタル酸の量に直接比例する)により形成された１Ｏ２の量および抗体により形成されたＨ２Ｏ２の量を表す。白色光中でヘマトポルフィリンIXなしで、抗体は著しい量の１Ｏ２を形成しない。
amplex red アッセイがＨ２Ｏ２に加えてタンパク質−過酸化水素誘導体を検出したとの懸念は、この方法で測定された見かけの濃度が、照射されたタンパク質が(サイズ排除濾過により)サンプルから除去されるかどうかと無関係であることから、度外視される。
量子化学法：すべてのＱＣ計算を、一般化された勾配近似および正確な交換を含む密度関数理論(ＤＦＴ)[J.C. Slater in Quantum Theory of Molecules and Solids, Vol. 4: The Self−Consistent Field of Molecules and Solids, McGraw Hill, New York, (1974)]のＢ３ＬＹＰフレイバーを用いて、Jaguar(Jaguar 4.0, Schroedinger, Inc. Portland, Oregon, 1998. B.H. Greeley, T.V. Russo, D.T. Mainz, R.A. Frisner, J.−M Langlois, W.A. Goddard III, R.E. Donnelly, J. Chem. Phys., 101, 4028 (1994)参照]で行った。６−３１Ｇ＊＊基本セットをすべての原子に使用した。すべての幾何学を完全に最適化した。振動周波数を計算して、各最小値が真の局所最小(正の周波数のみ)であり、各遷移状態(ＴＳ)が単一の仮想の周波数(Hessianの負の固有値)のみを有することを確認した。このようなＱＣ計算は、単純な有機分子について約３kcal／molの精度を有することを証明している。Ｏ２や３Ｏ２などの非閉殻分子は、より大きいエラーであることが予測される。しかし、このようなエラーは、ＱＣ結果の機械的関わり合いを補正すべきであるように、定誤差と思われる。すべてのエネルギーは、０点エネルギーまたは温度の補正なしに、kcal／molで報告する。
結果および考察
抗体は一重項分子酸素(１Ｏ２)から過酸化水素(Ｈ２Ｏ２)を作り得る。しかし、本明細書で報告するまで、このプロセスが触媒的であることは、知られていなかった。抗体が、任意の識別可能な補因子および電子供与体の非存在下で、速度の減少なしに、１Ｏ２から５００モル当量のＨ２Ｏ２を作り得るタンパク質クラスとして独特であることを示す。同位体取り込み実験および反応速度データを基にして、抗体はＨ２Ｏの１Ｏ２への前例のない付加を促進し、Ｈ２Ｏ２を最終的ににもたらす反応カスケードにおいて最初の中間体としてのＨ２Ｏ３を形成できることが提案される。キセノンでのＸ線結晶学的試験が、この化学反応が開始するであろう、抗体の折りたたみ内の保存された酸素結合部位の証拠となる。この知見は、１Ｏ２に対する免疫グロブリンの独特な保護機能を示唆し、１Ｏ２を解毒する必要が免疫グロブリンの折りたたみの展開に決定的な役割を演じるか否かの問題を提示する。
抗体は、供給源または抗原特異性にかかわらず、一重項分子酸素(１Ｏ２)から過酸化水素(Ｈ２Ｏ２)を産生し、それにより同分子中で認識および殺作用を調整する可能性がある(Wentworth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97, 10930 (2000))。この発見の可能性ある化学的および生物学的意味を考慮して、この過程の抗体内での機械的基本および構造的位置を検討した。これらの組合せ試験は、他のタンパク質と異なり、抗体が水と一重項酸素との前例のないセットの化学反応を触媒できることを明らかにする。
反応速度試験：長時間ＵＶ照射試験は、抗体介在Ｈ２Ｏ２産生が非免疫グロブリンタンパク質よりも非常に効率的であることを明らかにする(図８Ａ)。典型的に抗体は４０モル当量までの形成を直線的に示し、その後、速度は漸近的に低下し始める(図８Ｂ)。対照的に、非免疫グロブリンタンパク質はＨ２Ｏ２の“突発的(burst)”産生を示し、光酸化が起きるにつれてクエンチする(図８Ａ)。
他のタンパク質と異なり、抗体は、マウスモノクローナルＩｇＧ ＰＣＰ２１Ｈ３について示すように、アッセイ中につくられたＨ２Ｏ２が、カタラーゼで除外されると、実験の開始と同じ初期速度でＨ２Ｏ２の光産生を再開できる(図８Ｃ)。Ｈ２Ｏ２のカタラーゼ仲介破壊後のＨ２Ｏ２の継続的直線的産生について、このプロフィールは、アッセイしたすべての抗体で保持された。このように、この過程中に蓄積したＨ２Ｏ２は、それ自体の形成を(可逆性に)阻害する。見かけのＩＣ５０は２２５μＭと概算された(図８Ｄ)。
基質、転移状態アナログまたは反応産物のいずれかによる酵素の触媒機能の阻害は、しばしば活性部位現象についての強力な証拠となる。Ｈ２Ｏ２の抗体介在光産生が分子酸素(Ｋｍａｐｐ（Ｏ２）１８７μＭ)で飽和され得ることは、すでに知られている(Wentworth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97, 10930 (2000))。Ｈ２Ｏ２のこの形式的産物阻害は、このような結合部位現象についてさらなる証拠を提供する。
抗体によるＨ２Ｏ２の光産生に関する以前の報告は、作られ得るＨ２Ｏ２の最大量を調べていない(Wentworth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97, 10930 (2000))。この問題は、抗体サンプルのＵＶ照射の繰り返しサイクルにより、ついでカタラーゼによる産生Ｈ２Ｏ２の除去により検査した(図８Ｃは２つのこのようなサイクルを示す)。一つのシリーズの実験において、ＵＶ照射およびカタラーゼ添加のサイクルを１０サイクルまで実施した(ウマポリＩｇＧのＰＢＳ溶液、ｐＨ７.４)。これらの実験中、＞５００モル当量のＨ２Ｏ２が産生され、初期速度のわずかな低下のみが観察された。抗体以外に、このように効率的で長時間Ｈ２Ｏ２を産生することが発見された唯一の他のタンパク質は、αβＴ細胞レセプター(αβＴＣＲ)であった(図８Ｆ)。興味深いことに、αβＴＣＲは、抗体と免疫グロブリンの折りたたみドメインの類似の配列を共有する(Garcia et al., Sciences, 274,209 (1996)）。しかし、この構造モチーフの保持は、免疫グロブリン・スーパーファミリーのメンバーであるにもかかわらずＨ２Ｏ２を産生しないβ２−ミクログロブリンによって示されるように、タンパク質に対してＨ２Ｏ２産生能力を付与するのに必須であるようにはみえない (Welinder et al., Mol. Immunol., 28, 177 (1991)).。
抗体構造は、Ｈ２Ｏ２の酸化作用に対して著しく不活性である。Ｈ２Ｏ２(Ｈ２Ｏ２産生を完全に阻害するのに十分高い濃度で)存在下、６時間の標準的なＵＶ照射に曝露したとき、阻害Ｈ２Ｏ２がカタラーゼで破壊されると、ポリクローナルウマＩｇＧ抗体サンプルが完全な活性となる(図８Ｅ)。長時間一定の速度でＨ２Ｏ２産生を続ける能力は、Ｈ２Ｏ２への曝露後ですら、他のタンパク質により受ける化学的および光酸化的修飾に対する抗体構造の折りたたみの、いままで知られていない顕著な抵抗を表すことを明らかにする。標準条件での８時間ＵＶ照射後の抗体サンプルについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析では、抗体分子の有意のフラグメント化または凝縮もなかった。
Ｈ２Ｏ２の存在下(Ｈ２Ｏ２の明白な阻害作用に寄与し得る)で、タンパク質構造に側鎖位置レベルでさえ変化がないことを確認するために、Ｆａｂ４Ｃ６のＸ線結晶構造をＨ２Ｏ２の存在下および非存在下で調べた。Ｆａｂ４Ｃ６は、その元の結晶が他の公表された抗体よりも高い解像度(〜１.３Ｄ)で回析するため、選択した。重要な構造パラメーターの二乗平均平方根差(ＲＭＳＤ)を、４Ｃ６構造について３ｍＭのＨ２Ｏ２での浸漬実験の前後に比較した。すべての原子のＲＭＳＤ＝０.４１２Ｄ、Ｃα原子のＲＭＳＤ＝０.３２７Ｄ、主鎖原子のＲＭＳＤ＝０.３２８Ｄ、側鎖原子のＲＭＳＤ＝０.４８８Ｄ。マウスＦａｂ４Ｃ６(Li et al., J. Am. Chem. Soc., 117, 3308 (1995))の天然およびＨ２Ｏ２処理構造の重層は、重ね合わせ可能であり、Ｈ２Ｏ２に対する抗体の折りたたみの安定性についての証拠を補強する(図９)。
Ｈ２Ｏ２の抗体介在光産生の作用スペクトルおよび同じ波長範囲(２６０−３２０nm)での抗体タンパク質の対応吸収スペクトルを図１０に併記した。２つのスペクトルが、タンパク質中のトリプトファンの最大ＵＶ吸収に一致する励起波長で観測されるＨ２Ｏ２産生の最大効率で明らかに重ね合わせることができる。
ヘマトポルフィリンIX(φＡ＝０.２２、リン酸緩衝液ｐＨ７.０中)および可視光での３Ｏ２感作による１Ｏ２形成効率の関数としてウマＩｇＧによるＨ２Ｏ２産生の効率を調べ、感作により産生される各２７５±２５モル当量の１Ｏ２について、１モル当量のＨ２Ｏ２が抗体分子により産生されることが明らかとなった(Wilkinson et al., J. Phys. Chem. Ref. Data, 22, 113 (1993); Sakai et al., Proc. SPIE−Int. Soc. Opt. Eng., 2371, 264 (1995))。
電子供給源の問題：一重項酸素からの抗体介在Ｈ２Ｏ２産生により生じるメカニズム問題は、２つの下位問題に区別できる：一方はプロセスについての電子供給源であり、他方はプロセスの化学的メカニズムに関する。１Ｏ２のＨ２Ｏ２への変換に２モル当量の電子を要することから、抗体が１当量の抗体分子につき＞５００当量のＨ２Ｏ２を産生する事実が急性電子在庫問題を提起する。この電子供給源についての研究は最もはっきりした可能性のものから始まる。タンパク質を通した電子移動が最も容易にまた非常に大きい距離で起こり得る(Winkler et al., Pure & Appln. Chem., 71, 1753 (1999); Winkler Curr. Opin. Chem. Biol., 4, 192 (2000))。電子供給源として最初に考慮されるのは、典型的に電子ドナーとして関わり、かつ通常のタンパク質光酸化プロセスに言及される残基の収集であった。照射およびカタラーゼ処置の繰り返しサイクル中の抗体およびαβ−ＴＣＲによるほぼ一定速度のＨ２Ｏ２産生(図８Ｃおよび８Ｅ)は、酸化され得る残基が尽きるにしたがってＨ２Ｏ２産生の速度の顕著な低下が伴うはずであるため、このような機構と相反する。この速度の低下は、残る未酸化の基の酸化還元ポテンシャルが、タンパク質が正の電荷を帯びるにしたがって上昇するため、さらに悪化するであろう。
通常のタンパク質光−酸化は、１Ｏ２および他の酸素種(ＲＯＳ)、例えば、スーパーオキシドアニオン(Ｏ２ ●−)、ペルオキシルラジカル(ＨＯ２ ●)およびＨ２Ｏ２の産生をもたらすプロセスの複雑なカスケードである(Foote, Science, 162, 963 (1968))。現在のメカニズムについての考えは、タンパク質の光−酸化に対する感受性を５つまでのアミノ酸：トリプトファン(Ｔｒｐ)、チロシン(Ｔｙｒ)、システイン(およびシスチン)、メチオニン(Ｍｅｔ)、ヒスチジン(Ｈｉｓ)と結びつける(Straight and Spikes, in Singlet O2, A.A. Frimer, Ed. (CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1985), vol IV 9, pp. 91−143; Michaeli and Feitelson, Photochem, Photobiol., 59, 284 (1994))。Ｔｒｐおよび分子酸素によるＨ２Ｏ２の光産生は、よく特徴解明されたプロセスであって、少なくとも部分的に、本質的にＨ２Ｏ２および３Ｏ２を不均化する、１Ｏ２からＯ２への形成および還元を含む(McMormick and TThompson, J. Am. Chem. Soc., 100, 312 (1978))。トリプトファンは、個々のアミノ酸としてもまたタンパク質の構成成分としても、近ＵＶ照射(３００−３７５nm)に好気性条件で特に感作性であり、それは、特に効果的な近ＵＶ(λmax３２０nm)光増感剤であるＮ'−ホルミルキムレニン(ＮＦＫ)へのその変換による(Walrant and Santus, Photochem, Photobiol., 19, 411 (1974))。しかし、Ｔｒｐ光酸化は、近ＵＶの照射におけるＨ２Ｏ２の半化学量論的産生をともなっており(図１１Ａ)(McMormick and Thompson, J. Am. Chem. Soc., 100, 312 (1978))、Ｈ２Ｏ２光産生時での最も効果的な非免疫グロブリンであるβ−ガラクトシダーゼが、その３９Ｔｒｐ残基からわずか５.９モル当量のＨ２Ｏ２しか産生しない(図８Ａ)(Fowler and Zabin, J. Biol. Chem. 253, 5521 (1978))。
ヒトおよびマウス抗体の重鎖および軽鎖配列のKabatデータベースについての走査によると(３８９４のうち２０６８を分析した)、抗体がその全構造中に１５を越えるＴｒｐ残基をほとんどもたないことが明らかとなった(１４−３１Ｔｒｐ残基範囲で平均値＝１５.５)(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (US Department of Health and Human Services, Public Health Service, NIH, ed. 5th, 1991); Martin, PROTEINS: Struct., Funct. and Genet., 25, 130 (1996))。実際、タンパク質光酸化プロセスに関するすべてのアミノ酸(参照、前出)が抗体介在Ｈ２Ｏ２産生に総合的に関与しても、なお、産生される５００モル当量のＨ２Ｏ２を説明するのに、これらの残基の数は不十分である(４９−１６７活性残基範囲で平均値＝９０.１)。
次いで、還元当量としての塩化物イオン(ＰＢＳ中１５０ｍＭで存在)の可能性を、塩化物イオンがアントラキノンの三重項励起状態によるＨ２Ｏ２の光産生についての適切な電子供給源であることが知られているために調べた(Scharf and Weitz, Symp. Quantum Chem. Biochem. Jerusalem vol. 12 (Catal. Chem. Biochem.: Theory Exp.), pp. 355−365 (1979))。この可能性は、免疫グロブリンによるＨ２Ｏ２産生の速度が塩化物イオン濃度と無関係であることが判明したとき、すぐに度外視された。
金属イオンの可能な役割を調べた。このようなイオンは抗体中に、電子供給源として働き得るような量でほとんど存在し得ないが、その微量が触媒的酸化還元中心として中心的役割を演じるのかも知れない。すべての実際的な目的のために、このプロセスにおける微量の金属の影響を除外し得る実験を行った。例えば、Ｈ２Ｏ２の抗体介在光産生速度は、ＥＤＴＡ含有緩衝液での抗体サンプルの微細分析の前後で、変化しない(図１１Ｃ)。抗体サンプルのＥＤＴＡ処理後、ＩＣＰ原子放出分光法(ＡＥＣ)で、百万分の１よりはるかに低い量で残存する微量の金属イオンの存在が明らかになった。これは、この反応に影響する微量の金属について、アッセイしたすべての抗体がこの固有の能力を有するためすべての抗体に共通でなければならない。金属結合が抗体の内在的特性でないこと、また抗体結晶およびBrookhavenデータベースで利用可能な約３００抗体構造についての発明者らの分析と一致することは一般的に受け入れられる。
すべての観察が、タンパク質触媒の不活化に関与しないであろう電子供給源、および高回転数そして電子のいわば非限定供給源を説明できる電子供給源を同定する必要を強く示唆した。
１Ｏ２の化学ポテンシャルについて、さらに広く考慮した。抗体介在メカニズムにおける分子酸素のこのエネルギー形態の関与は、以前の報告から明確に推論された(Wentworth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97, 10930 (2000))。簡単に、Ｈ２Ｏ２光産生の抗体介在速度はＤ２Ｏ中で増加し、１Ｏ２減少剤であるアジ化ナトリウムの存在下で減少する。さらに、可視光中でヘマトポリフィリンIXおよび暗所での３,３'−(１,４−ナフチリデン)ジプロピオン酸ジナトリウム(化学１Ｏ２源)のエンドペルオキシドでの３Ｏ２の増感により、抗体がＨ２Ｏ２を産生することが示されている。１Ｏ２の関与はまた、抗体介在Ｈ２Ｏ２産生の作用スペクトルおよび抗体成分トリプトファンの吸収スペクトルに非常に類似している(図１０)。
１Ｏ２についての既知化学をスーパー求電子性“ジオキサ−エテン”についての化学として概念化できることから(Foote, Acc. Chem. Res., 1, 104 (1968))、水の分子が抗体の存在で１Ｏ２に求核性を加え、中間体としてのＨ２Ｏ３を形成するような今まで未知の可能性を考慮した。すなわち、Ｈ２Ｏ２に酸化される水が電子供給源の役割を果たし得る。
酸素同位体実験を、Ｈ２Ｏ２中に見られる酸素供給源の測定を通じて１Ｏ２によるＨ２Ｏの抗体触媒光酸化についての仮説を調べるために行った。Ｈ２Ｏ２中の１６Ｏ／１８Ｏを、標準的Ｈ２Ｏ２検出法の変法により測定した(Han et al., Anal. Biochem., 234, 107 (1996))。簡単に、この方法は、トリス−カルボキシエチルホスフィン(ＴＣＥＰ)での還元、続く対応ホスフィン酸化物の質量分析法(ＭＳ)を含む(図１２)。
これらの実験によって、酸素の存在下の抗体のＵＶ照射が水からＨ２Ｏ２への酸素取り込みをもたらすことが明らかになった(図１２Ａおよび１２Ｂ)。Ｈ２ １８Ｏ(９８％１８Ｏ)ホスフィン緩衝液(ＰＢ)溶液において飽和１６Ｏ２濃度条件下でのヒツジポリＩｇＧの照射後に、ホスフィン酸化物のＭＳ中に観測される１６Ｏ／１８Ｏ比の相対発生量は、２.２±０.１：１である。Ｈ２ １６ＯＰＢ中の１８Ｏに富む分子酸素混合物(９８％１８Ｏ)での逆の実験を行うとき、逆の比(１：２.２±０.１)が観測される(図１２Ｂ)。比率についてのこれらの値は、優れた再現性(＋１０％、ｎ＝１０)を示し、試験したすべての抗体について見られる。
下記のコントロール試験を実施した。最初に、１６Ｏ２およびＨ２ １６Ｏの条件下で、ポリＩｇＧ(ウマ)の照射がＨ２ １６Ｏ２を産生した(図１２Ｃ)。Ｈ２ １６Ｏ２自体(４００μＭ、ＰＢ中、ｐＨ７.０)を４時間、Ｈ２ １８Ｏ中で照射するとき、１８Ｏの取り込みはない。この結果は、１８ＯのＨ２Ｏ２への取り込みが、水との酸触媒交換によるか、またはＨ２ １６Ｏ２の均一開裂および水からＨ１８Ｏ●との再結合に関与するメカニズムにより起きるかもしれないとの懸念を少なくする。抗体がＨ２ １６Ｏ２の産生およびＨ２ １８Ｏとの酸触媒交換の両方を触媒する可能性を調べるために、不活性雰囲気下でＵＶ照射後にヒツジポリＩｇＧ(６.７μＭ)の存在下で、Ｈ２ １６Ｏ２(９８％１８Ｏ)におけるＨ２ １６Ｏ２(２００μＭ)の同位体交換を調べた。１８ＯのＨ２ １６Ｏ２への取り込みは極微量に過ぎなかった(図１２Ｄ)。
同位体実験をまた、Ｈ２Ｏ２を産生する際に最も効率的な非免疫グロブリンタンパク質であるβ−ガラクトシダーゼおよび３−メチルインドールで実施した。両事例とも、光酸化がＨ２Ｏ２への１８Ｏの取り込みを無視できる程度であり(図１２Ｅおよび１２Ｆ)、このタンパク質におけるインドール環自体およびトリプトファン残基が１Ｏ２の還元剤としてのみ挙動することを示した。
この見解は、３−メチルインドールの照射がＨ２Ｏ２を産生するが、産生されたＨ２Ｏ２がＨ２ １８Ｏからの酸素取り込みを含まないとの観察により、支持される。トリプトファンで行った同じ実験は１６Ｏ／１８Ｏ比１.２：１の交換をもたらす。この結果は、分子内一般酸として作用するアンモニウム官能基によるものであって、３'−ヒドロペルオキシドのジアステレオマー混合物の内部酸素にプロトン付加すると思われる。注目すべきは、化学量論的プロセスであり、またタンパク質中のＴｒｐが遊離のアンモニウム基を有していないため、これは化学的な観点から興味深いが、抗体によるＨ２Ｏ２の触媒的産生を説明できないことである。
化学的メカニズム：すべての抗体が一量項酸素による水の酸化を触媒できる。１Ｏ２によるＨ２Ｏの酸化について反応物と産物との熱力学的均衡(反応熱、△Ｈｒ＝＋２８.１kcal／mol)(D.R. Lide, in handbook of Chemistry and Physics, 73rd ed. (CRC, 1992))は、１Ｏ２の分子の２つ以上が、酸化された水の分子ごとにＨ２Ｏ２の２分子へのその変換の際に関与する化学量論を必要とする。この化学量論は、三重項酸素から一重項酸素への産生に関与する前にさらなる光エネルギーがプロセスに参加しないことを仮定する。仮定したメカニズム経路についての定性的化学的理論が、熱力学的考察と共に、式１ｂまたはｃのいずれかのようにほぼすべての化学量論を作る(すべてのエネルギーを形成の気相実験熱から計算し、kcal／molで報告する)：
１Ｏ２＋２Ｈ２Ｏ→２Ｈ２Ｏ２； ΔＨｒ ｏ＝２８.１ (１ａ)
２１Ｏ２＋２Ｈ２Ｏ→２Ｈ２Ｏ２＋３Ｏ２； ΔＨｒ ｏ＝５.６ (１ｂ)
３１Ｏ２＋２Ｈ２Ｏ→２Ｈ２Ｏ２＋２３Ｏ２； ΔＨｒ ｏ＝−１６.９(１ｃ)
テルリウム仲介酸化還元プロセスによる１Ｏ２および水の過酸化水素への遷移金属触媒変換についての最近の報告(Detty and Gibson, J. Am. Chem. Soc., 112, 4086 (1990))が、１Ｏ２およびＨ２ＯがＨ２Ｏ２へ変換され得るプロセス、および本プロセスのエネルギー需要が克服され得ることについて実験的証拠を提供する。抗体介在光酸化プロセスについてのメカニズムが１Ｏ２分子への水分子への添加を含み、Ｈ２Ｏ２への経路において最初の中間体として三酸化二水素を形成すると考えられる。触媒としての抗体の機能は、その可逆的形成についての不安定な(critical)中間体を安定にし、かつ、または、そのＨ２Ｏ２への変換をチャネリングして中間体の消費を促進する特異的な分子環境の供給でなければならない。このような環境の基本的な特徴は、抗体特異的周辺により条件付けられる活性部位での組織された水分子の特異的な集合体からなる。
Ｈ２Ｏ３は生物系で未だ検出されていないが、そのインビボでの化学はかなりの考察の源であり、インビトロでの性質は種々の実験および理論的処置の対象となってきた(C. Deby, La Recherche, 228, 378 (1991); Sawyer, in Oxygen Chemistry (Oxford University Press, Oxford, 1991); Cerkovnik and Plesnicar, J. Am. Chem. Soc., 115, 12169 (1993); Vincent and Hillier, J. Phys. Chem., 99, 3109 (1995); Plesnicar et al., Chem. Eur. J., 6, 809 (2000); Corey etal., J. Am. Chem. Soc., 108, 2472 (1986); Koller and Plesnicar, J. A. Chem. Soc., 118, 2470 (1996); Cacace et al., Sciene, 285, 81 (1999))。Plesnicarおよびその共同研究者らによると、Ｈ２Ｏ３はオゾンから還元的につくられ、Ｈ２Ｏおよび１Ｏ２に分解する(Koller and Plesnicar, J. A. Chem. Soc., 118, 2470 (1996))。顕微鏡的可逆性の原則を適用して、逆反応も１つ以上の水分子で触媒されはずであると推測された。このようなプロセスのもっともらしい反応経路およびエネルギーを図にするため、本明細書に記載のように第１原則量子化学(ＧＣ)法を用いた(Ｂ３ＬＹＰ密度関数理論)。結果を式２ａ−ｃに示す(すべてのエネルギーはkcal／molである)：
Figure 2006506419
水と１Ｏ２がＨ２Ｏ３をもたらす直接反応は、７０kcal／molの活性化バリアーで全く不利である(式２ａ)。しかし、第２または第３の水分子の付加で、各々３１.５および１５.５kcal／molまで活性化バリアーを減少する共鳴のプロセスを認める。実際、これらの付加的な水が触媒の役割を演じる(式２ｂにおいて、第２の水のＨが産物ＨＯＯＯＨに行き、第１の水のＨがそれに代わるのと同時である)。これらのバリアーは、水の第１のＨＯエネルギー(１１９kcal／mol)および１Ｏ２の結合エネルギー(９６kcal／mol)に比べると小さい。注意すべきは、式２ｂおよび２ｃでの逆反応がそれぞれ１５.５または０kcal／molのバリアーしか持たず、Ｈ２Ｏ３が大量の水または水に富む系において安定でないことを示唆する。このように、Ｈ２Ｏ３を産生し、利用するために抗体構造中の最良な部位が、このような水のない疎水性領域に近接の局在化した水および水二量体の存在する部位であると考えられる。
水の抗体触媒光酸化から誘導されるホスフィン酸化物中の１６Ｏ／１８Ｏ比が、この第一次の中間体Ｈ２Ｏ３が最終産物Ｈ２Ｏ２に変換されるであろう反応経路の選択を著しく拘束する。この比率は、２モルのＨ２Ｏから２モルのＨ２Ｏ２の産生に化学的に関与する１Ｏ２分子の数により、およびこのプロセスの詳細なメカニズムにより主に定まる。比率２.２：１は、２分子の１Ｏ２と２分子のＨ２Ｏが２分子のＨ２Ｏ２と１分子の分子酸素(熱力学的理由から３Ｏ２であるべき)に変換される特定のメカニズムについて予測される値に厳密に一致する。このようなメカニズムの例は、２分子Ｈ２Ｏ３のＨ２Ｏ４およびＨ２Ｏ２へのＳＮ２タイプ不均衡化、続く前者のＨ２Ｏ２および３Ｏ２への分解である。１Ｏ２の関与有りまたは無しでのＨ２Ｏ３のＨ２Ｏ２への変換についての理論的に適合する反応経路を定義するという複雑な問題は、量子化学(Ｂ３ＬＹＰ密度関数論)を用いる系統的な方法で取り組んできた。これらの研究は、Ｈ２Ｏ３の拡大的ドッキング計算(extensive docking calculation)およびその形成とＨ２Ｏ２への変換のための遷移状態をタンパク質の数について示す。実際、抗体(およびαβ−Ｔ細胞レセプター)の領域においてこれらの種を安定にする独特の部位が単離水を有する領域および疎水性領域に近接して存在する。この拡大的試験は、Ｈ２Ｏ３のＨ２Ｏ２への変換についての理論的に適合する化学的経路の全スペクトルについて可能な存在を明らかにした。
抗体と結合するキセノンについての構造的研究：供給源または抗原特異性と無関係に抗体が、またはαβ−ＴＣＲがこの反応を仲介する保存された能力を考慮して、Ｘ線構造試験を行って、これらの免疫グロブリンの折りたたみタンパク質内の可能な保存反応部位を調べた。任意の可能な場所についての重要な拘束は、分子酸素(可能な感受性残基を近位に持つ１Ｏ２または三重項、好ましくはトリプトファン)および水が共存しなければならないこと、および経路に沿う遷移状態および中間体がその部位または非常な近位で安定化されねばならないことである。
タンパク質内での同じ空洞においてＸｅとＯ２が共存しているとの考えを支持する強力な証拠がある(Tilson et al., J. Mol. Biol., 199, 195 (1988); Schoenborn et al., Nature, 207, 28 (1965))。したがって、キセノンガスを重原子トレーサーとして用いて、分子酸素に到達し得るマウスのモノクローナル抗体４Ｃ６(Li et al., J. Am. Chem. Soc., 117, 3308 (1995))内の空洞の位置を調べた。
３つのキセノン部位を同定し(図１３Ａ)、タンパク質における他のＸｅ結合部位において見られるように、すべて疎水性空洞を占めている(Scott and Gibson, Biochemistry, 36, 11909 (1997); Prange et al., PROTEINS: Struct., Funct. and Genet., 30, 61 (1998))。純化された天然構造とＸｅ誘導の構造を重ねると、キセノンの付加を別にして、タンパク質骨格または側鎖のコンフォメーションにおいて、または結合の水分子の位置において、識別できるような変化がほとんどない。
キセノンＩ結合部位(Ｘｅ１部位)を、すべての抗体およびαβＴＣＲにおいて保存されているため、さらに詳細に分析した(図１３Ｂ)。Ｘｅ１は、不変のＴｒｐから７ のＶＬのβシート間にある高度に保存された領域の中間に存する。Ｘｅ１部位は、外側分子表面から約５ のＶＬの免疫グロブリンの折りたたみを含む２つのβシート間に挟まれている。キセノン部位２(Ｘｅ２)は、抗体の重鎖と軽鎖との間に構造的に保存された面を形成するいくつかの高度に保存された残基の直上での抗原結合ポケットの基底に存在する(図１３Ａ)。ＶＬＶＨ面における残基は主に疎水性であり、ＴｒｐＨ１０９などの保存された芳香族側鎖を含む。
Ｆａｂ４Ｃ６中のＸｅ１についての接触側鎖は、ＡｌａＬ１９、ＩｌｅＬ２１、ＬｅｕＬ７３、ＩｌｅＬ７５であり、これらは、すべての抗体における高度に保存された脂肪族側鎖である(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (US Department of Health and Human Services, Public Health Service, NIH, ed. 5th, 1991)。加えて、調べたすべての抗体において、わずかな構造的変化のみが、この領域で観察された。とりわけ、いくつかの他の高度に保存され不変の残基がこのキセノン部位のすぐ近くに存在し、ＴｒｐＬ３５、ＰｈｅＬ６２、ＴｙｒＬ８６、ＬｅｕＬ１０４およびＣｙｓＬ２３とＣｙｓＬ８８との間のジスルフィド架橋を含む。ＴｒｐＬ３５がジスルフィド架橋に積み重なり、キセノン原子からわずか７ にある。この構造内容において、ＴｒｐＬ３５は、Ｘｅｌに最も近いＴｒｐであるので、分子酸素増感剤と推測し得る。２ＣαβＴＣＲ構造およびすべての利用可能なＴＣＲ配列との比較からすると、このＸｅｌ疎水性ポケットもＴＣＲ中に高度に保存されている(図５Ｂ)(Garcia, Science, 274, 209 (1996))。
Ｈ２Ｏ２を産生しないヒトβ２−ミクログロブリンは、その全体的免疫グロブリンの折りたたみにもかかわらず、抗体Ｘｅｌ結合ポケットを定義する同じ詳細な構造的特徴を有さない。また、β２−ミクログロブリンは、抗体およびＴＣＲの両方で起きる保存Ｔｒｐ残基を含有しない。ＴｒｐＬ３５(抗体)またはＴｒｐα３４(ＴＣＲ)が酸素増感剤であるならば、β２−ミクログロブリン中の対応するＴｒｐの欠如が、これが水の酸化を触媒しないとの知見に関係するのであろう。
このように、キセノン実験は、分子酸素にアクセス可能であり、かつ不変のＴｒｐに近接の保存領域(ＶＬ)中にある少なくとも１つの部位を同定した；等価の保存部位もＶＨの折りたたみで可能である。Ｘｅｌ部位周辺の構造および配列は、ＶＨドメインにおいて、ＶＬをＶＨに結びつける疑似的２−折りたたみ(立体構造)回転軸により正確に再製される。キセノン結合部位がこのドメインに位置していなかったが、分子酸素はＶＨ中の対応空洞になお到達し得ると考えられる。結晶が完全な平衡状態を形成するのに不十分な時間である２分間しか加圧しなかったこと、または単に、キセノンがＶＨ側鎖上の対応する空洞について酸素に比較してまたは大きすぎるため、または結晶パッキングのために、提案された重鎖キセノン部位を見つけ得なかった。他の抗体実験において、Ｘｅ結合部位は、結晶パッキングが結晶中のＸｅアクセスを調節できることを示唆する不斉単位の２つの分子のうち１つのみで発見された。これらの部位の周りの配列および構造についての分析は、抗体およびＴＣＲの両方で高度に保存されていることを示し、したがって、なぜ抗体およびＴＣＲにおけるＩｇの折りたたみがこの通常でない化学反応に関与できるのかについて可能な理解を提供する。
抗体は、タンパク質の中で、１Ｏ２をＨ２Ｏ２に触媒的に変換する能力において独特である。このプロセスが事象関連産生による殺害に参加すると考えられる。あるいは、抗体は１Ｏ２から生体を防御する機能を満たすことができる。これは、カタラーゼによる過酸化水素の水と三重項酸素へのさらなるプロセッシングを必要としよう。
実施例III：抗体の抗微生物活性
この実施例は、殺菌に対する抗体が、活性酸素種を産生することによりこれらの細菌を殺すことができることを説明する。
材料および方法
抗体および細胞調製物
ヒツジ(３１２４３)およびウマ(３１１２７)ポリクローナルＩｇＧをPierceから得、さらに精製することなく使用した。大腸菌Ｏ１１２ａ,ｃ−特異的マウスモノクローナル抗体(１５４０４)をQED biosciencesから得、さらに精製することなく使用した。大腸菌非特異的マウスモノクローナル抗体３３Ｆ１２および８４Ｇ３をScripps Hybridoma labから得、＞９８％純度で使用した(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づく)。モノクローナル３３Ｆ１２は、アルドール反応を触媒するマウスモノクローナルＩｇＧである。Wagner et al., Science 270, 1797(1995)。大腸菌ＸＬ１−ＢをStratageneから得た。大腸菌Ｏ１１２ａ,ｃ(ATCC 12804)は、栄養不良かつ免疫無防備の個体に感染できる腸侵入性株である。L. Siegfried, M. Kmetove, H. Puzova, M. Molokacova, J. Filka, J. Med. Microbiol. 41, 127(1994)。
以下の抗体調製物は、以下の方法に従い、社内で調製した。
大腸菌ＸＬ−１ブルーに特異的なウサギポリクローナルＩｇＧ
免疫化の日(０日目)、ニュージーランド白色ウサギ(２.５kg)を各耳から１０ml前採血し、加熱殺菌(６５℃、１５分)した、化学的コンピテントな大腸菌ＸＬ−１(ＯＤ６００＝１)(６５０μlおよび３５０μlのリン酸緩衝化食塩水、ＰＢＳ ｐＨ７.４)を皮下注射した。免疫化１４日後(１４日目)、ウサギに１回目と同じ方法で２回目の注射をした。免疫化２８日後(２８日後)、ウサギに１回目および２回目の注射と同じ方法で３回目の注射をした。免疫化３５日後(３５日目)、ウサギの耳から５０ml採血した。免疫化４２日後(４２日目)、ウサギの耳から５０ml採血した。
血清を室温で１−２時間放置し、次いで４℃で一晩置き、２５００−３５００rpmで１５分回転させた。上清を新しい丸底試験管(５０ml)に移し、９−１０Krpmで１５分回転した。これらの上清を清潔な円錐形(５０ml)試験管に移し、−１０℃で貯蔵した。血清を次いでＥＬＩＳＡ(下記参照)で試験し、ＰＢＳで１：１に希釈し、次いで０.２μＭフィルターを通して濾過した。血清サンプルのタンパク質濃度(Ａｂｓ２８０)を測定した。血清サンプルを次いでタンパク質Ｇカラム(Amersham Gamma-Bind G、１０mgタンパク質／mlビーズ)に充填した。結合した抗体を３カラム容量のＰＢＳ ｐＨ７.４で洗浄し、次いで２カラム容量の酢酸(０.１Ｍ、ｐＨ３.０)で溶出した。溶出ピークをＴｒｉｓ緩衝液(１Ｍ、ｐＨ９.０)(４mlフラクション中０.５ml)で中和し、ＰＢＳに対して透析して戻した。
大腸菌ＸＬ−１ブルーに特異的なマウスモノクローナルＩｇＧ
０日目に、１２９Ｇｉｘ＋マウス(６−８週齢、４匹／群)に、加熱殺菌した(６５℃、１５分)、化学的コンピテント大腸菌ＸＬ−１を、５０μlのリン酸緩衝化食塩水、ＰＢＳ ｐＨ７.４で１５０μl容量中、ＯＤ６００＝１で腹腔内注射した。１４日目に、マウスに１回目と同じ方法で２回目の注射をした。２８日目に、マウスに１回目および２回目の注射と同じ方法で３回目の注射をした。３５日目に、マウスから眼内穿刺により採血した。
ＸＬ−１ブルーに特異的な１２のモノクローナル抗体を、標準プロトコールを使用して調製した。抗体調製物を、硫酸アンモニウム沈殿、続くタンパク質Ｇカラム(Amersham Gamma-Bind G、１０mgタンパク質／mlビーズ)にかけることにより精製した。結合した抗体を３カラム容量のＰＢＳ ｐＨ７.４で洗浄し、次いで２カラム容量の酢酸(０.１Ｍ、ｐＨ３.０)で溶出した。溶出ピークをＴｒｉｓ緩衝液(１Ｍ、ｐＨ９.０)(４mlフラクション中０.５ml)で中和し、ＰＢＳに対して透析して戻した。
生存または死滅大腸菌への抗体−結合を測定するための一般的ＥＬＩＳＡ
大腸菌ＸＬ１−ブルーの凍結グリセロールストックのＯＤ６００を読み、生存細菌ストックをＰＢＳでＯＤ６００＝１.０まで希釈した。細菌の２５μlアリコートを９６ウェルhi-bind ＥＬＩＳＡプレートのウェルに入れ、３７℃で一晩乾燥させた。プレートをｄＨ２Ｏで２回穏やかに洗浄した。プレートウェルをＢＬＯＴＴＯ(５０μl／ウェル)で３０分、室温でブロックし、このブロッキング溶液を震盪により除去した。アッセイすべき抗体含有サンプルを次いでＢＬＯＴＴＯで希釈し、２５μlのこの溶液を各ウェルに入れた。プレートを３７℃で１時間、加湿チャンバー中でインキュベートし、ｄＨ２Ｏ(１０×)で洗浄し、２５μlの二次抗体(ＨＲＰ−ヤギ抗−ウサギ接合体、１：２０００)のＢＬＯＴＴＯ溶液を各ウェルに添加した。プレートを３７℃で１時間、加湿チャンバー中でインキュベートし、ｄＨ２Ｏ(１０×)で穏やかに洗浄した。顕色剤基質(５０μl／ウェル)を添加し、３０分後にプレートを４５０nmで読んだ。
死滅細菌サンプルもＥＬＩＳＡに使用した。これらのサンプルを上記と同様に扱ったが、ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートに添加し、接着させる前に、大腸菌を加熱殺菌(６５℃、１５分)した。
殺菌アッセイ
典型的な実験において、大腸菌の培養(対数増殖相、ＯＤ６００＝０.２−０.３)を繰り返しペレット化し(３×３,５００rpm)、ＰＢＳ(ｐＨ７.４)に再懸濁した。ＰＢＳ懸濁細胞を次いでガラスバイアルに添加し、４℃に冷却した。ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)および抗体(２０μＭ)を添加し、バイアルを光ボックス中(可視光、２.８mWcm−２)または暗所中に４℃で置き、１時間インキュベートした。生存能を寒天プレートにおけるコロニー形成単位(ＣＦＵ)の回復により測定した。各実験を少なくともデュプリケートで行った。
顕微鏡的研究
サンプルを下記のように電子顕微鏡用に調製した。細胞を、カコジデート(０.１Ｍ)中、０℃でパラホルムアルデヒド(２％ｗ／ｖ)、グルタールアルデヒド(２.５％ｗ／ｖ)で１.７５時間固定し、次いでペレット化した。細胞ペレットをＯｓＯ４(１％ｗ／ｖ)のカコジデート(０.１Ｍ)溶液に再懸濁し、３０分放置し、次いでペレット化した。ペレットを次いでエタノールおよびプロピレンオキシドで連続的に脱水し、樹脂に包埋し、次いで切片にした。切片を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色した。金標識試験のために、使用した方法は、上記に詳述のものに以下の段階を追加した。第一に、サンプルをペレット化し、新鮮な等張緩衝液で洗浄して、非結合一次抗体を除去した。第二に、ペレットを１２nm金粒子で共有結合的に修飾されているヤギ抗マウス抗体の溶液に再懸濁し、９０分インキュベートした。
水性条件下のＯ３の分解
用いた水性条件下でのＯ３の分解速度は、以下の方法で測定した。Ｏ２をPolymetricsオゾン発生器を通して産生したオゾンを、石英キュベット(１cm２)中、室温２分、リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ、ｐＨ７.４)溶液を通してバブリングした。光学密度の経時的変化を、２２℃に設定されたサーモスタットを備えたHitachi u.v./vis分光光度計で２６０nm(ε＝２,７００Ｍ−１cm−１)で少なくとも５半減期測定する。Takeuchi et al., Anal. Chim. Acta. 230, 183(1990)参照。Ｏ３の半減期を次いでGraphpad Prism V 3.0ソフトウェアを使用した、ＯＤ対時間のプロットから、グラフ的に(ｔ１／２＝６６秒)決定した(データは示していない)。アッセイの感受性は、ｔ＝０のＯＤの±０.１％(〜１μＭ)まで、分光光度計の精度により制限された。
オゾンのアッセイ
典型的な実験において、インディゴカルミン１(１mM)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液を、トランスイルミネーター(３１２nm、０.８mWcm−２)上、室温で抗体(２０μＭ)の存在下または非存在下、カタラーゼ(１３mU／mL)有りまたは無しで、石英マイクロタイタープレート(最終容量２００μＬ)中で、デュプリケートで照射した。種々の時点でサンプル(２０μＬ)を取り出し、リン酸緩衝液(１００mM、ｐＨ３.０、１８０μＬ)中にクエンチした。ＯＤを６１０nmでマイクロタイタープレートリーダー(Spectramax)で読んだ。イサチンスルホン酸２の産生をＬＣ−ＭＳ(Hitachi M-8000イオン・トラップ・エレクトロスプレー質量分析計に連結したHitachi D-7000 HPLC(陰イオン検出モード))で測定した。ＬＣ条件は、Spherisorb RP-C18カラムおよび１mL／分のアセトニトリル水(３０：７０)移動相であった。直列スプリッターを０.２mL／分のカラム流出物をＭＳに流れるように使用した。イサチンスルホン酸２ＲＴ＝３.４分、[ＭＨ]−２２６。
種々の反応性種を試験し、オゾン以外の種によりインディゴカルミン１がイサチンスルホン酸２に変換されるか否かを確認した。
Figure 2006506419
 ａ 酸化は、記載の条件下、室温で各々オキシダントをインディゴカルミン１(１mM)のリン酸緩衝液(ＰＢ、ｐＨ７.４)に添加する前後のマイクロタイタープレートリーダーでの、６１０nmでの吸光度変化にしたがい決定した。
ｂ １８Ｏ取り込みは、各オキシダントについて記載の条件下、インディゴカルミン１のＰＢ(１００mM、ｐＨ７.４)溶液中、Ｈ２ １８Ｏ(＞９５％標識)での酸化、および、陰イオン電子噴霧質量分析による環状α−ケトアミド２の同位体プロフィールのモニタリングにより決定した。アッセイ条件下、α−ケトアミド２のアミドカルボニルは、水と置換しなかった。
ｃ インディゴカルミン(１、１mM)をオゾン(〜６００μＭ)のＰＢ(１００mM、ｐＨ７.０)溶液に添加した。
ｄ １Ｏ２ ＊の効果は、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)溶液および１(１mM)のＰＢ溶液の、可視光(２.７mW／cm−２)で１時間の照射により試験した。
ｅ 引用文献４２参照。
ｆ カリウムスーパーオキシド(１０mM)のＤＭＳＯ溶液を、１のＰＢ(１００mM、ｐＨ７.０)溶液に添加し、最終有機共溶媒が５％となるようにした。
ｇ 最終濃度ＰＢ中２mM。
ｈ 測定していない。
ｉ インディゴカルミン(１、１mM)をＮａＯＣｌ(２０mM)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)に添加し、環状α−ケトアミド２の形成を、溶液の退色が完了した後、ＨＰＬＣにより測定した。
予備試験は、環状α−ケトアミド２のラクタムカルボニルの酸素と水の急速で可逆性の置換がｕ.ｖ.光(３１２nm、０.８mWcm−２)の存在下で起こることを明らかにした。しかしながら、白色光では、識別できる変化は実験中起こらなかった。このように、全ての１８Ｏ同位体取り込み試験は、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)および白色光(２.７mWcm−２)を１Ｏ２ ＊供給源として使用して行った。
さらなる試験を、通常の炭素−炭素二重結合を含む以下の付加的化学プローブを使用して行った。
Figure 2006506419
プローブである３−および４−ビニル−安息香酸(各々３および４)の選択は、ＨＰＬＣによる検出の容易さと連結したその水性溶解性が指標であった。典型的な実験において、３−ビニル安息香酸３(１mM)または４−ビニル安息香酸４(１mM)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液を、室温で抗体４Ｃ６またはヒツジポリクローナル抗体(２０μＭ)の存在下または非存在下で照射(３１２nm、０.８mW／cm−２)した。一定間隔でアリコート(２０μＬ)を取り出し、アセトニトリル：水(１：１)で１：３に希釈した。産生物の組成を逆相ＨＰＬＣにより検出した。
慣用の３−ビニル安息香酸３(１mM)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液の室温でのオゾン分解は、ベンズアルデヒド誘導体５ａの産生をもたらし、対応するエポキシド６ａの〜１０：１の比率での少ないわずかな生成を伴う。同様に、４の、上記と同条件下でのオゾン分解は、４−カルボキシベンズアルデヒド５ｂと、〜９：１の比率の対応するオキシラン５ｂの産生をもたらした。典型的な実験において、３または４(１mM)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液を、Ｏ３のＰＢＳ(６００μＭ)溶液に室温で添加し、５−１０分放置した。３および４のオゾン分解を、Ｏ３／Ｏ２混合物の水性反応溶液を介したバブリングよりもむしろこの方法で行い、芳香環のヒドロキシル化および断片化をもたらす３および４のさらなる酸化を防止した。産生物混合物および基質変換を逆相ＨＰＬＣにより解明した。ＨＰＬＣ分析を、Spherisorb RP-18カラムおよび１mL／分の流速のアセトニトリルおよび水(０.１％ＴＦＡ)(３０：７０)の移動相を伴うHitachi D-7000機械で行った。局在化をｕ.ｖ.検出により行った(２５４nm)(ＲＴ ３＝７.８４分；ＲＴ ５ａ＝４.０２分；ＲＴ ６ａ＝３.８２分；ＲＴ ４ ８.５０分；ＲＴ ５ｂ＝３.７２分；ＲＴ ６ｂ＝４.２５分)。ピーク領域を、標準曲線との比較により濃度に変換した。
好中球における抗体検出
好中球は、その細胞表面に抗体を有することが既知である。蛍光活性化細胞分類(ＦＡＣＳ)を、休止および活性化条件に存在する細胞あたりの免疫グロブリン分子の数の測定に使用した。休止条件下で、約５０,０００抗体分子／細胞が存在し、これは活性化により約６５,０００抗体分子／細胞まで増加した。
結果
抗体の抗微生物活性
上記に説明のように、抗体は、一重項分子酸素(１Ｏ２ ＊)と水から、三酸化二水素(Ｈ２Ｏ３)中間体を介して進む方法による、過酸化水素(Ｈ２Ｏ２)の形成を触媒する。本実施例で提供される結果は、抗体が細菌を効率的に殺す方法に利用できることを説明する。
最初の殺菌試験は、グラム陰性細菌大腸菌(ＸＬ１−ブルーおよびＯ−１１２ａ,ｃ)の二つの株を利用した。大腸菌ＸＬ１−ＢをStratageneから得た。大腸菌Ｏ１１２ａ,ｃ(ATCC 12804)は、栄養不良および免疫無防備個体に感染できる腸侵入性株である。Siegfried et al., J. Med. Microbiol. 41, 127(1994)。
１Ｏ２ ＊イオンは殺菌作用を有する。Berthiaume et al., Biotechnology 12, 703(1994)。しかしながら、抗体によるＨ２Ｏ２産生の開始は、基質１Ｏ２ ＊への暴露を必要とする。Wentworth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10930(2000)。したがって、それ自体単独で、大腸菌を殺さない１Ｏ２ ＊産生系を使用した。抗体は、例えばアントラセン−９,１０−ジプロピオン酸エンドペルオキシドのｕ.ｖ.または白色光または熱分解を各々使用して、内因性または外来増感剤または化学供給源のいずれかにより産生された１Ｏ２ ＊を利用できる。したがって、１Ｏ２ ＊産生系の選択は、単に反応効率および照射に対する細胞性または基質感受性のような実験的懸念を指標とする。これらの実験において、ヘマトポルフィリンIX(ＨＰＩＸ、４０μＭ)は、３Ｏ２の有効な増感剤として選択された。Wilkinson et al., J. Phys. Chem. Ref. Data 22, 113(1993)。白色光(光束２.７mWcm−２)で１時間、リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ、ｐＨ７.４)中、４±１℃で照射したとき、ヘマトポルフィリンIXは二つの大腸菌血清型(〜１０７細胞／mL)に対してほとんど殺菌活性を有しない。
典型的な実験において、大腸菌(対数増殖相、ＯＤ６００＝０.２−０.３)の培養を、細胞をペレット化し(３×３,５００rpm)、それをＰＢＳ(ｐＨ７.４)に再懸濁することにより、ＰＢＳで繰り返し洗浄した。ＰＢＳ懸濁細胞を次いでガラスバイアルに添加し、４℃に冷却した。ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)および抗体(２０μＭ)を添加し、バイアルを光ボックス(可視光、２.８mWcm−２)または暗所に４℃で入れ、１時間インキュベートした。生存能を、寒天プレート上のコロニー形成単位(ＣＦＵ)の回復により測定した。各実験を少なくともデュプリケートで行った。
モノクローナル抗体(２０μＭ)のヘマトポルフィリンIXおよび細菌混合物への添加は、＞９５％の細菌の殺菌をもたらした(図１４Ａ)。抗体の殺菌活性は、抗体濃度の関数であった。例えば、＞９５％のＯ１１２ａ,ｃ細胞が、１０μＭの抗原−特異的マウスモノクローナル抗体１５４０４で殺菌された。これらのデータは、細胞の５０％を殺す抗体濃度(ＥＣ５０)が８１±６nMであることを示唆した(図１４Ｂ)。同様の濃度対殺菌依存性が、ＸＬ１−ブルー大腸菌株に対する特異的モノクローナル抗体(２５Ｄ１１)で観察され、最大＞９５％殺菌が約１０μＭで観察された。
抗体介在殺菌活性は、照射時間の関数として(図１４Ｃ)およびヘマトポルフィリンIX濃度(光束を２.７mWcm−２に固定)の増加にしたがって(図１４Ｄ)、上昇した。抗体介在細菌性殺菌が、ヘマトポルフィリンIX濃度および光照射の両方に比例するという観察は、１Ｏ２ ＊および水酸化経路の両方が工程に重要な役割を演じることを示唆する。批判的に言えば、１Ｏ２ ＊の非存在下で、免疫グロブリンは、大腸菌の生存にほとんど効果を有しない。
コントロールは、コールド・ショックおよびヘマトポルフィリンIX毒性が、コロニー形成単位(ＣＦＵ)の見かけの損失に関係しないことを示唆した。さらに、共焦点顕微鏡は、抗体介在細菌細胞凝集も、抗体処置グループにおけるＣＦＵの損失に寄与しないことを明らかにした。細菌細胞の蛍光分析は、ヘマトポルフィリンIX−処理大腸菌細胞における膜結合増感剤の量が、抗体結合により増加しないことを示唆した。最後に、抗体の殺菌作用における微量金属の可能性のある役割を除外することは困難であるが、ＥＤＴＡ(２mM)の存在は、用いたアッセイ系では細菌の生存に影響しなかった。
抗体の殺菌の可能性は、一般的現象であるように見えた。試験した全１２種のマウスモノクローナル抗体(１×κγ、７×κγ２ａ、３×κγ２ｂ、１×κγ３アイソタイプ)および一つのウサギポリクローナルＩｇＧ(力価１２０,０００)サンプルは殺菌剤であった。非特異的抗体分析もまた、殺菌剤の産生が可能であった。１Ｏ２ ＊のみが水酸化経路の活性化に必要であった−このような活性化は、抗体−抗原結合に無関係であった。この点から、大腸菌細胞表面抗原に特性を有しない１０の非特異的マウスモノクローナル抗体、一つの非特異的ヒツジ抗体調製物および一つのウマポリクローナルＩｇＧサンプルを試験し、全て殺菌活性を有した。抗原非特異的抗体の殺菌活性の効果は、抗原−特異的抗体と非常に類似していることが観察された。典型的に２０μＭの抗体(非特異的)が、本アッセイシステムで＞９５％殺菌であった。抗体の殺菌作用は、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ、２０μＭ)が本アッセイシステムで殺菌性を示さないため、単なる非特異的タンパク質効果ではない。
観察された殺菌性の性質を洞察するために、殺された細菌の形態学を電子顕微鏡で試験した。金標識二次抗体を使用して、抗体が結合する細菌細胞壁上の部位に対して形態学的損傷を補正した。
殺菌は、抗原−抗体結合の部位における細菌細胞壁の穴の産生と関連する(図１５)。この方法は、サンプルとした細菌内に存在する形態学の範囲により証明されるように、徐々に進むものであるように見える。酸化的傷害が、細胞壁と血漿膜の水の透過性を増加させる、殺菌経路における明らかな段階が存在した。
細菌は約３０気圧の内圧下にあり、故に膜の任意の弱化が破滅的破壊をもたらし得る。この工程は、細胞壁と細胞質の境界に観察されるわずかな破壊から始まり(図１６Ａ)、それが細胞壁の細胞質成分からの明らかな分離を伴い、よりひどくなるように見える(図１６Ｂ)。水の連続した流入は、概して細菌細胞構造の歪みと変形をもたらし(図１６Ｃ)、最終的に抗体結合部位の細胞壁と血漿膜の破壊、および細胞質成分の流出をもたした(図１６Ｄ)。この点に関して、抗体介在殺菌により誘導される観察される形態学は、細菌が食作用により破壊されるときと類似していることは興味深い。Hofman et al., Infect. Immun. 68, 449(2000)。
殺菌剤の化学的性質
Ｈ２Ｏ２が、抗体が触媒する水の酸化経路の最終産物であるならば(Wentworth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10930(2000); P. Wentworth, Jr. et al Science 293, 1806(2001))、Ｈ２Ｏ２が単独で殺菌剤であろう。この結論は、Ｈ２Ｏ２を水(Ｈ２Ｏ)と分子酸素(Ｏ２)に変換するカタラーゼが非特異的抗体の殺菌活性に対する完全な防御を提供するという観察により補強された(図１７Ａ)。
非特異的抗体により産生されるＨ２Ｏ２の量は３５±５μＭであった。特異的抗体により産生されるＨ２Ｏ２の量は可変性であった。溶液中のＨ２Ｏ２と細菌性膜の表面に産生したＨ２Ｏ２の効果を直接比較した近接の問題は、複雑である。例えば、１１の大腸菌抗原−特異的マウスモノクローナル抗体と１１の大腸菌非特異的マウスモノクローナル抗体の殺菌活性に対するカタラーゼ(１３mU／mL)の保護的効果を試験した。非特異的抗体での全ての例では、カタラーゼは殺菌活性を完全に弱めた。抗原−特異的抗体では、しかしながら、カタラーゼによる保護の程度は、使用したモノクローナル抗体に依存し、広範囲で変化した。したがって、Ｈ２Ｏ２産生の近接性(細菌性膜上に直接または溶液中)は、カタラーゼにより提供される保護の程度に影響した。故に、溶液中のＨ２Ｏ２の効果は、抗原非特異的抗体により産生されるＨ２Ｏ２とのみ比較した。
ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)を含む混合物の、可視光(２.７mWcm−２)での１時間、４℃でのＰＢＳ(ｐＨ７.４)中の照射の間に非特異的抗体(２０μＭ)により産生されるＨ２Ｏ２形成(３５±５μＭ／ｈ)の平均速度は非常に一定であった。この平均値は、１０のマウスモノクローナルＩｇＧならびにヒツジおよびウマポリクローナルＩｇＧ(ｎ＝１２)から決定した。
しかしながら、二つの大腸菌細胞系におけるＨ２Ｏ２の毒性を定量したとき、非特異的抗体により産生されるＨ２Ｏ２の量、３５±５μＭは単独では殺菌活性の効果をもたらさないであろうことが明らかとなった(図１７Ｂ)。この値は、細胞系がＸＬ１−ブルーまたはＯ１１２ａ,ｃのいずれかであるかに依存して、５０％の細菌を殺すのに必要なものの各々１桁から４桁低かった。
Ｈ２Ｏ２と抗体および／またはＨ２Ｏ２とヘマトポルフィリンIXの組み合わせは、Ｈ２Ｏ２単独よりも毒性でなかった。これらの可変数を試験し、殺菌活性の効果に関係しているであろう、Ｈ２Ｏ２と他のアッセイ成分の間のある相互作用があるか否かを確認した。特に、以下の条件の組み合わせを、大腸菌Ｏ１１２ａ,ｃに対する殺菌活性に関して試験した：
１. Ｈ２Ｏ２(２mM)および非特異的抗体(２０μＭ)；
２. Ｈ２Ｏ２(２mM)および抗原−特異的抗体(２０μＭ)；および
３. Ｈ２Ｏ２(２mM)およびＨＰＩＸ(４０μＭ)。
各グループを１時間、可視光(２.７mWcm−２)で４℃で照射した。Ｈ２Ｏ２(２mM)単独と比較して、殺菌の増強はこれらの組み合わせのいずれでも観察されなかった。
Ｈ２Ｏ２の大腸菌に対する毒性が、抗体により産生されたものより低いという発見は、カタラーゼでの再試験を必要とした。一つの可能性は、Ｈ２Ｏ２が、また抗体により産生されるある他の化学種と反応して他の殺菌分子(複数もある)を産生し、したがって、Ｈ２Ｏ２を破壊することにより、カタラーゼが他の化学種の形成を防止することである。他の案は、Ｈ２Ｏ２への途中で産生される殺菌種がまたカタラーゼの基質であることである。
さらなる実験は、オゾン(Ｏ３)が抗体により産生されることを示唆した。用いた水性条件下で、オゾンはかなり長寿命である(ｔ１／２＝６６秒)。このように、オゾンは、水性系におけるＯ３の検出のための感受性試薬であるインディゴカルミン１のような化学プローブにより検出されるのに十分長寿命である。Takeuchi et al., Anal. Chem. 61, 619(1989); Takeuchi et al., Anal. Chim. Acta. 230, 183(1990)。水性溶液中のインディゴカルミン１の慣用のオゾン分解は、インディゴカルミン１の特徴的吸光度の退色(γmax ６１０nm、ε＝２０,０００LM-１cm−１)と環状α−ケトアミド２の形成をもたらした(図１８Ａ)。
オゾンが抗体により産生されたことを証明するために、以下の実験を行った。インディゴカルミン１(１mM)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液を、ｕ.ｖ.光(３１２nm、０.８mWcm−２)で、抗体非存在下照射した。退色は観察されなかった。しかしながら、同じ実験をヒツジポリクローナル抗体(２０μＭ)またはマウスモノクローナル抗体３３Ｆ１２(２０μＭ)のいずれかの存在下で行ったとき、インディゴカルミン１の退色が観察された(図１８Ｂ)。エレクトロスプレー質量分析およびＨＰＬＣ分析は、環状α−ケトアミド２がこの工程で産生されたことを確認した。ヒツジポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体３３Ｆ１２は、インディゴカルミン１(１mM)の照射(３１２nm、０.８mWcm−２)２時間後、４.１μＭおよび４.９μＭの環状α−ケトアミド２を各々産生した。インディゴカルミン１の環状α−ケトアミド２への抗体介在変換の初期速度は、抗体調製物に依存せず直線であった(ヒツジポリクローナルＩｇＧ＝３４.８±１.８nM。分−１、３３Ｆ１２＝４０.５±１.５nM。分−１)(図１８Ｂ)。
インディゴカルミン１のＣ＝Ｃ二重結合の酸化的開裂は、オゾン検出に感受性のプローブである。Takeuchi et al., Anal. Chem. 61, 619(1989); Takeuchi et al., Anal. Chim. Acta. 230, 183(1990)。しかしながら、このような開裂はオゾンに特異的ではない。表２に列記したオキシダントでのさらなる実験を、これらのオキシダントがまたインディゴカルミン１を酸化できるか否か試験するための特異的条件下で行った。このような実験は、一重項酸素(１Ｏ２)がインディゴカルミン１の溶液を退色し、酸化的二重結合開裂により環状α−ケトアミド２を開裂することを確認した。１Ｏ２ ＊は、ｕ.ｖ.照射すると抗体により産生される。Wentworth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10930(2000); Wentworth et al., Science 293, 1806(2001)。１Ｏ２ ＊によるインディゴカルミン１の環状α−ケトアミド２への酸化的開裂とＯ３によるものの間の分析的差異を試験した。
さらなる実験は、Ｏ３による開裂が、オゾンがオキシダントであるとき、環状α−ケトアミド２のラクタムカルボニル基への１８Ｏの取り込みが観察されることにより、１Ｏ２ ＊による開裂と区別できることを示唆した。１Ｏ２ ＊がオキシダントであるとき、環状α−ケトアミド２のラクタムカルボニル基へのこのような１８Ｏの取り込みは起きなかった。同位体取り込み実験を、したがって、Ｈ２ １８Ｏ(＞９５％１８Ｏ)含有リン酸緩衝液(ＰＢ、１００mM、ｐＨ７.４)(表２および図１９)で行い、１Ｏ２ ＊をヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)の可視光(２.７mWcm−２)照射により産生した。予備的実験は、１８Ｏ−水において、インディゴカルミン１および２の両方が、インディゴカルミン１ならびに２のケトン−カルボニル基へのゆっくりであるが自発的な同位体取り込みをするが、２のラクタムカルボニル基にはしないことを明らかにした。このように、２のマススペクトルにおける診断マーカーは、２のケトンおよびラクタムカルボニル基の両方への１８Ｏ取り込みに対応する、二重同位体取り込み由来の[Ｍ−Ｈ]−２３０フラグメントであった。故に、酸化産生物のマススペクトルにおいて、マスピーク[Ｍ−Ｈ]−２３０が、インディゴカルミン１の酸化をＨ２ １８Ｏ中で化学的オゾン分解により行ったとき観察されたが(図１９Ｂ)、インディゴカルミン１を１Ｏ２ ＊で酸化したときには観察されなかった(図１９Ｃ)。Gorman et al., in Singlet Oxygen Chemistry, 205(1988)。
インディゴカルミン１(１００μＭ)をヒツジＩｇＧ(２０μＭ)およびヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)の存在下可視光(２.８mWcm−２)で照射したとき、酸化産生物２が形成され、水の１８Ｏのラクタムカルボニルへの交換を証明するマススペクトルを有した(図１９Ａ)。これらのデータは、オゾンが、抗体が存在するとき、インディゴカルミン１のオキシダントであることを示唆する。
オゾンが抗体により産生されることをさらに実証するために、通常の炭素−炭素二重結合を含む以下の付加的化学的プローブを試験した。
Figure 2006506419
典型的な実験において、３−ビニル安息香酸３(１mM)または４−ビニル安息香酸４(１mM)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液を、抗体４Ｃ６またはヒツジポリクローナル抗体(２０μＭ)の存在下または非存在下で、室温で照射(３１２nm、０.８mW／cm−２)した。一定間隔でアリコート(２０μＬ)を取り出し、アセトニトリル：水(１：１)で１：３に希釈した。産生物の組成を逆相ＨＰＬＣにより検出した。
ヒツジポリクローナルＩｇＧ(２０μＭ)の存在下、化合物３および４(１mM)のｕ.ｖ.光(３１２nm、０.８mWcm−２)での照射は、各々３−カルボキシベンズアルデヒド５ａと３−オキシラニル安息香酸６ａ(比率１５：１、３時間後、３の１.５％変換)および４−カルボキシベンズアルデヒド５ｂと４−オキシラニル−安息香酸６ｂ(比率１０：１、３時間後４の２％変換)をもたらした。これらの産生物はまた、化合物３および４を慣用の経路でオゾン分解したときに観察された。さらに、これらの結果は、インディゴカルミン１の退色が観察されたものである、ヒツジポリクローナル抗体またはマウスモノクローナル抗体３３Ｆ１２のいずれかの存在下で、ｕ.ｖ.光で照射したインディゴカルミン１に関して観察されたものと同等であった(図１８Ｂ)。再び、抗体が存在しないとき、退色は観察されないが、抗体の存在下、オゾンの指標である酸化産物が観察された。
著しい対照として、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)および可視光(２.７mWcm−２)により産生される１Ｏ２ ＊は、同様の条件下で３または４のいかなる検出可能な酸化ももたらさなかった。したがって、３−ビニル安息香酸３および４−ビニル安息香酸４はオゾンに選択的であり、オゾンは反応中に存在する抗体により産生されなければならない。
活性化好中球によるオゾン産生の証拠
好中球は、細菌に対する宿主防御の中心であり、その表面に抗体を有し、活性化により１Ｏ２ ＊を含む強力なオキシダントのカクテルを産生する能力が知られている。Steinbeck et al., J. Biol. Chem. 267, 13425(1992); Steinbeck et al., J. Biol. Chem. 268, 15649(1993)。このように、これらの細胞は、したがって、１Ｏ２ ＊の非光化学的、生物学的供給源と、水−酸化経路によるこの基質の処理ができる抗体の両方を提供する。体のほとんどの領域が光化学エネルギーを利用できない。故に、好中球が１Ｏ２の細胞性供給源を提供するのであれば、活性化後に抗体で覆われた好中球から放出されるオキシダントの分析は、このような抗体によるオゾンまたはＨ２Ｏ２産生が生理学的関係を有し得るか否かの指標を提供する。
ヒト好中球を、M. Markert, P. C. Andrews, and B. M. Babior Methods Enzymol. 105, 358(1984)に記載のように調製した。ミリスチン酸フォルボール(１μｇ／mL)での活性化に続き、好中球(１.５×１０７細胞／mL)はインディゴカルミン１をイサチンスルホン酸２にに酸化的開裂するオキシダント種を産生した(図１９および図２０Ｂ)。次亜塩素酸(ＨＯＣｌ)が好中球により産生されることが知られているオキシダントであるが、ＮａＯＣｌ(２mM)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液での試験は、インディゴカルミン１(１００μＭ)を酸化したが、インディゴカルミン１の二重結合を開裂し、イサチンスルホン酸２を産生しなかった。インディゴカルミン１の酸化を１８Ｏ水中で行ったとき、単離された開裂産生物イサチンスルホン酸２のマススペクトルの[Ｍ−Ｈ]−２３０マスピークで確認されたように、５０％のラクタムカルボニル酸素が１８Ｏから成った(図２０Ｂ)。この１８Ｏ取り込みは、オゾンが抗体で覆われた好中球により産生されたことを示唆する。
図２０Ａは、ミリスチン酸フォルボール(１μｇ／mL)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液で３７℃で活性化したヒト好中球(ＰＭＮ、１.５×１０７細胞／mL)によるインディゴカルミン１(３０μＭ)の酸化(＞)およびイサチンスルホン酸２の形成(□)の時間経過を説明する。興味深いことに、インディゴカルミン１からイサチンスルホン酸２の潜在的収率のほとんど５０％(６０μＭの潜在能で２５.１±０.３μＭ)が好中球カスケード中に観察され、酸化的経路中のこの変換を担うオキシダントのかなりの濃度を明らかにする。
実施例IV：サルモネラに対する抗体による殺菌活性
本実施例は、ネズミチフス菌に対する抗体が、活性酸素種を産生することによりこれらの細菌を殺すことができることを説明する。
方法
ネズミチフス菌(ATCC 12804)をＡＴＣＣから得た。サルモネラ非特異的マウスモノクローナル抗体３３Ｆ１２および８４Ｇ３をScripps Hybridoma labから得、＞９８％純度で使用した(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づく)。
細菌殺菌試験のために産生したマウスモノクローナル抗体
６−８週齢のＧｉｘ＋マウス、加熱殺菌(６５℃、１５分)に対するネズミチフス菌抗体を産生するために使用した。以下の免疫化スケジュールを用いた。
０日目、１２９匹のＧｉｘ＋マウス(４匹／グループ)の各々に加熱殺菌、化学的コンピテントネズミチフス菌(ＯＤ６００＝１)(１５０μl細菌および５０μlのリン酸緩衝化食塩水、ＰＢＳ ｐＨ７.４)を腹腔内注射する。
１４日目、マウスに同細菌性溶液の２回目の注射をする。
２８日目、マウスに１回目、２回目と同じ３回目の注射をする。
３５日目、マウスから眼内穿刺により採血する。
モノクローナル抗体を、標準プロトコールを使用したこれらの免疫化プロトコールにしたがい調製した。これらの抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈殿し、続いてタンパク質Ｇカラム(Amersham Gamma-Bind G、１０mgタンパク質／mlビーズ)にかけることを含んだ。結合した抗体を３カラム容量のＰＢＳ ｐＨ７.４で洗浄し、次いで２カラム容量の酢酸(０.１Ｍ、ｐＨ３.０)で溶出した。溶出ピークをＴｒｉｓ緩衝液(１Ｍ、ｐＨ９.０)(４mlフラクション中０.５ml)で中和し、ＰＢＳに対して透析して戻した。
生存または死滅ネズミチフス菌への抗体−結合に関するＥＬＩＳＡアッセイ
生存細菌：ネズミチフス菌の凍結グリセロールストックのＯＤ６０を、細菌細胞濃度の評価に使用し、細菌懸濁液をＰＢＳでＯＤ６００＝１.０に希釈した。希釈細菌懸濁液を一定量(２５μl／ウェル)、９６ウェルhi-bindＥＬＩＳＡプレートに取り、一晩３７℃で乾燥させた。プレートを蒸留水で穏やかに２回洗浄し、ＢＬＯＴＴＯ(５０μl／ウェル)で３０分、室温でブロックした。ＢＬＯＴＴＯを震盪により除去した。ＢＬＯＴＴＯ中の抗体含有サンプル(２５μl／ウェル)を次いで添加し、プレートを３７℃で１時間、加湿チャンバー中でインキュベートした。ウェルを蒸留水で１０回洗浄し、二次抗体(ＨＲＰ−ヤギ抗−ウサギ接合体、１：２０００、２５μlウェル)のＢＬＯＴＴＯ溶液を添加した。プレートを次いで３７℃で１時間、加湿チャンバー中でインキュベートし、蒸留水で１０回穏やかに洗浄した。次いで顕色剤基質(５０μl／ウェル)を添加した。プレートを３０分後に４５０nmで読んだ。
死滅細菌：上記と同じ方法を死滅細菌で繰り返したが、細菌をＥＬＩＳＡプレートに添加する前に加熱殺菌(６５℃、１５分)した。
殺菌アッセイ
典型的な実験において、対数増殖相でＯＤ６００＝０.２−０.３のネズミチフス菌を繰り返しペレット化し(３×３,５００rpm)、ＰＢＳ(ｐＨ７.４)に再懸濁した。ＰＢＳ懸濁細胞を次いでガラスバイアルに添加し、４℃に冷却した。ヘマトポルフィリンIX溶液(４０μＭ)および抗体(２０μＭ)を添加した。バイアルを光ボックス(可視光、２.８mWcm−２)または暗所に、４℃で置いた。１時間インキュベートした。生存能を、寒天プレート上のコロニー形成単位(ＣＦＵ)の回復により測定した。各実験は、少なくともデュプリケートで行った。
結果
ネズミチフス菌−特異的マウスモノクローナル抗体の一団を産生し、殺菌活性について試験した。試験した各抗体は殺菌性であり、抗体が５μＭより多い濃度で存在している限り、ヘマトポルフィリンIX溶液(１２０μＭ)の存在下で１時間照射後、ネズミチフス菌を５０％殺菌した(図２１)。抗体−濃度試験は、殺菌活性の最大効果が、約２０μＭ抗体で達成されることを明らかにした。例えば、９５％より多い細菌細胞の殺菌が、２０μＭ ６Ｂ５で達成された(図２１参照)。
コントロールは、コールド・ショックおよびヘマトポルフィリンIX毒性が、コロニー形成単位(ＣＦＵ)の見かけの損失に関係しないことを示唆した。さらに、共焦点顕微鏡は、抗体介在細菌細胞凝集も、抗体処置グループにおけるＣＦＵの損失に寄与しないことを明らかにした。細菌細胞の蛍光分析は、ヘマトポルフィリンIX−処理大腸菌細胞における膜結合増感剤の量が、抗体結合により増加しないことを示唆した。抗体の殺菌作用は、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ、２０μＭ)が本アッセイシステムで殺菌性を示さないため、単なる非特異的タンパク質効果ではない。最後に、抗体の殺菌作用における微量金属の可能性のある役割を除外することは困難であるが、ＥＤＴＡ(２mM)の存在は、用いたアッセイ系では細菌の生存に影響しなかった。
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本明細書で引用し、または記載した全ての特許および刊行物は、本発明が関連する分野の当業者の技術レベルの指標であり、このような引用特許または刊行物の各々は、それらがその全体を個々に出典明示により包含するのと、または、本明細書にその全体を明示するのと同程度、出典明示により本明細書に包含させる。出願人は、任意のこのような引用特許または刊行物由来の任意のおよび全ての材料および情報のこの明細書への物理的な取り込みの権限を保持する。
本明細書に記載した具体的な方法および組成物は、好ましい実施態様の代表であり、本発明の範囲を限定する意図はない。他の目的、態様、および実施態様は、本明細書の考察後に当業者に発生し、それらは特許請求の範囲により定義した本発明の精神の範囲内に包含されるであろう。当業者には、種々の置換および変形を、本明細書に記載の本発明に、本発明の範囲および精神から逸脱することなく成しえることは明らかであろう。本明細書に説明的に記載する本発明は、必須であるとして本明細書に記載していない任意の要素(複数もある)または限定(複数もある)の非存在下で適当に実施し得る。本明細書に説明的に記載する方法および工程は、異なる順番のステップで適切に実施し得、それらは本明細書または特許請求の範囲に示すステップの順番に制限される必要はない。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する単数形は、内容が明らかに異なる指示をしない限り、複数形を含む。このように、例えば、“宿主細胞”なる言及は、このような宿主細胞の複数形(例えば、培養または集団)を含む、などである。本特許を、本明細書に記載の具体的実施例または本明細書に具体的に記載の実施態様もしくは方法に限定すると解釈し得る状況は存在しない。本特許は、出願人による答弁書において、無条件かつ留保なしに、特定的かつ明示的に採択されない限り、如何なる状況下おいても、特許商標庁の如何なる審査官または他の如何なる公務員もしくは従業員がなした如何なる陳述によっても制限的に解釈されてはならない。
用いている用語および表現は、記載のための用語として用いており、限定のためではなく、このような用語および表現の使用が、示されかつ記載された性質に相当する任意のものまたはその一部を除外することを意図するものではなく、種々の変形が請求している本発明の範囲内で可能であることは認識される。このように、本願明細書は、好ましい実施態様および所望の性質を記載しているが、本明細書に記載の概念の修飾および変形が、当業者により選択され、このような修飾および変形が添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内であると見なされるべきである。
本発明は本明細書に広く、一般的に記載している。一般的な記載に含まれる狭い種および亜属のグループも、本発明の一部を形成する。これは、摘出された材料を本明細書に具体的に引用しているかいないかに関係なく、生物の属由来の任意の対象の除去に但し書きまたは消極的な限定を伴う、本発明の遺伝的記載を含む。
他の実施態様は本発明の範囲内である。加えて、本発明の特性または態様をマーカッシュ・グループの観点で記載しているとき、当業者は、本発明がまたそれによりマーカッシュ・グループのメンバーまたはメンバーのサブグループの任意の個々の観点から記載されていることを認識するであろう。
図１は、食細胞の酸素依存的殺菌作用を図解する。１Ｏ２とＯ２ ●−の相互変換が示されている。 図２は、amplex red assayが関与する化学変換段階を図説する。抗体(このスキームではＩｇＧとして記載)は１Ｏ２をＯ２ ●−に変換し、これは過酸化水素から自発的に発生し得る。ホースラディッシュペルオキシダーゼ存在下で、過酸化水素がamplex red基質を脱アセチル化および酸化し、それにより５８７nmの蛍光を発する分子を産生する。amplex red assayを示す。
図３は、マウスのモノクローナルＩｇＧ ＥＰ２−１９Ｇ２(２０μＭ)の存在下(□)または非存在下(△)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)中でのＨ2Ｏ2産生の初期時間経過を示す。エラーバーは、平均値からのデータ範囲を示す。
図４は、ＵＶ照射し、amplex red試薬でＨ２Ｏ２検出した後のマウス抗体１Ｄ４ Ｆａｂフラグメントの一つの結晶の蛍光顕微鏡写真を示す。
図５は活性酸素種の抗体介在触媒に必要な時間経過および反応条件を説明する。図５Ａは、ＰＢＳ(ｐＨ７.４)中のヘマトポルフィリン(４０μＭ)と可視光による、３１１２７抗体(ウマＩｇＧ、２０μＭ)の存在下(Ｏ)または非存在下(◆)でのＨ２Ｏ２形成の時間経過を提供する。図５Ｂは、３１１２７抗体(ウマＩｇＧ、６.７μＭ)存在下の、他に何も添加しないＰＢＳ(ｐＨ７.４)(□)または、ＮａＮ３を添加したＰＢＳ溶液(ｐＨ７.４)(Ｏ、１００μＭ)もしくはＰＢＳのＤ２Ｏ溶液(ｐＨ７.４)(◇)中、ヘマトポルフィリン(４０μＭ)と可視光によるＨ２Ｏ２形成の時間経過を説明する。図５Ｃは抗体タンパク質濃度(３１１２７、ウマＩｇＧ)のＨ２Ｏ２形成速度における影響を説明する。図５Ｄは酸素濃度の、３１１２７抗体(ウマＩｇＧ、６.７μＭ)によるＨ２Ｏ２形成速度における影響を説明する。全測定点は少なくともデュプリケートの実験測定の平均値である。エラーバーは実験的に測定した値の平均からの範囲である。
図６は、タンパク質の一団に関して測定したＨ２Ｏ２形成の初期速度と抗体(データは表１由来)との比較を示す棒グラフである。全測定点は少なくともデュプリケートの実験測定の平均値である。エラーバーは実験的に測定した値の平均からの範囲である。ＯＶＡ、鶏卵オバルブミン；ＳＯＤ、スーパーオキシドジスムターゼ。
図７Ａは、ＰＢＳ(ｐＨ７.４)中のウマＩｇＧ(６.７μＭ)のＵＶ照射によるＨ２Ｏ２形成速度を説明する。図７Ｂは、Ｈ２Ｏ２形成と同時に測定した、ウマＩｇＧの３２６nm(励起＝２８０nm)での蛍光放出を説明する。
図８は種々の濃度の抗体下のＨ２Ｏ２形成を示す。図８Ａは、免疫グロブリンおよび非免疫グロブリンタンパク質によるＨ２Ｏ２の産生を説明する。アッセイは、環境酸素条件下、２０ＥＣでトランスイルミネーター(Fischer Biotech)上、密封ガラスバイアル中でリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)[１０mM リン酸ナトリウム、１５０mM ＮａＣｌ(ｐＨ７.４)]中の個々の抗体／タンパク質サンプル(１００μＬ、６.７μＭ)の近ＵＶ照射(３１２nm、８００μＷcm−２)により行った。アリコート(１０μＬ)をアッセイを通して、一定間隔で除いた。Ｈ２Ｏ２濃度をamplex red法により測定した。各データ点を、少なくともデュプリケートの測定の平均±ＳＥＭとして報告する：●ポリクローナル(ポリ)免疫グロブリン(Ｉｇ)Ｇ、ヒト；Ｏポリ−ＩｇＧ、ウマ；□ポリ−ＩｇＧ、ヒツジ；▽モノクローナル(ｍ)ＩｇＧ(ＷＤ１ ６Ｇ６)、マウス；△ポリ−ＩｇＭ、ヒト；◇ｍＩｇＧ(９２Ｈ２)、マウス；■β−ガラクトシダーゼ(β−ｇａｌ)；▲鶏オバルブミン(ＯＶＡ)；▼αラクトアルブミン(αｌａｃｔ)；◆ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)。図８Ｂは、ヒツジポリ−ＩｇＧ(６.７μＭ、２００μＬ)によるＨ２Ｏ２の長期産生を説明する。８時間の９８ウェル石英プレートの密封ウェルにおけるＰＢＳ中の近ＵＶ照射。Ｈ２Ｏ２濃度は図８Ａに記載のように測定した。図８Ｃは経時的なＨ２Ｏ２の抗体触媒産生におけるカタラーゼの効果を説明する。マウスモノクローナル抗体ＰＣＰ−２１Ｈ３(ＩｇＧ)の溶液(６.７μＭ、２００μＬ)を、９６ウェル石英プレートの密封ウェル中、ＰＢＳ中で５１０分照射した。Ｈ２Ｏ２をamplex red assayによりアッセイし、次いで、Eupergit C上に固定化したカタラーゼ(１０mg、２８８mU)の添加により破壊した。カタラーゼを濾過により除去し、抗体溶液を４２０分再照射した。速度(０−５１０分)＝０.３６８、μＭ分−１(ｒ２＝０.９９８)；速度(５１１−９３０分)＝０.３９８μＭ分−１(ｒ２＝０.９８７)。図８Ｄは、ウマポリ−ＩｇＧ抗体による触媒の最大の速度の存在下のＨ２Ｏ２濃度における効果を説明する。このようなグラフは、ウマポリ−ＩｇＧによるＨ２Ｏ２の光産生におけるＨ２Ｏ２のＩＣ５０の決定を可能にする。ウマＩｇＧ(６.７μＭ)の溶液を種々の濃度のＨ２Ｏ２(０−４５０μＭ)とインキュベートし、図８Ａに記載のようにＨ２Ｏ２形成の最初の速度を測定した。グラフはＨ２Ｏ２形成の速度対Ｈ２Ｏ２濃度のプロットであり、２２５μＭのＩＣ５０を明らかにする。図８Ｅは、Ｈ２Ｏ２によるＨ２Ｏ２の抗体光産生の長期阻害およびＨ２Ｏ２除去後の活性の完全な回復を説明する。アッセイは、Ｈ２Ｏ２(４５０μＭ)存在下、３６０分のウマポリ−ＩｇＧ(ＰＢＳ中６.７mM、ｐＨ７.４)の最初のＵＶ照射を含んだ。Ｈ２Ｏ２を次いでカタラーゼ(Eupergit Cに固定化)により除去し、ポリ−ＩｇＧサンプルをさらに４８０分ＵＶ光で照射した。アッセイを通したＨ２Ｏ２形成をamplex red assayにより測定した。図８ＦはＨ２Ｏ２産生におけるカタラーゼの効果を説明する。αβ−ＴＣＲ(６.７μＭ、２００μＬ)の溶液を図８Ｃで記載のように３６０、３６７および３８９分照射した。各照射中に産生したＨ２Ｏ２を、図８Ｃに記載のようにアッセイし、破壊した。速度(０−３６０分)＝０.６９３μＭ分−１(ｒ２＝０.９６２)。２００μＭを超える増加曲線(progress curve)における曲率は、Ｈ２Ｏ２による予測される阻害と一致する(下記参照)；速度(３６１−７２７分)＝０.４２７μＭ分−ｌ(ｒ２＝０.９８７)；速度(７２８−１１１７分)＝０.３８６μＭ分−１(ｒ２＝０.９９１)。
図９は、天然４Ｃ６ Ｆａｂ(カラー写真では薄青色およびピンク色)およびＨ２Ｏ２存在下の４Ｃ６ Ｆａｂ(カラー写真では濃青色および赤色)の重ね合わせを説明する。図９Ａに関して、天然４Ｃ６結晶を３分、４mM Ｈ２Ｏ２に浸し、直ぐにＳＳＲＬ ＢＬ ９−１でのデータ収集のために急速冷凍した。二次および三次構造の全体的構造完全性は、Ｈ２Ｏ２の存在下で明らかに保たれた(ＲＭＳＤ Ｃα＝０.３３Å、側鎖＝０.４９Å)。ＲＭＳＤはＣＮＳで計算した。図９Ｂは、Ｆａｂ ４Ｃ６への安息香酸の結合を説明する。高解像度Ｘ線構造は、Ｆａｂ ４Ｃ６が安息香酸と交差反応性であることを示す。Ｈ２Ｏ２有りまたは無しの４Ｃ６連結部位の重ね合わせは、結合部位中の側鎖立体構造が維持が保たれることを証明する(カラー写真における薄いおよび濃い色の側鎖が、各々＋および−Ｈ２Ｏ２に対応する)。さらに、安息香酸の明らかな電子密度が、Ｆａｂ ４Ｃ６の結合特性が４mM Ｈ２Ｏ２中で変化しないままであるということを強調する。電子密度地図は１.５σに合わせた２ｆｏ−ｆｃシグマ加重マップであり、図はBobscriptに作った。
図１０Ａは、ダイオード・アレイＨＰ８４５２Ａ分光光度計、Ａｂｓmax ２８０nmで測定したウマポリクローナルＩｇＧの吸光度スペクトルを示す。図１０Ｂは、ウマポリクローナルＩｇＧの、波長２６０と３２０nmの間の作用スペクトルを提供し、２８０nmでＨ２Ｏ２形成の最大活性が示される。アッセイをデュプリケートで行い、抗体溶液[ＰＢＳ中６.７μＭ(ｐＨ７.４)]を石英試験管に添加し、次いでそれをキセノンアークランプの光線およびＳＬＭ分光螢光計のモノクロメーターに１時間置いた。Ｈ２Ｏ２濃度をamplex red assayにより測定した。
図１１Ａは、トリプトファン(２０μＭ)によるＨ２Ｏ２の経時的産生を説明する。条件およびアッセイ法は図８Ａに記載の通りである。図１１Ｂは、Ｈ２Ｏ２の抗体介在光産生におけるクロライドイオンの効果を提供する。ヒツジポリ−ＩｇＧ■(６.７μＭ、２００μＬ)またはウマポリ−ＩｇＧ▲(６.７μＭ、２００μＬ)の溶液を凍結乾燥して乾燥し、次いで脱イオン水またはＮａＣｌ(ａｑ.)に、クロライドイオンの最終濃度が０−１６０mMとなるように溶解した。サンプルを、環境酸素条件下、２０ＥＣでトランスイルミネーター(８００μＷcm−２)上、密封ガラスバイアル中でデュプリケートで照射した。アリコート(１０μＬ)をアッセイを通して除去し、Ｈ２Ｏ２濃度をamplex red assayにより測定した。Ｈ２Ｏ２形成の割合を、各抗体サンプルで平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ.対[ＮａＣｌ]としてプロットした。図１１Ｃは、Ｈ２Ｏ２の抗体介在光産生におけるＥＤＴＡ含有緩衝液中の透析の効果を説明する。二つの抗体調製物である、マウスモノクローナル抗体ＰＣＰ２１Ｈ３およびウマポリクローナルＩｇＧによるＨ２Ｏ２の光産生を、ＥＤＴＡ(２０mM)含有ＰＢＳでの透析前と後で比較した。条件およびアッセイ法は図８Ａに記載の通りであった。各データ点は少なくともデュプリケートの測定の平均±ＳＥＭとして報告する：[●透析前のマウスｍＩｇＧ ＰＣＰ２１Ｈ３；■透析後のマウスｍＩｇＧ ＰＣＰ２１Ｈ３；▲透析前のポリ−ＩｇＧ、ウマ；◆透析後のポリ−ＩｇＧ、ウマ。
図１２は、基質トリスカルボキシエチルホスフィン(ＴＣＥＰ)と、１６Ｏ含有Ｈ２Ｏ２または１８Ｏ含有Ｈ２Ｏ２のいずれかによる酸化を説明するマススペクトルを提供する。ＥＳＩ(陰極性)マススペクトルを、Ｈ２Ｏ２での酸化後、ＴＣＥＰ[(Ｍ−Ｈ)−２４９]およびそのオキシド[(Ｍ−Ｈ)−２６５(１６Ｏ)および(Ｍ−Ｈ)−２６７(１８Ｏ)]として取った。図１２Ａは、Ｈ２ １８Ｏ(９８％１８Ｏ)ＰＢ中、１６Ｏ２好気条件でヒツジポリ−ＩｇＧ(６.７／μＭ)で照射後のＴＣＥＰおよびそのオキシドのマススペクトルを説明する。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６５に小さなピーク)および１８Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６７に大きなピーク)の混合物を作る。図１２Ｂは、Ｈ２ １６Ｏ ＰＢ中、富化された１８Ｏ２(９０％１８Ｏ)好気条件下のヒツジポリ−ＩｇＧ(６.７μＭ)の照射後のＴＣＥＰおよびそのオキシドのマススペクトルを提供する。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６５に小さいピーク)および１８Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６７に大きなピーク)の混合物を作る。図１２Ｃは、Ｈ２ １６Ｏ ＰＢ中の１６Ｏ２好気濃度下行ったポリ−ＩｇＧの照射後のＴＣＥＰおよびそのオキシドのマススペクトルを提供する。アッセイ条件および方法は、Ｈ２ １６ＯをＨ２ １８Ｏに変えた以外、方法および材料(実施例II)と同じである。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６５に大きなピーク)のみが観察される。図１２Ｄは、嫌気(脱気およびアルゴン下)条件下、Ｈ２ １８Ｏ ＰＢで８時間、２０ＥＣ下のヒツジポリ−ＩｇＧ(６.７μＭ)およびＨ２ １６Ｏ２(２００μＭ)照射後の、ＴＣＥＰおよびそのオキシドのマススペクトルを提供する。ＴＣＥＰの添加は、方法および材料(実施例II)に記載の通りであった。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６５に大きなピーク)のみが観察される。図１２Ｅは、Ｈ２ １８Ｏ ＰＢ中の１６Ｏ２好気条件下の３−メチルインドール(５００μＭ)の照射後のＴＣＥＰおよびそのオキシドのマススペクトルを提供する。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６５に大きなピーク)のみが観察される。アッセイ条件および方法は、３−メチル−インドールが小さすぎる分子量であるため、サイズ排除濾過を行わなかった以外、方法および材料(実施例II)に記載の通りであった。したがって、ＴＣＥＰを３−メチル−インドール含有ＰＢ溶液に添加した。図１２Ｆは、Ｈ２ １８Ｏ ＰＢ中１６Ｏ２好気条件下のβ−ｇａｌ(５０μＭ)の照射後の、ＴＣＥＰおよびそのオキシドのマススペクトルを提供する。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６５に大きなピーク)のみが観察される。アッセイ条件および方法は、方法および材料(実施例II)に記載の通りである。
図１３は、材料および方法(実施例II)に記載の抗体４Ｃ６におけるＸｅ結合部位を示す。図１３Ａは、カラー写真で軽鎖がピンク色であり、重鎖が青色であるＦａｂ ４Ｃ６のＣαトレースの標準側面図を示す。３つの結合したキセノン原子(カラー写真で緑色)を、５σで合わせたＦｏ−Ｆｃ電子密度マップと共に示す。図１３Ｂは、保存キセノン部位１の周りのＦａｂ ４Ｃ６および２Ｃ αβ ＴＣＲ(ＰＤＢ／ＴＣＲ)の重層を提供する。ＶＬ主鎖Ｃαトレース(カラー写真でピンク色)および側鎖(カラー写真で黄色)ならびに対応する２Ｃ αβ ＴＣＲのＶα(カラー写真で赤色および金色)を重ねる(図はInsight2000を使用して作った)。
図１４は抗体による細菌の殺菌を示す。図１４Ａは、大腸菌ＸＬ１−ブルーおよびＯ１１２ａ,ｃ株の、異なる実験条件下での生存を示す棒グラフを提供する。生存は回復したコロニー形成単位(ＣＦＵ)として、実験開始時(ｔ＝０分)のＣＦＵの割合として報告する。黒色棒および薄灰色棒は、薄灰色グループ(２、４、６、８、１０および１２)が可視光(２.７mWcm−２)に６０分暴露され、黒色グループ(１、３、５、７、９および１１)が暗所に６０分置かれた以外、同じ実験条件に対応する。細菌細胞密度は１０７細胞／mLであった。報告した各データ点は、大腸菌ＸＬ１−ブルー(グループ１−６)およびＯ１１２ａ,ｃ(グループ７−１２)の、以下の条件下の平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ.(ｎ＝６)である。グループ１−２ ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃のＸＬ１−ブルー細胞。グループ３−４ ＨＰＩＸ(４０μＭ)、ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃のＸＬ１−ブルー細胞。グループ５−６ ＸＬ１−ブルー−特異的モノクローナル抗体(２５Ｄ１１、２０μＭ)、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)、ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃のＸＬ１−ブルー細胞。グループ７−８ ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃のＯ１１２ａ,ｃ細胞。グループ９−１０ ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃のＨＰＩＸ(４０μＭ)、Ｏ１１２ａ,ｃ細胞。グループ１１−１２ ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃のＯ１１２ａ,ｃ−特異的モノクローナル抗体(１５４０４、２０μＭ)、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)、Ｏ１１２ａ,ｃ細胞。図１４Ｂは、大腸菌Ｏ１１２ａ,ｃの生存における抗体濃度の効果を説明する。用いた抗体はＯ１１２ａ,ｃ−特異的モノクローナル抗体、１５４０４であった。報告する各データ点は、平均値±Ｓ.Ｅ.Ｍ(ｎ＝３)である。５０％の細胞を殺すのに対応する１５４０４抗体の濃度(ＥＣ５０)は８１±６nMであった。図１４Ｃは大腸菌ＸＬ１−ブルー−特異的マウスモノクローナル抗体１２Ｂ２の殺菌作用における照射時間の効果をグラフ的に説明する。グラフは照射時間(２.７mWcm−２)対ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)および１２Ｂ２(２０μＭ)存在下の大腸菌ＸＬ１−ブルーの生存を提供する。報告する各データ点は、平均値±Ｓ.Ｅ.Ｍ(ｎ＝３)である。５０％の細胞を殺すのに対応する照射時間は３０±２分であった。図１４Ｄは、抗体誘発殺菌作用のヘマトポルフィリンIX濃度依存性を説明する。用いた抗体は大腸菌ＸＬ１−ブルー−特異的マウスモノクローナル抗体２５Ｄ１１であった。グラフは、大腸菌ＸＬ１−ブルーの生存対暴露したヘマトポルフィリンIX濃度を提供する。以下の条件を用いた：ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃、暗所、６０分のＸＬ１−ブルー細胞(＞)。ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃で白色光(２.７mWcm−２)下のＸＬ１−ブルー細胞(△)。ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃、暗所、６０分の２５Ｄ１１(２０μＭ)、ＸＬ１−ブルー細胞(◆)。ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃、白色光(２.７mWcm−２)下、６０分の２５Ｄ１１(２０μＭ)、ＸＬ１−ブルー細胞(◇)。
図１５は、抗原−特異的マウスモノクローナルＩｇＧ(１５４０４、２０μＭ)、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)のＰＢＳ溶液および可視光に１時間、４℃(＜５％生存可能)で暴露した後の大腸菌Ｏ１１２ａ,ｃ細胞の電子顕微鏡写真を提供する。抗体結合部位を可視化するために、金標識ヤギ抗マウス抗体を殺菌アッセイの完了後に添加した。抗原非特異的抗体の殺菌活性は、抗原−特異的抗体と比較して非常に小さいことが観察された。典型的に２０μＭの抗体(非特異的)が、本アッセイシステムで＞９５％殺菌性であった。
図１６Ａ−Ｃは、非特異的マウスモノクローナルＩｇＧ抗体(８４Ｇ３、２０μＭ)、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)のＰＢＳ溶液および可視光に１時間、４℃(１％生存可能)で暴露した後の大腸菌ＸＬ−１ブルー細胞の電子顕微鏡写真である。図１６Ａの矢印は細胞質含有物からの細胞膜の先だった分離を指す。図１６Ｄは、抗原−特異的マウスモノクローナルＩｇＧ(１５４０４、１０μＭ)、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)のＰＢＳ溶液および可視光に、１時間、室温(＜５％生存可能)で暴露後の血清型大腸菌Ｏ１１２ａ,ｃの電子顕微鏡写真を提供する。金標識を当業者に既知の方法を使用して行った。
図１７Ａは、大腸菌ＸＬ１−ブルーに対する抗体の殺菌作用におけるカタラーゼの効果を説明する[回復したコロニー形成単位(ＣＦＵ)として、実験開始時(ｔ＝０分)のＣＦＵの割合として報告する]。カタラーゼはＨ２Ｏ２を水(Ｈ２Ｏ)と酸素分子(Ｏ２)に変換する。各グループを白色光(２.７mWcm−２)で６０分、４℃で照射した。細菌細胞密度は〜１０７細胞／mLであった。実験グループ(１−７)を以下のように試験した：グループ１ 大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞およびヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液。グループ２ 大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞および非特異的マウスモノクローナル抗体８４Ｇ３(２０μＭ)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液。グループ３ 大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)およびモノクローナル抗体８４Ｇ３(２０μＭ)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液。グループ４ 大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)、モノクローナル抗体８４Ｇ３(２０μＭ)およびカタラーゼ(１３mU／mL)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液。グループ５ 大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞および特異的ウサギポリクローナル抗体(２０μＭ)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液。グループ６ 大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)および特異的ウサギポリクローナル抗体(２０μＭ)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液。グループ７ 大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)、特異的ウサギポリクローナル抗体(２０μＭ)およびカタラーゼ(１３mU／mL)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液。各点は複数の実験の平均値±Ｓ.Ｅ.Ｍ.として報告する(ｎ＝６)。記号＊＊は、同じ時点のコントロールと比較して＜０.０１のｐ値を意味する。殺菌活性は、いかなる暗所コントロールでも観察されなかった(データは示していない)。図１７Ｂは、大腸菌ＸＬ１−ブルーおよびＯ１１２ａ,ｃ血清型の生存におけるＨ２Ｏ２の濃度依存的毒性を説明する。垂直の点線は、上記の図１４およびHofman et al., Infect. Immun. 68, 449(2000)に記載の条件を使用した６０分のインキュベーション中に抗体により産生されることが予期されるＨ２Ｏ２の濃度である。３５±５μＭ Ｈ２Ｏ２の値が、１２の異なるモノクローナル抗体の少なくともデュプリケートのアッセイから得られた平均値である。
図１８は、カタラーゼの存在下および非存在下の抗体のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液のＵＶ照射(３１２nm、０.８mWcm−２)中のインディゴカルミン１(１mM)からイサチンスルホン酸２への進行を説明する。Steinbeck et al., J. Biol. Chem. 267, 13425(1992)。各点は、少なくともデュプリケートの測定の平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ.として示す。線形回帰分析をGraphpad Prism v.3.0ソフトウェアで行う。イサチンスルホン酸２の形成速度(ν)は以下の条件下で観察した：ヒツジポリクローナルＩｇＧ(２０μＭ)(●)ν＝３４.８±１.８nM／分；マウスモノクローナル抗体３３Ｆ１２(２０μＭ)(□)ν＝４０.５±１.５nm／分；ヒツジポリクローナルＩｇＧ(２０μＭ)および可溶性カタラーゼ(１３mU／mL)(△)ν＝３３.５±２.３nM／分；マウスモノクローナル抗体３３Ｆ１２(２０μＭ)および可溶性カタラーゼ(１３mU／mL)(▽)ν＝４１.８±１.２nM／分。
図１９Ａ−Ｃは、Ｈ２ １８Ｏ(＞９５％１８Ｏ)リン酸緩衝液(ＰＢ、１００mM、ｐＨ７.４)中、室温で種々の条件下のインディゴカルミン１(１mM)の酸化中に産生されたイサチンスルホン酸２[(ＭＨ)−２２６、(Ｍ−Ｈ)−２２８(１８Ｏ)および(Ｍ−Ｈ)−(２×１８Ｏ)]の電子噴霧イオン化(陰極性)マススペクトルを提供する。図１９Ａは、５分の化学的オゾン分解(ＰＢ中６００μＭ)によるインディゴカルミン１の酸化の間に産生されたイサチンスルホン酸２のマススペクトルを提供する。図１９Ｂは、４時間、白色光(２.７mWcm−２)、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)およびヒツジポリ−ＩｇＧ(２０μＭ)での照射によるインディゴカルミン１の酸化の間に産生されたイサチンスルホン酸２のマススペクトルを提供する。図１９Ｃは、４時間、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)と白色光(２.７mWcm−２)での照射によるインディゴカルミン１の酸化の間に産生されたイサチンスルホン酸２のマススペクトルを提供する。
図２０Ａは、ミリスチン酸フォルボール(１μｇ／mL)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液中、３７℃で活性化したヒト好中球(ＰＭＮ、１.５×１０７細胞／mL)による、インディゴカルミン１(３０μＭ)の酸化(＞)および２の形成(□)の時間経過を説明する。インディゴカルミン１の酸化は、活性化していないＰＭＮでは起こらない(データは示していない)。好中球を先に記載のように調製した。次亜塩素酸(ＨＯＣｌ)は、好中球により産生されることが既知の酸化剤である。我々の手で、ＮａＯＣｌ(２mM)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液は１(１００μＭ)を酸化したが、１の二重結合を開裂し、イサチンスルホン酸２を産生しなかった。図２０Ｂは、図２０Ａに記載の条件下で、活性化ヒト好中球によりインディゴカルミン１の酸化中に産生されたイサチンスルホン酸２の陰イオン電子噴霧マススペクトルである。
図２１Ａ−Ｂは、ネズミチフス菌−特異的抗体６Ｂ５の殺菌活性を説明する棒グラフを提供する。平均コロニー形成単位(ｎ＝３)を生存ネズミチフス菌と、異なる条件下で調製した６Ｂ５抗体のインキュベーションの０時間目(ｔ＝０、青色)および１時間後(ｔ＝１時間、マゼンタ色)で示す。図２１Ａは、白色光照射(１.５mWcm−２光束)により行った実験の結果を示す。アッセイは：サルモネラ細胞単独；サルモネラ細胞およびヘマトポルフィリンIX(ＨＰ)(１２０μＭ)；サルモネラ細胞および６Ｂ５抗体(４０μＭ)；サルモネラ細胞、６Ｂ５抗体(５μＭ)およびヘマトポルフィリンIX(１２０μＭ)；サルモネラ細胞、６Ｂ５抗体(１０μＭ)およびヘマトポルフィリンIX(１２０μＭ)；サルモネラ細胞、６Ｂ５抗体(２０μＭ)およびヘマトポルフィリンIX(１２０μＭ)；サルモネラ細胞、６Ｂ５抗体(３０μＭ)およびヘマトポルフィリンIX(１２０μＭ)；サルモネラ細胞、６Ｂ５抗体(４０μＭ)およびヘマトポルフィリンIX(１２０μＭ)。図２１Ｂは暗所(０光束)で行った実験の結果を示す。アッセイは：サルモネラ細胞単独；サルモネラ細胞およびヘマトポルフィリンIX(１２０μＭ)；サルモネラ細胞および６Ｂ５抗体(４０μＭ)；サルモネラ細胞、６Ｂ５抗体(５μＭ)およびヘマトポルフィリンIX(１２０μＭ)；サルモネラ細胞、６Ｂ５抗体(１０μＭ)およびヘマトポルフィリンIX(１２０μＭ)；サルモネラ細胞、６Ｂ５抗体(２０μＭ)およびヘマトポルフィリンIX(１２０μＭ)；サルモネラ細胞、６Ｂ５抗体(３０μＭ)およびヘマトポルフィリンIX(１２０μＭ)；サルモネラ細胞、６Ｂ５抗体(４０μＭ)およびヘマトポルフィリンIX(１２０μＭ)を含んだ。

Claims (47)

  1. 本質的に微生物と結合できる抗体と薬学的に許容される担体を含み、その抗体が一重項酸素(１Ｏ２)が存在するとき活性酸素種を産生できる、抗微生物組成物。
  2. さらに一重項酸素(１Ｏ２)を産生できる増感分子を含む、請求項１記載の抗微生物組成物。
  3. 増感分子がプテリン、フラビン、ヘマトポルフィリン、テトラキス(４−スルフォナートフェニル)ポルフィリン、ビピリジルルテニウム(II)錯体、ローズベンガル色素、キノン、ローダミン色素、フタロシアニン、ヒポクレリン、ルブロシアニン、ピナシアノール、アロシアニンまたはクロリンである、請求項２記載の抗微生物組成物。
  4. 増感分子が抗体に結合している、請求項２記載の抗微生物組成物。
  5. 増感分子が光に曝されたときに一重項酸素を産生できる、請求項２記載の抗微生物組成物。
  6. 抗体がヒトまたはヒト化抗体である、請求項１記載の抗微生物組成物。
  7. 抗体がＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、ＦｖまたはｓＦｖフラグメントである、請求項１記載の抗微生物組成物。
  8. 活性酸素種がスーパーオキシドラジカル、ヒドロキシルラジカルまたは過酸化水素である、請求項１記載の抗微生物組成物。
  9. 活性酸素種がオゾンである、請求項１記載の抗微生物組成物。
  10. 微生物がグラム陰性細菌である、請求項１記載の抗微生物組成物。
  11. 微生物がアエロモナス属(Aeromonas spp.)、バチルス属(Bacillus spp.)、バクテロイデス属(Bacteroides spp.)、カンピロバクター属(Campylobacter spp.)、クロストリジウム属(Clostridium spp.)、エンテロバクター属(Enterobacter spp.)、エンテロコッカス属(Enterococcus spp.)、エシェリキア属(Escherichia spp.)、螺旋菌属(Gastrospirillum sp.)、ヘリコバクター属(Helicobacter spp.)、クレブシエラ属(Klebsiella spp.)、サルモネラ属(Salmonella spp.)、シゲラ属(Shigella spp.)、ブドウ球菌(Staphylococcus spp.)、シュードモナス属(Pseudomonas spp.)、ビブリオ属(Vibrio spp.)またはエルシニア属(Yersinia spp.)である、請求項１記載の抗微生物組成物。
  12. 微生物がブドウ球菌感染、チフス、食中毒、細菌性赤痢、肺炎、コレラ、潰瘍、下痢、出血性大腸炎、溶血性尿毒症症候群または血栓性血小板減少性紫斑病と関連する、請求項１記載の抗微生物組成物。
  13. 微生物が黄色ブドウ球菌、チフス菌、ネズミチフス菌、大腸菌、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、志賀菌、緑膿菌、シュードモナス・セパシア、コレラ菌、ピロリ菌、黄色ブドウ球菌の多剤耐性株、エンテロコッカス・フェシウムのバンコマイシン耐性株またはエンテロコッカス・フェカーリスのバンコマイシン耐性株である、請求項１記載の抗微生物組成物。
  14. 微生物がエシェリキア属、シュードモナス属またはサルモネラ属である、請求項１記載の抗微生物組成物。
  15. 微生物が大腸菌、ネズミチフス菌または緑膿菌である、請求項１記載の抗微生物組成物。
  16. 微生物がウイルスである、請求項１記載の抗微生物組成物。
  17. ウイルスがＤＮＡウイルスである、請求項１６記載の抗微生物組成物。
  18. ウイルスがＲＮＡウイルスである、請求項１６記載の抗微生物組成物。
  19. ウイルスがウイロイドまたはプリオンである、請求項１６記載の抗微生物組成物。
  20. ウイルスがＡ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、パポーバウイルス、パルボウイルス、レオウイルス、オルビウイルス、ピコルナウイルス、ロタウイルス、アルファウイルス、ルビウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、パラミクソウイルス、モルビリウイルス、ニューモウイルス、ラブドウイルス、リッサウイルス、オルトミクソウイルス、ブンヤウイルス、フレボウイルス、ナイロウイルス、ヘパドナウイルス、アレナウイルス、レトロウイルス、エンテロウイルス、リノウイルスまたはフィロウイルスである、請求項１６記載の抗微生物組成物。
  21. 哺乳類に本質的に微生物と結合できる抗体と薬学的に許容される担体を含み、その抗体が一重項酸素(１Ｏ２)が存在するとき活性酸素種を産生できる、抗微生物組成物を投与することを含む、哺乳類における微生物感染の処置法。
  22. 組成物がさらに一重項酸素(１Ｏ２)を産生できる増感分子を含む、請求項２１記載の方法。
  23. 増感分子がプテリン、フラビン、ヘマトポルフィリン、テトラキス(４−スルフォナートフェニル)ポルフィリン、ビピリジルルテニウム(II)錯体、ローズベンガル色素、キノン、ローダミン色素、フタロシアニン、ヒポクレリン、ルブロシアニン、ピナシアノール、アロシアニンまたはクロリンである、請求項２２記載の方法。
  24. 増感分子が抗体に結合している、請求項２２記載の方法。
  25. 抗体がヒトまたはヒト化抗体である、請求項２１記載の方法。
  26. 抗体がＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、ＦｖまたはｓＦｖフラグメントである、請求項２１記載の方法。
  27. 活性酸素種がスーパーオキシドラジカル、ヒドロキシルラジカルまたは過酸化水素である、請求項２１記載の方法。
  28. 活性酸素種がオゾンである、請求項２１記載の方法。
  29. 微生物がグラム陰性細菌である、請求項２１記載の方法。
  30. 微生物がアエロモナス属、バチルス属、バクテロイデス属、カンピロバクター属、クロストリジウム属、エンテロバクター属、エンテロコッカス属、エシェリキア属、螺旋菌属、ヘリコバクター属、クレブシエラ属、サルモネラ属、シゲラ属、ブドウ球菌、シュードモナス属、ビブリオ属またはエルシニア属である、請求項２１記載の方法。
  31. 微生物がブドウ球菌感染、チフス、食中毒、細菌性赤痢、肺炎、コレラ、潰瘍、下痢、出血性大腸炎、溶血性尿毒症症候群または血栓性血小板減少性紫斑病と関連する、請求項２１記載の方法。
  32. 微生物が黄色ブドウ球菌、チフス菌、ネズミチフス菌、大腸菌、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、志賀菌、緑膿菌、シュードモナス・セパシア、コレラ菌、ピロリ菌、黄色ブドウ球菌の多剤耐性株、エンテロコッカス・フェシウムのバンコマイシン耐性株またはエンテロコッカス・フェカーリスのバンコマイシン耐性株である、請求項２１記載の方法。
  33. 微生物がエシェリキア属、シュードモナス属またはサルモネラ属である、請求項２１記載の方法。
  34. 微生物が大腸菌、ネズミチフス菌または緑膿菌である、請求項２１記載の方法。
  35. 微生物がウイルスである、請求項２１記載の方法。
  36. ウイルスがＤＮＡウイルスである、請求項３５記載の方法。
  37. ウイルスがＲＮＡウイルスである、請求項３５記載の方法。
  38. ウイルスがウイロイドまたはプリオンである、請求項３５記載の方法。
  39. ウイルスがＡ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、パポーバウイルス、パルボウイルス、レオウイルス、オルビウイルス、ピコルナウイルス、ロタウイルス、アルファウイルス、ルビウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、パラミクソウイルス、モルビリウイルス、ニューモウイルス、ラブドウイルス、リッサウイルス、オルトミクソウイルス、ブンヤウイルス、フレボウイルス、ナイロウイルス、ヘパドナウイルス、アレナウイルス、レトロウイルス、エンテロウイルス、リノウイルスまたはフィロウイルスである、請求項３５記載の方法。
  40. 微生物と、微生物と結合できる抗体および一重項酸素(１Ｏ２)の供給源を接触させることを含む、微生物の増殖を阻害するために活性酸素種を発生させる方法。
  41. 一重項酸素(１Ｏ２)の供給源が増感分子である、請求項４０記載の方法。
  42. 増感分子がプテリン、フラビン、ヘマトポルフィリン、テトラキス(４−スルフォナートフェニル)ポルフィリン、ビピリジルルテニウム(II)錯体、ローズベンガル色素、キノン、ローダミン色素、フタロシアニン、ヒポクレリン、ルブロシアニン、ピナシアノール、アロシアニンまたはクロリンである、請求項４１記載の方法。
  43. 増感分子が抗体に結合している、請求項４１記載の方法。
  44. 抗体がヒトまたはヒト化抗体である、請求項４０記載の方法。
  45. 抗体がＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、ＦｖまたはｓＦｖフラグメントである、請求項４０記載の方法。
  46. 活性酸素種がスーパーオキシドラジカル、ヒドロキシルラジカルまたは過酸化水素である、請求項４０記載の方法。
  47. 活性酸素種がオゾンである、請求項４０記載の方法。

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