CN1226306C - 胎盘蛋白质13的抗体 - Google Patents

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Abstract

公开了一种可结合胎盘蛋白质13(PP-13)的单克隆抗体(Mab)。同时公开了产生Mab的杂交瘤克隆，用Mab测定生物液中PP-13水平的免疫测定法、以及在生物液中测定PP-13水平的试剂盒。

Description

胎盘蛋白质13的抗体
发明领域
本发明涉及一种针对胎盘蛋白质的抗体。
发明背景
文中引用的参考文献用圆括号内的数字表示，列在说明书的最后。
妊娠管理的目的是出生成熟、健康的婴儿，不产生对母体和新生儿健康有不良影响的并发症。相当多的妊娠受多种紊乱影响。其中有早产、子宫内发育迟缓和先兆子痫。这些并发症对所影响的妊娠造成负面影响，这对患者及健康保障系统都是花费巨大的。
胎盘蛋白质13(PP-13)是以前从人胎盘组织分离的一种蛋白质(U.S.4,500,451 Bohn等人，其中内容在此处引用以供参考)。该蛋白质用以下参数表征：电泳迁移率、等电点、沉降系数、超离心测定的分子量、SDS-PAGE电泳测定的分子量、消光系数和糖含量。已测定了其氨基酸组成(每100个残基中每种氨基酸的残基数)，但尚未测定其氨基酸序列。
PP-13曾用于对三种特定妊娠相关的紊乱：子宫内发育迟缓、先兆子痫和早产进行早期检测(U.S.5,198,366 Silberman等人，其中内容在此处引用以供参考)。已分别开发了用标记的PP-13和抗PP-13多克隆抗血清进行了放射免疫测定(RIA)和酶联免疫吸附测定(ELISA)。但是只有RIA给出了实验结果，ELISA还没有给出实验结果。在Silberman专利中未进一步公开PP-13的特性。关于其它胎盘蛋白质的确定及它们与妊娠紊乱的关系在文献中也有报道(1-3)。
ELISA满足了对其客观性、简单性、敏感性和以前只有放射免疫测定(4)才能达到的特异性的需要。通过对ELISA和RIA进行方法比较，揭示了前一种方法的诸多优点；
1.ELISA绝对安全，不需要特别设计的实验室和经过培训的与放射活性物质打交道的工作人员。
2.双抗体夹心ELISA是一种更加敏感、快速且易于定量的方法。
3.与放射活性示踪剂相比较，酶相当稳定并且具有高水平的结果可重复性。
4.利用ELISA-读数仪的分光光度原理易于测定酶活性。ELISA-读数仪比γ-计数器廉价且易于操作，
5.ELISA更适于自动化。
因此希望开发用于测定PP-13水平的改良ELISA。
发明概述
本发明的一个目的是提供可结合PP-13的单克隆抗体(Mab)。
本发明进一步的一个目的是提供测定生物液中PP-13水平的免疫测定法。
本发明的一个方面是提供可结合PP-13的Mab。特别是，本发明提供了选自克隆#26-2、27-2-3、215-28-3、534-16和606-8-11-67的杂交瘤克隆，以及由这些克隆产生的Mab。根据布达佩斯条约，这些克隆保藏在位于法国，巴黎，Rue du Docteur Roux 25，巴斯德研究所的国立微生物保藏中心(CNCM)。克隆的详细保藏资料如下：
    克隆#     登记号     保藏日期
    26-2     I-2134     1999年3月4日
    27-2-3     I-2135     1999年3月4日
    215-28-3     I-2136     1999年3月4日
    534-16     1-2137     1999年3月4日
    606-8-11-67     I-2138     1999年3月4日
本发明的另一个方面是提供测定生物液中PP-13水平的免疫测定法，包括以下步骤：(a)将生物液与根据本发明的Mab接触，由此形成Mab-PP-13复合体；(b)将复合体暴露于连接至信号产生分子的二级抗体，该二级抗体能结合此复合体；以及(c)提供利于此信号产生分子产生信号的条件。
在本说明书中，术语“信号产生分子”涉及能直接或间接产生可检测信号的分子。例如，信号可以是放射活性的发射，或者是在特定波长下的分光光度吸收。优选地，信号为可被分光光度测量仪检测的颜色。例如信号产生分子可通过自身与生色底物作用直接产生信号，或者通过与另一个可产生信号的分子结合，从而间接产生信号。在一个优选的实施方案中，信号产生分子是一种配体，其通过与连接至一种酶的配体结合分子结合，接下来催化导致颜色形成的反应，从而间接产生信号。
生物液可以是任何含有PP-13的液体，如胎盘提取物或者血清。优选的液体为血清。在本发明这方面的一个实施方案中，与PP-13上一个位点结合的Mab被结合于固相上，如微量滴定孔或珠。二级抗体可与PP-13上的另一个位点结合，它可以是多克隆或单克隆。在一个优选的实施方案中，二级抗体也是一种本发明的Mab。
本发明进一步的一个方面是提供测定生物液中PP-13水平的试剂盒，它包含：(a)根据本发明的Mab；(b)与信号产生分子连接的二级抗体；以及(c)PP-13标准液。在一个优选的实施方案中，如上所述，二级抗体也是一种Mab。该试剂盒可用于进行上述的免疫测定。
附图简述：
为了了解本发明，以及了解它如何用于实际操作，现在将参照附图，以非限制性实例的方式描述一个优选的实施方案。
图1显示了小鼠抗PP-13腹水&IgG的SDS-PAGE电泳图(为显现杂质，凝胶是过载的)；
图2阐明用直接ELISA检测小鼠抗PP-13血清；
图3阐明用直接ELISA对抗PP-13抗体的分类；
图4&5阐明用夹心ELISA检测抗PP-13抗体；
图6-9阐明用直接ELISA对抗PP-13抗体的分类(克隆：二筛)；
图10阐明用直接ELISA对抗PP-13抗体的分类(克隆：三筛)；
图11阐明不同组合的双单克隆抗体夹心ELISA；
图12显示了PP-13 ELISA的标准曲线(单克隆夹心)；
图13阐明PP-13 ELISA的灵敏度(单克隆夹心)；
图14阐明了PP-13在血清中的稀释曲线(单克隆夹心ELISA)；以及
图15阐明了PP-13分析复原检验(单克隆夹心ELISA)。
优选的实施方案详述
材料和方法
(a)PP-13的纯化
对Bohn等人描述的方法加以改进后，从人胎盘分离和纯化本研究所用的PP-13。新鲜获得的胎盘剥去膜和母体外层物，将内胎滋养层区切成小块，置于搅拌器中用约1.5升的DDW匀浆5min。接下来的所有步骤均在4℃进行。加入几滴浓缩NaOH，将提取物的pH调节至7.0。然后，将提取物用组织匀浆器(Politron)再匀浆5min，每批300ml。将匀浆后的胎盘提取物搅拌30min，然后10,000转每分(Sorval大转头)离心60min。保留上清，补加0.5M NaCl、100mM Tris-HCl、0.05％Tween 20和0.1％NaN3，用真空泵通过深层滤器过滤，收集含有PP-13的滤液用作第一免疫吸附柱，贮存于-20℃。
用缓冲液A(1M NaCl、100mM Tris-HCl、0.1％NaN3，pH8.0)平衡60ml床体积的包含兔抗PP-13 IgG级分的抗PP-13免疫吸附柱(I)。该柱足以处理一个胎盘提取物。胎盘提取物以4ml/min的流速上样至柱，用缓冲液A洗脱，直至光密度(OD)水平达到基线。用6M尿素溶液(用1mg/10ml的安伯来特离子交换剂MB-6，20-50目处理)从柱洗脱PP-13峰。洗脱下来的蛋白质溶液(约150ml)用10kD MW截断盘膜超滤浓缩至终体积50ml。同时，将缓冲液切换为磷酸盐缓冲液(PBS)，其中含有0.1％NaN3，pH7.4。
用PBS+0.1％NaN3，pH7.4平衡60ml床体积的包含兔抗人胎盘提取物IgG级分之抗胎盘提取物反向免疫吸附柱(II)。从柱I获得的富含PP-13的提取物以3ml/min的流速上样至柱。收集未结合的蛋白质(约130ml)，用10kD MW截断盘膜浓缩至终体积40ml。用6M尿素溶液去除与柱结合的杂质，使柱再生，并且用5倍床体积的PBS+0.1％叠氮钠洗。
用PBS平衡56ml床体积的包含兔抗人α-1、β-和δ-球蛋白IgG的抗人球蛋白反向免疫吸附柱(III)。从柱II获得的浓缩PP-13提取物以3ml/min的流速上样至柱III，收集未结合的蛋白质(约120ml)。用6M尿素溶液使柱再生，并且用PBS洗。用第一个免疫吸附柱再纯化此物质，然后用Superdex 75 Hiload 26/60柱凝胶过滤层析。浓缩的PP-13级分(约3ml)以3ml/min的流速上样至事先用PBS平衡过的凝胶过滤柱，用PBS洗脱柱，以5ml一级分进行收集。PP-13在第三峰被洗脱，浓缩至1ml。SDS-PAGE电泳(5)分析纯度，用Microbradford法和ELISA法定量。
(b)抗PP-13单克隆抗体的制备
在Weizmann研究所(以色列)生产单克隆抗PP-13抗体(Mab)。五只三周龄雌性Balb/c小鼠(Jackson)，每只小鼠每次注射(i.d.和s.c.)用PBS和完全弗氏佐剂制备的0.05mg PP-13，免疫两次，然后注射用无佐剂PBS制备的PP-13，免疫两次。分别在小鼠每个后爪垫注射，及两侧和背部多点注射。每隔两周注射一次。在第三次和第四次免疫后10天进行血试验。
三周后，对反应最佳的两只小鼠(见结果部分连续两天i.p.注射0.05mgPP-13两次，最后一次加强免疫后5天，取这两只小鼠的脾，如前所述(6)，用41％的聚乙二醇(Serva，Heidelberg，FRG)将来自每个脾的一亿个细胞与两千万个NSO/1骨髓瘤细胞进行融合，其中NSO/1骨髓瘤细胞由C.Milstein(CRC，Cambridge，UK)惠赠。
融合后，将细胞以50,000个活细胞/孔的浓度分散于6个微孔板(96孔/板)。在HAT存在下，于8％CO2的湿度培养箱对杂交细胞进行生长选择。生长培养基为补加了1mM丙酮酸、2mM谷氨酰胺、青霉素(10单位/ml)、链霉素(0.02mg/ml)和15％热灭活的马血清(HS，Beit HaemekBiological Industries，以色列)的Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM high glucose，Gibco)。阳性杂交培养物能避开HAT而生长，通过有限稀释法克隆，在软琼脂中再克隆，以及在大体积的DMEM-HS中体外增殖，或者在pyrstane-处理的(BALB/c×DBA/2)小鼠体内以腹水形式增殖。
用蛋白质G柱(Sigma，Cat.#P4691)亲和纯化最佳克隆产生的腹水液。收集IgG级分，并进行透析、浓缩、定量和在抗体捕捉直接ELISA试验中检测。将等分的样品生物素化，并且再次进行抗体捕捉直接ELISA试验和多种双-单克隆抗体夹心ELISA试验。选择具最高敏感性的最佳抗体组合用于双-单克隆Ab夹心ELISA的进一步试验。
抗体捕捉直接ELISA用来筛选抗PP-13抗体。用纯化的PP-13包被微量滴定板，并且用含1％BSA的PBS封闭。初级抗体为试验血、杂交瘤培养上清或腹水的抗血清。用正常小鼠血清(NMS)作为阴性对照。与其它小鼠免疫球蛋白无交叉反应的AP-山羊抗小鼠IgG(Fc)(Sigma，Cat.#A1418)和生物素-山羊抗小鼠IgM(ZymedLaboratories.Inc.，Cat.#62-6840)用作二级抗体，以确定抗体的分类特异性。将AP-外抗生物素蛋白(Extravidin)应用于事先与生物素化Ab孵育过的微孔板。
与底物孵育后，用微孔板读数器(BIO-TEK Instruments.Inc.)405nm处测光密度。由于Ab亲和性与检测方法的敏感性密切相关，故用双抗体夹心ELISA评估单克隆抗体亲和性以及与另一个配对抗体相互作用的能力，其中以兔多克隆抗PP-13 IgG为初级抗体。纯化的PP-13作为标准溶液，浓度在0至2.0ng/ml之间。以试验血、杂交瘤培养上清或腹水的抗血清作为二级抗体。AP-山羊抗小鼠IgG用于检测Ab。与底物孵育后，用微孔板读数器405nm处扫描ELISA板。
(c)双-单克隆抗体夹心ELISA
为测定生物液中的PP-13，建立了以生物素-外抗生物素蛋白为放大系统的双-单克隆抗体夹心固相酶免疫测定法。用来自人胎盘的高度纯化的PP-13作为标准和对照。两个在双抗体夹心试验中显示最佳结果的纯化腹水IgG级分用于进行ELISA。用SDS-PAGE电泳控制它们的纯度水平(图1)。一个Ab用于包被平底96-孔 Nunc-微孔板，另一个Ab生物素化后作为二级抗体。
用PBS配制的抗PP-13 IgG包被ELISA板，室温下孵育2小时。孵育后，用PBS+0.05％吐温20洗板3次，用测定缓冲液(PBS+1％BSA+0.05％吐温20)室温下封闭2小时。然后，用同样方式洗板。用混合的雄性血清/测定缓冲液稀释PP-13标准和对照(1∶3)，或者用测定缓冲液稀释未知样品(血清)(1∶3)，上样，室温过夜孵育微孔板。此后及以下全部步骤均用测定缓冲液洗板3次。加入作为二级抗体的、用测定缓冲液配制的生物素-抗PP-13 IgG，将板在室温孵育2小时。然后，将ELISA板与用测定缓冲液配制的外抗生物素蛋白-碱性磷酸酶溶液(Sigma，Cat.#E2636)室温孵育2小时。加入底物-生色混合液(Sigma，Cat.#104-105)进行反应，405nm处用ELISA读数器读取结果。用样品减去空白(混合的雄性血清/测定缓冲液，1∶3)的光密度测定标准或未知抗原的量。将这个数据对已知量的PP-13作图，绘制标准曲线。绘制标准曲线的2 SD置信区间作为质量控制统计学的基础。用Dbase软件计算结果。
结果
(a)抗PP-13单克隆抗体的检测
(i)试验血
滴定从五个免疫小鼠的试验血中得到的血清(1∶200-1∶48600)，监测反应的进展。用抗体捕捉直接ELISA测血样。发现小鼠#1、2、4具有强反应：可检测到高水平的特异抗体；而小鼠#3和#5的抗血清滴度低(图2)。在夹心ELISA中，同样的小鼠显示很高的抗体亲和性，可识别从50pg/ml开始的不同浓度的PP-13(未示)。具最佳反应的两只小鼠为#1和#2，选做最后的加强免疫和融合。
(ii)筛选组织培养上清(sups)
在杂交瘤生长过程中，使用AP-山羊抗小鼠IgG用抗体捕捉ELISA法周期性筛选组织培养sups。对阳性样品，用同一二级抗体重筛，并且用生物素-山羊抗小鼠IgM确定Ab的分类。对supS#12、26、27、59、79、140、215、249、409、442、489、502、531、534、606、669、676、808、882进行重筛，发现Ab#26、27、215、249、534、606、669、882属于IgG类，Ab#12、59、79、489、502、531、676属于IgM类，而Ab#140、409、442、808与两种二级抗体均为低水平结合(选择结果见图3)。
用夹心ELISA评估Ab的亲和性，以兔抗PP-13 IgG作为初级抗体，#27、215和534组织培养物产生的Ab具有高亲和性(选择结果见图4)。选择产生IgG类抗体的#26、27、215、249、534、606、669、882组织培养物用于克隆。它们的克隆以同样方式重筛(图5-10)。考虑到Ab的种类、水平和亲和性，使用最稳定的克隆#26-2、27-2-3、215-28-3、534-16和606-8-11-67诱导腹水。
克隆#26-2产生具高反应水平的IgG类Ab。
克隆#27-2-3产生具高亲和性的IgG类Ab，检测限为0.05ng/ml的PP-13。
克隆#215-28-3产生相对高反应的且具最佳亲和性的IgG类Ab，可识别从0.05ng/ml开始的不同浓度的PP-13。
克隆#534-16产生相对高亲和性的IgG类Ab，对PP-13浓度的检测限为0.2ng/ml。
克隆#606-8-11-67产生具高反应水平的IgG类Ab。
(iii)纯化和检测腹水液
用蛋白质G柱(Sigma，Cat.#P4691)亲和纯化#26-2、27-2-3、215-28-3、534-16和606-8-11-67五种腹水。它们的IgG级分已经用Ab捕捉直接ELISA法进行了试验，并证实了IgG的种类。将这些Ab等份生物素化。标记后，用Ab捕捉直接ELISA检测生物素-Ab，检测试剂为AP-外抗生物素蛋白。生物素化后所有的Ab均识别PP-13。对不同组合的初级抗体和二级抗体进行双抗体夹心检测。结果发现以#27-2-3的IgG包被，以#215-28-3生物素-IgG作为二级抗体是最有效的组合(图11)。该检测的敏感性为0.05ng/ml的PP-13。
(b)双抗体夹心ELISA的特性
(i)标准曲线统计
优化双抗体夹心ELISA的检测条件，绘制标准曲线。使用了不同浓度的PP-13：10、20、100、200、500pg/ml(图12)。将PP-13标准品减去空白所得的光密度值对已知量的PP-13作图。可以可信地测定有效范围在10至500pg/ml之间的PP-13浓度。标准曲线的形状几乎为线状，PP-13浓度与光密度之间的相关系数r＝0.99。离线的残余数SD为0.08，p值＜0.0001(双尾检验)。斜率急剧上升，与y轴的截距几乎为0。标准曲线数据点的平均变异系数为5.6％，2 SD置信限相对狭窄。
(ii)试验的敏感性
将这个参数定义为测定的最小检测限，其值为可与不包含蛋白质的样品区分开来的最小PP-13浓度，这个区分一方面基于对零标准估计值的置信限，另一方面是基于对标准估计值的置信限。从图中(图13)可以看出，10pg/ml PP-13与零可以清楚地区分开。这是使用夹心ELISA技术可达到的最高敏感性。
(iii)特异性
检测任一类型非特异性的传统方法是测定稀释样品和标准之间的平行性。在稀释实验中，发现合并的血清样品和不同浓度的标准PP-13溶液之间具有高水平的平行性。将合并的血清以1∶2、1∶4、1∶8和1∶16系列稀释。绘制出血清和标准PP-13溶液的标准化数据点(图14)。计算两条稀释曲线间的相关性。合并的血清曲线的斜率为1.02；相关系数r＝0.9998；离线的残余数SD为2.79，p值＜0.0001(双尾检验)。
(iv)分析复原检验
本检验基于对血清中已知浓度PP-13的测定.向怀孕妇女的合并的血清补加4个已知浓度的PP-13：20、50、100和200pg/ml，然后与同一浓度的PP-13对照汇合体一起分析。对数据点绘图(图15)。总体的分析复原为106.2％，曲线为线形，其斜率为1.03。所评估的混合血清中PP-13水平与所评估的对照汇合体中PP-13水平的相关性很强(r＝1)。
(V)测定内和测定间变异
这些参数用于评估测定的精密度.用同一测定内评估的对照样品的变异系数来评价测定内变异，其计算如下：
CV(％)＝标准偏差/平均*100％
发现测定内变异在1.5％和3.5％之间。测定间变异根据同样的公式计算，它是基于对每次测定的质量控制汇合体的等分样品进行评估。发现测定间变异在2.6％和8.4％之间(表1)。
表1 PP-13 ELISA的测定内和测定间变异
  PP-13水平pg/ml 测定内变异(CV，％)(n＝每次16个) 测定间变异(CV，％)(n＝8次测定)
  20 1.54 4.61
  50 3.51 8.39
  100 2.01 4.64
  200 1.91 2.56
(c)人血清中PP-13水平
采用双-单克隆抗体夹心ELISA测定男人、非怀孕和怀孕妇女的PP-13。结果怀孕妇女的PP-13水平(225.8+/-100.5pg/ml)显著高于非怀孕妇女(17.1+/-45.9pg/ml)或者男人(6.8+/-13.1pg/ml)的检测浓度。来自男人和非怀孕妇女的许多样品显示零水平的PP-13。这些结果暗示PP-13是一个真正的胎盘蛋白质，PP-13双抗体夹心ELISA可用作怀孕妇女的筛选工具。
参考文献
1.Bohn，H.，Winckle，W.，Grundmann，U.，胎盘蛋白质及其生物功能的免疫化学检测，妇产科学文献(Arch.Gynecol.Obstet.)，249：107-118(1991).
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Claims (12)

1.一种可以在夹心ELISA实验中检测浓度为10pg/ml胎盘蛋白质13的IgG型单克隆抗体，其由选自克隆#26-2、27-2-3、215-28-3、534-16和606-8-11-67的杂交瘤细胞产生。
2.一种杂交瘤克隆，其选自克隆#26-2、27-2-3、215-28-3、534-16和606-8-11-67。
3.一种检测生物液中胎盘蛋白质13水平的免疫测定方法，其包含以下步骤：
(a)将该液与根据权利要求1的单克隆抗体接触，由此形成单克隆抗体-胎盘蛋白质13复合体；
(b)将此复合体暴露于连接至信号产生分子的根据权利要求1的二级单克隆抗体，所述二级单克隆抗体能结合该复合体；且
(c)提供利于由该信号产生分子产生信号的条件，
其中，所述免疫测定能测量10-500pg/ml的浓度范围的胎盘蛋白质13。
4.根据权利要求3的免疫测定，其中步骤(a)所述的单克隆抗体结合至固相。
5.根据权利要求3或4的免疫测定，其中所述的信号产生分子是酶。
6.根据权利要求3或4的免疫测定，其中所述的信号产生分子是配体，权利要求3的步骤(c)包括将步骤(b)的产物和与酶连接的配体结合分子一起孵育。
7.根据权利要求6的免疫测定，其中所述的配体是生物素，所述的配体结合分子是外抗生物素蛋白。
8.一种测定生物液中胎盘蛋白质13水平的试剂盒，其包含
(a)根据权利要求1的单克隆抗体；
(b)与信号产生分子连接的根据权利要求1的二级单克隆抗体；以及
(c)胎盘蛋白质13标准溶液。
9.根据权利要求8的试剂盒，其中步骤(a)所述的单克隆抗体结合至固相。
10.根据权利要求8或9的试剂盒，其中所述的信号产生分子是酶。
11.根据权利要求8或9的试剂盒，其中所述的信号产生分子是配体，并且所述的试剂盒还包含与酶连接的配体结合分子。
12.根据权利要求11的试剂盒，其中所述的配体是生物素，所述的配体结合分子是外抗生物素蛋白。
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