ES2230082T3 - Anticuerpos dirigidos contra la proteina placentaria 13. - Google Patents
Anticuerpos dirigidos contra la proteina placentaria 13.Info
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Abstract
Un anticuerpo monoclonal (Mab) capaz de unirse a la Proteína Placentaria 13 (PP-13) y de detectar PP-13 a una concentración de 10 pg/ml en un ensayo ELISA tipo sándwich.
Description
Anticuerpos dirigidos contra la proteína
placentaria 13
Esta invención se refiere a anticuerpos inducidos
contra una proteína placentaria.
Las referencias a las que se hace mención en el
texto mediante un número entre paréntesis se enumeran al final de la
memoria descriptiva.
El objetivo del cuidado del embarazo es el
alumbramiento de un niño maduro, sano, sin encontrar complicaciones
que puedan afectar adversamente al buen estado tanto de la madre
como del recién nacido. Un porcentaje significativo de embarazos
están afectados por diversos trastornos. Entre ellos están el parto
prematuro, el retraso del crecimiento intrauterino y la
preeclampsia. Estas complicaciones afectan negativamente al
resultado de los embarazos afectados, ocasionando enormes costes
tanto para los pacientes como para el sistema sanitario.
La Proteína Placentaria 13
(PP-13) es una proteína que fue aislada previamente
a partir de tejido placentario humano (documento U.S. 4.500.451 de
Bohn, et al.).
La proteína se caracterizó por los siguientes
parámetros: movilidad electroforética, punto isoeléctrico,
coeficiente de sedimentación, peso molecular determinado por
ultracentrifugación, peso molecular determinado por electroforesis
SDS-PAGE, coeficiente de extinción y contenido de
carbohidratos. Se determinó la composición de aminoácidos (restos
por 100 restos) pero no la secuencia de aminoácidos.
Se usó PP-13 para desarrollar un
ensayo para la detección en la etapa temprana de tres trastornos
específicos relacionados con el embarazo: retraso del crecimiento
intrauterino, preeclampsia y parto prematuro (documento U.S.
5.198.366 de Sillberman). Se desarrollaron tanto un
radioinmunoensayo (RIA) como un ensayo inmunoabsorbente unido a
enzima (ELISA) usando PP-13 marcada y antisuero
Policlonal de PP-13 respectivamente. Sin embargo,
sólo se proporcionaron resultados experimentales para el RIA, y no
para el ELISA. En la patente de Silberman no se han descrito
propiedades adicionales de PP-13. También hay
informes en la bibliografía con respecto a la determinación de otras
proteínas placentarias y sus relaciones con los trastornos del
embarazo (1-3).
Además, el documento WO 99/38970 describe el uso
de la proteína PP-13 pura para preparar anticuerpos
monoclonales usando métodos convencionales.
El ELISA cumple los requisitos de la objetividad,
simplicidad, sensibilidad y especificidad sólo conseguidas
previamente mediante radioinmunoensayo (4). Una comparación
metodológica de ELISA y RIA pone de manifiesto varias ventajas del
primer método:
- 1.
- El ELISA es absolutamente seguro y no requiere un laboratorio especialmente diseñado y personal cualificado para trabajar con material radiactivo.
- 2.
- El ELISA tipo sándwich de dos anticuerpos es un método más sensible, rápido y fácilmente cuantificable.
- 3.
- Las enzimas son más estables que los indicadores radiactivos y causan un alto nivel de reproducibilidad de los resultados.
- 4.
- La actividad enzimática puede medirse fácilmente usando el principio espectrofotométrico de un lector ELISA, que es mucho más barato y sencillo de manipular que un contador gamma.
- 5.
- El ELISA es más apropiado para automatización.
Por lo tanto, es deseable desarrollar un ELISA
mejorado para la determinación de niveles de
PP-13.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar anticuerpos monoclonales (Mab) capaces de unir
PP-13 a una sensibilidad apropiada para detectar
los trastornos específicos relacionados con el embarazo mencionados
anteriormente en una fase temprana del embarazo.
Es un objetivo adicional de la invención
proporcionar un inmunoensayo que mida el nivel de
PP-13 en fluidos biológicos.
En un aspecto de la invención, se proporciona un
Mab capaz de unir PP-13 a una concentración de 10
pg/ml en un ensayo ELISA tipo sándwich.
En particular, la invención proporciona clones de
hibridoma seleccionados entre el grupo compuesto por los clones nº
26-2, 27-2-3,
215-28-3, 534-16 y
606-8-11-67, así
como los Mab producidos por estos clones. Estos clones se han
depositado de acuerdo con el Tratado de Budapest en la Colección
Nacional de Cultivos de Microorganismos del Instituto Pasteur de la
Rue du Docteur Roux 25, París, Francia. A continuación se
proporcionan los detalles del depósito de los clones:
| Nº de clon | Nº de entrada | Fecha de depósito |
| 26-2 | I-2134 | 4 de marzo de 1999 |
| 27-2-3 | l-2135 | 4 de marzo de 1999 |
| 215-28-3 | l-2136 | 4 de marzo de 1999 |
| 534-16 | l-2137 | 4 de marzo de 1999 |
| 606-8-11-67 | l-2138 | 4 de marzo de 1999 |
En otro aspecto de la invención, se proporciona
un inmunoensayo para medir el nivel de PP-13 en un
fluido biológico que comprende las etapas de: (a) poner el fluido en
contacto con un Mab de acuerdo con la invención, cultivando, de ese
modo, complejos Mab-PP-13; (b)
exponer los complejos a un segundo anticuerpo unido a una molécula
de generación de señales, siendo capaz el segundo anticuerpo de unir
los complejos; y (c) proporcionar las condiciones conducentes a la
producción de una señal generada por la molécula de generación de
señales, donde dicho inmunoensayo es capaz de medir
PP-13 sobre un intervalo de concentraciones de
10-500 pg/ml.
En la presente memoria descriptiva, la expresión
"molécula de generación de señales" se refiere a una
molécula capaz de generar, tanto directa como indirectamente, una
señal detectable. La señal puede ser, por ejemplo, una emisión
radiactiva o una absorbancia espectrofotométrica a una longitud de
onda específica. Preferiblemente, la señal será de un color que
pueda detectarse con un lector espectrofotométrico. La molécula de
generación de señales puede generar la señal directamente, por
ejemplo, reaccionando ella misma con un sustrato cromogénico, o
indirectamente, por ejemplo, mediante unión con otra molécula que es
capaz de generar una señal. En una realización preferida, la
molécula de generación de señales es un ligando que genera una señal
indirectamente mediante la unión a una molécula de unión a ligando
que está unido a una enzima que a su vez cataliza una reacción, que
da como resultado la formación de color.
El fluido biológico puede se cualquier fluido que
puede contener PP-13, tal como extracto
placentario o suero sanguíneo. Preferiblemente, el fluido es suero
sanguíneo. En una realización de este aspecto de la invención, los
Mab, que unen un sitio en PP-13, se unen a una fase
sólida tal como un pocillo de microtitulación o una perla. El
segundo anticuerpo será capaz de unirse a otro sitio en
PP-13, y puede ser policlonal o monoclonal. En una
realización preferida, el segundo anticuerpo también es un Mab de
acuerdo con la invención.
En un aspecto adicional de la invención, se
proporciona un kit para medir el nivel de PP-13 en
un fluido biológico que comprende: (a) un Mab de acuerdo con la
invención; (b) un segundo anticuerpo unido a una molécula de
generación de señales donde el segundo anticuerpo es capaz de unir
los complejos de PP-13 y el Mab de (a) y (c)
soluciones patrón de PP-13. En una realización
preferida, el segundo anticuerpo es también un Mab, como se
describió anteriormente. El kit puede usarse para realizar un
inmunoensayo como se describió anteriormente.
Para entender la invención y para ver cómo se
puede llevar a cabo en la práctica, ahora se describirá una
realización preferida, sólo a modo de ejemplo no limitante, con
referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
la Figura 1 muestra una electroforesis
SDS-PAGE de fluido ascítico e IgG de ratón
anti-PP-13 (el gel está sobrecargado
para la visualización de las impurezas);
la Figura 2 ilustra el ensayo de suero de ratón
anti-PP-13 en un ELISA directo;
la Figura 3 ilustra la clasificación de
anticuerpos anti-PP-13 en un ELISA
directo;
las Figuras 4 y 5 ilustran el ensayo de
anticuerpos anti-PP-13 en un ELISA
tipo sándwich;
las Figuras 6-9 ilustran la
clasificación de anticuerpos
anti-PP-13 en un ELISA directo
(clonación: 2º exploración);
la Figura 10 ilustra la clasificación de
anticuerpos anti-PP-13 en un ELISA
directo (clonación: 3º exploración);
la Figura 11 ilustra un ELISA tipo sándwich de
dos anticuerpos monoclonales en diferentes variantes;
la Figura 12 muestra una curva patrón de un ELISA
de PP-13 (sándwich monoclonal);
la Figura 13 ilustra la sensibilidad de un ELISA
de PP-13 (sándwich monoclonal);
la Figura 14 ilustra una curva de dilución de
PP-13 en el suero sanguíneo (ELISA tipo sándwich
monoclonal); y
la Figura 15 ilustra un ensayo de recuperación
analítico de PP-13 (ELISA tipo sándwich
monoclonal).
La PP-13 usada en este estudio se
aisló y purificó a partir de placenta humana de acuerdo con el
método descrito por Bohn et al. con algunas modificaciones.
Se quitaron de la placenta recién obtenida las membranas y la capa
externa materna. La región interna fetal del trofoblasto se cortó en
pequeños trozos y se homogeneizaron en un mezclador con
aproximadamente 1,5 litros de DDW durante 5 min. Las etapas
posteriores se llevaron a cabo a 4ºC. El pH del extracto se ajustó
a 7,0 mediante la adición de varias gotas de NaOH concentrado. El
extracto entonces se homogeneizó de nuevo con un homogeneizador
tisular (Politrón) durante 5 min en lotes de 300 ml. El extracto
placentario homogeneizado se agitó durante 30 min y entonces se
centrifugó durante 60 minutos a 10.000 rpm (rotor grande Sorval):
se recuperó el sobrenadante, se suplementó con NaCl 0,5 M,
Tris-HCl 100 mM, Tween®20 al 0,05% y NaN_{3} al
0,1%, y se filtró a través de filtros profundos, usando una bomba de
vacío. El filtrado que contenía PP-13 se recogió
para la primera columna de inmunoabsorbancia y se guardó a
-20ºC.
Se equilibró una columna de inmunoabsorbancia
anti-PP-13 de un volumen de lecho de
60 ml (I), que contenía una fracción de IgG de conejo
anti-PP-13, con tampón A (NaCl 1 M,
Tris-HCl 100 mM, NaN_{3} al 0,1%, pH 8,0). Esta
columna era suficiente para manipular el extracto de una placenta.
El extracto de placenta se cargó en la columna a una velocidad de
fuljo de 4 ml/min. La columna se lavó con tampón A hasta que el
nivel de densidad óptica (OD) alcanzó la línea basal. El pico de
PP-13 se eluyó de la columna con una solución de
urea 6 M (tratada con 1 mg/10 ml de intercambiador iónico de
amberlita MB-6 de malla de 20-50).
La solución de proteína eluída (aproximadamente 150 ml) se concentró
mediante ultrafiltración, usando secciones de membrana de disco de
peso molecular de 10 kD; a un volumen final de 50 ml. Al mismo
tiempo, se cambió el tampón por solución salina tamponada con
fosfato (PBS), que contenía NaN_{3} al 0,1%, pH 7,4.
Se equilibró una columna de inmunoabsorbancia
negativa anti-extracto placentario de un volumen de
lecho de 60 ml (II), que contenía una fracción de IgG de conejo
anti-extractos placentarios humanos, con PBS +
NaN_{3} al 0,1%, pH 7,4. El extracto enriquecido en
PP-13 obtenido de la columna I se cargó en la
columna a una velocidad de flujo de 3 ml/min. La proteína sin unir
(aproximadamente 130 ml) se recogió y concentró usando membranas de
disco con un límite de peso molecular de 10 kD a un volumen final de
40 ml. La columna se regeneró con solución de urea 6 M para retirar
las impurezas unidas a la columna y se lavó con 5 volúmenes de
lecho de PBS + azida sódica al 0,1%.
Se equilibró una columna de inmunoabsorbancia
negativa de anti-globulina humana de un volumen de
lecho de 56 ml (III), que contenía IgG de conejo
anti-globulina alfa-1, beta y delta
humanas, con PBS. El concentrado de PP-13 obtenido
de la columna II se cargó en la columna III a una velocidad de flujo
de 3 ml/min. La proteína sin unir (aproximadamente 120 ml) se
recogió y la columna se regeneró con solución de urea 6 M y se lavó
con PBS. Este material se purificó de nuevo usando la primera
columna de inmunoabsorbancia, y después se usó para cromatografía
de exclusión molecular que se realizó en una columna de Superdex® 75
Hiload® 26/60. La fracción de PP-13 concentrada
(aproximadamente 3 ml) se cargó en la columna de exclusión
molecular, equilibrada previamente con PBS, a una velocidad de
flujo de 3 ml/min. La columna se lavó con PBS y se recogieron
fracciones de 5 ml cada una. Se eluyó PP-13 como un
tercer pico, se concentró a un volumen de 1 ml, se analizó la
pureza mediante electroforesis SDS-PAGE (5) y se
cuantificó mediante el método Microbradford y mediante ELISA.
Los anticuerpos monoclonales
anti-PP-13 (Mab) se produjeron en el
Instituto Weizmann (Israel). Se inmunizaron 2 veces cinco ratones
hembra Balb/c (Jackson) de tres meses de edad con 0,05 mg de
PP-13 en PBS y adyuvante completo de Freund por
inyección por ratón (i.d. y s.c.), y dos veces con
PP-13 en PBS sin adyuvante. Las inyecciones se
hicieron en cada almohadilla plantar trasera y después en múltiples
sitios en ambos costados y la espalda de los ratones. Las
inyecciones se separaron por un intervalo de dos semanas. Las
extracciones de sangre de ensayo se llevaron a cabo 10 días después
de la tercera y cuarta inmunización.
Tres semanas después, dos ratones que tenían la
mejor respuesta (véase la sección de resultados) recibieron dos
inyecciones de 0,05 mg de PP-13 i.p. durante dos
días consecutivos. Cinco días después del último refuerzo, se
retiraron los bazos de los dos ratones y se fusionaron 100 millones
de células de cada bazo individual usando polietilenglicol 1500 al
41% (Serva, Heidelberg, FRG) con 20 millones de células de la línea
de mieloma NSO/1 amablemente proporcionadas por C. Milstein (MRC,
Cambridge, Reino Unido), como se describió previamente (6).
Después de la fusión, las células se repartieron
en seis microplacas (cada una de 96 pocillos) a una concentración de
50.000 células viables/pocillo. Las células híbridas seleccionadas
por crecimiento en presencia de HAT se mantuvieron en un incubador
humidificado en presencia de CO_{2} al 8% en aire. El medio de
crecimiento era medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM con
altos contenidos de glucosa, Gibco) suplementado con piruvato 1 mM,
glutamina 2 mM, penicilina (10 unidades/ml), estreptomicina (0,02
mg/ml) y suero de caballo al 15% inactivado por calor (HS, Belt
Haemek Biological Industries, Israel). Los cultivos híbridos
positivos se retiraron de HAT, se clonaron mediante dilución
limitante, se clonaron de nuevo en agar blando y se propagaron
in vitro en grandes volúmenes de DMEM-HS o
in vivo como ascitis en ratones (BALB/c x DBA/2) tratados
con pristano.
Los fluidos ascíticos producidos usando los
mejores clones se purificaron por afinidad en una columna de
proteína G (Sigma, Cat. nº P 4691). Las fracciones de IgG se
recogieron, dializaron, concentraron, cuantificaron y ensayaron en
un ELISA directo de captura de anticuerpo. Las alícuotas se
biotinilaron y ensayaron de nuevo en un ELISA directo de captura de
anticuerpo y en variantes de un ELISA tipo sándwich de dos
anticuerpos monoclonales. Se eligió la mejor combinación de
anticuerpos con la sensibilidad más alta para el desarrollo de un
ELISA tipo sándwich de dos anticuerpos monoclonales.
El ELISA de captura de anticuerpos se empleó para
la detección de anticuerpos
anti-PP-13. Las placas de
microtitulación se recubrieron con PP-13 purificado
y se bloquearon con BSA al 1% en PBS. El antisuero de las muestras
de sangre de ensayo, los sobrenadantes del cultivo de hibridoma o
los fluidos ascíticos se aplicaron como un anticuerpo primario. El
suero de ratón normal (NMS) sirvió como un control negativo. Se
usaron AP-anticuerpo de cabra
anti-IgG (Fc) de ratón, sin reactividad cruzada con
otras inmunoglobulinas de ratón (Sigma, Cat. nº A 1418) y
Biotina-anticuerpo de cabra anti-IgM
de ratón (Zymed Laboratories, Inc., Cat. nº
62-6840), como anticuerpos secundarios para la
determinación de especificidad de clase de anticuerpo. Se aplicó
AP-Extravidina a los pocillos de la microplaca
previamente incubados con anticuerpo biotinilado.
Después de la incubación con el sustrato, se
detectó la densidad óptica en un lector de Microplacas
(BIO-TEK Instruments, Inc.) a 405 nm. Como la
afinidad del anticuerpo está relacionada estrechamente con la
sensibilidad del ensayo, se evaluaron las afinidades de los
anticuerpos monoclonales y la capacidad de trabajar con otro
anticuerpo como par usando un ELISA tipo sándwich de dos anticuerpos
con IgG policlonal de conejo
anti-PP-13 como anticuerpo primario.
La PP-13 purificada sirvió como solución patrón con
concentraciones de 0 a 2,0 ng/ml. Como anticuerpos secundarios se
aplicaron el antisuero de las muestras de sangre de ensayo, los
sobrenadantes del cultivo de hibridoma o los fluidos ascíticos.
Como anticuerpo de detección se usó AP-anticuerpo
de cabra anti-IgG de ratón. Después de la
incubación con el sustrato, las placas ELISA se exploraron en el
lector de Microplacas a 405 nm.
Se estableció un inmunoensayo de enzimas en fase
sólida tipo sándwich de dos anticuerpos monoclonales con un sistema
de amplificación biotina-extravidina para medir
PP-13 en fluidos biológicos. Se usó la
PP-13 altamente purificada de placenta humana como
patrón y control. Dos fracciones de IgG de los fluidos ascíticos
purificados mostraron el mejor resultado en la prueba del ensayo
tipo sándwich de dos anticuerpos usada para el desarrollo del
ELISA. Su nivel de pureza se controló mediante electroforesis
SDS-PAGE (Figura 1). Se usó un anticuerpo para el
recubrimiento de microplacas Nunc de 96 pocillos de fondo plano
mientras que el segundo sirvió como anticuerpo secundario tras la
biotinilación.
Las placas ELISA se recubrieron con IgG
anti-PP-13 en PBS y se incubaron
durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación las
placas se lavaron 3 veces con PBS + Tween® 20 al 0,05% y se
bloquearon con tampón de ensayo (PBS + BSA al 1% + Tween® 20 al
0,05%) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después, las placas
se lavaron de la misma manera, se cargaron el patrón y los
controles de PP-13 diluidos en suero masculino
combinado/tampón de ensayo (1:3) o la muestra desconocida (suero
sanguíneo) diluida en tampón de ensayo (1:3), y las microplacas se
incubaron durante una noche a temperatura ambiente. Después de esto
y de las etapas siguientes, las placas se lavaron 3 veces con tampón
de ensayo. Se añadió Biotina-IgG
anti-PP-13 en tampón de ensayo como
segundo anticuerpo y las placas se incubaron durante 2 horas a
temperatura ambiente, y entonces las placas ELISA se incubaron con
extravidina-solución de fosfatasa alcalina (sigma,
Cat. nº E 2636) en tampón de ensayo durante 2 horas a temperatura
ambiente. La reacción se desarrollo mediante la adición de
sustrato-mezcla cromogénica (Sigma, Cat nº
104-105) y los resultados se detectaron en un
lector de ELISA a 405 nm. La cantidad de patrón o antígeno
desconocido se determinó como una densidad óptica (OD) de la muestra
menos el blanco (suero masculino combinado/tampón de ensayo; 1:3).
Se estableció una curva patrón mediante la representación de los
datos frente a la cantidad conocida de PP-13. Se ha
representado el intervalo de confianza 2SD de la curva patrón como
una base para el control de calidad estadístico. Los resultados se
calcularon usando el programa Dbase.
El suero sanguíneo obtenido de cinco ratones
inmunizados durante las extracciones de sangre de ensayo se
titularon (1:200 - 1:48600) para observar el desarrollo de la
respuesta. Las muestras de sangre se comprobaron en el ELISA directo
de captura de anticuerpo. Se descubrió que los ratones nº 1, 2, 4
tienen una repuesta fuerte: se detectaron altos niveles de
anticuerpo específico. Las titulaciones de antisuero de los ratones
nº 3 y nº 5 fueron inferiores (Figura 2). Los mismos ratones
mostraron una afinidad bastante alta en el ELISA tipo sándwich
reconociendo diferentes concentraciones de PP-13
empezando en 50 pg/ml (no mostrado). Dos ratones, nº 1 y nº 2, que
tienen la mejor respuesta, se eligieron para el último refuerzo y
fusión.
Se exploraron los sobrenadantes del cultivo
tisular periódicamente durante el crecimiento del hibridoma mediante
un ELISA de captura de anticuerpo usando
AP-anticuerpo de cabra anti-IgG de
ratón. Las muestras positivas se exploraron de nuevo usando el mismo
segundo anticuerpo y Biotina anti-IgM de ratón, de
cabra, para identificar la clase de anticuerpos. Se exploraron de
nuevo los sobrenadantes nº 12, 26, 27, 59, 79, 140, 215, 249, 409,
442, 489, 502, 531, 534, 606, 669, 676, 808 y 882. Se descubrió que
los anticuerpos nº 26, 27, 215, 249, 534, 606, 669 y 882 pertenecían
a la clase IgG, los anticuerpos nº 12, 59, 79, 489, 502, 531 y 676
se clasificaron como IgM y los anticuerpos nº 140, 409, 442 y 808
mostraron bajos niveles con ambos anticuerpos secundarios (los
resultados seleccionados se muestran en la Figura 3).
Las afinidades de los anticuerpos se evaluaron en
un ELISA tipo sándwich con IgG de conejo
anti-PP-13 como anticuerpo primario.
Los cultivos titulares nº 27, 215 y 534 produjeron anticuerpo con
alta afinidad (los resultados seleccionados se muestran en la Figura
4). Los cultivos titulares nº 26, 27, 215, 249, 534, 606, 669 y 882
que producen anticuerpos de clase IgG se eligieron para clonación.
Sus clones se exploraron de nuevo de la misma manera (Figuras
5-10). Tomando en consideración la clase, nivel y
afinidad del anticuerpo, se usaron los clones más estables nº
26-2, 27-2-3,
215-28-3, 534-16 y
606-8-11-67 para la
inducción de ascitis:
El clon nº 26-2 produjo
anticuerpos de clase IgG con un alto nivel de respuesta.
El clon nº 27-2-3
produjo anticuerpos de clase IgG con alta afinidad; el límite de
detección fue 0,05 ng/ml de PP-13.
El clon nº
215-28-3 produjo anticuerpos de
clase IgG con una respuesta relativamente alta y la mejor afinidad,
reconociendo diferentes concentraciones de PP-13
empezando en 0,05 ng/ml.
El clon nº 534-16 produjo
anticuerpos de clase IgG con afinidad relativamente alta; el límite
de detección de concentración de PP-13 fue 0,2
ng/ml.
El clon nº
606-8-11-67 produjo
anticuerpos de clase IgG con un alto nivel de respuesta.
Se purificaron por afinidad cinco fluidos
ascíticos nº 26-2,
27-2-3,
215-28-3, 534-16 y
606-8-11-67 en una
columna de proteína G (Sigma, Cat. nº P 4691). Sus fracciones de IgG
se ensayaron en el ELISA directo de captura de anticuerpo
confirmando la clase IgG. Se biotinilaron alícuotas de estos
anticuerpos. Tras el marcaje, se comprobaron los
botina-anticuerpos en el ELISA directo de captura de
anticuerpo, usando AP-Extravidina como reactivo de
detección. Todos los anticuerpos reconocieron PP-13
tras la biotinilación. Se llevaron a cabo dos ensayos tipo sándwich
de dos anticuerpos con diferentes combinaciones de anticuerpo
primario y secundario. Se descubrió que la variante más eficaz usaba
IgG nº 27-2-3 para el recubrimiento
y Biotina-IgG nº
215-28-3 como segundo anticuerpo
(Figura 11). La sensibilidad de este ensayo fue de 0,05 ng/ml de
PP-13.
Se optimizaron las condiciones de ensayo de un
ELISA tipo sándwich de dos anticuerpos y se construyó una curva
patrón. Se usaron diferentes concentraciones de
PP-13: 10, 20, 50, 100, 200 y 500 pg/ml (Figura 12).
Se representaron las densidades ópticas de las muestras patrón de
PP-13 menos el blanco vs. cantidades conocidas de
PP-13. Se midió con cierta precisión un intervalo
eficaz de concentraciones de PP-13 comprendido entre
10 a 500 pg/ml. La forma de la curva patrón era casi lineal; el
coeficiente de correlación entre las concentraciones de
PP-13 y las densidades ópticas fue r = 0,99. Los SD
de los datos residuales de la línea = 0,08, valor p < 0,0001 (de
dos colas). La pendiente era bastante pronunciada, con un corte en
el eje-y próximo a 0. El coeficiente medio de la
variación de los puntos de los datos de la curva patrón fue del
5,6%, y los límites de confianza 2SD fueron bastante estrechos.
Este parámetro está definido como el límite de
detección mínimo de un ensayo que se va a determinar como la
concentración mínima de PP-13 que puede distinguirse
a partir de una muestra que no contiene proteína. La distinción se
basa en los límites de confianza de la estimación del patrón cero
por una parte, y el patrón por otra parte. En la gráfica (Figura 13)
se ve que 10 pg/ml de PP-13 podrían distinguirse
claramente del cero. Esta es la máxima sensibilidad que puede
lograrse usando la técnica de ELISA tipo sándwich.
El método tradicional para detectar cualquier
tipo de falta especificidad es un examen de paralelismo entre
diluciones de la muestra y el patrón. Se ha descubierto un alto
nivel de paralelismo entre las muestras de suero sanguíneo
combinadas y las diferentes concentraciones de la solución de
PP-13 patrón en experimentos de dilución. Se han
hecho series de diluciones de suero combinado: 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16.
Se trazaron los puntos de los datos normalizados del suero sanguíneo
y la solución patrón de PP-13 (Figura 14). Se
calculó la correlación entre las dos curvas de dilución. La
pendiente de la curva de suero combinado fue = 1,02; el coeficiente
de correlación r = 0,9998; SD de los datos residuales de la línea =
2,79; valor p < 0,0001 (de dos colas).
Este ensayo está basado en la determinación de
concentraciones conocidas de PP-13 en suero
sanguíneo. El suero sanguíneo combinado de mujeres embarazadas se
suplementó con cuatro cantidades de PP-13 conocidas:
20, 50, 100 y 200 pg/ml y se analizó junto con las mismas
concentraciones de la combinación de control de
PP-13. Los puntos de los datos se representaron en
una gráfica (Figura 15). Se descubrió que la recuperación analítica
global era del 106,2% y la curva era lineal con la pendiente =
1,03. La correlación entre los niveles estimados de
PP-13 en suero sanguíneo combinado y en la
combinación de control era muy fuerte (r = 1).
Estos parámetros se usaron para la evaluación de
la precisión de ensayo. La variación intra-ensayo
se evaluó como el coeficiente de variación de las muestras control
estimadas en el mismo ensayo y se calculó como:
CV (%) =
desviación típica/media x
100%
Se descubrió que está entre el 1,5% y el 3,5%. La
variación inter-ensayo se calculó de acuerdo con la
misma fórmula, basada en estimaciones de alícuotas de la combinación
de control de calidad en cada ensayo ejecutado y se descubrió que
está entre el 2,6% y el 8,4% (Tabla 1).
Se empleó un ELISA tipo sándwich de dos
anticuerpos monoclonales para medir PP-13 en suero
sanguíneo de hombres, mujeres no embarazadas y mujeres embarazadas.
Se descubrió que el nivel de PP-13 en mujeres
embarazadas era significativamente mayor (225,8 +/- 100,5 pg/ml)
que las concentraciones detectadas en mujeres no embarazadas (17,1
+/- 45,9 pg/ml) o en hombres (6,8 +/- 13,1 pg/ml). Muchas muestras
de hombres y mujeres no embarazadas mostraron un nivel cero de
PP-13. Estos resultados sugieren que
PP-13 es una proteína placentaria real y se puede
usar un ELISA tipo sándwich de dos anticuerpos de
PP-13 como herramienta de exploración en mujeres
embarazadas.
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Claims (14)
1. Un anticuerpo monoclonal (Mab) capaz de unirse
a la Proteína Placentaria 13 (PP-13) y de detectar
PP-13 a una concentración de 10 pg/ml en un ensayo
ELISA tipo sándwich.
2. Un Mab de acuerdo con la reivindicación 1
producido por una célula de hibridoma seleccionada entre el grupo
compuesto por los clones que tienen los números de entrada
I-2134, l-2135,
l-2136, l-2137 y
l-2138.
3. Un Mab de acuerdo con la reivindicación 2
producido por los clones de hibridoma que tienen los números de
entrada l-2135 o l-2136.
4. Un clon de hibridoma seleccionado entre el
grupo compuesto por los clones que tienen los números de entrada
I-2134, l-2135,
l-2136, l-2137 y
l-2138.
5. Un inmunoensayo para medir el nivel de
PP-13 en un fluido biológico que comprende las
etapas de:
- (a)
- poner dicho fluido en contacto con un Mab de acuerdo con la reivindicación 1, formando, de ese modo, complejos Mab-PP-13;
- (b)
- exponer dichos complejos a un segundo anticuerpo unido a una molécula de generación de señales, siendo capaz dicho segundo anticuerpo de unir dichos complejos; y
- (c)
- proporcionar las condiciones conducentes a la producción de una señal generada por dicha molécula de generación de señales,
donde dicho inmunoensayo es capaz
de medir PP-13 sobre un intervalo de
concentraciones de 10-500
pg/ml.
6. Un inmunoensayo de acuerdo con la
reivindicación 5, donde dicho Mab en la etapa (a) está unido a una
fase sólida.
7. Un inmunoensayo de acuerdo con las
reivindicaciones 5 o 6, donde dicha molécula de generación de
señales es una enzima.
8. Un inmunoensayo de acuerdo con las
reivindicaciones 5 o 6, donde dicha molécula de generación de
señales es un ligando, y la etapa (c) de la reivindicación 5
comprende la incubación del producto de la etapa (b) con una
molécula de unión a ligando unida a una enzima.
9. Un inmunoensayo de acuerdo con la
reivindicación 8, donde dicho ligando es biotina o dicha molécula
de unión a ligando es extravidina.
10. Un kit para medir el nivel de
PP-13 en un fluido biológico, que comprende
- (a)
- un Mab de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3;
- (b)
- un segundo anticuerpo unido a una molécula de generación de señales, donde el segundo anticuerpo es capaz de unir los complejos de PP-13 y el Mab de (a); y
- (c)
- soluciones patrón de PP-13.
11. Un kit de acuerdo con la reivindicación 10,
donde dicho Mab en la etapa (a) está unido a una fase sólida.
12. Un kit de acuerdo con las reivindicaciones 10
ó 11 donde dicha molécula de generación de señales es una
enzima.
13. Un kit de acuerdo con las reivindicaciones 10
ó 11, donde dicha molécula de generación de señales es un ligando,
y dicho kit comprende adicionalmente una molécula de unión a
ligando unida a la enzima.
14. Un kit de acuerdo con la reivindicación 13,
donde dicho ligando es biotina y dicha molécula de unión a ligando
es extravidina.
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