ES2340472T3 - Procedimiento para estimar la cantidad de tipos celulares de neutrofilos especificos. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para estimar in vitro la cantidad de células específicas en una muestra de un paciente, en el que se usan moléculas con especificidad celular para calcular el número de células específicas, que comprende a) extraer una alícuota de dicha muestra; y b) medir la concentración de dos moléculas con especificidad celular en dicha muestra extraída por medio de un ensayo inmunológico y determinar la relación entre las concentraciones de dichas moléculas, en el que las moléculas con especificidad celular son proteínas de neutrófilos.
Description
Procedimiento para estimar la cantidad de tipos
celulares de neutrófilos específicos.
La presente invención se refiere a la estimación
de la cantidad de subtipos de células específicas, por ejemplo el
número de ciertos subtipos de leucocitos, por medio de mediciones de
proteínas únicas en extractos de sangre y otro material biológico.
El conocimiento del número o cantidad de subtipos específicos de
glóbulos blancos es importante en el diagnóstico clínico y la
vigilancia de sujetos con enfermedades inflamatorias entre las que
se incluyen enfermedad infecciosa, cáncer, alergia/asma, etc.
La estimación del número de diversos leucocitos
en la sangre y en otros fluidos corporales es una de las
herramientas usadas más ampliamente en medicina. La forma
tradicional de obtener esta información es el recuento y
diferenciación de las células con un microscopio óptico. Esta
técnica se complementa por el recuento automático en contadores de
células basados en el principio de recuento del número de partículas
en el fluido y la medición de diversos parámetros físicos tales
como el tamaño y la dispersión hacia delante y lateral, pero también
por tinción histoquímica de células. Una extensión de estas
técnicas es el principio del citómetro de flujo en el que se usan
anticuerpos para identificar células individuales basándose en sus
antígenos de la superficie celular o por medio de su contenido de
antígenos intracelulares después de la permeabilización de las
células.
En el documento WO 00/58726 se describe un
procedimiento para cuantificar la cantidad de leucocitos en sangre
entera. Sin embargo, este procedimiento no cuantifica diferentes
subtipos específicos de leucocitos respecto al número o
relación.
Existe la necesidad de ensayos fáciles de usar,
baratos y fiables para estimar el número de diversos glóbulos
blancos tales como neutrófilos y eosinófilos, en la sangre y en
otros fluidos corporales, aplicables en el sitio de atención,
ayudando de esta manera al médico en su toma de decisiones
inmediata.
El presente inventor ha descubierto que la
extracción de sangre entera con, por ejemplo, detergentes tales
como CTAB (bromuro de N-cetil-N,N,N-trimetilamonio) y
la posterior medición por inmunoensayos específicos de las
proteínas de neutrófilos MPO (micloperoxidasa), HNL (lipocalina de
neutrófilos humanos) o lactoferrina, o las mediciones específicas
de proteínas de eosinófilos tales como EPX (proteína x de
eosinófilos) o EPO (peroxidasa de eosinófilos) identificarán de
forma precisa el número de eosinófilos presentes en la sangre. La
estimación del número de neutrófilos es útil en el diagnóstico y
monitorización de sujetos con enfermedades inflamatorias tales como
infecciones o enfermedades reumatoides, pero también junto con el
tratamiento médico, en particular el tratamiento citostático, en el
que puede producirse una reducción de la producción de neutrófilos,
es decir, neutropenia como efecto adverso grave del tratamiento. La
estimación del número de eosinófilos es útil en pacientes con
enfermedad alérgica, enfermedades inflamatorias crónicas,
enfermedades parasitarias y ciertos cánceres tales como la
enfermedad de Hodking, pero también como un indicador general de
enfermedad, ya que pueden aparecer números elevados de eosinófilos
en varias enfermedades por razones desconocidas.
La invención se refiere a la estimación de
poblaciones en diversas fases de maduración de células mieloides, ya
que algunas proteínas intracelulares se producen principalmente por
células inmaduras y otras proteínas principalmente por células más
maduras.
De esta manera, la invención se refiere a un
procedimiento para estimar in vitro la cantidad, refiriéndose
la cantidad al número o relación de subtipos de células específicas
en una muestra de un paciente, que comprende
- a)
- extraer una alícuota de dicha muestra; y
- b)
- medir la concentración de dos moléculas con especificidad celular en dicha muestra extraída mediante un ensayo inmunológico y determinar la relación entre las concentraciones de dichas moléculas,
en el que las moléculas con especificidad
celular son proteínas de neutrófilos.
\vskip1.000000\baselineskip
La muestra preferentemente es sangre u otro
fluido corporal. Se extrae una cantidad muy pequeña de muestra, tal
como 1-10 \mul de muestra, pero podrían
considerarse volúmenes mayores.
La extracción preferentemente se realiza con
detergentes catiónicos. El tiempo de extracción es muy corto, por
ejemplo, 1 minuto. Preferentemente, el detergente es CTAB.
\newpage
Preferentemente, la medición en la etapa b) es
por medio de un inmunoensayo, tal como ELISA, EIA, FEIA o RIA.
La molécula o moléculas con especificidad
celular son proteínas de neutrófilos tales como MPO
(mieloperoxidasa), HNL (lipocaína de neutrófilos humanos) o
lactoferrina para medir neutrófilos.
La presente invención se describirá con más
detalle a continuación en asociación con los dibujos adjuntos en los
que
la Fig. 1 muestra una correlación entre el
número de neutrófilos sanguíneos y la concentración de proteína MPO
en sangre entera extraída con detergente.
La Fig. 2 muestra la relación entre MPO y
lactoferrina en sangre entera extraída con detergente.
La Fig. 3 muestra una correlación entre el
número de eosinófilos y la concentración de proteína EPO en sangre
entera extraída con detergente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon gránulos a partir de la capa
leucocitaria de granulocitos obtenidos de donantes de sangre sanos
usando una modificación del procedimiento descrito por Peterson y
col. (Eur. J. Haematol. 40 (1988) 415-423). En
resumen, los glóbulos rojos se dejaron sedimentar usando Dextrano
T-500 antes de recoger el plasma rico en
leucocitos. Los leucocitos se lavaron dos veces en Sacarosa 0,34 M y
se suspendieron en 5 volúmenes de Sacarosa 0,34 M. Los leucocitos
se cavitaron usando N_{2} a una presión de 750 psi (5,17 MPa)
durante 30 min a +4ºC (Klempner y col., J. Cell. Biol. 86 (1980)
21-28; y Borregaard y col., J. Cell. Biol. 97 (1983)
52-61). El cavitado se suspendió en Sacarosa 0,34 M
y NaCl 0,17 M y se centrifugó durante 20 min a 450 xg a +4ºC.
Es sobrenadante se centrifugó durante 20 min a
10.000 xg a +4ºC para sedimentar los gránulos. A partir de los
extractos de gránulos se purificó mieloperoxidasa (MPO) de acuerdo
con Olsson y col. (Scand. J. Haematol. 9 (1972)
483-491) y Cooray y col. (Vet. Immunol.
Immunopathol. 38 (1993) 261-272). La preparación
final fue completamente homogénea de acuerdo con la relación de
absorbancia A430 nm/A280 nm, que fue 0,80 (Agner Acta. Chem. Scand.
12 (1958) 89-94).
Se purificó lipocalina de neutrófilos humanos
(HNL) como se describe (Xu y col., Scand J Clin Lab Invest 54
(1994) 365-376). La HNL se purificó hasta la
homogeneidad de acuerdo con la electroforesis en
SDS-PAGE y tinción con plata y el antígeno no
reaccionaba con anticuerpos contra las otras proteínas de
neutrófilos, MPO; Lactoferrina, Catepsina G, Elastasa y Lisozima.
La Lactoferrina se purificó como se describe (Reiter Int. J. Tissue
React. 5 (1983) 87-96). La Peroxidasa de
Eosinófilos (EPO) se purificó como se describe (Carlson y col. J.
Immunol. 134 (1985) 1875-1879) y la preparación
final fue homogénea de acuerdo con la relación de absorbancia A415
nm/A280 nm, que fue 1,15. La proteína de eosinófilos (EPX) se
purificó hasta la homogeneidad como se describe (Peterson y col.,
Immunol. 50 (1983) 19-26). La preparación final
aparecía como una banda en la electroforesis
SDS-PAGE y no reaccionaba con anticuerpos contra la
proteína catiónica de eosinófilos (ECP), elastasa, catepsina G, MPO
y EPO.
\vskip1.000000\baselineskip
Se indujeron anticuerpos contra MPO, HNL, EPO y
EPX en conejos mediante inyecciones intracutáneas en múltiples
sitios en conejos de 50-100 \mug en total de las
proteínas purificadas suspendidas en adyuvante completo e
incompleto de Freund. La especificidad de los anticuerpos se evaluó
por inmunodifusión doble (Ouchterlony Acta Pathol. Microbiol. Scand
26 (1949) 507-) en agarosa y se ensayó frente a extractos de
gránulos de neutrófilos y eosinófilos y las siguientes proteínas
purificadas: catepsina G, elastasa, MPO, lisozima, lactoferrina,
ECP, EPX; EPO.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizaron ratones Balb/c hembra por vía
subcutánea con proteína purificada. La sensibilización se realizó
por inyección de 50 \mug de proteína pura mezclada con adyuvante
completo de Freund. Se realizaron tres refuerzos con
aproximadamente 50 \mug de proteína pura en PBS (solución salina
tamponada con fosfato). Se fusionaron células de bazo como se
describe (Galfré y col., Nature 266 (1977) 550-552)
con células de mieloma Sp2/0. Se exploraron los anticuerpos en los
sobrenadantes de los cultivos celulares usando una técnica ELISA
con pocillos recubiertos de antígeno. También se exploró la
especificidad de los anticuerpos presentes en los sobrenadantes por
proteínas de gránulos respectivas y se localizaron los epítopes en
BIAcore® (BIAcore, Uppsala, Sweden). Se seleccionaron hibridomas de
acuerdo con los experimentos ELISA y BIAcore y se clonaron,
expandieron y purificaron. Todos los anticuerpos seleccionados
fueron del subtipo IgG1.
\vskip1.000000\baselineskip
La HNL se evaluó usando un radioinmunoensayo
como se describe (Xu y col., J. Immunol. Methods 171 (1994)
245-252. Las variaciones entre y dentro de los
ensayos fueron menores del 10% y el límite de detección fue menor de
4 \mug/l.
Se midió EPX y Mieloperoxidasa usando
radioinmunoensayos disponibles en el mercado (Pharmacia Diagnostics
AB, Uppsala, Sweden). Las variaciones entre y dentro de los ensayos
fueron menores del 10% y el límite de detección fue menor de 3 y 8
\mug/l, respectivamente.
La EPO se midió usando un ensayo
inmunofluorométrico prototipo que utiliza el Pharmacia CAP System®
como se describe (Nielsen y col., Allergy 53 (1998)
778-785. Las variaciones entre y dentro de los
ensayos fueron menores del 8% y el límite de detección fue menor de
0,5 \mug/l.
La lactoferrina se estimó como se describe
(Olofsson y col., Scand J Haematol 18 (1977) 73-80).
Las variaciones entre y dentro de los ensayos fueron menores del 8%
y el límite de detección fue menor de 2 \mug/l.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recogieron aleatoriamente muestras de sangre
que contenían EDTA extraídas de pacientes en el Hospital
Universitario, Uppsala, Sweden. Se realizaron recuentos de células
sanguíneas en cada muestra por medio de un contador de células
Coulter SAKS (Beckman Coulter, Inc.).
Las proteínas de los gránulos se extrajeron a
partir de granulocitos por medio de la adición de CTAB (bromuro de
N-cetil-N,N,N-trimetilamonio) a una concentración
final del 0,05-0,5% a una pequeña alícuota de
sangre, 1-10 \mul. La mezcla después se incubó
durante al menos 1 minuto y después se almacenó congelada a -20ºC
antes del análisis.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó un análisis de regresión usando el
paquete estadístico Statistica (Statsoft, Tulsa, USA).
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención muestra que la extracción
de una pequeña alícuota de sangre, 1-10 \mul, con
CTAB, concentración final del 0,05-0,5%, durante al
menos 1 minuto y la posterior medición de la proteína de neutrófilos
MPO por medio de un inmunoensayo específico estima de forma exacta
del número de neutrófilos en la sangre.
Como se muestra en la figura 1, la concentración
de MPO en el extracto se correlacionaba de forma significativa y
lineal (r=0,96) con el número de neutrófilos en la sangre extraída,
como se estima por medio de un contador de células Coulter STKS
(Beckman Coulter, Inc.). A partir de la ecuación de la línea de
regresión es evidente que la desviación desde el origen era mínima,
indicando la especificidad celular de la medición. Los resultados
se obtuvieron a partir de una población mixta de pacientes
hospitalizados (n=275) con niveles tanto elevados como reducidos de
neutrófilos en su sangre. De esta manera, algunos pacientes tenían
niveles muy elevados debido a infecciones bacterianas agudas y
otros tenían niveles seriamente reducidos debido a leucemia o al
tratamiento con fármacos citostáticos. A pesar de la inclusión de
estos extremos en el cálculo, la relación entre el número de
neutrófilos y la concentración de MPO fue lineal a lo largo de todo
el intervalo medido. Cuando se midió HNL, la correlación
correspondiente fue r=0,93 y también con una relación lineal con el
número de neutrófilos a lo largo todo el intervalo. La medición de
lactoferrina también mostró una relación lineal a lo largo de todo
el intervalo y un coeficiente de correlación de r=0,82.
\vskip1.000000\baselineskip
Es bien sabido que la MPO se almacena en los
gránulos primarios de los neutrófilos, mientras que la lactoferrina
y la HNL se almacenan en gránulos secundarios. Esto se debe a que la
producción de MPO se realiza principalmente durante las primeras
fases de maduración, es decir, por mieloblastos y promielocitos,
mientras que la lactoferrina y la HNL se producen principalmente
durante las últimas etapas de maduración, es decir, por los
mielocitos. También se sabe que la producción de MPO está menos
afectada por una mayor necesidad de neutrófilos en la circulación,
tal como en caso de infecciones agudas, que la producción de
lactoferrina y HNL. Por lo tanto, la relación entre el contenido de
proteínas de gránulos secundarios y MPO proporcionaría a los
presentes inventores una estimación del tamaño relativo de las
diversas etapas de maduración de los neutrófilos en la sangre y una
indicación de la renovación de los neutrófilos por la médula
ósea.
En la fig. 2 se muestra que la relación entre la
concentración de MPO y la concentración de lactoferrina en sangre
entera extraída varía aproximadamente 20 veces entre pacientes,
teniendo los pacientes con leucemia mieloide las mayores
relaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo se muestra que la extracción de
una pequeña alícuota de sangre, 1-10 \mul, con
CTAB, 0,05-0,5% durante al menos 1 minuto y la
posterior medición de la proteína de eosinófilos EPO por medio de un
inmunoensayo específico estima de forma precisa el número de
eosinófilos en la sangre.
Como se muestra en la figura 3, la concentración
de EPO en el extracto estaba significativa y linealmente
correlacionada (r=0,95) con el número de eosinófilos en la sangre
extraída, según se estima por medio de un contador de células
Coulter STKS (Beckman Coulter, Inc.). A partir de la ecuación de la
línea de regresión, es evidente que la desviación desde el origen
era mínima, indicando la especificidad celular de la medición. Los
resultados se obtuvieron a partir de una población mixta de
pacientes hospitalizados (n=275) con niveles tanto elevados como
reducidos de eosinófilos en su sangre. De esta manera, algunos
pacientes tenían números elevados por alergia y asma, enfermedades
inflamatorias crónicas, cáncer, etc. y algunos tenían números
reducidos debido, entre otras cosas, a infecciones agudas.
A pesar de la inclusión de estos extremos en el
cálculo, la relación entre el número de eosinófilos y la
concentración de EPO fue lineal en todo el intervalo medido. Cuando
se midió EPX, la correlación correspondiente fue r=0,93 y también
con una relación lineal con el número de eosinófilos en todo el
intervalo.
Los ejemplos anteriores 1-3
describen neutrófilos, diferentes formas de maduración de
neutrófilos y eosinófilos. Sin embargo, la invención no debe
considerarse limitada a estos tipos celulares.
Por ejemplo, la proteína de basófilos BB1 puede
medir basófilos.
Marcadores de la superficie celular tales como
CD20 pueden medir linfocitos B y linfocitos T CD3. Los marcadores de
la superficie celular CD4 y CD8 pueden usarse para medir diferentes
poblaciones de linfocitos.
Los monocitos pueden medirse por CD14 o
lisozima.
Los trombocitos puede medirse por
\beta-tromboglobulina.
Como se describe en el Ejemplo 2, la
determinación de relaciones es especialmente interesante para
células mieloides, pero también para diversas subpoblaciones de
linfocitos.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (5)
1. Un procedimiento para estimar in vitro
la cantidad de células específicas en una muestra de un paciente, en
el que se usan moléculas con especificidad celular para calcular el
número de células específicas, que comprende
- a)
- extraer una alícuota de dicha muestra; y
- b)
- medir la concentración de dos moléculas con especificidad celular en dicha muestra extraída por medio de un ensayo inmunológico y determinar la relación entre las concentraciones de dichas moléculas,
en el que las moléculas con especificidad
celular son proteínas de neutrófilos.
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2. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la extracción se realiza con un
detergente catiónico.
3. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 2, en el que el detergente es CTAB (bromuro de
N-cetil-N,N,N-trimetilamonio).
4. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra del paciente
es sangre entera.
5. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que las moléculas con
especificidad celular son MPO (mieloperoxidasa), HNL (lipocalina de
neutrófilos humanos) o lactoferrina.
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