CS253240B1 - Myší lymfocytární hybridom HBslC6B12 - Google Patents

Abstract

Řešení se týká myšího lymfocytárního hybridomu, produkujícího protilátku proti povrchovému antigenu viru hepatitidy B, který je uložen ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením HBslCgB12· Samotná monoklonální protilátka tohoto hybridomu je vhodná pro detekci povrchového antigenu v enzymoimunologickém testu.

Description

Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridní buněčné linie, která byla sestrojena fůzí buněk myší myelomové linie Sp2/0 a myších slezinných lymfoidních buněk, produkujících protilátky proti povrchovému antigénu viru hepatitidy B. Povrchový antigen je důležitou součástí viru hepatitidy B a jeho stanovení má zásadní význam při diagnostice onemocnění.

Dosud se protilátky proti povrchovému antigénu vyrábějí tak, že purifikovaný povrchový antigen je opakovaně injikován produkčním zvířatům, nejčastěji králíkům (kozám). Sérum takto imunizovaných zvířat, odebírané po určité době působení antigénu, slouží jako zdroj protilátek. Tento postup, který je nazýván konvenční imunizace^ má 2 zásadní neodstranitelné nevýhody. Pro každou imunizaci je nezbytný povrchový antigen, jehož purifikace představuje velmi nákladný a zdravotně rizikový postup. Séra získaná po imunizaci tímto antigenem obsahují nejen protilátky proti povrchovému antigénu, ale i protilátky proti lidským sérovým bílkovinám, především proti lidskému sérovému albuminu, přičemž tyto balastní protilátky je nutné odstraňovat.

Nevýhody konvenčních sér proti povrchovému antigénu odstraňuje použití hybridomové technologie. Produkt hybridomu - monoklonální protilátka - je namířena proti jediné antigenní determinantě povrchového antigénu a produkce monoklonálních protilátek nevyžaduje imunizaci zvířat antigenem. Použití monoklonální protilátky dále umožňuje zvýšení citlivosti detekční metody ELISA, který je používán pro diagnostiku choroby.

Z publikovaných výsledků je známo, že povrchový antigen viru hepatitidy B není jedinou antigenní složkou, ale představuje komplex několika antigenů. Ve všech izolátech se nachází skupinově specifická determinanta a. Další 2 páry subtypově specifických determinant d/y a r/w se obvykle nevyskytují společně a jsou považovány za alely (Le Bouvier, G.L.: The heterogeneity of Australia antigen, I. Infect. Dis 123: 671, 1971).

Monoklonální protilátky proti skupinově specifické determinantě a jsou výhodné pro diagnostické použití.

Podstatného pokroku v diagnostice hepatitidy B, který se projeví ve vyšší citlivosti a zároveň vyšší spolehlivosti testu, se dosáhne, jsou-li k dispozici klonované hybridní buněčné linie produkující monoklonální protilátku proti skupinově specifické a determinantě povrchového antigénu. Takový hybridom je uložen ve Sbírce hybridomu Ostavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 6, Flemingovo nám. 2, pod označením

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Kunitomo, K. , Yahara, S. Saji, H., Hosoi, T.: Monoclonal antibodies to hepatitis B surface antigen (HBsAg) as a tool fot the automated HBsAg screening Vox Sanguinis 45: 104, 1983); klonováním populace hybridních buněk, získaných hybridizací buněk ze sleziny myší kmene BALB/c, které byly imunizovány povrchovým antigenem víru hepatitidy B a buněk myší myelomové linie Sp2/0.

Výhodou hybridomů je, že produkují homogenní monoklonální protilátky, které reagují s povrchovým antigenem. Hybridom HBslCgB^ í^e možno kultivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. Z konzerv, které jsou uchovávány v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky bez dalšího antigénu. Protilátka produkovaná klonem HBslCgB^ reaguje specificky s a determinantou povrchového antigénu viru hepatitidy B.

Příklad: ‘

Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno 2 x 10^ hybridomových buněk do peritoneální dutiny myší kmene BALB/c. Této myši bylo 14 dní před podáním hybridomových buněk aplikováno 0,7 ml parafinového oleje do peritoneální dutiny. Po 12 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byla myš usmrcena a naprodukovaná ascitická tekutina byla odebrána.

Celkem bylo získáno 5 ml ascitické tekutiny, ve které bylo obsaženo 10 mg/ml imunoglobulinu. Monoklonální protilátka reagovala specificky s povrchovým antigenem viru hepatitidy B v enzymoimunologickém a radioimunologickém testu.

Z ascitické tekutiny byl purifikován imunoglobulih pomocí síranové metody a tímto imunoglobulinem byly potahovány mikrotitrační destičky v koncentraci 50 pg/ml. Pak byly přidány vzorky vyšetřované na přítomnosti povrchového antigenu viru hepatitidy B a konjugát polyklonální protilátky proti povrchovému antigenu s křenovou peroxidá2ou a enzymoimunologický test byl dokončen způsobem používaným pro detekci povrchového antigenu pomocí diagnostické soupravy ELISA HBsAg Micro I (ÚSOL). Použití monoklonální protilátky umožnilo detekci 1,5 ng povrchového antigenu/ml, což představuje dvojnásobné zvýšení citlivosti testu ve srovnání s systémem používající konvenční polyklonální protilátky.

Základním kultivačním médiem pro buňky hybridomu HBslgB^^ j^e Eaglogo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí doplněné o neesenciální aminokyseliny. Toto médium (označované jako H-MEMd), Ostav molekulární genetiky ČSAV) je pro kultivaci hybridomu doplněno penicilinem, streptomycinem a inaktivovaným telecím sérem /Bioveta, Ivanovice na Hané) . Hybridom je kultivován při 37 °C.

Hibridom 1C,.B₁₉ produkuje imunoglobulin podtřídy IgGl, izoelektrický bod je pH 6,6 až ^{0 1Z} 9-1

6,8. Asociační konstanta 2.10 M . Monoklonální protilátka produkovaná klonem HBsiC.B, _ o 1 2 reaguje specificky s povrchovým antigenem viru hepatitidy B. Tento hybridom může být průmyslově využíván jako zdroj protilátky proti povrchovému antigenu v diagnostických soupravách.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Myší lymfocytární hybridom HBslCgB^ produkují monoklonální protilátku podtřídy IgGl proti povrchovému antigenu viru hepatitidy B.