CS253240B1

CS253240B1 - Mouse lymphocyte hybridome hbs1c6b12

Info

Publication number: CS253240B1
Application number: CS86424A
Authority: CS
Inventors: Ivo Hlozanek; Evzen Korec; Vlasta Dostalova; Jaroslav Koenig; Petr Mancal; Vratislav Nemecek; Vladimir Zeleny
Original assignee: Ivo Hlozanek; Evzen Korec; Vlasta Dostalova; Jaroslav Koenig; Petr Mancal; Vratislav Nemecek; Vladimir Zeleny
Priority date: 1986-01-20
Filing date: 1986-01-20
Publication date: 1987-10-15
Also published as: CS42486A1

Abstract

Řešení se týká myšího lymfocytárního hybridomu, produkujícího protilátku proti povrchovému antigenu viru hepatitidy B, který je uložen ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením HBslCgB12· Samotná monoklonální protilátka tohoto hybridomu je vhodná pro detekci povrchového antigenu v enzymoimunologickém testu.The present invention relates to mouse lymphocytic antibody-producing hybridoma hepatitis B virus surface antigen which is deposited in the Institute's hybridoma collection molecular genetics of the Czechoslovak Academy of Sciences under the designation HBslCgB12 · Monoclonal antibody alone This hybridoma is suitable for detecting surface antigen in enzymimmunological test.

Description

Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridní buněčné linie, která byla sestrojena fůzí buněk myší myelomové linie Sp2/0 a myších slezinných lymfoidních buněk, produkujících protilátky proti povrchovému antigénu viru hepatitidy B. Povrchový antigen je důležitou součástí viru hepatitidy B a jeho stanovení má zásadní význam při diagnostice onemocnění.The present invention relates to a novel hybridoma, i.e. a hybrid cell line which has been constructed by fusing cells of the mouse myeloma line Sp2 / 0 and mouse spleen lymphoid cells producing antibodies against the hepatitis B virus surface antigen. essential in the diagnosis of disease.

Dosud se protilátky proti povrchovému antigénu vyrábějí tak, že purifikovaný povrchový antigen je opakovaně injikován produkčním zvířatům, nejčastěji králíkům (kozám). Sérum takto imunizovaných zvířat, odebírané po určité době působení antigénu, slouží jako zdroj protilátek. Tento postup, který je nazýván konvenční imunizace^ má 2 zásadní neodstranitelné nevýhody. Pro každou imunizaci je nezbytný povrchový antigen, jehož purifikace představuje velmi nákladný a zdravotně rizikový postup. Séra získaná po imunizaci tímto antigenem obsahují nejen protilátky proti povrchovému antigénu, ale i protilátky proti lidským sérovým bílkovinám, především proti lidskému sérovému albuminu, přičemž tyto balastní protilátky je nutné odstraňovat.To date, antibodies to the surface antigen have been produced by the purified surface antigen being injected repeatedly into production animals, most commonly rabbits (goats). Serum of animals immunized in this way, taken after some time of antigen treatment, serves as a source of antibodies. This procedure, which is called conventional immunization, has 2 major unavoidable disadvantages. For each immunization, a surface antigen is required, the purification of which is a very costly and health-risk procedure. Sera obtained after immunization with this antigen contain not only antibodies against the surface antigen but also antibodies against human serum proteins, especially against human serum albumin, and these ballast antibodies must be removed.

Nevýhody konvenčních sér proti povrchovému antigénu odstraňuje použití hybridomové technologie. Produkt hybridomu - monoklonální protilátka - je namířena proti jediné antigenní determinantě povrchového antigénu a produkce monoklonálních protilátek nevyžaduje imunizaci zvířat antigenem. Použití monoklonální protilátky dále umožňuje zvýšení citlivosti detekční metody ELISA, který je používán pro diagnostiku choroby.The disadvantages of conventional sera against surface antigen are eliminated by the use of hybridoma technology. The hybridoma product - a monoclonal antibody - is directed against a single antigenic determinant of the surface antigen and the production of monoclonal antibodies does not require immunization of animals with the antigen. The use of a monoclonal antibody further enables the sensitivity of the ELISA detection method used to diagnose the disease to be increased.

Z publikovaných výsledků je známo, že povrchový antigen viru hepatitidy B není jedinou antigenní složkou, ale představuje komplex několika antigenů. Ve všech izolátech se nachází skupinově specifická determinanta a. Další 2 páry subtypově specifických determinant d/y a r/w se obvykle nevyskytují společně a jsou považovány za alely (Le Bouvier, G.L.: The heterogeneity of Australia antigen, I. Infect. Dis 123: 671, 1971).It is known from the published results that the hepatitis B virus surface antigen is not the only antigenic component, but is a complex of several antigens. A group-specific determinant α is found in all isolates. The other 2 pairs of specific d / yar / w determinants are not commonly found together and are considered alleles (Le Bouvier, GL: The heterogeneity of Australia antigen, I. Infect. Dis 123: 671 (1971).

Monoklonální protilátky proti skupinově specifické determinantě a jsou výhodné pro diagnostické použití.Monoclonal antibodies against the group-specific determinant and are preferred for diagnostic use.

Podstatného pokroku v diagnostice hepatitidy B, který se projeví ve vyšší citlivosti a zároveň vyšší spolehlivosti testu, se dosáhne, jsou-li k dispozici klonované hybridní buněčné linie produkující monoklonální protilátku proti skupinově specifické a determinantě povrchového antigénu. Takový hybridom je uložen ve Sbírce hybridomu Ostavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 6, Flemingovo nám. 2, pod označenímSubstantial progress in the diagnosis of hepatitis B, which results in higher sensitivity and at the same time higher test reliability, is achieved when cloned hybrid cell lines producing a monoclonal antibody against a group specific and surface antigen determinant are available. Such a hybridoma is deposited in the Hybridoma Collection of the Institute of Molecular Genetics of the Czechoslovak Academy of Sciences in Prague 6, Flemingovo nám. 2, under the designation

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Kunitomo, K. , Yahara, S. Saji, H., Hosoi, T.: Monoclonal antibodies to hepatitis B surface antigen (HBsAg) as a tool fot the automated HBsAg screening Vox Sanguinis 45: 104, 1983); klonováním populace hybridních buněk, získaných hybridizací buněk ze sleziny myší kmene BALB/c, které byly imunizovány povrchovým antigenem víru hepatitidy B a buněk myší myelomové linie Sp2/0.The hybridoma was obtained by a method known in the literature (Kunitomo, K., Yahara, S. Saji, H., Hosoi, T .: Monoclonal Antibodies to Hepatitis B Surface Antigen (HBsAg) and a Tool Photo of Automated HBsAg Screening by Vox Sanguinis 45 : 104 (1983); cloning a population of hybrid cells obtained by hybridizing cells from the spleen of BALB / c mice that were immunized with the hepatitis B virus surface antigen and Sp2 / 0 mouse myeloma line cells.

Výhodou hybridomů je, že produkují homogenní monoklonální protilátky, které reagují s povrchovým antigenem. Hybridom HBslCgB^ í^e možno kultivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. Z konzerv, které jsou uchovávány v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky bez dalšího antigénu. Protilátka produkovaná klonem HBslCgB^ reaguje specificky s a determinantou povrchového antigénu viru hepatitidy B.The advantage of hybridomas is that they produce homogeneous monoclonal antibodies that react with a surface antigen. Hybridoma HBslCgB ^e ^ you may be cultured in vitro in a suitable media for animal cells, and adapted to grow in vivo in the peritoneal cavity of BALB / c. From cans that are stored in liquid nitrogen, antibody production can be started without additional antigen. The antibody produced by HBslCgB4 clone reacts specifically with the determinant of hepatitis B virus surface antigen.

Příklad: ‘Example: ‘

Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno 2 x 10^ hybridomových buněk do peritoneální dutiny myší kmene BALB/c. Této myši bylo 14 dní před podáním hybridomových buněk aplikováno 0,7 ml parafinového oleje do peritoneální dutiny. Po 12 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byla myš usmrcena a naprodukovaná ascitická tekutina byla odebrána.To expand the hybridoma cells in vivo, 2 x 10 6 hybridoma cells were injected into the peritoneal cavity of BALB / c mouse mice. This mouse was injected with 0.7 ml paraffin oil 14 days prior to the administration of the hybridoma cells into the peritoneal cavity. After 12 days of hybridoma growth in the peritoneal cavity, the mouse was sacrificed and the produced ascites fluid was collected.

Celkem bylo získáno 5 ml ascitické tekutiny, ve které bylo obsaženo 10 mg/ml imunoglobulinu. Monoklonální protilátka reagovala specificky s povrchovým antigenem viru hepatitidy B v enzymoimunologickém a radioimunologickém testu.A total of 5 ml of ascites fluid was obtained containing 10 mg / ml of immunoglobulin. The monoclonal antibody reacted specifically with the hepatitis B virus surface antigen in an enzyme and radioimmunoassay.

Z ascitické tekutiny byl purifikován imunoglobulih pomocí síranové metody a tímto imunoglobulinem byly potahovány mikrotitrační destičky v koncentraci 50 pg/ml. Pak byly přidány vzorky vyšetřované na přítomnosti povrchového antigenu viru hepatitidy B a konjugát polyklonální protilátky proti povrchovému antigenu s křenovou peroxidá2ou a enzymoimunologický test byl dokončen způsobem používaným pro detekci povrchového antigenu pomocí diagnostické soupravy ELISA HBsAg Micro I (ÚSOL). Použití monoklonální protilátky umožnilo detekci 1,5 ng povrchového antigenu/ml, což představuje dvojnásobné zvýšení citlivosti testu ve srovnání s systémem používající konvenční polyklonální protilátky.The immunoglobulin was purified from the ascites fluid by the sulphate method and coated with microtiter plates at a concentration of 50 µg / ml. Samples examined for the presence of hepatitis B virus surface antigen and horseradish peroxidase surface antigen polyclonal antibody conjugate were then added and the enzyme immunoassay was completed as used for surface antigen detection using the HBsAg Micro I ELISA kit (USSOL). Using the monoclonal antibody allowed the detection of 1.5 ng of surface antigen / ml, which represents a two-fold increase in assay sensitivity compared to a system using conventional polyclonal antibodies.

Základním kultivačním médiem pro buňky hybridomu HBslgB^^ j^e Eaglogo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí doplněné o neesenciální aminokyseliny. Toto médium (označované jako H-MEMd), Ostav molekulární genetiky ČSAV) je pro kultivaci hybridomu doplněno penicilinem, streptomycinem a inaktivovaným telecím sérem /Bioveta, Ivanovice na Hané) . Hybridom je kultivován při 37 °C.The basic culture medium for the hybridoma cells HBslgB ^^ j ^e Eaglogo minimum essential medium with Hank's salt mixture supplemented with nonessential amino acids. This medium (referred to as H-MEMd), Ostav molecular genetics CSAV) is supplemented with penicillin, streptomycin and inactivated calf serum (Bioveta, Ivanovice na Hané) for hybridoma culture. The hybridoma is cultured at 37 ° C.

Hibridom 1C,.B₁₉ produkuje imunoglobulin podtřídy IgGl, izoelektrický bod je pH 6,6 až ^{0 1Z} 9-1Hibridoma 1C, .B ₁₉ produces immunoglobulin of IgG1 subclass, isoelectric point is pH 6,6 to ^{0 1Z} 9-1

6,8. Asociační konstanta 2.10 M . Monoklonální protilátka produkovaná klonem HBsiC.B, _ o 1 2 reaguje specificky s povrchovým antigenem viru hepatitidy B. Tento hybridom může být průmyslově využíván jako zdroj protilátky proti povrchovému antigenu v diagnostických soupravách.6.8. Association constant 2.10 M. The monoclonal antibody produced by the HBsiC.B.1.2 clone reacts specifically with the hepatitis B virus surface antigen. This hybridoma can be industrially used as a source of the surface antigen antibody in diagnostic kits.

Claims

SUBJECT OF THE INVENTION

The HBs1CgB ^ murine lymphocyte hybridoma produces a monoclonal antibody of IgG1 subclass against hepatitis B virus surface antigen.