CS255640B1

CS255640B1 - Mouse lymphocytar hybridome forming antibodies against surface antigen of hepatitis-b virus which can be marked by horse-radish peroxidase

Info

Publication number: CS255640B1
Application number: CS867274A
Authority: CS
Inventors: Ivo Hlozanek; Evzen Korec; Vlasta Dostalova; Jaroslav Koenig; Petr Mancal; Vladimir Zeleny
Original assignee: Ivo Hlozanek; Evzen Korec; Vlasta Dostalova; Jaroslav Koenig; Petr Mancal; Vladimir Zeleny
Priority date: 1986-10-08
Filing date: 1986-10-08
Publication date: 1988-03-15
Also published as: CS727486A1

Abstract

Řešení se týká myšího lymfocytárniho hybridomu, produkujícího protilátku proti povrchovému antigenu viru hepatitidy B, které lze značit křenovou peroxidázou, který je uložen ve Sbírce hybridomů Ostavu molekulární genetiky ČSAV pod označením IMG-CZAS HBs 73F.A.. Protilátku lze značit □ .1 křenovou peroxidázou. Značená i neznačená protilátka je vhodná pro detekci povrchového antigenu viru hepatitidy B v enzymoimunologickém testu. Uvedený hybridom může být využit pro zdokonaleni diagnostiky hepatitidy B.The solution relates to mouse lymphocyte antibody-producing hybridoma hepatitis B virus surface antigen which can be labeled with horseradish peroxidase, which it is deposited in the Collection of Hybridomas of the Molecular Molecule genetics of CSAV under the designation IMG-CZAS HBs 73F.A .. The antibody can be labeled with 1 .1 horseradish peroxidase. Marked and unmarked the antibody is suitable for surface detection of the hepatitis B virus antigen in the enzyme immunoassay test. The hybridoma may be used to improve the diagnosis of hepatitis B.

Description

(54) Myší lymfocytární hybridem produkující protilátky proti povrchovému antigenu viru hepatitidy B, které lze značit křenovou peroxidázou(54) Mouse lymphocyte hybrid producing antibodies against hepatitis B virus surface antigen that can be labeled with horseradish peroxidase

Řešení se týká myšího lymfocytárniho hybridomu, produkujícího protilátku proti povrchovému antigenu viru hepatitidy B, které lze značit křenovou peroxidázou, který je uložen ve Sbírce hybridomů Ostavu molekulární genetiky ČSAV pod označenímThe invention relates to a murine lymphocyte hybridoma producing an antibody against the hepatitis B virus surface antigen, which can be labeled with horseradish peroxidase, which is deposited in the Collection of Hybridomas of the State of Molecular Genetics of the Czechoslovak Academy of Sciences under the designation

IMG-CZAS HBs 73F.A.. Protilátku lze značit □ .1 křenovou peroxidázou. Značená i neznačená protilátka je vhodná pro detekci povrchového antigenu viru hepatitidy B v enzymoimunologickém testu. Uvedený hybridom může být využit pro zdokonaleni diagnostiky hepatitidy B.IMG-CZAS HBs 73F.A .. The antibody can be labeled with 1 .1 horseradish peroxidase. Both labeled and unlabeled antibodies are suitable for the detection of hepatitis B virus surface antigen in an enzyme-linked immunoassay. Said hybridoma can be used to improve the diagnosis of hepatitis B.

Vynález se týká myšího lymfocytárního hybridomů produkujícího protilátky proti povrchovému antigenu viru hepatitidy B, které lze značit křenovou peroxidázou.The invention relates to murine lymphocyte hybridomas producing antibodies against the hepatitis B virus surface antigen that can be labeled with horseradish peroxidase.

Hybridní buněčná linie byla sestrojena fúzí buněk myelomové linie SP2/O a myších slezinných lymfoidníoh buněk, produkujících protilátky proti povrchovému antigenu viru hepatitidy B. Povrchový antigen je důležitou součástí viru hepatitidy B a jeho stanovení má zásadní význam při diagnostice onemocnění hepatitidou B.The hybrid cell line was constructed by fusing myeloma cell line SP2 / O and murine spleen lymphoid cells producing antibodies against the hepatitis B surface antigen. The surface antigen is an important part of hepatitis B virus and its determination is essential in the diagnosis of hepatitis B disease.

Tento vynález navazuje na vynálezy myších lymfocytárních hybridomů HBslCgB^^ a 72C4A7 produkující protilátky proti povrchovému antigenu viru hepatitidy B (AO č. 252 792,The present invention follows the inventions of murine lymphocyte hybridomas HBs1CgB4 ^ and 72C4A7 producing antibodies against hepatitis B virus surface antigen (AO No. 252 792,

AO č. 253 240).AO No. 253 240).

Povrchový antigen viru hepatitidy je v klinické praxi detekován pomocí enzymoimunologického testu ve třech vrstvách. Jamky polystyrénových destiček jsou potahovány protilátkou proti povrchovému antigenu, pak je přidán vzorek testovaného séra a nakonec je přidán konjugát proti povrchovému antigenu s křenovou peroxidázou. Monoklonální protilátky produkované hybrídomy HBslC_gB₁₂ a 72C₄A₇ jsou s výhodou použitelné v 1. vrstvě, tj. pro potahováni jamek, přičemž.ve 3. vrstvě bylo dosud nutné používat polyklonální protilátky značené křenovou peroxidázou.The hepatitis virus surface antigen is detected in clinical practice by the three-layer enzyme immunoassay. The wells of polystyrene plates are coated with an antibody to the surface antigen, then a sample of the test serum is added and finally the conjugate to the surface antigen with horseradish peroxidase is added. Monoclonal antibodies produced by hybridomas HBslC _g B ₁₂ and 72C ₄ and ₇ are preferably used in the first layer, i.e. for coating the wells, wherein in the third layer has hitherto been necessary to use the polyclonal antibody labeled with horseradish peroxidase.

Tuto nevýhodu odstraňují látky produkované hybridomem podle vynálezu, které lze značit křenovou peroxidázou, který je uložen ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 6, Flemingovo nám. 2, pod označením IMG-CZAS HBs 73F₅A2 a které pak mohou být použity v 3. vrstvě enzymoimunologického testu. Podstatného pokroku v diagnostice hepatitidy B, který se projeví ve vyšší spolehlivosti a citlivosti testu se dosáhne, je-li k dispozici klonovaná hybridní buněčná linie dle vynálezu, které jsou značitelné křenovou peroxidázou.This disadvantage is overcome by the substances produced by the hybridoma according to the invention, which can be labeled with horseradish peroxidase, which is deposited in the Collection of Hybridomas of the Institute of Molecular Genetics of the Czechoslovak Academy of Sciences in Prague 6, Flemingovo nám. 2, under the designation IMG-CZAS HBs 73F ₅ A2, and which can then be used in the 3rd layer of the enzyme immunoassay. Substantial progress in the diagnosis of hepatitis B, which results in higher reliability and sensitivity of the assay, is achieved when a cloned hybrid cell line of the invention that is labeled with horseradish peroxidase is available.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Kunimoto, K. a kol. Vox Sanguinís 45: 104, 1983) klonováním populace hybridních buněk získaných hybrídizací buněk ze slezin myší BALB/c, které byly imunizovány povrchovým antigenem viru hepatitidy B a buněk myší myelomové linie SP2/O. Výhodou hybridomů HBs 73F^A| je, že produkuje protilátky specificky reagující s povrchovým antigenem viru hepatitidy B, přičemž tyto protilátky je možné značit křenovou peroxidázou. Pro diagnostické účely je pak možné využít jak neznačenou protilátku - pro potahování jamek, tak protilátku značenou křenovou peroxidázou - v 3. vrstvě enzymoimunologického testu. Použití značené protilátky v kombinaci s neznačenou protilátkou produkovanou hybridomem lCgB^j nebo 72C^A₇ umožňuje vyvinutí diagnostické soupravy pro detekci povrchového antigenu na bázi monoklonálních protilátek dosahujících optimálních parametrů.The hybridoma was obtained by a method known in the literature (Kunimoto, K. et al. Vox Sanguinis 45: 104, 1983) by cloning a population of hybrid cells obtained by hybridizing spleen cells from BALB / c mice immunized with hepatitis B virus surface antigen and mouse cells myeloma lines SP2 / O. An advantage of HBs 73F ^ A 1 hybridomas is that it produces antibodies specifically reacting with the hepatitis B virus surface antigen, which antibodies can be labeled with horseradish peroxidase. For diagnostic purposes, it is possible to use both unlabeled antibody - for coating the wells and antibody labeled with horseradish peroxidase - in the 3rd layer of the enzyme immunoassay. Use of labeled antibody in combination with unlabeled antibody produced by hybridoma lCgB ^ j or A _7-72C allow the development of diagnostic kits for the detection of surface antigen-based monoclonal antibodies accomplish optimal parameters.

Hybridom HBs 73FjA^ je možno kultivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. Z konzerv, které jsou uchovány v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky.The HBs 73FjA4 hybridoma can be cultured in vitro in animal cell media and is adapted for growth in vivo in the peritoneal cavity of BALB / c mouse mice. From cans that are stored in liquid nitrogen, antibody production can be initiated.

Příklad:Example:

Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno 2x 10⁶ hybridomových buněk do peritoneální dutiny myši kmene BALB/c. Této myši bylo 14 dní před podáním hybrídomových buněk aplikováno 0,7 ml parafinového oleje do peritoneální dutiny. Po 12 dnech růstu hybridomů v peritoneální dutině byla myš usmrcena a naprodukovaná ascitická tekutina byla odebrána. Celkem bylo získáno 5 ml ascitické tekutiny, ve které bylo obsaženo přibližně 8 mg/ml imunoglobulinu. Monoklonální protilátka reagovala specificky s povrchovým antigenem v enzymoimunologickém testu.To expand the hybridoma cells in vivo, 2x10 ⁶ hybridoma cells were injected into the peritoneal cavity of the BALB / c mouse. This mouse was injected with 0.7 ml paraffin oil 14 days prior to the administration of the hybridoma cells into the peritoneal cavity. After 12 days of hybridoma growth in the peritoneal cavity, the mouse was sacrificed and the produced ascites fluid was collected. A total of 5 ml of ascites fluid was obtained, containing approximately 8 mg / ml of immunoglobulin. The monoclonal antibody reacted specifically with the surface antigen in an enzyme immunoassay.

Z ascitické tekutiny byl pomocí síranové metody vypurífíkován imunoglobulin, který byl značen křenovou peroxidázou pomocí dvoustupňové glutaraldehydové metody podle Avramease a Ternyncka (Immunochemistry 8: 1 175, 1971). Jamky mikro titračních destiček byly potahovány monoklonální protilátkou produkovanou klonem HBs ICgB^^ v koncentraci 50 yug/ml. Pak byly přidány vzorky vyšetřované na přítomnost povrchového antigenu viru hepatitidy B a byl přidán konjugát monoklonální protilátky, která je produkována hybridomem HBs 73F^A^ s křenovou peroxidázou a test byl dokončen způsobem používaným pro detekci povrchového antigenu pomocí diagnostické soupravy SEVATEST ELISA HBsAg Micro I (ŮSOL). Tento test umožnil detekci 1,5 ng povrchového antigenu/ml.Immunoglobulin, which was labeled with horseradish peroxidase by the two-step glutaraldehyde method of Avramease and Ternynck (Immunochemistry 8: 1175, 1971), was purified from the ascites fluid by the sulfate method. The wells of the micro titration plates were coated with the monoclonal antibody produced by the HBs ICgB ^ clone at a concentration of 50 µg / ml. Then, samples tested for the presence of hepatitis B virus surface antigen were added and a monoclonal antibody conjugate produced by horseradish peroxidase HBs 73F ^ A ^ hybridoma was added and the assay was completed as described for the surface antigen detection using the SEVATEST ELISA HBsAg Micro I diagnostic kit ( ŮSOL). This assay allowed the detection of 1.5 ng of surface antigen / ml.

Základní kultivační médium pro buňky hybridomu HBs 73F^A^ je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí doplněné a neesenciální aminokyseliny. Toto médium (označované jako H-MEMd - Ústav molekulární genetiky ČSAV) je pro kultivaci hybridomů doplněno penicilinem, streptomycinem a inaktivovaným telecím sérem (Bioveta, Ivanovice na Hané). Hybridom je kultivován při 37 °C. Hybridom HBs 73F^A| produkuje protilátku podtřídy IgGl, izoelektrický bod je pH 6,1 až 6,6.The basic culture medium for HBs 73F ^ A ^ hybridoma cells is Eagle's minimal essential medium with Hanks' salt mixture of supplemented and non-essential amino acids. This medium (called H-MEMd - Institute of Molecular Genetics of the Czechoslovak Academy of Sciences) is supplemented with penicillin, streptomycin and inactivated calf serum (Bioveta, Ivanovice na Hané) for hybridoma culture. The hybridoma is cultured at 37 ° C. HBs 73F-A hybrid produces an antibody of IgG1 subclass, the isoelectric point being pH 6.1 to 6.6.

Monoklonální protilátka produkovaná klonem HBs 73F^A^ reaguje specificky s povrchovým antigenem viru hepatitidy B. Tuto protilátku lze značit křenovou peroxidázou a značenou protilátku lze využít v enzymoimunologickém testu pro detekci povrchového antigenu. Tento hybridom může být průmyslově využíván jako zdroj protilátky proti povrchovému antigenu v diagnostických soupravách.The monoclonal antibody produced by the clone HBs 73F ^ A ^ reacts specifically with the hepatitis B virus surface antigen. This antibody can be labeled with horseradish peroxidase and the labeled antibody can be used in an enzymatic immunoassay to detect the surface antigen. This hybridoma can be industrially used as a source of anti-surface antigen antibody in diagnostic kits.

Claims

SUBJECT OF THE INVENTION

Mouse lymphocyte hybridoma IMG-CZAS HBs 73F ^ A ^ producing antibodies against hepatitis B virus surface antigen that can be labeled with horseradish peroxidase.