CS265494B1 - Myší lymfocytámí hybridom produkující protilátky proti e antigenu viru hepatitidy B (HBeAg) - Google Patents

Abstract

Řešení se týká myšího lymfocytárního hybridomu, produkujícího protilátky proti HBeAg, který je uložen ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením IMG CZAS HBe A2C12F9B1. Protilátka je vhodná pro detekci a afinitní purifikaci HBeAg.

Description

Vynález se týká myšího lymfocytárního hybridomu produkujícího protilátky proti e antigenu viru hepatitídy B.

Hybridní buněčná linie byla sestrojena fůzí buněk myší myelomové linie SP2/0 a myších slezinných lymfoidních buněk, produkující protilátky proti e antigenu viru hepatitidy B (HBeAg). E antigen vzniká proteolytickým štěpením core antigenu v infikované jaterní buňce, přičemž následuje vyplavováni e antigenu do krve.

Stanoveni hladiny HBeAg v krvi má zásadní význam pro diagnostiku a zvláště pro monitorováni průběhu hepatitidy B. Tato vyšetření byla do současné doby prováděna pomocí lidských polyklonálnich protilátek. Test, využívající lidské polyklonální anti-HBeAg protilátky, ale dosahuje nízké citlivosti a specifity reakcí.

Tento nedostatek odstraňuje myší lymfocytární hybridom produkující protilátky proti HBeAg podle vynálezu, uložený ve Sbírce hybridomu Ústavu molekulární genetiky ČSAV, Praha 6, Flemingovo 2, pod označením HBe á₂C₂₂F_gB₂·

Uvedené protilátky mohou být použity v enzymoimunologickém testu pro detekci HBeAg, dále pro afinitní čištění HBeAg, což umožňuje purifikovat vysoce čistý e antigen.

Podstatného pokroku v diagnostice a monitorování hepatitidy B se dosáhne, je-li k dispozici klonovaná hybridní linie, produkujíc! protilátky proti e antigenu viru hepatitidy B.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Kčhler, G., Mistein,

C., Nátuře 256: 495 až 497, 1975) klonováním populace hybridních buněk získaných hybridizací buněk ze sleziny myší BALB/c, které byly imunizovány HBeAg a buněk myší myelomové linie SP2/0. HBeAg byl připraven štěpením HBeAg, který byl purifikován z bakterií, obsahujících rekombinantní expresní plasmid.

Výhodou hybridomu HBe ^A2^C12^F9^B1 je, že produkuje protilátky specificky reagující s HBeAg. Tuto protilátku lze použít pro detekci HBeAg a pro afinitní purifikaci HBeAg.

Použití této protilátky umožňuje vyvinutí diagnostické soupravy pro detekci HBeAg dosahující optimálních parametrů.

Hybridom HBe ^A2^C12^F9^B1 je možno kultivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. z konzerv, které jsou uchovávány v kapalném dusíku lze zahájit produkcí protilátky.

Příklad

Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno lxlO⁶ hybridomových buněk do peritoneální dutiny myší kmene BALB/c. Této myši bylo 14 dni před podáním hybridomových buněk aplikováno 0,7 ml parafinového oleje do peritoneální dutiny. Po 15 až 30 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byla myš usmrcena a ascitická tekutina odebrána.

Průměrně byly získány 4 ml ascitické tekutiny, ve které bylo obsaženo přibližně 4 mg/ml imunoglobulinu. Monoklonální protilátka reagovala specificky s HBeAg v enzymoimunologickém testu.

Z ascitické tekutiny byl pomocí síranové metody purifikován imunoglobulin. Jamky mikrotitračních destiček byly potahovány monoklonální protilátkou produkovanou klonem HBe ^A2^Ci2^F9^Bl v koncentraci 50 ug/ml. Pak byly přidány vzorky obsahují různé koncentrace HBeAg a nakonec byl přidán konjugát polyklonální protilátky proti HBeAg s křenovou peroxidázou a enzymoimunologický test byl dokončen standardním způsobem.

Tento test umožnil detekci 10 ng HBeAg/ml.

Základní kultivační médium pro buňky hybridomů HBe ^A2^C12^F9^B1 je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí doplněné o neesenciální aminokyseliny. Toto médium (označované jako H-MEMd- Ostav molekulární genetiky ČSAV) je pro kultivaci hybridomů doplněno inaktivovaným telecím sérem (Bioveta, Ivanovice na Hané), penicilinem a streptomycinem. Hybridom je kultivován při 37 °C. Hybridom HBe ^A2^C12^F9^B1 produkuje protilátku isotypu IgG2B, isoelektrický bod je pH 6,7 až 7,3.

Monoklonální protilátka produkovaná klonem HBe ^A2^C22^F9^B1 reaguje specificky s HBeAg.

Tuto protilátku lze využít k detekci a k afinitní purifikaci HBeAg. Tento hybridom může být průmyslově využíván jako zdroj protilátky proti HBeAg v diagnostických soupravách.

Claims (1)

1. Myši lymfocytární hybridom IMG CZAS HBe ^A2^C12^F9^B1' produkující protilátky proti e antigenu viru hepatitidy B (HBeAg).