JPS62231170A

JPS62231170A - 標識複合体

Info

Publication number: JPS62231170A
Application number: JP7497386A
Authority: JP
Inventors: Takashi Tsuji; 孝辻; Yasuo Kihara; 木原　康夫; Kenjiro Mori; 健二郎森; Tetsuo Watanabe; 哲男渡辺
Original assignee: Nitto Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 1986-03-31
Filing date: 1986-03-31
Publication date: 1987-10-09

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、液体試料中に含まれる被分析体としての抗原
若しくはハプテン、又は抗体、或いはこれら被分析体が
細胞、組織その他の物質に含まれる場合に、これら被分
析体を定量するために用いられる標識化された抗原（又
はハプテン）又は抗体、及びその製造方法に関する。

（従来の技術）抗原（又はハプテン）抗体反応の高い特異性と検出感度
を利用して、抗原（又はハプテン）又は抗体を同定し、
定量する方法として、従来より固相イムノアッセイ　（
免疫検定法）が知られている。

この方法においては、抗原（又はハプテン）又は抗体の
いずれかを標識化する必要がある。一般には、これら標
識化された抗原（又はハプテン）又は抗体（以下、標識
複合体という。）は、抗原（又はハプテン）や抗体（以
下、免疫反応体という。）に標識剤を結合させてなるも
のであって、かかる標識複合体が、実用性にすぐれると
共に、高怒度及び高精度であるたカには、標識複合体に
おいて、標識剤や免疫反応体の活性や機能が高く保持さ
れていること、°長期間にわたる保存が可能であること
、標識化されていない物質等の不純物を含まないこと等
が強く要求される。

従来、かかる標識複合体の製造方法として、代表向には
架橋法が知られている。この架橋法によれば、標識剤と
免疫反応体とを水に溶解し、この水ン容液にグルタルア
ルデヒドドを加え、標識剤と免疫反応体とを相互に架橋させた後
、過剰のジアルデヒドを除去して、標識複合体を得るも
のである。また、この方法の改良として、標識剤をジア
ルデヒドにて処理して、標識剤にアルデヒド基を有せし
めた後、過剰のアルデヒドを除去し、次いで、その標識
剤に具有したアルデヒド基を利用して標識剤に免疫反応
体を結合させて、標識複合体を得るものである。

また、反応特異性の高い２官能性試薬を用いる方法も知
られている。例えば、Ｎ．Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレ
イミドのような２官能性試薬は、チオール基とは速やか
に反応するが、他方、アミノ基や水酸基との反応は通常
は著しく遅いという反応特異性を有する。そこで、チオ
ール基を有する免疫反応体にＮ，Ｎ’−ｏ−フェニレン
ジマレイミドを反応させり後、過剰のＮ，Ｎ’−ｏ−フ
ェニレンジマレイミドを除去し、次いで、チオール基を
有する標識剤と反応させることによって、標識複合体を
得ることができる。

更に別の方法として、反応特異性の高い異なる２種の官
能基を有する試薬、例えば、Ｎ−　（メタマレイミドベ
ンゾイルオキシ）スクシンイミドを用いる方法も知られ
ている。

しかし、上記した従来の方法はいずれも、免疫反応体又
は標識剤の架橋の効率が悪く、免疫反応体が相互に、又
は標識剤が相互に架橋されるものもあり、標識剤の生成
に寄与しない割合が高い。

従って、得られる標識複合体の収率が低いほか、免疫反
応体上の標識剤の結合密度が著しく少ないために、標識
剤の活性も小さい。また、免疫反応体に標識剤を直接に
結合させるために、一般に、活性、機能、特異性等が失
われやすい。更に、適用し得る免疫反応体と標識剤の種
類が限定されているうえに、得られる標識複合体の精製
処理が極めて煩瑣である。

（発明の目的）本発明者らは、従来の標識複合体における上記した問題
を解決するために鋭意研究した結果、ポリエチレンイミ
ンを担体とし、これに標識剤及び免疫反応体を共に結合
させて、標識複合体を得ることによって、上記した問題
を一挙に解決し得て、高感度高精度の標識複合体を容易
且つ高収率で得ることができることを見出して、本発明
に至ったものである。

（発明の構成）本発明による標識複合体は、ポリエチレンイミンを担体
とし、これに抗原若しくはハプテン、又は抗体と共に、
標識剤とが結合されていることを特徴とする。

本発明において担体として用いるポリエチレンイミンは
、分子内に第１級、第２級及び第３級アミノ基を存する
実質的に線状の重合体であって、水溶性高分子の１つと
して既に知られている。このようなポリエチレンイミン
は市販されていて、本発明においてはかかる市販品を用
いることができる。

免疫反応体としては、活性化によってアミノ基と共有結
合で結合し得る抗原若しくはハプテン、又は抗体であれ
ば、任意のものを用いることができる。かかる免疫反応
体の具体例としては、例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、
ブタ等に免疫して抗血清を得、これから精製して得た抗
体（Ｔ−グロブリン）や、細菌、ウィルス、血清等から
抽出した抗原を挙げることができる。

また、標識剤としても、従来より固相イムノアッセイに
用いられている標識剤であって、活性化によってアミノ
基と共有結合し得る任意の標識剤を用いることができ、
一般的には、酵素、螢燐光物質、色素等を用いることが
できる。具体的には、酵素として、例えば、パーオキシ
ダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファ
ターゼ、リゾチーム、グルコアミラーゼ、グルコースオ
キシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ウレ
アーゼ、カタラーゼ、補酵素ＮＡＤ等を挙げることがで
き、また、螢燐光物質や色素として、例えば、フルオレ
セインイソシアネート、フルオレセイン、ローダミン、
ローダミン、アクリジン等を挙げることができる。

本発明による標識複合体は、標識剤及び／又は免疫反応
体を活性化し、これらを同時に、又は逐次的にポリエチ
レンイミンの存在下で反応させた後、遠心分離、膜分離
等の適宜手段にて高分子量体を分離精製することによっ
て得ることができる。

免疫反応体及び標識剤の活性化方法としては、例えば、
「酵素免疫測定法」　（石川栄治はか、医学会読（昭和
５３年１２月発行））や、「実験と応用アフイニテイク
ロマトグラフイー」　（千畑一部ばか、講談社（昭和４
１年９月発行））に記載されているように、従来より知
られている任意の方法によればよい。例えば、標識剤又
は免疫反応体が官能基としてアミノ基を有するときは、
これをジアルデヒドと反応させることによって活性化す
ることができ、このようにして活性化された標識剤と免
疫反応体とをポリエチレンイミンの存在下に反応させる
ことによって、本発明による標識複合体を得ることがで
きる。

このようにして、本発明によれば、抗原若しくはハプテ
ン、又は抗体と標識剤とが共有結合によってポリエチレ
ンイミンに固定化されてなる標識複合体を得ることがで
きるが、かかる標識複合体においては、標識剤及び免疫
反応体がそれぞれ個別にポリエチレンイミンに共有結合
にて結合されていてもよく、或いは相互に結合された標
識剤と免疫反応体とがポリエチレンイミンに共有結合に
て結合されていてもよい。これらは本発明の標識複合体
において識別され得ない。

より詳細に説明すれば、本発明による標識複合体は、次
のような方法によって調製することができる。１つの方
法として、先ず、標識剤を活性化した後、これに対して
ｌ／１００〜１００倍モル、好ましくは１〜１０倍モル
量のポリエチレンイミンを添加し、反応させ、次いで、
免疫反応体を標識剤に対して１／１０００〜１０倍モル
、好ましくは１／１００〜１倍モル量を添加し、反応さ
せた後、残存する活性化官能基をアミノ酸や適宜の遷元
剤等によってブロックし、次いで、ゲル濾過して、標識
複合体を分離する。

この方法において、活性化標識剤とポリエチレンイミン
との反応は、標識剤の活性化方法にもよるが、グルタル
アルデヒド法にて活性化した標識剤を用いる場合は、室
温にて１〜４時間、攪拌すれば十分である。また、反応
後の活性化官能基のブロックには、Ｌ−リジン、アルギ
ニン等のアミノ酸や、水素化ホウ素ナトリウム等の還元
剤を用いればよい。かかる方法は、既に知られている。

また、別の方法として、先ず、標識剤及び免疫反応体を
それぞれ活性化したうえで、この活性化標識剤に対して
１／１００〜１００倍モル、好ましくは１〜１０倍モル
量のポリエチレンイミンを添加して、標識剤と反応させ
た後、活性化免疫反応体を標識剤に対して１／１０００
〜１０倍モル、好ましくはｌ／１００〜１倍モル量添加
して反応させる。この後、残存する残存する活性化官能
基をアミノ酸や適宜の還元剤等によってブロックし、次
いで、ゲル濾過して、標識複合体を分離する。

この方法において、標識剤が結合されたポリエチレンイ
ミンと活性化免疫反応体との反応も、免疫反応体の活性
化方法によるが、同様にグルタルアルデヒド法にて活性
化された免疫反応体を用いる場合は、室温にて１〜４時
間、攪拌すれば十分である。

尚、上記のような製造方法において、ポリエチレンイミ
ンを標識剤に対して約等モル量添加した場合は、反応系
に沈殿を生じることがあるので、この場合には、遠心分
離にてこの沈殿を除去した後、その後の操作に移ればよ
い。本発明においては、理由は必ずしも明らかではない
が、通常、ポリエチレンイミンを標識剤に対して過剰■
添加することによって、高い回収率にて標識複合体を得
るごとができる。

このようにして得られる本発明による標識複合体は、水
中に浸漬して保存してもよく、又は凍結乾燥して保存し
てもよい。

（発明の効果）以上のように、本発明による標識複合体は、ポリエチレ
ンイミンを担体とし、この担体上に免疫反応体と標識剤
とが共に結合されており、従来の方法に比べて、２〜１
０倍もの高い回収率にて標識複合体を得ることができる
のみならず、得られる標識複合体は高怒度高精度である
。更に、標識剤及び免疫反応体のポリエチレンイミンと
の反応条件を調整することによって、得られる標識複合
体を未反応の標識剤から容易に分離することができるの
で、その製造及び精製が容易であって、特に、煩瑣な操
作を必要としない。

（実施例）以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れら実施例により何ら限定されるものではない。

実施例１（１１標識複合体の調製パーオキシダーゼ（シグマ社製タイプＩＶ）　　５■を
重炭酸すＩ−ＩＪウム緩衝液（０，３Ｍ）１ｍｌに溶解
し、次いで、これに１％の１−フルオロ−２，ｌｌ−ジ
ニトロベンゼンを含むエタノール溶液０．１ｍｌヲ加え
て、攪拌下に室温で１時間反応させた。この後、過ヨウ
素酸ナトリウム水溶液（０，０６Ｍ）１ｍ１を加え、室
温で３０分間反応させ、次いで、エチレングリコール水
溶液（０，１６Ｍ）　　１ｍｌを加えて、室温で３０分
間攪拌した。この後、炭酸ナトリウム緩衝）夜（ｐｉｆ
　９．５．０．０１Ｍ）を用いて４℃にて一夜透析し、
活性化パーオキシダーゼを得た。

この活性化パーオキシダーゼにポリエチレンイミンを第
１表に示すように種々の濃度にて加え、それぞれ室温に
て２時間、攪拌下に反応させた。

更に、抗ヒ）ＩｇＧγ鎖（ウサギＩｇＧ画分、ダコ社製
）５曙を加え、室温で２時間攪拌した後、水素化ホウ素
ナトリウム５ｎｗを加え、４℃で一夜攪拌した。

反応後、遠心分離によって沈殿物を除き、それぞれにつ
いてセファクリルＳ−２００（ファルマシア社製、０．
８５％の塩化ナトリウムを含むリン酸ナトリウム緩衝１
ｆｆｌ（ｐＨ７，５，０，０１Ｍ）で平衡化したもの）
で展開した。その結果を第１図に示す。

図中、第１ピークが標識複合体であり、斜線部分を集め
精製標識複合体とした。第２ピークが未結合酵素及び未
結合抗体を含む分画であり、図から明らかなようにポリ
エチレンイミンを使用することによって高い回収率を得
ることができる。

（２）回収率上記のようにして、用いたパーオキシダーゼのうち、標
識複合体として回収されたパーオキシダーゼ量の割合（
酵素回収率）と、ゲル濾過によって分離した標識複合体
と未反応パーオキシダーゼの比率を第１表に示す。活性
化パーオキシダーゼ第１表（注）＊活性化パーオキシダーゼに対する蚤に対して、
ポリエチレンイミンを１〜１００倍モル■用いるとき、
酵素の回収率が高いことが理解される。

（３）標識複合体の活性ヒ目ｇｃを測定するイムノアッセイによって、１２６種
の標識複合体の活性を測定した。

マイクロプレート（ファルコン社製）の各ウェルに抗ヒ
目ｇｃγ鎖（ウサギＩｇＧ画分、ダコ社製）の０．３ｍ
ｇ／ｍｌ溶液（リン酸ナトリウム緩衝液、ｐｉｆ７．４
．０．０１Ｍ）を浸し、４°Ｃで一夜放置した後、１０
ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液（リン酸ナトリウム緩衝液、ｐ
ｉｆ７．４．０．ＯＩＭ）に置換し、更に、−夜装置し
て、抗体感作マイクロプレートを得た。

リン酸ナトリウム緩衝液（０，２％ＢＳＡ及び０゜８％
塩化ナトリウムを含む。ｐｉｆ７．０．０．ＯＩＭ）に
てヒトＩｇＧ　（シグマ社製）を１１０００ｎ／ｍｌか
ら２段階希釈にて希釈して標準系列をｓＪｌ製し、この
標準系列１００μβと上記と同じ緩衝液１００μｌとを
上記抗体感作マイクロプレートに順次に加えた。

室温にて１時間反応させた後、各ウェルを０．１％ＢＳ
Ａを含有するリン酸緩衝液にて洗浄し、調製した酵素標
識抗体を１００〜１０００倍希釈したちの２００μ！加
え、更に、１時間反応させた。

次いで、各ウェルを０．１％ＢＳＡを含有するリン酸緩
衝液にて洗浄した後、酵素基質反応液として、２８ｍＭ
ｏ−フェニレンジアミン及び５ｍＭ過酸化水素水を含有
するｐＨ６，０，０，１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液２０
０μｌを加え、室温にて２０分間反応させた後、２Ｎ硫
酸にて反応を停止し、４９２ｎｍにおける吸光度を測定
した。結果を第２表に示す。

実施例２実施例１において、抗ヒトＩｇＧｒｔｆｆに代えてウサ
ギＩｇＧをグルタルアルデヒド法にて活性化すると共に
、酵素として第３表に示すものをグルタルアルデヒド法
にて活性化したものを用いた以外は、実施例１と同様に
して、本発明による標識複合体を調製した。

ポリエチレンイミンを使用しない場合を対照とし、これ
を１００としたときの標識複合体の相対的な回収率を第
３表に示す。本発明によれば、標識複合体を高い収率に
て製造し得ることが理解される。

第　　３　　表

【図面の簡単な説明】

第１図は、ポリエチレンイミンに標識化酸素と抗体を反
応させた後、ゲル濾過による分画を示し、斜線領域が本
発明による標識複合体の分画である。尚、図中の番号は第１表中の番号を示す。図面り）ｆ、・、！４（内ひに変更ない第２図分亘第３図第４図第す図分画第６図手続補正書（方式）１、事件の表示　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　り昭和６１年特許願第０７４９７３号　　　　　　　
「２、発明の名称　　　　　　　　　　　　　　　　　
　識標識複合体　　　　　　　　　　　　　　　　　分
３、補正をする者　　　　　　　　　　　　　　　　　
の事件との関係　特許出願人　　　　　　　　　　番住
　所　大阪府茨木市下穂積１丁目１番２号　　（２）名
　称　日東電気工業株式会社４、代理人住　所　大阪市西区新町１丁目８番３号）・プ（）。１．７一′ ５、補正命令の日付　昭和６１年　６月　４日（発送日
　昭和６１年　６月２４日）６、補正により増加する発明の数補正の内容明細書第１７頁の「４、図面の簡単な説明」欄の「第１
図は、・・・を示す。」を削除し、代わに次の文を加入
する。第１図から第６図は、ポリエチレンイミンに標化酵素と
抗体を反応させた後、ゲル濾過による画を示し、斜線領
域が本発明による標識複合体分画である。尚、各図中の
番号は、第１表中の号を示す。」全図を別紙のとおり補正する。以上手続補正Ｓ（自発）昭和６１年　７月／θ 昭和６１年特許願第０７４９７３号２、発明の名称標識複合体３、補正をする廿事件との関係　特許出願人住　所　大阪府茨木市下穂積１丁目１番２名　ｊシＦ　
　日東電気工業株式会社４、代理人住　所　大阪市西区新町１丁目８番３号新町七福ビル氏名弁理士（７９１２）牧野逸部〒５５０　　電話（０６）　５３１−４１８１５ｉ＋ｉ
ｉ正命令の日付　昭和　　年　　月　　日（発送日　昭
和　　年　　月　　日）６、補正により増加する発明の数補正の内容日　　（１１明細書第１２頁１７行の「第１図」を「第
１図から第６図」と補正する。（２）明細書第１２頁１８行の「図中、］を削除し、代
わりに［各図中の番号は、後述する第１表中の番号を示
し、ｊを加入する。以上号

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ポリエチレンイミンを担体とし、これに抗原若し
くはハプテン、又は抗体と共に、標識剤とが結合されて
いることを特徴とする標識複合体。
（２）標識剤が酵素であることを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載の標識複合体。
（３）標識剤が螢燐光物質であることを特徴とする特許
請求の範囲第１項記載の標識複合体。
（４）標識剤が色素であることを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載の標識複合体。