JPS61501418A - 双特異性抗体決定子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 支持異性抗体決定子 ＩｇＧ抗俸は、それぞれ軽ＣＬ）鯛と重Ｉ鎖とよシなる２つの半分子で作成され ることが知られている。２つの半分子よシなるＨ鎖はジスルフィド結合にょシ結 合され、これらは選択的還元にょ）破壊することができる。２穐の異なるＩｇＧ 試料につきこの工程を行なえは、半分子が結合してハイブリッド抗体を形成する ことができる。これは、完全ウサギグロブリンを用いて行なうことができる〔ニ ソ／　７　（Ｎｌｓｏｎｏｆｆ）等Ｎ　（１９６４）、サイエンス１Ｎ１３４巻 、第５７６−５７９頁〕。さらに、ＩｇＡ抗体は崗−の半分子まで切断すること ができる。

また、へイブリッドは、完全抗体でな（ＩｇＧ抗体のＦ　（ａ　ｂ’）２断片を 用いても形成されている。すなわち、免役特異性を与えない分子のＦ（ｅ’）部 分は、ハイブリッド化削に、たとえはペグシンのような適当なグロテアーゼでの （／１ｗＴによって除去される。この手法はニソノフ等（１９６０）、Ａｒｃｈ 引ｏｃｈｅｍ　、　Ｂｉｏｐｂｙｓ、第８９巻、第２３０〜２４４頁並びにニソ ノ７及びリバース（１９６ｏ）、λｒｃｈ＊Ｂｌｏｃｈｓｍ−Ｂ１０ｐＨ７１， 、第９３巻、第４６０〜４６２頁に記載されている。最近の論文°〔カレント・ コンテンツ（１９８１年１１月２日）、第４４ｓ１第２５頁〕において、ニソノ ７は次のように述べている： 「現在まで、この方法は主として抗−７工リチン抗体と細胞表面抗原に対する抗 体とのへイブリッドを用いて７エリテンによシ細胞表面を染色することによりそ の用途が制限されていた。さらに、へイブリ、ラド抗体の使用も、薬理剤を所望 の組織表面と特異的に接触させる手段として考えられていた。」細胞毒性薬剤を 供給するためのこの種のへイブリッドの使用も、ラソ（Ｒａｍｏ）及びグリフイ ン（Ｇｒｉｆｆｌｎ）　（１９７８）。

Ｆ＠ｄ、　Ｐｙｏｃ−第５７巻、第１３５０頁に示設されている。

ミルスティン（ＭｌｌｓｔａＩｎ）　（１９８１）、Ｐｒｏｃ、　Ｒ，ｓｏｃ、 ＬｏＨｄ、　。

第Ｂ２１１巻、第３９３−４１２頁はｒｍ扁の特異的処理に対す、る；毒性物質 のキャリアとしてモノクローナル抗体」を使用する可能性を示灰して、ｒＦａｋ ｌ断片は完全抗体よシも良好な標的剤である」と述べている。

成しうる２個のｍ胞を融合させてハイブリッド抗体を産生しうるへイブリッド細 胞を作成することによっても作られている。この種の方法は、ミルスティン・ア ンド・りｘ　ａ　（Ｍｌｌａｔａｌｎ　ｈ　Ｃｕ＊１１ｏ）　（１９８５）％ネ イチャー、第３０５巻、第５３７〜５４０頁に記載されている。異なるモノクロ ーナル抗体を産生ずるネズミへイプリドーマ！Ｉ胞を融合させ、かつ得られた融 合細胞によシ２穐の貝なる詳の初期重鎮と軽鎖との全ゆる可能は組み合せで構成 される抗体混合物が産生される。この分子混合物には、初期抗体分子のそれぞれ の半部よシなるハイブリッド抗体があ夛、これはイオン交換クロマドグ２フイー によシ部分精製することができた。

他の論文、すなわち２ソ等（１９８１Ｌカンサー・リサーチ、第４１巻、第２０ ７５−２０７８頁は、ウサギ抗体Ｆ　（ａ　ｂ’）２断片の不純な試料の生成を 記載している。

このウサギ抗体断片は還元によシ切断され、かつアンチリシンＡ鎖Ｆ（ａｂ’） ２１’ｉ片と再結合された。ｉｔｂ薬剤供給実験には、支持異性のダイマーが使 用された。この論文は次のように述べている： 「この研究に使用した２種類のｗＩ製抗体は慣用のへテロ抗体から単離した。し たがって、これら２種のものを融合させると、複雑な親和性と特異性との組み合 せが生ずる筈である。均質なハイブリドーマ古来の抗体の出現は、へイブリッド 抗体の構成生部の結合親和性に対し完全な制御を与え、この均一性は供給ベヒク ルとしてのその最終的効果を著しく促進する。」 本発明は同一の支持異性（ｂＩ＊ｐｅｃｌｆｌｃ）　抗体決定子よシなる均質試 料を提供し、各支持異性決定子祉ジスルフィド結合によシ結合された２個のＬ− Ｈ半分子で構成され、各Ｌ−Ｈ半分子は互いに異なっておシ、かつ異なる抗原決 定子に対し特異性である。

本発明の支持異性モノクローナル抗体決定子は、それぞれ１個もしくはそれ以上 のジスルフィド結合によシ結合された２個の同一のＬ−Ｈ半分子よシなる２種の 異なるモノクローナル抗体決定子を供給し、これら２種の異なる抗体決定子をジ スルフィド結合を破壊するのに充分な条件にかけ、Ｌ−Ｈ半分子をこれらが化学 的に結合して１個もしくはそれ以上のジスルフィド結合の形成によシ支持異性抗 体決定子を形成しうるような条件下で結合させることによシ作成される。

好ましくは、この方法はさらに、結合工程前にチオール活性化剤によシ一対の同 一半分子を誘導する工程を含み、チオール活性化剤はチオール活性化半分子と異 なる半分子との間のジスルフィド結合の形成を促進する。

他の好適具体例において、モノクローナル抗体はＩｇＧ（特に好ましくはＩｇＧ １、或いはやや劣る′がＩｇＧ２人、ＩｇＧ２Ｂ若しくはＩｇＧ５）又はＩｇ人 である。各半分子は、ＩｇＧ抗体からめ導される場合、少なくともＦ　（ａ　ｂ ’）部分を含む。チオール活性化剤は、チオール活性化半分子の再結合を防止す る。モノクローナル抗体決定子の一方又は両者は２個以上のジスルフィド結合に より結合された半分子で構成され、これら決定子を半分子まで切断する工程は、 これら半分子のＨ鍋内におけるジスルフィド結２．２′−ジピリジンジスルフィ ド、４４−ジピリジンジスルフィド又はサルファイドとテトラチオネートとの混 合物である（Ｆ（ａｂ’）断片を他の蛋白質へ結合するためのチオール活性化剤 の使用は、たとえはラソ等（１９８０）、ジャーナル・イミュノロジー、第１２ ５巻、第２６１０頁；ラソ等、（１９８２）、カンサー・リサーチ、第４２巻、 第４５７頁及びマスホ等（１９７９）、Ｂ、　Ｂ、　Ｒ，Ｃ，。

第９０巻、第５２０頁に記載されておシ、これらをここに参考のため引用する〕 。好ましくは、ジスルフィド結合によシ元来結合されている半分子のＨｉｔにお けるジスルフィド結合の形成は、切断反応をたとえば至上コ化合物（たとえば亜 砒酸す）　ＩＪウム）のような無機至上Ｑ塩或いはアリール亜砒酸エステル（た とえば酸化フェニルアルシン）或いはカドミウム塩のようなジチオール錯体形成 剤の存在下で行なうことによシ、或いは切断反応をＨ鎖の構成が改変されてジス ルフィド結合の形成を思出するような条件下、たとえばｐ）（五８〜４５（最も 好ましくは４２）の下で行なうことによシ、或いはたとえばカルボキシペプチダ ーゼＹのようが蛋白分解酵素を用いて１個以外の全システィン残基を除去するこ とによシ阻止される。

互いに類似した半分子の再結合を思出する場合、混合物からの支持異性決定子の 精製はたとえばゲルー過によ）分子寸法に基づいて簡単に行なうことができる。

これは、溶解している分子、すなわち半分子及び支持異性へイブリッドが寸法に おいて係数２だけ相違しているので可能である。他の分離法は、たとえばイオン 交換及び等電集束法である。

第１因は生物発光分析に有用な集成体の略記であシ、第２図は支持異性モノクロ ーナル抗体決定子を用いるチャンネリング免疫分析の略図であシ、第３図は支持 異性モノクローナル抗体決定子を用いる螢光エネルギー移動免疫分析の略図であ シ、第４図はネズミＩｇ（ｈと比較したウサギＩｇ−の構造を示す略図であシ、 第５図はネズミ半分子における連鎖内ジスルフィド競合反応の略図であシ、 第６図は支持異性モノクローナル抗体決定子の好適製造方法の略図であシ、 第７図は支持異性モノクローナル抗体決定子を用いる発光エネルギ４移動免疫分 析の略図である。

本発明の支持異性モノクローナル抗体決定子は広範な用途に有用でちる。これら の用途は全て、これら決定子が動物における抗体生産を刺激しつる２種の抗原決 定子のｅ異性部位Ｂ′ｔ−介する高特異性リンカ−（たとえば連層の又は表面若 しくは粒子上に固定化された有効な蛋白、ポリペプチド、戻水化物、核酸又はへ ブテン）として作用しうる能力に由来する。

本発明によ゛る支持異性抗体決定子の１つの用途は、異なる抗原決定子を含有す る又は固定化させた所望の表面へ所望の抗原物＊を結合させる薬剤としての使用 である。

たとえば、粒子又μ膜に固定化された酵素を面相触媒として使用することができ る。他のものに比較したこの種の固定化の利点は、＃素泊性に対し悪影響のない 抗体を選択しつること、及び不純な混合物から純粋な酵素を固走化させうろこと である。さらに、支持異性抗体決定子は、たとえば医学的障害の診断に使用され る免疫分析法のために高度に特異的な支持異性試薬として、或いは生物系におけ る抗原決定子間の関係を研究するための分子グローブとして使用すること本でき る。

支持異性抗体決定子の他の用途は、′ＷＬ極における使用である。任意の形状の 電極、たとえばボールチェン（Ｗｏｈｌｔｊ＠ｎ）　（１９Ｂ　４　）、アナリ テイカル・ケミストリー、第５６春、第８７人頁に記載されている電界効果トラ ンジスタのような固相上ンサに使用することができる。

支持異性抗体決定子を用いて作成した酵素電極は、従来の酵素電極よりも幾つか の利点を有する。１つの利点は、その正確な自己組立特性である。すなわち、適 当なハブテンを膜（を極膜或いは電極に連携する別の膜のいずれか）に取力付け 、次いでこのハプテン誘導膜を適当な支持異性抗体と酵素とを含有する浴液中へ 浸漬することによ）、所望の菟極集灰体が簡単に作成される。さらに、この組み 立ての容易性は、長時間の使用中に劣化が生じた後に電格を容易に再充電しうる ことを意味する。

これら電極の他の利点は、さらに支持興性抗体決定子の特異性の砲能である。任 意に与えられた酵素は、抗体の特典的部位に結合しうる多数の抗原部位を有する 。しかしながら、多数のこれら部位における結合は酵素の失活をもたらしつる。

支持異性モノクローナル抗体決定子の場合、この問題は決定子が酵素の失活を生 ぜしぬない部位においてのみ酵素と結合するよう選択されるので避けられる。

他の利点は、！極の組み立て又は再充電を不純な酵素混合物で行ないうることで ある。何故なら、支持異性抗体決定子の独特な特異性は、不純な混合物から適切 な酵素を選択しうるからである。成る場合、電極集成体は緩和な二機能性交差リ ンカ−１たとえはジメチルスペルイミデートによシ安定化させることができる。

支持異性抗体決定子のさらに他の用途は、たとえば分子マイクロ回路として使用 するための自己組立ネットワークの形成における使用である。

上記の用途は、パララス（Ｐａｕｌｕｓ）　に係る米国特許第４．４４４，８７ ８号公報に詳細に記載されており、参考のためここに引用する。

以下、本発明の支持異性抗体決定子の作成、並びに抗体がネズミに由来する場合 に使用する特定方法にっきょシ詳細に説明する。

第４図はウサギＩｇ（ｈ抗体とネズＺ　Ｉｇ（）ｚ抗体（これら抗体は殆んどモ ノクローナル抗体からなっている）の間の構造上の相違を示している。これらの 構造は、重鎮を結合するジスルフィド結合の個ｉが相違している。ウサギＩｇ（ ｈの２つの半部は単一結合によシ合体され、Ｆ（ａｂ’）２からＦ（為ｂ′）モ ノ！−への切断、並びに七ツマ−からダイマーへの再結合は、１個のみの結合の 破壊及び再形成を含み、これは比較的簡単な処理である。これに対し、ネズｉ　 工ｇ（）、の重鎖は３＆ｉのジスルフィド結合にょシ結合され、その破壊及び再 形成は第５図に示した種類の連鎖内の競合副反応をもたらして、所望生成物の収 率を著しく低下させる。連鎖内反応は、半分子を異なる半分子との結合に対し使 用不可能にする。本発明の方法は、ネズミモノクローナル抗体並びに他の哺乳動 物に由来する抗体から純粋な支持異性モノクフーナル抗体決定子を高収率で生産 することを可能にする。

この方法は次の工程順序を含む。常法を用いて２種の異なるモノクローナルＩｇ Ｇ１抗体試料を作成し、各抗体は２つの所望特異性の１つを有する。次いで、各 試料をたとえはペプシンのような過当なプロテアーゼに露出させて、抗体分子の Ｆ　（（：’）部分を切断することによＦ）　Ｆ（ａｂ’）＊断片を生成させる 。次いで、各試料を、Ｆ（ａｂ’）半分子を結合しているジスルフィド結合を破 壊するが分子内の他のジスルフィド結合は破壊しないような条件にかける。

同時に、これらの条件は、たとえはジチオール錯体形成剤〔たとえば至上酵ナト リウム（第６図に示す）、芳香族亜砒酸化合物、たとえＦｉ酷化フェニルアルシ ン又はＣｄＣ１，）の添加によシ、或いは重鎮の構成を改変することによシ（た とえばｐＨを４−２まで下げることにょシ）、或いは蛋白分解酵素（たとえばカ ルボキシペプチダーゼＹ）を用いて１個以外の全還元システィン残基を除去する ことにより、単−ＭＩＲ内のジスルフィドの形成を思出するような条件である。

次いで、これら試料の一方をチオール活性化剤にＵ呈させて遊離チオールの全部 を錯体化させることにょう、他の連層チオールと急速に反応してジスルフィドを 形成しうる誘導体を生成させ、これを第６図における順序１、の最後に示す。こ の目的に適する試薬には、たとえばＤＴＮＢのような芳香族ジスルフィド〔エル マン（Ｅｌ　１ｍ１ｎ）（１９５９）、Ａｒｃｈ、　ＢｌｏＣｈ＠ｔｎ、　Ｂｌ ｏｐｈｙｓ、第８２巻、第７０頁〕（第６図）、２．２１−ジピリジンジスルフ ィド、４．４′−ジピリジンジスルフィド〔グラ七チ（ＧｒａｓａｔＨ）等（１ ９６７）、Ａｒｃｈ、　Ｂｌｏｃｈ＠ｍ、　Ｂｌｏｐｈｙｓ、第１１９巻、第４ １頁〕及びサル７アイト／テトラチオネート〔マスホ等（１９７９）、Ｂ、　Ｂ 、　Ｒ，Ｃ，、第９８巻、第５２０頁〕がある。次いで、この活性化された試料 をＭ６図の順序３にしたがって、少なくとも幾つかの半分子が化学的に結合して 支持異性　−抗原決定子番形成するが単特平性Ｆ　（ａ　ｂ’）ｇを形成しない ような条件下で、可使チオールを有する他のジチオール錯体化試料と結合させる 。

“代案として、両試料をチオール活性化剤にＮ呈させて活性化チオール誘導体を 生成させることもできる〔これは、多くの場合、活性化誘導体の比較的良好な安 定性が得られるため便利である）。次いで、試料の一方を過剰の低分子量チオー ルで処理して、Ｆ（ａｂ’）モノマーに退廃チオールを再生させ、次いで過剰の 低分子チオールから分店する。ジチオール錯体形成剤（第６図の順序２）の添加 により、或いは重鎖の構成を改変することによシ、分子内ジスルフィド結合の形 成を避けることができる。

しかしながら成る場合には、分子内ジスルフィド結合を形成することも望ましい 。次いで、との試料を、少なくとも幾つかの半分子が化学的に結合して支持異性 Ｆ（ａｂ’方を形成するような条件下でジオール活性化型にて他のＦ（ａｂ’　 ）　試料と結合させる。

前記条件下で生成されるＦ　（ａ　ｂ’）２フラクシヨンは、適当にＭ製された モノクローナル抗体が出発物質として使用されているならば、所望の支持異性抗 体決定子だけで構成されているので、モノマーＦ（ａｂ’）　７ラクシヨンを所 望のＰ　（ａ　ｂ’）２から分子寸法に基づいてたとえばゲル濾過のような便利 な方法によシ除去して簡単に得ることができる。

各支持異性決定子が蛋白アジジンにおける独特な抗原部位に対し特異性である部 位と・、＃素Ｂ−ガラクトシダーゼにおける独特な抗原部位に対し特異性である 部位とを育するような同一の双′＃異性抗体決定子の均質試料を作成するには、 次の手順を使用する。この手順は、第６囚に一般的に示した工程にしたがう。

第１工程は、２種の蛋白質アビジン及びＢ−ガラクトシダーゼに対するモノクロ ーナル抗体の作成である。これは、先ず標準的な免疫法を用いて各＃素に対し１ 群のＢＡＬＢ／Ｃネズミを免疫化させることによシ行なわれる。

免疫化の後、免疫化動物の傅細胞を作成し、かつこれをガル、７しくＧａ１ｆｒ ＠）　等（１９８１）、メソツブ・イン・エンチモロジー、第７３巻、第３〜４ ６頁に記載された方法にようＭＯＰＣ−２１黒髄腫細胞の誘導体（たとえばＮＳ Ｉ又はＳＰ２１０−Ａｇ１４）と融合させる。ハイブリッドｉｎをヒボキサンチ ン−アミノプテリン−チミジン媒体中で選択し、クローン化させ、かつガルフレ 等（上記）に記載した方法によシ所望の酵素に対する抗体の産生につきスクリー ニングする。次いで、所望の酵素に対する抗体を産生ずることが判明したクロー ンをスクリーニングして、酵素に対する高親和性を有しかつ酵素の失活を生ぜし めないようなＩｇへ種類の抗体を産生ずるクローンを選択する。興味あるクロー ンを液体音素下で使用するまで貯蔵する。プリスタン処理したネズミの腹腔内に 腹水臓逼としてクローン化細胞を増殖させる標準技術によシ抗体を作成する。

次いで、アビジン及びＢ−ガラクトシダーゼに対する所望のＩｇｏ１抗体を、パ ルハム等（１９８２）％ジャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソツブ、第５ ３巻、第１３３〜１７３頁に冥質的に記載されたように硫酸アンモニウム沈澱、 ゲルー過及び直線的塩濃度勾配によるＤＥＡＥセルローズでのクロマドグ２フイ ーを含む方法によって腹水液から精製する。これらモノクローナル抗体を、ラモ イ（Ｌａｍ０７　＋　）及びニソノフ（Ｎｌｓｏｎｏｆｆ）　（１９８５）、ジ ャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソツブ、第５６巻、第２３５〜２４３頁 に記載されたように１１Ｍ酢酸ナトリウム１ｌＨ４２）においてペプシン（２重 量％）と共に２５℃にて１８時間培養することにょシ、Ｆ　（ａ　ｂ’）ｚ断片 まで切断する。次いで、これらＰ　（ａ　ｂ’）２　断片を、パルハム等（上記 ）に記載されたように（ＬＩＭリンリン酸ナトリウム　ｐ　Ｈ＆　８　）におい てＴ　３　Ｋ　３０００ＳＷカラムで高性能液体クロマトグラフィーにがけて精 製する。

次いで、これらＦ（ａｂ’）２７ラクシヨンを、１ｍＭのＥＤＴＡと１０ｍＭの 亜砒酸ナトリウムとα１Ｍのリン酸ナトリウム（１）Ｈ４Ｓ　）とにおいて１ｍ Ｍの２−メルカプトエチルアミンによシ２５℃にて１８時時間光することにょシ Ｆａｂ’　モノ！−まで完全に変換させる。次いで、この混合物に固体ＤＴＮＢ を２０ｍＭの１＆終濃度まて加える。

２５℃にて２〜３時５ｆＩ後、過剰のＤ’ｒＮＢと低分子量の生成物とを、αＩ Ｍ’リン醜ナトサナトリウムｔｓ）及びＩｍＭＢＤＴ人て平衡化させ九七７アデ ツクス　Ｇ−２５における遠心分離ゲル濾過にょシ除去する。得られた？畠り′ 　モノマーのチオニトロベンゾエート誘導体は比較的安定であシ、これを殆んど 分解することなく数日間貯蔵することができる。

次いで、Ｐａｂ’　モノマー（抗アビジン抗体から誘導したもの）のチオニトロ ベンゾエート誘導体の１つを、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　及びＩＩＭリンリン酸ナトリ ウムＨ４８）において１０ｒｎＭのメルカプトエチルアミンと共に２５℃にて３ ０分間＃！饗することによ）遊離チＸ−ル型（ジチオールふ＠休作ナス）中で憂 漁＋スー玲１．ｑで　ツーのメルカプトエチルアミンと低分子量の反応生成物と を、（１１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ４８）及びＩｍＭＥＤＴ人で平衡化させた セファデックスＧ−２５で遠心分離ゲル濾過によって除去する。

次いで、得られた抗−アビジンＦ（ａ　ｂ’）−チオールを直ちに、α５ＴＩ９ ／−若しくはそれ以上の蛋白濃度にて抗−Ｂ−ガラクトシダーゼＦａｂ’のチオ ニトロベンゾエート誘導体の当モル蓋と２５℃にて３〜２０時間接触させて、支 持異性Ｆ（λｂ′）１を生成させる。次いで、この混合物に固体ＤＴＮＢを５ｍ Ｍの最終濃度まで加え、かつ２５℃にて３時間放置することにょシ全ての非共有 ダイマー物質の消失を促進する。次いで、アビジン及びＢ−ガラクトシダーゼに 対する均質な支持異性抗体決定子を、１１Ｍのリン酸ナトリウＡ（ｐＨｔｓ）に おけるＴ　Ｓ　Ｋ　！１０００ＳＷの高性能液体クロマトグラフィーにょｂ　Ｆ （ａｂ’）ｚ　７ラクシヨンを残余のＦａｂ’モノ！−から分層ｆる？ニーとに よって作成し、この手順はＦ　（ｈ　ｂ’）２に害を与えずかつ他物質に結合さ せる必要がなく、活性に影響を及ぼしうるような構成上の変化の危険性が少ない 。所望の支持異性抗体決定子の形成は、ビオチン置換ｔ換したセルローズの円盤 に対するＢ−ガラクトシダーゼのアビジン依存性結合を生ぜしめる能力によって 便利に示すことができる。

支持異性抗体決定子は、化合物（たとえば乳糖）の分析に際しビオチン置換され たセルロース膜へ結合させることができ、Ｂ−ガラクトシダーゼがその測定に役 立つ（以下、詳細に説明する）。

ビオチンに結合したアビジンを有する膜を、抗アビジンの半部及び抗−Ｂ−ガラ クトシダーゼの半部を有する支持異性決定子とＢ−ガラクトシダーゼとに簡単に 接結”させて、ビオチン直換膜上に抗−Ｂ−ガラクトシダーゼを固定化させるこ とができる。同様にして、グルコスオキシダーゼも膜に固定化することができる 。

上記の同じ手順を用いて、一方が酵素グルコースオキシダーゼにおける独特な抗 原部位とＢ−ガラクトシダーゼにおける抗原部位とに対する特異性を有しかつ他 方がグルコースオキシダーゼに対する異なる抗原部位とＩ型コラーゲンにおける 抗原部位とに対する特異性を有するような、２種の支持異性分子を作成すること 本できる。

これらを使用して、パウルス（上記）に記載されたように、乳糖を一般的に測定 するための電柵を形成することができる。

以下、分析される未知論の物質の尺度として比色法、反射測定法、発光測定法又 は螢光測定法によ）測定しうる物質につき測定を使用する種類の分析の例につき 説明する。一般に、この分析は履体試料中の未知物質の量を測定し、この未知物 質は少なくとも第１酵素によシ作用を受けて、未知物質の尺度として使用しつる 測定可能なイオン若しくは化合物を発生する。分析は、第１＃素と支持体若しく は化合物を発生する。分析は、第１＃素と支持体若しくは第２酵素とに対し特異 性をＭする本発明の支持異性抗体決定子によって、第１酵素を固体支持体（たと えば、ビーズ又は茨文持体）或いは予め順次に作用する第２酵素へ結合させるこ とを含む。この方法においては、反応順序に多くの、＠次の酵素が関与し、作用 する最後の酵素が一般に支持体に結合される。試料を支持体に固定化された結合 ＃素と接触させ、かつ測定可能なイオン若しくは化合物を測定する。測定しうる 未知物質はたとえば血糖を包含する。

代案として、順次の酵素を、測定すべき未知物質を介して適当な支持異性抗体に よって間接的に結合させることもできる。これは、たとえばホルモン（たとえば 妊娠試験で測定されるヒト絨毛ゴナドトロピン及びインシュリン）のような生物 分子につき測定しうる物質の範白を拡大する。

第１図は、双ｌ＃異性抗体決定子によシ結合される自己組立酵素の配置を示す（ 丸印の酵素を結合するシェブロンとして示す）。配列における最後の酵素（ルシ フエ２−−ｖ）は、たとえばアビジン及びビオチン−置換膜（図示せず）を用い て固定化させることができる。図示したように還元された場合、ルシフェラーゼ は生物発光性となる。〔図示した反応連鎖はウィーンハウゼン（Ｗ’Ｉ＠ｎ−ｈ ＠＋ｘ＊ａｎ）及びデル力（Ｄ＠Ｌｕｃａ）　（ｔ９８２）、アナリチカルーバ イオケミストリー、第１２７巻、第３８０頁並びにハスチンゲス（Ｈａｓｔｌｍ ｇｇ）　等に係る米国特許第４，２７８，７６１号公報に＃細に記載されておシ 、これらを参考のためここに引用する〕。

第２図は、２ｇｉの原符異性モノクローナル抗体決定子を使用する「チャンネリ ング」免疫分析を示している〔図示した分析はりットマン（ＬＩｔｍａｎ）等（ １９８０）、アナリテイカル・バイオケミストリー、第１０６巻、第２２３頁に 記載されたチャンネリング免疫分析の原理の幾つかを用いる〕。第１の支持異性 決定子は第１＃素と、測定される抗原（たとえばヒト絨毛ゴナドトロピン）にお ける第１抗原部位とに対し特異性を有する。第２の支持異性決定子は第２酵素と 、測定される抗原における第２抗原部位とに対し特異性を有する。第１９素は第 １基質に作用して第２基質を生成することができ、この第２基質は第２＃素によ ）作用を受けて測定可能な化合物若しくはイオンを発生することができる。この 分析は、測定すべき分子を含有すると思われる液体混合物を２種の支持異性決定 子及び２種の＃素と、第１基質の存在下で接触させて行なわれる。未知物質が存 在する場合、これら２種の決定子はこの物質に結合しかつ決定子に結合した２種 の＃素を互いに極めて接近させて２権の反応の効率を著しく増大させつる。図示 した反応式において、第１酵素はグルコースオキシダーゼであシ、第２酵素はペ ルオキシダーゼであシ、第１基質はグルコースであシ、かつ第２基質は過酸化物 であってロイコ染料を酸化することによりｉ定可能な染料を生成する。配列にお ける最後の＃素を固定化させることができる。第２図に示した分析は信号をノイ ズ比に対し改善する光学特性を含み、酵素結合性の未知物質が存在しない場合に ペルオキシダーゼの作用を抑えるのに充分多量の競合酵素（この場合、カタラー ゼ）を使用する。

第３因は、第２図の分析に類似した螢光エネルギー移動免疫分析法を示している 。両者における相違点は、エネルギー移動分析においては有機基質でなく光を順 次に作用させて測定可能な結果を得るととである。この分析Ｆｉ２種の螢光性蛋 白質を使用し、図示した分析においてこれらはフィフエリトリン（ｒＰｈｙＪ　 ）及びアロフィコシアニン（「λＩＩＪ）であう、両者は青色−緑色藻垣により 生成され、グレイザー（Ｇｌａｘａｒ）及びストライヤー（１を−ｒｙφｒ）　 （１９８４）　、バイオフィジカル・ジャーナル、第４３巻、第３２３頁には免 疫分析に有用であると記載されて　−おシ、これを参考のためここに引用する。

第３図に示したように、一方の原符異性モノクローナル抗体決定子は分析される 抗原（たとえはヒト絨毛ゴナドトロピン）における第１部位とｐｈ７とに対する 特異性を有し、かつ第２双特異性モノクローナル抗体決定子は抗原における第２ 部位と人１１とに対する特異性を有する。抗原の存在はｐｈ７と人１１とを密接 させて、エネルギー移動効率を著しく増大させる。ｐｈ７が５００　ｎｍにて励 起しかつ５８０ｕｍにて透過するのに対し、Ａｌｌが５００ｎｍにつき透明であ るが５８０ｎｍにて励起しかつ６６０ｍｍにて透過するので、信号が発生する。

かくして、両蛋白質に光を順次に通過させることによ？）６６０ｒｓｍの信号の みが得られ、この方法の効率は蛋白質の接近性に依存する。

上記分析におけるように、一方又は両方の螢光性蛋白質を、慣用手段によシ或い は本発明の支持異性決定子によシ支持体上へ固定化することができる。

第７図に示した近縁種類の免疫分析は、発光性分子と螢光性物質との間の発光エ ネルギー移動を含む〔パテル（Ｆａｔａｌ）等（１９８３）、アナリテイカル・ バイオケミストリー、第１２９巻、第１６２〜１６９頁〕。第７図を参照して、 発光性蛋白質アエクオリンをフイフエリトリンと組み合せて使用する。抗原の存 在はアエクオリンとフイコエリトリンとを近接させて、エネルギー移動効率を著 しく増大させる。ＣａＯの添加は４７５ｎｍにおけるアエクオリンの発光性を誘 発して、フイコエリトリンを励起させると共にこれによ、ｊ）５８０ｎｍにて螢 光を発生させる。かくして、フイ；エリトリンによるアエクオリンの発光性の波 長変調によって５８０ｎｍの信号のみが得られ、その効率はこれら蛋白質の接近 性に依存する。

他の実施態様については、以下の請求の範凹に示す。

たとえは、Ｉｇ（ｈ抗体が好適であるが、本発明にはＩｆ−及びＩｇＡ抗体も使 用することができる。さらに、ｐ（ｅ’）部分だけでなく全半分子を使用するこ ともできる。ジチオール錯体形成剤として亜砒酸ナトリウムの代シに（Ｌ２５ｍ Ｍのび化フェニルアルシンを使用することによシ収率を僅かに向上させることも できる。

−一１−１−１ １”ｌＧ、４ ′灸、ｎゲ）コブ゛ノンガ巧− 缶入゛ミ１９Ｇ１ コ　ロ　ロ が 手続補正書 昭和６１年　５月　２日 特許庁長官　宇　賀　道　部　殿 補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　ボストン　バイオメディカル　リサーチインステイテユート、インコー ポレイテッド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．それぞれ１個若しくはそれ以上のジスルフイド結合により結合された２個の 同一のＬ−Ｈ半分子からなる２種の異なるモノクローナル抗体決定子を供給し、 前記Ｌ−Ｈ半分子を結合する前記ジスルフイド結合を破壊するのに充分な条件に 前記２種の異なる抗体決定子をかけることにより、各決定子を一対の同一半分子 まで切断し、 前記同一半分子対の１つをチオール活性化剤で誘導化させ、かつ 前記半分子をこれらが１個若しくはそれ以上のジフイルド結合の形成により双特 異性抗体決定子を形成しうる条件下で結合させる ことを特徴とする双特異性モノクローナル抗体決定子の製造方法。 ２．チオール活性化剤が１個若しくはそれ以上のジスルフイド結合の形成を促進 すると共に、チオール活性化された同一半分子の再結合を阻止する請求の範囲第 １項記載の方法。 ３．２種の異なる抗体決定子がＩｇＧ若しくはＩｇＡである請求の範囲第１項記 載の方法。 ４．２種の異なる抗体決定子がＩｇＧ１である請求の範囲第３項記載の方法。 ５．２種の異なる抗体決定子がＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ若しくはＩｇＧ３である 請求の範囲第３項記載の方法。 ６．各異なる半分子がＩｇＧ抗体のＦ（ａｂ′）部分よりなる請求の範囲第３項 記載の方法。 ７．モノクローナルＩｇＧ決定子の一方が２個以上のジスルフイド結合により結 合された２個の同一Ｌ−Ｈ半分子からなり、かつ半分子への前記決定子の切断工 程を前記半分子のＨ鎖におけるジスルフイド結合の形成を阻止する条件下で行な う請求の範囲第３項記載の方法。 ８．両モノクローナル抗体法定子が２個以上のジスルフイド結合により結合され た２個の同一Ｌ−Ｈ半分子からなり、かつ半分子への両決定子の切断をこれら半 分子のＨ−鎖におけるジスルフイド結合の形成を阻止する条件下で行なう請求の 範囲第３項記載の方法。 ９．Ｈ−鎖におけるジスルフイド結合の形成を、ジチオール錯体形成剤の存在下 で切断を行なうことにより阻止する請求の範囲第７項又は第８項記載の方法。 １０．ジチオール錯体形成剤が亜砒酸化合物からなる請求の範囲第９項記載の方 法。 １１．亜砒酸化合物が無機亜砒酸塩からなる請求の範囲第１０項記載の方法。 １２．無機亜砒酸化合物が亜砒酸ナトリウムからなる請求の範囲第１１項記載の 方法。 １３．亜砒酸化合物がアリール亜砒酸エステルからなる請求の範囲第１０項記載 の方法。 １４．アリール亜砒酸エステルが酸化フエニールアルジンからなる請求の範囲第 １３項記載の方法。 １５．ジチオール錯体形成剤がカドミウム塩からなる請求の範囲第９項記載の方 法。 １６．Ｈ−鎖におけるジスルフイド結合の形成を、Ｈ−鎖の構成が改変されてジ スルフイド結合の形成を阻止するような条件下で切断を行なうことにより阻止す る請求の範囲第７項又は第８項記載の方法。 １７．Ｈ−鎖におけるジスルフイド結合の形成を、ｐＨ３．８〜４．５にて切断 を行なうことにより阻止する請求の範囲第１６項記載の方法。 １８．ｐＨが約４．２である請求の範囲第１７項記載の方法。 １９．Ｈ−鎖におけるジスルフイド結合の形成を、切断の後に蛋白分解酵素によ り１個以外の全還元システイン残基を除去することにより阻止する請求の範囲第 ７項又は第８項記載の方法。 ２０．蛋白分解酵素がカルボキシベブチダーゼＹからなる請求の範囲第１９項記 載の方法。 ２１．チオール活性化剤が芳香族ジスルフイドからなる請求の範囲第１項記載の 方法。 ２２．芳香族ジスルフイドが５．５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）から なる請求の範囲第２１項記載の方法。 ２３．芳香族ジスルフイドが２．２′−ジピリジンジスルフイドからなる請求の 範囲第２１項記載の方法。 ２４．芳香族ジスルフイドが４，４′−ジピリジンジスルフイドからなる請求の 範囲第２１項記載の方法。 ２５．チオール活性化剤がサルフアイトとテトラチオネートとの混合物からなる 請求の範囲第１項記載の方法。 ２６．チオール活性化剤による両Ｆ（ａｂ′）半分子の誘導化の後に、これら半 分子の一方を遊離チオールに対し使用しうるチオール活性化Ｆ（ａｂ′）まで変 換する請求の範囲第６項記載の方法。 ２７．後の還元を、半分子のＨ−鎖におけるジスルフイド結合の形成を阻止する 条件下で行なう請求の範囲第２６項記載の方法。 ２８．Ｈ−鎖におけるジスルフイド結合の形成を、ジチオール錯体形成剤の存在 下に切断を行なうことにより阻止する請求の範囲第２７項記載の方法。 ２９．双特異性抗体決定子から未反応の半分子を分離する工程をさらに含む請求 の範囲第１項記載の方法。 ３０．分離工程が、分子寸法に基づく分離からなる請求の範囲第２９項記載の方 法。 ３１．分離工程がゲルろ過からなる請求の範囲第３０項記載の方法。 ３２．分離工程がイオン交換、電気泳動、等電集束又は親和性クロマトグラフイ ーからなる請求の範囲第２９項記載の方法。 ５３．液体試料中の未知物質の量を測定するに際し、この物質に少なくとも第１ 酵素を作用させて測定可能なイオン若しくは化合物を発生させ、発生するこのイ オン若しくは化合物は前記物質の尺度となる分析法において、（ａ）前記第１酵 素を、ジスルフイド結合により結合された２個のＬ−Ｈ半分子からなる双特異在 モノクローナル抗体決定子によつて固体支持体又は予め順次に作用する第２の酵 素に結合させ、前記各半分子は他の半分子とは異なりかつモノクローナルＩｇＧ 抗体の少なくともＦ（ａｂ′）部分を有し、前記Ｌ−Ｈ半分子の１つは前記第１ 酵素分子における抗原部位に対し特異性であり、他方の半分子は前記支持体若し くは前記第２酵素における抗原部位に対し特異性であり、 （ｂ）前記試料を、前記第１酵素及び前記第２酵素若しくは前記支持体を結合す る前記双特異性モノクローナル抗体決定子と接触させ、かつ （ｃ）前記測定可能なイオン若しくは化合物を前記試料における前記未知物質の 尺度として測定することを特徴とする分析法。 ３４．測定可能なイオン若しくは化合物を螢光、着色又は発光の測定により測定 する請求の範囲第３３項記載の分析法。 ３５．（１）２種の双特異性モノクローナル抗体決定子を供給し、 第１の決定子は測定する抗原における第１抗原部位と第１酵素とに対し特異性を 有し、 第２決定子は測定される前記抗原における第２抗原部位と第２酵素に対し特異性 を有し、 前記第１酵素は第１基質に作用して、前記第２酵素により作用を受けて測定可能 なイオン若しくは化合物を生成しうる第２基質を発生し、 前記第１及び第２双特異性モノクローナル抗体決定子をそれぞれ前記第１及び第 ２酵素に結合させ、（２）前記第１及び第２双特異性モノクローナル抗体決定子 並びに前記第１及び第２酵素を前記第１基質の存在下に前記試料と接触させ、 （３）前記測定可能なイオン若しくは化合物を、測定される前記抗原の尺度とし て測定する ことを特徴とする液体試料における抗原を測定するためのチヤンネリング免疫分 析法。 ３６．酵素の１種を、一方のＬ−Ｈ半分子がこの酵素における抗原部位に対し特 異性でありかつ他方の半分子か前記支持体における抗原部位に対し特異性である 双特異性抗体決定子により固体支持体に結合する請求の範囲第３５項記載のチヤ ンネリング免疫分析法。 ３７．第１酵素がグルコースオキシダーゼであり、第２酵素がペルオキシダーゼ であり、第１基質がグルコースであり、かつ第２基質が過酸化物である請求の範 囲第３５項又は第３６項記載の分析法。 ３８．測定可能なイオン若しくは化合物を螢光、着色又は発光の測定により測定 する請求の範囲第３５項又は第３６項記載の分析法。 ３９．（１）２種の双特異性モノクローナル抗体決定子を供給し、 第１決定子は測定する抗原における第１抗原部位と第１螢光性抗原とに対し特異 性を有し、 第２決定子は測定する前記抗原における第２抗原部位と第２螢光性抗原とに対し 特異性を有し、第１螢光性抗原は第２螢光性抗原が殆んど吸収を示さない第１波 長にて光を吸収すると共に、前記第２螢光性抗原により吸収されうる第２波長に て螢光を発生し、前記第２螢光性抗原は前記第２波長の光を吸収する際に前記第 １螢光性抗原が殆んど吸収を示さない第３波長にて螢光を発生することができ、 （２）前記第１及び第２双特異性モノクローナル抗体決定子並びに前記第１及び 第２螢光性抗原を前記試料と接触させ、 （３）前記第１波長の光を前記混合物に通過させ、かつ（４）前記第３波長にて 放出される光の量を、前記測定される抗原の尺度として測定する ことを特徴とする液体試料における抗原を測定するための螢光エネルギー移動免 疫分析法。 ４０．第１螢光性抗原がフイコエリトリンからなり、第２螢光性抗原がフイコシ アニンからなり、前記第１波長が約５００ｎｍであり、前記第２波長が約５８０ ｎｍであり、かつ前記第３波長が約６６０ｎｍである請求の範囲第３９項記載の 免疫分析法。 ４１．（１）２種の双特異性モノクローナル抗体決定子を供給し、 第１決定子は測定する抗原における第１抗原部位と発光性抗原とに対し特異性で あり、 第２決定子は測定する前記抗原における第２抗原部位と螢光性抗原とに対し特異 性を有し、 発光性抗原は螢光性抗原により吸収されうる第１波長にて発光することができ、 螢光性抗原は前記第１波長の光の吸収に際し前記発光性抗原が殆んど吸収を示さ ない第２波長にて螢光を発生することができ、（２）前記双特異性モノクローナ ル抗体決定子並びに前記発光性及び螢光性抗原を前記試料と接触させ、（３）発 光性抗原の発光を誘発させ、かつ（４）第２波長にて発生する光の量を、測定す る前記抗原の尺度として測定する ことを特徴とする液体試料における抗原を測定するための発光エネルギー移動免 疫分析法。