DK169153B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af en bispecifik monoklonal antistof-determinant - Google Patents

Description

DK 169153 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af en bispecifik monoklonal antistof-determinant, hvilken fremgangsmåde omfatter tilvejebringelse af to forskellige monoklonale antistof-determinanter, 5 hvor hver determinant omfatter to identiske L-H-halvmole-kyler knyttet sammen med en eller flere disulfidbindinger, underkastelse af de to forskellige antistof-determinanter for betingelser tilstrækkelige til at bryde nævnte disulfidbindinger, der sammenknytter nævnte L-H-halvmole-10 kyler, hvorved hver determinant splittes i et par identiske halvmolekyler, derivatisering af et af nævnte par identiske halvmolekyler med et thiolaktiverende middel og kombinering af halvmolekylerne til dannelse af de bispecifikke antistof-determinanter ved dannelsen af en eller 15 flere disulfidbindinger. Det thiolaktiverende middel kan være et arsenit, et aromatisk disulfid, såsom 5,5'-di-thiobis-(2-nitrobenzoesyre), 2,2'-dipyridindisulfid eller 4,4-dipyridindisulfid eller en blanding af sulfit og te-trathionat.

20

Dansk patentansøgning nr. 3795/83 beskriver en fremgangsmåde til fremstilling af identiske bispecifikke monoklonale antistof-determinanter. Den foreliggende opfindelse forbedrer denne proces væsentligt ved at hindre intramo-25 lekylær sulfidbindingsdannelse under processen. Dette opnås ved anvendelsen af dithiolaktiverende midler som et trin, der hindrer gendannelsen af de oprindelige antistof-determinanter. Denne gendannelse af udgangsmaterialerne er normalt en sidereaktion, som ellers resulterer i 30 betragtelige reduktioner i udbyttet af det ønskede produkt. Sådanne sidereaktioner undgås ved hjælp af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse.

igG-antistofferne er kendte for at bestå af to halvmole-35 kyler, der hver indeholder en let (L) kæde og en tung (H) kæde. H-kæderne af de to halvdele er bundne med disulfidbindinger, som kan brydes ved selektiv reduktion. Hvis DK 169153 B1 2 dette trin udføres for to forskellige IgG-prøver, kan halvmolekylerne kombineres til dannelse af hybride antistoffer. Dette kan foretages under anvendelse af intakte kaninglobuliner, Nisonoff et al. (1964), Science 134, 5 376-379. IgA-antistofferne kan også splittes i identiske halvmolekyler.

Hybrider er også blevet dannet under anvendelse af F(ab')2~fragmenterne af IgG-antistoffer frem for intakte 10 antistoffer; dvs. F(c')-delene af molekylet, som ikke giver immunospecificitet, er, før hybridisering, fjernet ved nedbrydning med en passende protease, såsom pepsin. Denne procedure er blevet beskrevet i Nisonoff et al. (1960) Arch. Biochem. Biophys. 89, 230-244 og i Nisonoff 15 og Rivers (1960) Arch. Biochem. Biophys. 93, 460-462. I en senere diskussion af den første artikel skrev Nisonoff i Current Contents (2. nov. 1981) 44, 25: "So far this procedure has had limited applica-20 tion, principally in the staining of cell surfaces with ferritin by using a hybrid of anti-ferritin antibody and antibody to a cell surface antigen. The use of hybrid antibody has also been considered as a means of bringing a 25 pharmacological agent specifically into contact with a desired tissue surface."

Anvendelsen af sådanne hybrider til afgivelsen af cytoto-xiske lægemidler er også blevet foreslået i Raso og Grif-30 fin (1978) Fed. Proc. 37, 1350.

Milstein (1981) Proc. R. Soc. Lond. B211, 393-412 foreslår muligheden af at anvende "monoclonal antibodies as carriers of toxic substances for specifik treatment of 35 tumors" og anfører, at "it is possible that Fab fragments will be better targeting agents than intact antibody." 3 DK 169153 B1

Hybrid-antistoffer er også blevet dannet ved sammensmeltning af to celler, der hver er i stand til at producere forskellige antistoffer, til fremstilling af en hybridcelle, der er i stand til at producere hybride antistof-5 fer. En sådan metode er beskrevet i Milstein og Cuello (1983) Nature 305, 537-540. Musehybridomaceller producerende forskellige monoklonale antistoffer blev sammensmeltet, og de resulterende sammensmeltede celler producerede blandinger af antistoffer sammensat af alle mulige 10 kombinationer af de to forskellige sæt parentale tunge og lette kæder. Blandt denne blanding af molekyler var hybrid-antistoffer bestående af en halvdel af hver af de parentale antistofmolekyler, som delvis kunne renses ved ionbytningskromatografi.

15

En anden artikel, Raso et al. (1981) Cancer Research 41, 2073-2078, beskriver dannelsen af en uren prøve af kaninantistof (F(ab!)2-fragmenter; kaninantistoffragmenterne blev splittet ved reduktion og samlet igen med antiricin 20 A-kæde F(ab')2-fragmenter. De duale specificitetsdimere blev anvendt i målrettede lægemiddelafgiftsforsøg. Artiklen anfører: "The two types of purified antibodies used for 25 this work were isolated from conventional hete- * roantisera. Thus, a complicated array of affinity and specificity combinations must arise upon annealing these two populations. The advent of homogenous hybridoma-derived antibodies will af-30 ford absolute control over the binding affi nities of the constituent halves of a hybrid antibody, and this uniformity should greatly boost their ultimate effectiveness as delivery vehicles ."

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en homogen prøve af identiske bispecifikke antistof-determinanter, 35 DK 169153 B1 4 hvor hver bispecifik determinant er sammensat af to L-H-halvmolekyler sammenknyttet med disulfidbindinger, hvor hvert L-H-halvmolekyle er forskelligt fra det andet og specifikt for en anden antistof-determinant.

5

De specifikke monoklonale antistof-determinanter ifølge opfindelsen fremstilles ved at tilvejebringe to forskellige monoklonale antistof-determinanter, der hver er sammensat af to identiske L-H-halvmolekyler sammenknyttet 10 med en eller flere disulfidbindinger; ved at underkaste de to forskellige antistof-determinanter for betingelser tilstrækkelige til at bryde disulfidbindingerne, der sammenknytter L-H-halvmolekylerne under betingelser, som gør det muligt for dem kemisk at kombinere til dannelse af de 15 bispecifikke antistof-determinanter ved dannelsen af en eller flere disulfidbindinger.

Fremgangsmåden omfatter endvidere foretrukkent, før kombineringstrinnet, derivatisering af et par identiske 20 halvmolekyler med et thiolaktiverende middel, som letter dannelse af disulfidbindingerne mellem de thiolaktiverede halvmolekyler og de andre halvmolekyler.

I andre foretrukne udførelsesformer er de monoklonale an-251 tistoffer IgG (mest foretrukkent IgG^, eller, mindre fo- retrukkent, IgG2A, IgG2B eller IgG3) eller IgA; hvert halvmolekyle omfatter, hvis det er afledt fra et IgG-an-tistof, i det mindste F(ab')-delen; det thiolaktiverende middel forhindrer rekombination af de thiolaktiverede 30 halvmolekyler; den ene eller begge de monoklonale antistof-determinanter er sammensat af halvmolekyler sammenknyttet med mere end én disulf idbinding, og trinnet til splitning af sådanne determinanter i to halvmolekyler udføres under betingelser, som forhindrer dannelsen af di-35 sulfidbindinger inde i H-kæderne i halvmolekylerne; og det thiolaktiverende middel er 5,5'-dithiobis-(2-nitro-benzoesyre), 2,2'-dipyridindisulfid, 4,4-dipyridindisul- 5 DK 169153 B1 fid eller en blanding af sulfit og tetrathionat. (Anvendelsen af thiolaktiverende midler til at knytte F(ab')-fragmenter til andre proteiner er blevet beskrevet, f.eks. i Raso et al. (1980) J. Immunol. 125, 2610; Raso 5 et al. (1982) Cancer Res. 42, 457, og Masuho et al.

(1979) B.B.R.C. 90, 320, hvortil der henvises). Dannelsen af disulfidbindinger inde i H-kæderne i halvmolekylerne, der oprindeligt er sammenknyttet med disulfidbindinger, forhindres foretrukkent ved at udføre splitningsreaktio-10 nen i nærværelse af et dithiolkompleksdannende middel, såsom et arsenit, f.eks. et uorganisk arsenit, såsom na-triumarsenit, eller et arylarsenit, f.eks. phenylarsen-oxid, eller et cadmiumsalt, eller ved at udføre splitningsreaktionen under betingelser, under hvilke tilpas-15 ningen af H-kæderne modificeres til at forhindre disul-f idbindingsdannelse, f.eks. ved pH mellem 3,8 og 4,5 (mest foretrukkent 4,2) eller ved at fjerne alle reducerede cysteinrester på nær én under anvendelse af et pro-teolytisk enzym, såsom carboxypeptidase Y.

20

Hvor rekombinationen af ens halvmolekyler indbyrdes forhindres, kan rensning af bispecifikke determinanter fra blandingen udføres ganske enkelt på basis af molekylstør-relse, f.eks. ved gelfiltrering; dette er muligt, fordi 25 de eneste molekyler i opløsningen, halvmolekyler og bi-specifikke molekyler, er forskellige i størrelse med en faktor på 2. Andre separationsmetoder er f.eks. ionbytning og isoelektrisk fokusering.

30 Fig. 1 viser skematisk strukturen af kanin-IgG1 sammenlignet med mus-IgG^.

Fig. 2 viser skematisk konkurrerende intrakæde-disulfidreaktioner i halvmolekyler fra mus.

Fig. 3 viser skematisk en foretrukken metode til fremstilling af bispecifikke monoklonale antistof-determinan- 35 DK 169153 B1 6 ter.

De bispecifikke monoklonale antistof-determinanter ifølge opfindelsen er nyttige til en lang række anvendelser.

5 Disse anvendelser skyldes alle evnen for disse determinanter til at tjene som højspecifikke linkere via specifikke sites B', af to vilkårlige antigene determinanter i stand til at stimulere antistofproduktion hos dyr; f.eks. effektive proteiner, polypeptider, kulhydrater, nuclein-10 syrer eller haptener, enten frie eller immobiliseret på overflader eller partikler.

De bispecifikke antistof-determinanter ifølge opfindelsen er velegnede til anvendelse som midler til binding af en 15 ønsket antigenhelhed til en ønsket overflade, som indeholder, eller hvortil der er immobiliseret en anden antistof-determinant. F.eks. kan således immobiliserede enzymer på partikler eller membraner anvendes som faststof-katalysatorer. Fordele ved denne type immobilisering frem 20 for andre er, at antistoffer kan udvælges, som ikke har nogen uheldig virkning på enzymaktivitet, og at rene enzymer kan immobiliseres fra urene blandinger. Bispecifikke antistof-determinanter kan også anvendes som yderst specifikke bispecifikke reagenser for immunoprøveprocedu-25 rer, som f.eks. anvendes ved diagnose af medicinske fejl eller sygdomme, eller som molekylprober for at studere forholdet mellem antigene determinanter i biologiske systemer.

30 En yderligere anvendelse af de biospecifikke antistof-de- terminanter er deres anvendelse i elektroder. Opfindelsen kan anvendes i elektroder af enhver konfiguration, f.eks. i sensorer på fast form, såsom felteffekttransistorer, f.eks. som beskrevet i Wohltjen (1984) Analyt. Chem. 56, 35 87A.

DK 169153 B1 7 I det følgende beskrives mere detaljeret dannelsen af de bispecifikke antistof-determinanter ifølge opfindelsen og den særlige metode, der anvendes, hvor antistofferne er af museoprindelse.

5

Fig. 1 viser forskellen i struktur mellem kanin-IgG^-antistoffer og mus-IgG^-antistoffer (som omfatter de fleste monoklonale antistoffer). Disse strukturer afviger i antal disulfidbindinger, der tilknytter de tunge kæder. De 10 to halvdele af kanin-igG^ holdes sammen af en enkelt binding, og reduktionen af F(ab')2 til F(ab') monomer såvel som reassocieringen af monomer til den dimere involverer således brydning og dannelse af kun én binding, en relativ enkelt proces. I modsætning hertil er de tunge kæder 15 fra mus-IgG1 knyttet med tre disulfidbindinger, og brydningen deraf og gendannelsen kan føre til konkurrerende intrakædesidereaktioner af den type, der er vist på fig.

2, som i betydelig grad kan formindske udbyttet af det ønskede produkt. Intrakædereaktionen gør halvmolekylet 20 utilgængeligt for rekombinering med et andet halvmolekyle. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen muliggør produktion af rene bispecifikke monoklonale antistof-determinanter i højt udbytte ud fra musemonoklonale antistoffer såvel som fra antistoffer afledt fra andre pattedyrarter.

25

Fremgangsmåden involverer følgende række trin. Anvendelse af konventionelle metoder, to forskellige monoklonale IgG^-antistofprøver fremstilles, hvor hvert antistof har en af de to ønskede specificiteter. Hver prøve udsættes 30 derpå for en passende protease, såsom pepsin, for at fraspalte F(c')-delen af antistofmolekylet til fremstilling af et F(ab'). Hver prøve underkastes derpå betingelser tilstrækkelige til at bryde sulfidbindingerne, der sammenkæder F(ab')-halvmolekylerne, men ikke nogen af de 35 andre disulfidbindinger i molekylet. Samtidig er disse betingelser således, at man undgår dannelsen af disulfider inde i en enkelt tung kæde, f.eks. ved addition af et DK 169153 Bl 8 dithiolkompleksdannende middel (f.eks. natriumarsenit (som vist i fig. 3), et aromatisk arsenit, såsom phenyl-arsenoxid, eller CdCl2) eller ved at modificere tilpasningen af den tunge kæde (f.eks. ved at nedsætte pH til 5 4,2) eller ved at fjerne alle de reducerede cysteinrester på nær en med et proteolytisk enzym (f.eks. carboxypepti-dase Y).

En af prøverne udsættes derpå for et thiolaktiverende 10 middel for at kompleksdanne alle frie thioler, danne et derivat, der kan reagere hurtigt med andre frie thioler til dannelse af disulfider som vist sidst i sekvens 1 i fig. 3. Blandt de midler, der er egnede til dette formål, kan nævnes aromatiske disulfider, såsom DTNB (Ellman 15 (1959) Arch. Biochem. Biophys. 82, 70) (fig. 3), 2,2'-di- pyridindisulfid, 4,4'-dipyridindisulfid (Grasetti et al. (1967) Arch. Biochem. Biophys. 119, 41) og sulfit/tetra-thionat (Masuho et al. (1979) B.B.R.C. 98, 320). Denne aktiverede prøve kombineres derpå (sekvens 3 fig. 3) med 20 den anden dithiolkompleksdannede prøve, som har tilgængelige thioler, under betingelser, hvor i det mindste nogle halvmolekyler kombinerer kemisk til dannelse af bispecifikke antistof-determinanter, men intet monospecifikt F(ab’)2.

25

Alternativt kan begge prøver udsættes for det thiolaktiverende middel til dannelse af de aktiverede thiolderiva-ter. (Dette er ofte hensigtsmæssigt på grund af den forholdsvis gode stabilitet af de aktiverede derivater). En 30 af prøverne behandles derpå med et overskud af en thiol med lav molekylvægt til regenerering af de frie thioler på den F(ab’)-monomere efterfulgt af adskillelse fra overskud af thioler med lav molekylvægt. Intramolekylær disulfidbindingsdannelse kan undgås ved tilsætning af et 35 dithiolkompleksdannende middel (sekvens 2 i fig. 3) eller ved at modificere tilpasningen af den tunge kæde. Det kan imidlertid i nogle tilfælde være ønskeligt at tillade DK 169153 B1 9 dannelsen af intramolekylære disulfidbindinger. Denne prøve kombineres derpå (sekvens 3 i fig. 3) med den F(ab')-prøve på den thiolaktiverede form under betingelser, hvor i det mindste nogle halvmolekyler kombinerer 5 kemisk til dannelse af bispecifikt FCab'^·

Da F(ab'^-fraktionen produceret under disse betingelser kun består af de ønskede bispecifikke antistof-determi-nanter, forudsat at der er anvendt passende rensede mono-10 klonale antistoffer som udgangsmaterialer, kan homogene bispecifikke antistof-determinanter opnås ved ganske enkelt at fjerne den monomere F(ab')-fraktion fra den ønskede F(ab')2 på basis af molekylestørrelse ved en hensigtsmæssig procedure, såsom gelfiltrering.

15 Følgende procedure anvendes til fremstilling af en homogen prøve af identiske bispecifikke antistof-determinanter, i hvilke hver bispecifik determinant har et site, der er specifikt for et enestående antigen-site på pro-20 teinet avidin, og et site, der er specifikt for et enestående antigen-site på enzymet B-galactosidase. Denne procedure følger de trin, der er vist alment på fig. 3.

Det første trin er fremstillingen af monoklonale anti-25 stoffer mod de to proteiner avidin og B-galactosidase. Dette gøres ved først at immunisere en gruppe BALB/C-mus mod hvert enzym under anvendelse af standardiserede immuniser ingsprocedurer.

30 Efter immunisering udvindes miltceller af immuniserede dyr og sammensmeltes med et derivat af MOPC-21 myeloma-celler (f.eks. NSI eller SP2/0-Agl4) under anvendelse af den procedure, der er beskrevet i Galfre et al. (1981) Methods in Enzymology 73, 3-46. De hybride celler udvæl-35 ges i hypoxanthin-aminopterin-thymidin-medium, klones og screenes for produktion af antistoffer mod de ønskede enzymer ved den metode, der er beskrevet i Galfre et al.

10 DK 169153 B1

Id. De kloner, der findes at producere antistoffer mod det ønskede enzym, screenes derpå til udvælgelse af en klon, som producerer et antistof af IgG^-klassen, som har en høj affinitet for enzymet, og som ikke forårsager in-5 aktivering af enzymet. De kloner, der er af interesse, opbevares indtil anvendelse under flydende nitrogen. Antistof fremstilles ved standardteknik til propagering af de klonede celler som ascites tumorer i peritoneale hulheder af pristan-primede mus.

10

De ønskede IgG^-antistoffer mod avidin og B-galactosidase renses derpå fra ascites-væske i alt væsentligt som beskrevet af Parham et al. (1982) Journal of Immunological Methods 53, 133-173 ved en procedure, der involverer am-15 moniumsulfatudfældning, gelfiltrering og kromatografi på

DEAS-cellulose med en lineær saltgradient. De monoklonale antistoffer kløves til F(ab' ^-fragmenter med pepsin som beskrevet af Lamoyi og Nisonoff (1983) Journal of Immunological Methods 56, 235-243 ved inkubering i 18 timer ved 20 25 °C med pepsin (2 vægt-%) i 0,1 M natriumacetat, pH

4,2. F(ab')^-fragmenterne renses derpå ved HPLC på en TSK 3000 SW-kolonne i 0,1 M natriumphosphat, pH 6,8, som beskrevet i Parham et al. Id. F(ab’fraktionerne overføres derpå fuldstændigt i Fab'-monomer ved reduktion med 1 25 mM 2-mercaptoethylamin i 1 mM EDTA, 10 mM natriumar senit og 0,1 M natriumphosphat, pH 6,8, i 18 timer ved 25 °C. Blandingen suppleres derpå med fast DTNB til en slutkon-centration på 20 mM. Efter 2 til 3 timers forløb ved 25 °C fjernes overskud af DTNB og produkter med lav molekyl-30 vægt ved centrifugalgelfiltrering på "Sephadex" G-25 bragt i ligevægt med 0,1 M natriumphosphat, pH 6,8 og 1 mM EDTA. De resulterende thionitrobenzoatderivater af Fab'-monomere er forholdsvis stabile og kan opbevares i flere dage uden væsentlig dekomponering.

Et af thiobenzoatderivaterne af Fab'-monomer (afledt fra antiavidin-antistof) konverteres derpå tilbage til den 35 DK 169153 B1 11 frie thiolform (kompleksdannet med dithiol) ved inkube-ring i 30 minutter ved 25 °C med 10 mM mercaptoethylamin i 1 mM EDTA og 0,1 M natriumphosphat, pH 6,8. Overskuddet af mercaptoethylamin og reaktionsprodukterne med lav mo-5 lekylvægt fjernes derpå ved centrifugal gelfiltrering på "Sephadex" G-25 bragt i ligevægt med 0,1 M natriumphosphat, pH 6,8 og 1 mM EDTA.

Den resulterende antiavidin F(ab')-thiol bringes derpå 10 straks i kontakt med en ækvimolær mængde af thionitroben-zoatderivatet af anti-B-galactosidase-Fab', ved en proteinkoncentration på 0,5 mg/ml eller derover, i 3 til 20 timer ved 25 °C for at tillade dannelse af bispecifikt F(ab')2* Blandingen suppleres derpå med fast DTNB til en 15 s lutkoncentration på 5 mM og efterlades i 3 timer ved 25 °C for at fremme fjernelse af eventuelt ikke-kovalent di-mert materiale. Homogen bispecifik antistof-determinant mod avidin og B-galactosidase fremstilles derpå ved at skille F(ab'^-fraktionen fra rest Fab'-monomere ved HPLC 20 på TSK 3000 SW i 0,1 M i natriumphosphat, pH 6,8, en procedure, som ikke beskadiger F(abT)^, og som ikke kræver, at det er bundet til noget andet, hvilket minimerer risikoen for tilpasningsændringer, som kunne påvirke aktiviteten. Dannelsen af den ønskede bispecifikke antistof-de-25 terminant kan hensigtsmæssigt vises ved dens evne til at forårsage avidin-afhængig binding af B-galactosidase til skiver af biotin-substitueret cellulose.

Den bispecifikke antistof-determinant kan kobles til en 30 biotin-substitueret cellulosemembran i en prøve for en forbindelse, f.eks. lactose, som B-galactosidase kan hjælpe med at måle (som forklaret mere detaljeret i det følgende).

35 Anti-B-galactosidase kan immobiliseres på den biotin-substituerede membran ved ganske enkelt at bringe membranen (som har avidin bundet til biotin) i kontakt med den bio DK 169153 B1 12 specifikke determinant, der har en antiavianhalvdel og en anti-B-galactosidase-halvdel, og med B-galactosidase. På lignende måde kan glucoseoxidase immobiliseres til membranen.

5

Under anvendelse af samme procedure som beskrevet i det foregående kan der fremstilles to bispecifikke molekyler, hvor det første har specificitet for et enkelt antigent site på enzymet glucoseoxidase og for et antigent site på 10 B-galactosidase, og det andet kan have specificitet for et andet forskelligt antigent site på glucoseoxidase og for et antigent site på type I kollagen. Disse kan anvendes til dannelse af en elektrode til måling af lactose generelt, som beskrevet i Paulus, id.

15

Det følgende er en beskrivelse på et eksempel på den type prøve, som gør brug af målingen af et stof, som kan måles kolorimetrisk, reflektometrisk, luminescent eller fluoro-metrisk, som mål for en ukendt mængde af et stof, for 20 hvilket der prøves. Generelt måler prøven mængden af et ukendt stof i en væskeprøve, hvilket stof påvirkes mindst af et første enzym til udvikling af en målelig ion eller forbindelse, som kan anvendes som mål for det ukendte stof. Prøven involverer binding af det første enzym til 25 en fast bærer (f.eks. en bærer i form af en perle eller membran), eller til et tidligere sekventielt virkende andet enzym ved hjælp af en biospecifik antistof-determinant ifølge opfindelsen, der har specificitet for det første enzym og for bæreren eller det andet enzym. Så 30 mange sekventielle enzymer, som er involveret i reaktionssekvensen, kan tilknyttes på denne måde, idet mindst ét virker generelt ved at blive knyttet til bæreren. Prøven bringes i kontakt med det bundne enzym eller de bundne enzymer, der er immobiliseret på bæreren, og den måle-35 lige ion eller forbindelse måles. Ukendte stoffer, som kan måles, omfatter f.eks. blodsukker.

13 DK 169153 B1

Alternativt kan de sekventielle enzymer tilknyttes direkte via et ukendt stof, der skal måles, via passende biospecifikke antistoffer. Dette udstrækker området af stoffer, der kan måles, til biomolekyler, såsom hormoner 5 (f.eks. hormon chorionisk gonadotropin, målt i graviditet s tes ter, og insulin).

Andre udførelsesformer er omfattet af de efterfølgende krav. F.eks. kan IgG2- og IgA-antistofferne også anvendes 10 i opfindelsen, skønt IgG^-antistoffer er foretrukne. Der kan også anvendes hele halvmolekylet frem for F(c')-delen. Udbyttet kan forbedres let ved som dithiolkompleks-dannelsesmidlet at anvende 0,25 mM phenylarsenoxid i stedet for natriumarsenit.

15 20 25 30 35

Claims (9)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en bispecifik mono-5 klonal antistof-determinant ved tilvejebringelse af to forskellige monoklonale antistof-determinanter, hvor hver determinant omfatter to identiske L-H-halvmolekyler knyttet sammen med en eller flere 10 disulfidbindinger, underkastelse af de to forskellige antistof-determinanter for betingelser tilstrækkelige til at bryde nævnte disul-fidbindinger, der sammenknytter nævnte L-H-halvmolekyler, 15 hvorved hver determinant splittes i et par identiske halvmolekyler, hvilken reaktion udføres i nærværelse af et dithiol-kompleksdannende middel, hvorved dannelse af disulfidbindinger inde i halvmolekylernes H-kæder forhindres , 20 derivatisering af nævnte par identiske halvmolekyler med thiolaktiverende middel til dannelse af et L-H-halvmole-kylkompleks, efterfulgt af 25 kombinering af halvmolekylerne under betingelser, som tillader, at nævnte halvmolekyler danner nævnte bispecifikke antistof-determinanter ved dannelsen af en eller flere disulfidbindinger.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at de to forskellige antis tof-determinanter er IgO eller IgA.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet 35 ved, at hvert forskelligt halvmolekyle består af F(ab')-delen af IgG-antistof. 15 DK 169153 B1

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at en af de monoklonale IgG-determinanter omfatter to identiske L-H-halvmolekyler knyttet sammen med mere end én disulfidbinding. 5

5. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at dithiol-kompleksdannelsesmidlet omfatter et arse-nit.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det thiolaktiverende middel er et aromatisk disulfid, fortrinsvis 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoesyre), 15 2,2'-dipyridindisulfid og/eller 4,4’dipyridindisulfid.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det thiolaktiverende middel omfatter en blanding 20 af sulfit og tetrathionat.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at et af halvmolekylerne efter derivatiseringen af begge F(ab')-halvmolekyler med et thiolaktiverende middel 25 overføres fra det tilgængelige thiolaktiverede F(ab') til den frie thiol.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man yderligere i et trin fraskiller eventuelle 30 uomsatte halvmolekyler fra de bispecifikke antistof-determinanter . 35