JPH03169897A - 化学修飾エクオリンとその調製法 - Google Patents
化学修飾エクオリンとその調製法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野】
本発明は、共有結合により化学修飾されたエクオリン活
性を有する蛋白質、該蛋白質と該蛋白質の基質となり得
る発光体との複合体およびそれらの調製法に間する． ［従来の技術とその問題点］ エクオリンは、米国ワシントン州フライデーハーパー島
近郊に生息する発光クラゲより分離されたカルシウム受
容発光蛋白質である．エクオリンは１分子に２分子（あ
るいは３分子）のＣａ”イオンが結合することによりエ
クオリン分子中に含まれる活性化状態にあるセレンテラ
ジンが酸化され、光とＣＯ，を放出する．この発光には
、Ｃａ”イオンが不可欠なことより、エクオリンを用い
てＣａ”を特異的に定量検出することが可能である，
Ｃａ”イオンの検出限界は１Ｇ−”Ｍ程度であり、非常
に感度が良いことが特徴である．しかしながら、エクオ
リンの天然からの分離は発光クラゲ１０トンから２００
園ｇ程度にすぎず、生産量は十分でなく、一定の供給が
保証されていない． 本発明者は組換えＤＮＡの手法を用いて、発光クラゲよ
りアポエクオリンのｃＤＮ＾をクローニングし、その１
次構造を決定した （特開昭６１−１３５．５８１ｉ）
，次いで、このｃＤＮ＾を用いて大腸菌を宿主とし、
その菌体内及び菌体外でのアボエクオリンの生産に戒功
した （特開昭６２−１９６．０３１１．さらに陰イオ
ン交換クロマトグラフイー法によるアポエクオリンの精
製法も確立した く特開平１ −１３２，３９７）．ま
た機能遺伝子と結合したエクオリン遺伝子を作成し、そ
の融合蛋白質の生産に戒功した（特開昭８４−２６１
，９４２、特願昭６３−３０８，４２４）．さらに、酵
素免疫測定法に利用すべく、その融合蛋白質の高純度精
製標品の調製法を確立し（特願平１−６９，８６２）、
この特異的結合能を有する蛋白質との融合蛋白質を用い
た免疫測定法も確立した（特願平１ −７４，７４２）
， 診断薬等への応用は、当業者に周知である．更なる有用
性にはエクオリンの化学修飾や固定化が不可欠である．
化学修飾が可能になれば、エクオリンを安定化させたり
、両親媒性の物質で修飾することによってエクオリンを
両親媒性にしたり、或は酵素や抗体などの機能分子と結
合させることでＭ素免疫測定法などへの応用が可能とな
る．また、固定化が可能となれば、上述のような特異的
な活性を保持したまま、しかも水に不溶性のエクオリン
、即ち、固定化エクオリンを作ることができ、更に反応
終了液中よりエクオリンのみを変性させずに回収し、こ
れを再利用することが可能となる．そうなれば、バイオ
センサー等への利用も可能となると予測できる． 本発明者らは上述の技術的事情にかんがみ、研究の結果
、エクオリンを共有結合により化学修飾することができ
た．以上の説明から明らかなように、本発明の目的は化
学修飾されたエクオリン活性を有する蛋白質および該蛋
白質と該蛋白質の基質となり得る発光体との複合体の調
製に関する方法、及び化学修飾されたエクオリン活性を
有する蛋白質および該蛋白質と該蛋白質の基質となり得
る発光体との複合体を提供することである．［問題を解
決するための手段］ 本発明は、下記（１）〜（３）の構成を有する．（１）
エクオリン活性を有する蛋白質に有機質を共有結合させ
ることを特徴とする化学修飾されたエクオリン活性を有
する蛋白質の調製法．（２）前記第 （！）項に記載の
Ｉ１製法により調製されてなる化学修飾されたエクオリ
ン活性を有する蛋白質． （３）前記！ （２１項に記載の蛋白質と該蛋白質の
基質となり得る発光体とを結合させて得られる該蛋白質
と該発光体との複合体． 本発明の構成につき以下に詳述する． ここでエクオリン活性を有する蛋白質とは、＼ アポエクオリン蛋白質の他、種々の機能蛋白質とアポエ
クオリンとの融合蛋白質や種々の物質により修飾を受け
た修飾アポエクオリン等の蛋白質であってエクオリン活
性を有するものを言う．本発明は、エクオリン活性を有
する共有結合により化学修飾されたエクオリン及びその
調製法によるもので、例えば後述の実施例に示す方法で
行１１うことができる． 本発明を添付図及び表によって説明すると、第ｌ図は化
学修飾法によりアミノ基修飾担体に固定化されたエクオ
リン活性を有する蛋白質調製工程図（フローシ一ト）を
示す． 先ず、アガロース系担体をｔ ｍＭ ＨＣＩで膨潤、洗
浄する．更に、カップリングＩＸ ｍ液すなわち０．５
Ｍ ＮａＣｌ／０．ＩＭ Ｎａｌ−ＩＣＯｓ（ｐＨ ８
．３）緩衝液で担体を洗浄し、直ちにアポエクオリンを
０．５Ｍ ＮａＣＩ／０．ＩＭＮａｌｌＣＯｓ（ｐＨ
ａ．３） Ｈｉｍ液に溶解させたアポエクオリン溶液に
、該膨潤・洗浄した担体を混合して、担体にアポエクオ
リンを共有結合により固定化する． 遠心分離により担体からアポエクオリン溶液を分別した
後、０．５Ｍ ＮａＣＩ／０．２Ｍブロッキング＆ｉ街
液すなわち、グリシン緩衝液で担体上の過剰の活性基を
除去する．遠心分離により上澄を除去した後、Ｏ．ＳＭ
ＮａＣｌ／０．ＩＭ 酢酸（ｐｌ＋ ４．０）１ｉ
街液と上述のカップリング緩衝液すなわち０．５Ｍ Ｎ
ａｆ：１／０．ＩＭＮａ｝ＩｃＯｓ （ｐＨ ８！）綴
街液で交互に担体を洗浄して、遊離のアポエクオリンを
除去する．本操作により遊離のアポエクオリンは９９％
以上除去され、化学修飾によりアガロース系担体に固定
化されたアボエクオリンがｍ製される． 第２図は、化学修飾法によりチオール基修飾アガロース
系担体に固定化されたエクオリン活性を有する蛋白Ｘ調
製工程図（フローシ一ト）を示す．担体を膨潤紐衝液す
なわち２０ｍＭ Ｔｒｌｓ−｝ＩＣＩ（ｐＨ７．０ｌｉ
ｌ街液で膨潤、洗浄する．更に、カップリング級衝液す
なわち２０ｓＭ Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ（ｐｌｌ７．８ｌｉ
ｉｉ液で担体を洗浄し、直ちじアボエクオリンを２０ａ
ＭＴｒｌｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）１１２１７液に溶解
させたものに、膨潤・洗浄した担体を混合して、担体に
アポエクオリンを共有結合により固定化する． 遠心分１ｅより担体からアポエクオリン溶液を分別した
後、０．１％２−メルカブトエタノール／０．５Ｎ Ｎ
ａＣｌ／０．ＩＭ酢酸（ｐｕ４．０） １！ｉ街液で担
体上の過剰の活性基を除去する．遠心分離により上澄を
除去した後、２０ｍＭ Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７．
０）Ｌｌ街液で担体を洗浄して、遊離のアポエクオリン
を除去する．本操作によって、チオール基修飾によりア
ガロース系担体に固定化されたアポエクオリンが調製さ
れる． 第３図は、上記第１．２図の説明に係る操作により化学
修飾法によって固定化されたアボエクオリンを示す．同
図（Ａ）は、アミノ基修飾担体に共有結合により固定化
されたアポエクオリンである．アボエクオリンのりジン
残基の側鎮のアミノ基がアミノ基修飾担体と反応してイ
ソウレア結合を形成して固定化される． 同図（８）は、チオール基修飾担体に共有結合により固
定化されたアボエクオリンである．アボエクオリンのシ
ステイン残基の側鎖のチオール基がチオール基修飾担体
の活性チオール基とチオールジスルフィド交換反応し、
混合ジスルフィドを形成して固定化される． 第４図は、ポリエチレングリコールにより化学修飾され
たエクオリン活性を有する蛋白質調製工程図（フローシ
ート）を示す， ０．８５％ＮａＣ１を含む５０ｍＭ
ＫＨｔＰＯ４（ＰＨ７．２＞Ｍ街液８ ａｌｌにアボ
エクオリンを溶解した後、このうちの６ ｓＪ２を分
取し、これにポリエチレングリコール１５Ｇ一℃を加え
、室温で攪拌しながら反応させる．反応開始後５、１０
，２０、３０、６０、１２０、１１１０分後に５００μ
４２ずっ分取し、０．８５Ｎａ（；Ｉを含む５ｈＭ Ｋ
Ｈ２Ｐ０４ＭＩＮ液９．５１ＩＩＬに加えて反応を止め
る．以上の操作によりポリエチレングリコールに化学修
飾されたアポエクオリンが得られる． 第５図は、上記操作により化学修飾されたアポエクオリ
ンを示す．アポエクオリンのアよノ基とアミノ基修飾ポ
リエチレングリコールのカルポキシル基とが酸アよド結
合を形成して、アポエクオリンがポリエチレングリコー
ルによって修飾される． 第 １ 表 第１表は、前記第１図及び第２図の調製工程により固定
化されたアボエクオリンの両相体に対する結合量を示し
たものである．結合量は、遊離のアポエクオリンの量よ
り求めている．結合量・結合した割合共にアミノ基を介
して固定化されたものの方が高かった． 第２表 第２表は、アミノ基修飾担体及びチオール基修飾担体両
担体に起因する散乱等でどの程度、発光の強度が減少す
るかを表わしたものである．光子減少率の測定は、後述
の実施例４に例示されているように、例えば、固定化に
要した担体と同量の担体を膨潤、洗浄した後、アボエク
オリンをセレンテラジンおよび２−メルカブトエタノー
ル共存下で、４℃、２時間処理したものを、、膨潤、洗
浄した担体と混合し、結合していないエクオリンの発光
を測定することで求めた． 第 ３ 表 第３表は、担体に固定化されていないエクオリンの活性
に対してのアミノ基修飾担体及びチオ−ル基修飾担体に
固定化されたエクオリンの相対活性を現わしている．こ
の値は、担体に固定化されたエクオリンの発光を測定し
、前記第２表の光子の減少率から実際の発光量を求めた
ものである．その結果、相対活性はアミノ基を修飾した
場合よりもチオール基を修飾した場合の方が高く、化学
修飾による固定化にはチオール基を用いたナが有利であ
ると考えられる． 第４表 第４表は、ボリエチレングリコール修飾エクオリンの相
対活性および該蛋白質の修飾率を示したものである．修
Ｍ率の増加Ｃともない相対活性が減少した．相対活性が
低いもののポリエチレングリコール修飾エクオリンはエ
クオリン活性を有していた． ［発明の効果］ 本発明の方法によれば、担体に固定化あるいは化学修飾
をすることが出来る．化学修飾が可能になれば、エクオ
リンを安定化させたり、両親媒性の物質で修飾すること
によってエクオリンを両親媒性にしたり、或は酵素や抗
体などの機能分子と結合させることで酵素免疫測定法な
どへの応用が可能となる．また、固定化することによっ
て水に不溶性となり、使用後の蛋白質を回収・再利用す
ることも可能となる． 検出感度の良さから、化学修飾することによりバイオセ
ンサーや免疫検定法等の各種測定検出法への応用も期待
でき、その利用範囲は極めて広い． 本発明の化学修飾や固定化したエクオリン活性を有する
蛋白質の有用性は、当業者に自明であり、上記の開示に
より、当業者は特許請求された本発明を実施できる．し
かし、この発明の理解を増すために、本発明に１！要な
化学修飾エリクオリンの調製法に使われる手順を以下に
明らかにする． ［実施例］ 実施例１［共有結合法によるエクオリンのアミノ基修飾
担体への固定化］ 担体として、アミノ基修飾担体を使用した．担体１０Ｑ
ｍｇをｌ．ｓ＋ｉｊｌエツベンドルフチェーブ中で１
ｍＭ ＨＣＩで１５分間膨潤させた後、遠心分頗により
余分の１ ｍＭ ＩＩＣＩを除去した．ついで、１ ａ
Ｍ ＨＣＩ２０ｍｊＺを担体に２０回に分けて加えその
度に１１１１０Ｉを遠心分離で除去して担体を洗浄した
．次ぎに、０．５Ｍ ＮａＣＩ／０．ＩＭ ＮａＨＣＯ
ｓ（Ｇｌ｝１８．３）１１衝液で担体を洗浄し、直ちに
アボエクオリン３．０９ｍｇを含む０．ＳＭ ＮａＣ１
／０．ＩＭ ＮａＨＣＯｓ（ＰＨＩＩ．３）｝３１衝液
に担体を移し、２５℃で２時間反応させた． このときは用いたアボエクオゾンは、以下の方法により
調製した．組換えＤＮＡの手法により製造したアボエク
オリン （特開昭８３−１０２．８９５）を、陰イオン
交換クロマトグラフィー法により処理し（特開平１ −
１３２，３９７） 、さらに逆相｝ＩＰＬｃにより精製
した． 逆相ＩＩ Ｐ Ｌ Ｃは、コスモシル１０Ｃ４−３００
（ ＩＯＸ １５０ｍ＋＊）のカラムに、溶媒系とし
て水／アセトニトリル（共に ０．１％トリフルオロ酢
酸を含む）系を用い、アセトニトリルのグラジエントは
２０〜８０％で行い、アボエクオリンビークを分取した
．このアボエクオリン画分を凍結乾燥してアボエクオリ
ンを調整し、−２０℃で保存したものを使用した．２時
間反応させた後、遠心分離を行ｔ４い、担体と上澄に分
けた．次ぎに、過剰の活性基を除去するためにＯ．ＳＭ
ＮａＣｌ／０．２Ｍグリシンと担体を４℃で１６時間
反応させた後、遠心分離をして上澄を除去した．この後
、遊離のアポエクオリンを除去するために、０．５Ｍ
ＮａＣｌ／０．ＩＭ酢１１Ｉｉ！（ｐＨ４．０） ｌ！
街液と０．５Ｍ ＮａＣ１／０．ＩＭ ＮａＨＣＯｓ（
９１｛８．３）ｕｆｆｉ液で交互に４回担体を洗浄した
．以上の操作によりアミノ基修飾担体に固定化されたア
ポエクオリンが得られた． 実施例２［共有結合法によるエクオリンのチオール基修
飾担体への固定化］ 担体として、チオール基修飾担体を使用した．担体１［
１０Ｂを１．５ｍｊ２エツベンドルフチューブ中で２０
ｍＭ Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ（ｐ１１７．０））！［１液で
１５分間膨潤させた後、遠心分離により余分の２０ｓ＆
ｌ Ｔｒ１ｓ−ＨＣＩ（ＰＩＩ７．Ｏ）緩衝液を除去し
た． ついで、２０ｍＭ Ｔｒ修飾−｝１０１（ｐＨ７．０）
ＡＩｉｉｔ液２０■℃を担体に２０回に分けて加えその
度に２０ｍＭ Ｔｒ修飾−ＩＩｃＩ（ｐ｝１７．０）
１１衝液を遠心分離で除去して担体を洗浄した．次ぎに
、２０ｓＭ Ｔｒ１ｓ−ＨＣＩ （ｐ！｛７．８）１１
衝液で担体を洗浄し、直ちにアポエクオリン１．６３
Ｂを含む２ｈＭ Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．６）ｉＪ
ｌ衝液に担体を移し、２５℃で２時間反応させた． このときに用いたアボエクオリンは、以下の方法により
Ｗ製した．組換えＤＮＡの手法により製造したアポエク
オリン （特開昭６３−１０２，６９５）を、陰イオン
交換クロマトグラフイー法により処理し（特開平１ −
１３２，３９７） 、ざらに逆相ＨＰＬＣにより精製し
た． 逆相ＨＰＬＣは、コスモシルｌＯｃ４−３０（１ （
ＩＯＸ Ｌ５ＧａｍｌＯカラムに、溶媒系として水／ア
セトニトリル（共に ０．１％トリフルオロ酢酸を含む
）系を用い、アセトニトリルのグラジエントは２０〜８
０％で行い、アボエクオリンピークを分取した．このア
ポエクオリン画分を凍結乾燥してアポエクオリンを調整
し、−２０℃で保存したものを使用した．２時間反応さ
せた後、遠心分離を行ない、担体と上澄に分けた．次ぎ
Ｃ１過剰の活性基を除去するために２−メルカブトエタ
ノール１μ℃を含む０．５Ｍ ＮａＣＩ／０．ＩＭ酢酸
（ｐ｝１４．０） １ｉ街液１００μ１と担体を２５℃
で３０分間反応させた後、遠心分離をして上澄を除去し
た．この後、遊離のアポエクオリンを除去するために、
２０ｍＭ Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．ｏ）ｌＪ［街液
で担体を洗浄した．以上の操作によりチオール基修飾担
体に固定されたアボエクオリンが得られた． 実施例３［アボエクオリンのアくノ基修飾担体及びチオ
ール基修飾担体への結合量の測定］実施例１及び２で得
られた上澄につき、エクオリン活性を測定し、これ．よ
り各担体への結合量を求めた．反応液１００μｆ中に２
０１丁ｒｌｓ−Ｉｔ：１（ｐ｝１７．６），１０ｍＭ
ＥＤＴＡ １ｉ街液、２μｇ ／ａｌｌセレンテラジン
５μ角、２−メルカプトエタノール１μｌ１上澄を含む
． ４℃に２時間放置したのち、反応液の一部をルミフォト
メーター（ＴＤ−４０００，ラボサイエンス社）のキエ
ベット（外径１０Ｘ ６５ｍｍ）中に移し、３０−ＭＣ
ａＣｌ２／３０ｍＭ Ｔｒ修飾−ＨＣＩ（ｐＨ７．６）
をｔｏｏ／Ｊｕｌ注入し、その発光量を測定した． また、２−メルカブトエタノールを含む２ｈＭＴｒｌｓ
−ＨＣＩ （ｐ｝１７．８） ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ
ｉ１衝液中で、固定化されたエクオリンの脱離が起こる
か否かを調べるために、２０＠Ｍ Ｔｒ修飾−ＨＣＩ（
ｐＨ７．８），１０ｍＭ ＥＤＴＡｉｌｍ液、２μｇ／
一ｋセレンテラジン５μｌ、２−メルカブトエタノール
１μｌを含む反応液１００μｌを、実施例１および２で
得られたアポエクオリン固定化担体の１部に加え、４℃
で２時間放置した後、遠心分離を行い上澄の１部を分取
してそのエクオリン活性を調べた． その結果から、各担体に対する結合量を求め、さらに全
アポエクオリン中での固定化アポエクオリンの割合を求
めたものが前述の第１表である．結合量及び結合した割
合共に、アミノ基修飾によって固定化されたものの方が
高かった．実施例４［アミノ基修飾担体及びチオール基
修飾担体による発光の散乱の影響の測定］ 担体に固定化されたアポエクオリンの相対活性を測定す
る際に、担体による発光の散乱等により、測定値が実際
の発光量よりも低い値として測定される．そこで、担体
による発光の散乱等の影響を見るために以下の測定を行
なった．実施例１及び２で使用した担体と同一かつ同量
の担体を実施例１′Ｅｔ．び２と同様の方法で膨潤、洗
浄、残留活性基の除去及びａｍアポエクオリンの除去を
行った．次に、 ２０ｍＭ Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ （ｐｌ
ｌ７．Ｂ） ．１０ｍＭ ＥＤＴＡ ＩＩ街液、２μｇ
／ＩＩＪＺセレンテラジン５μフ、２−メルカブトエタ
ノール１μ角、アポエクオリン５０μｇを含む反応液１
００μＡを４℃で２時間放置したのち、これを上記の担
体と素早く混合し、混合直後のエクオリン活性を測定し
た．この操作に於て、担体と反応液の混合からエクオリ
ン活性測定までに要する時間（約ｉｏ秒）では、エクオ
リンの結合及び吸着は殆ど起こっていないことも確認済
みであるので、この測定の結果から、結合及び吸着をし
ていないエクオリンの発光が各相体によりどの程度、散
乱等によって低い値として測定されるかが求められた．
この結果を示したのが前述の第２表である． 実施例５［ア主ノ基修飾担体及びチオール基修飾担体に
固定化されたエクオリンの相対活性測定］２０ｍＶ Ｔ
ｒｌｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．６），ｔｏｍＭ ＥＤＴＡｉ
ｌ衝液、２μｇ ／ｓｊ！セレンテラジン５μ１、２−
メルカプトエタノール１μ１を含む反応液１００μｌを
、実施例１および２で得られたアボエクオリン固定化担
体の１部に加え、４℃で２時間放置した後、そのエクオ
リン活性を調べた． この結果と、先の実施例３で得られた各相体に対する結
合量と実施例４で得られた各担体による散乱等の影響の
結果から、固定化エクオリンの相対活性を求めた．この
結果を第３表（前述）に示す． 両方の担体で、固定化後もエクオリン活性を保持してい
ることが確認されたが、アミノ基を修飾した場合よりも
チオール基を修飾した場合の方が相対活性が高く、チオ
ール基修飾担体を用いた方が固定化には有利であると考
えられた．実施例６［共有結合法によるポリエチレング
リコール修飾アポエクオリンの作製］ ０．８５％ＮａＣｌを含む５０ｉＭ ＫＨｚＰ０４（Ｉ
ＩＨ７．２）綴Ｉ液８ｓｉｔにアポエクオリンを溶解し
た後、このうちの６ ■ｌを分取し、これにメトキシポ
リエチレングリコールーＮ−サクシニ主ヂルサクシネー
ト１５０ｍｊｌを加え、室温で攪伴しながら反応させる
．反応開始後５、ｌＯ、２Ｇ， ３０、６０、１２Ｇ、
１８０分後に５００μＡずつ分取し、０．８５％ＮａＣ
１を含む５０ｍＭ ＫＨ＊Ｐ０４１１ｉ街液９．５ｍＩ
Ｌに加えて反応を止める．以上の操作によりポリエチレ
ングリコールに修飾されたアポエクオリンが得られた．
（第４図参照）．実施例７［ポリエチレングリコール修
飾アポエクオリンの修飾率の決定］ ポリエチレングリコール修飾アポエクオリン及び非修飾
アボエクオリン（ｌＯ〜２００μｇ ／Ｉｌｉｌ ）
（Ｄ５０μｓ／ｍｉ溶液２５ｍＡに４％ＮａＨＣＯ３．
０．２５ｍｊ！ ， ０．１％トリニトロベンゼンス
ルホン酸０．２５一ｌを加え、２時間４０℃で攪伴した
． 次に、１０％ドデシル硫酸ナトリウム０．２５ｍｊｌ
，Ｉ Ｎ ＩＣＩ Ｏ．１２！＋ｓＪ２を加え、３３Ｓ
ｎａでの吸光度を測定した． 非修飾アポエクオリンの吸光度から検量線を作成し、こ
の検量線とポリエチレングリコール修飾アボエクオリン
の吸光度より該蛋白質の脩飾率を求めた． 実施例８［ポリエチレングリコール修飾エクオリンの相
対活性の測定］ 実施例６で得られたポリエチレングリコール修飾アポエ
クオリン及び非修飾アポエクオリンのエクオリン活性を
測定し、これよりポリエチレングリコール修飾エクオリ
ンの非修飾エクオリンに蛋白ｘ＆：対する相対活性を求
めた．反応液１００μＡ中に２０ｍＭ Ｔｒｌｓ−ＨＣ
Ｉ（ｐＨ７．６）．ｌＯｓＭ ＥＤＴＡｉＩ街液、２μ
ｇ ／ｔｓｌｔセレンテラジン５μＡ１２−メルカプト
エタノール１μＡ１ポリエチレングリコール修飾アボエ
クオリンあるいは非修飾アポエクオリンを含む． ４℃に２時間放置したのち、反応液の一部をルミフ才ト
メーター（ ＴＤ−４０００，ラボサイエンス社）のキ
ュベット中に移し、 ３０ｍｉＪ ＣａＣｌ２／３０ｍ
Ｍ Ｔｒｌｓ−１１ＣＩ（１１１１７．６）を１００μ
２注入し、その発光量を測定した． この結果より求めたポリエチレングリコール修飾エクオ
リンの相対活性及び先の実施例７で求めた該蛋白質の修
飾率を示したものが第４表（前述）である．修飾率の増
加にともない相対活性が減少しているものの明らかにエ
クオリン活性は有していた． 以上の実施各例の結果を総合すると、化学修飾ざれたア
ポエクオリンはエクオリン活性を有し、アポエクオリン
の化学修１！Ｉ＆：於いては、チオール基による修飾が
有利であると考えられた．また、エクオリン活性は、エ
クオリン活性を有する蛋白質と該蛋白質の基質となり得
る発光体が複合体を形成することによって初めて示され
るが、本発明の実施例により、エクオリン活性を有する
蛋白質と該蛋白質の基質となり得る発光体の複合体が固
定化され、かつエクオリン活性を有することは、明らか
である． 以上、本発明により化学修飾されたエクオリン活性を有
する蛋白賞、および該蛋白質と該蛋白質の基質となり得
る発光体との複合体とその調製法が提供された．
性を有する蛋白質、該蛋白質と該蛋白質の基質となり得
る発光体との複合体およびそれらの調製法に間する． ［従来の技術とその問題点］ エクオリンは、米国ワシントン州フライデーハーパー島
近郊に生息する発光クラゲより分離されたカルシウム受
容発光蛋白質である．エクオリンは１分子に２分子（あ
るいは３分子）のＣａ”イオンが結合することによりエ
クオリン分子中に含まれる活性化状態にあるセレンテラ
ジンが酸化され、光とＣＯ，を放出する．この発光には
、Ｃａ”イオンが不可欠なことより、エクオリンを用い
てＣａ”を特異的に定量検出することが可能である，
Ｃａ”イオンの検出限界は１Ｇ−”Ｍ程度であり、非常
に感度が良いことが特徴である．しかしながら、エクオ
リンの天然からの分離は発光クラゲ１０トンから２００
園ｇ程度にすぎず、生産量は十分でなく、一定の供給が
保証されていない． 本発明者は組換えＤＮＡの手法を用いて、発光クラゲよ
りアポエクオリンのｃＤＮ＾をクローニングし、その１
次構造を決定した （特開昭６１−１３５．５８１ｉ）
，次いで、このｃＤＮ＾を用いて大腸菌を宿主とし、
その菌体内及び菌体外でのアボエクオリンの生産に戒功
した （特開昭６２−１９６．０３１１．さらに陰イオ
ン交換クロマトグラフイー法によるアポエクオリンの精
製法も確立した く特開平１ −１３２，３９７）．ま
た機能遺伝子と結合したエクオリン遺伝子を作成し、そ
の融合蛋白質の生産に戒功した（特開昭８４−２６１
，９４２、特願昭６３−３０８，４２４）．さらに、酵
素免疫測定法に利用すべく、その融合蛋白質の高純度精
製標品の調製法を確立し（特願平１−６９，８６２）、
この特異的結合能を有する蛋白質との融合蛋白質を用い
た免疫測定法も確立した（特願平１ −７４，７４２）
， 診断薬等への応用は、当業者に周知である．更なる有用
性にはエクオリンの化学修飾や固定化が不可欠である．
化学修飾が可能になれば、エクオリンを安定化させたり
、両親媒性の物質で修飾することによってエクオリンを
両親媒性にしたり、或は酵素や抗体などの機能分子と結
合させることでＭ素免疫測定法などへの応用が可能とな
る．また、固定化が可能となれば、上述のような特異的
な活性を保持したまま、しかも水に不溶性のエクオリン
、即ち、固定化エクオリンを作ることができ、更に反応
終了液中よりエクオリンのみを変性させずに回収し、こ
れを再利用することが可能となる．そうなれば、バイオ
センサー等への利用も可能となると予測できる． 本発明者らは上述の技術的事情にかんがみ、研究の結果
、エクオリンを共有結合により化学修飾することができ
た．以上の説明から明らかなように、本発明の目的は化
学修飾されたエクオリン活性を有する蛋白質および該蛋
白質と該蛋白質の基質となり得る発光体との複合体の調
製に関する方法、及び化学修飾されたエクオリン活性を
有する蛋白質および該蛋白質と該蛋白質の基質となり得
る発光体との複合体を提供することである．［問題を解
決するための手段］ 本発明は、下記（１）〜（３）の構成を有する．（１）
エクオリン活性を有する蛋白質に有機質を共有結合させ
ることを特徴とする化学修飾されたエクオリン活性を有
する蛋白質の調製法．（２）前記第 （！）項に記載の
Ｉ１製法により調製されてなる化学修飾されたエクオリ
ン活性を有する蛋白質． （３）前記！ （２１項に記載の蛋白質と該蛋白質の
基質となり得る発光体とを結合させて得られる該蛋白質
と該発光体との複合体． 本発明の構成につき以下に詳述する． ここでエクオリン活性を有する蛋白質とは、＼ アポエクオリン蛋白質の他、種々の機能蛋白質とアポエ
クオリンとの融合蛋白質や種々の物質により修飾を受け
た修飾アポエクオリン等の蛋白質であってエクオリン活
性を有するものを言う．本発明は、エクオリン活性を有
する共有結合により化学修飾されたエクオリン及びその
調製法によるもので、例えば後述の実施例に示す方法で
行１１うことができる． 本発明を添付図及び表によって説明すると、第ｌ図は化
学修飾法によりアミノ基修飾担体に固定化されたエクオ
リン活性を有する蛋白質調製工程図（フローシ一ト）を
示す． 先ず、アガロース系担体をｔ ｍＭ ＨＣＩで膨潤、洗
浄する．更に、カップリングＩＸ ｍ液すなわち０．５
Ｍ ＮａＣｌ／０．ＩＭ Ｎａｌ−ＩＣＯｓ（ｐＨ ８
．３）緩衝液で担体を洗浄し、直ちにアポエクオリンを
０．５Ｍ ＮａＣＩ／０．ＩＭＮａｌｌＣＯｓ（ｐＨ
ａ．３） Ｈｉｍ液に溶解させたアポエクオリン溶液に
、該膨潤・洗浄した担体を混合して、担体にアポエクオ
リンを共有結合により固定化する． 遠心分離により担体からアポエクオリン溶液を分別した
後、０．５Ｍ ＮａＣＩ／０．２Ｍブロッキング＆ｉ街
液すなわち、グリシン緩衝液で担体上の過剰の活性基を
除去する．遠心分離により上澄を除去した後、Ｏ．ＳＭ
ＮａＣｌ／０．ＩＭ 酢酸（ｐｌ＋ ４．０）１ｉ
街液と上述のカップリング緩衝液すなわち０．５Ｍ Ｎ
ａｆ：１／０．ＩＭＮａ｝ＩｃＯｓ （ｐＨ ８！）綴
街液で交互に担体を洗浄して、遊離のアポエクオリンを
除去する．本操作により遊離のアポエクオリンは９９％
以上除去され、化学修飾によりアガロース系担体に固定
化されたアボエクオリンがｍ製される． 第２図は、化学修飾法によりチオール基修飾アガロース
系担体に固定化されたエクオリン活性を有する蛋白Ｘ調
製工程図（フローシ一ト）を示す．担体を膨潤紐衝液す
なわち２０ｍＭ Ｔｒｌｓ−｝ＩＣＩ（ｐＨ７．０ｌｉ
ｌ街液で膨潤、洗浄する．更に、カップリング級衝液す
なわち２０ｓＭ Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ（ｐｌｌ７．８ｌｉ
ｉｉ液で担体を洗浄し、直ちじアボエクオリンを２０ａ
ＭＴｒｌｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）１１２１７液に溶解
させたものに、膨潤・洗浄した担体を混合して、担体に
アポエクオリンを共有結合により固定化する． 遠心分１ｅより担体からアポエクオリン溶液を分別した
後、０．１％２−メルカブトエタノール／０．５Ｎ Ｎ
ａＣｌ／０．ＩＭ酢酸（ｐｕ４．０） １！ｉ街液で担
体上の過剰の活性基を除去する．遠心分離により上澄を
除去した後、２０ｍＭ Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７．
０）Ｌｌ街液で担体を洗浄して、遊離のアポエクオリン
を除去する．本操作によって、チオール基修飾によりア
ガロース系担体に固定化されたアポエクオリンが調製さ
れる． 第３図は、上記第１．２図の説明に係る操作により化学
修飾法によって固定化されたアボエクオリンを示す．同
図（Ａ）は、アミノ基修飾担体に共有結合により固定化
されたアポエクオリンである．アボエクオリンのりジン
残基の側鎮のアミノ基がアミノ基修飾担体と反応してイ
ソウレア結合を形成して固定化される． 同図（８）は、チオール基修飾担体に共有結合により固
定化されたアボエクオリンである．アボエクオリンのシ
ステイン残基の側鎖のチオール基がチオール基修飾担体
の活性チオール基とチオールジスルフィド交換反応し、
混合ジスルフィドを形成して固定化される． 第４図は、ポリエチレングリコールにより化学修飾され
たエクオリン活性を有する蛋白質調製工程図（フローシ
ート）を示す， ０．８５％ＮａＣ１を含む５０ｍＭ
ＫＨｔＰＯ４（ＰＨ７．２＞Ｍ街液８ ａｌｌにアボ
エクオリンを溶解した後、このうちの６ ｓＪ２を分
取し、これにポリエチレングリコール１５Ｇ一℃を加え
、室温で攪拌しながら反応させる．反応開始後５、１０
，２０、３０、６０、１２０、１１１０分後に５００μ
４２ずっ分取し、０．８５Ｎａ（；Ｉを含む５ｈＭ Ｋ
Ｈ２Ｐ０４ＭＩＮ液９．５１ＩＩＬに加えて反応を止め
る．以上の操作によりポリエチレングリコールに化学修
飾されたアポエクオリンが得られる． 第５図は、上記操作により化学修飾されたアポエクオリ
ンを示す．アポエクオリンのアよノ基とアミノ基修飾ポ
リエチレングリコールのカルポキシル基とが酸アよド結
合を形成して、アポエクオリンがポリエチレングリコー
ルによって修飾される． 第 １ 表 第１表は、前記第１図及び第２図の調製工程により固定
化されたアボエクオリンの両相体に対する結合量を示し
たものである．結合量は、遊離のアポエクオリンの量よ
り求めている．結合量・結合した割合共にアミノ基を介
して固定化されたものの方が高かった． 第２表 第２表は、アミノ基修飾担体及びチオール基修飾担体両
担体に起因する散乱等でどの程度、発光の強度が減少す
るかを表わしたものである．光子減少率の測定は、後述
の実施例４に例示されているように、例えば、固定化に
要した担体と同量の担体を膨潤、洗浄した後、アボエク
オリンをセレンテラジンおよび２−メルカブトエタノー
ル共存下で、４℃、２時間処理したものを、、膨潤、洗
浄した担体と混合し、結合していないエクオリンの発光
を測定することで求めた． 第 ３ 表 第３表は、担体に固定化されていないエクオリンの活性
に対してのアミノ基修飾担体及びチオ−ル基修飾担体に
固定化されたエクオリンの相対活性を現わしている．こ
の値は、担体に固定化されたエクオリンの発光を測定し
、前記第２表の光子の減少率から実際の発光量を求めた
ものである．その結果、相対活性はアミノ基を修飾した
場合よりもチオール基を修飾した場合の方が高く、化学
修飾による固定化にはチオール基を用いたナが有利であ
ると考えられる． 第４表 第４表は、ボリエチレングリコール修飾エクオリンの相
対活性および該蛋白質の修飾率を示したものである．修
Ｍ率の増加Ｃともない相対活性が減少した．相対活性が
低いもののポリエチレングリコール修飾エクオリンはエ
クオリン活性を有していた． ［発明の効果］ 本発明の方法によれば、担体に固定化あるいは化学修飾
をすることが出来る．化学修飾が可能になれば、エクオ
リンを安定化させたり、両親媒性の物質で修飾すること
によってエクオリンを両親媒性にしたり、或は酵素や抗
体などの機能分子と結合させることで酵素免疫測定法な
どへの応用が可能となる．また、固定化することによっ
て水に不溶性となり、使用後の蛋白質を回収・再利用す
ることも可能となる． 検出感度の良さから、化学修飾することによりバイオセ
ンサーや免疫検定法等の各種測定検出法への応用も期待
でき、その利用範囲は極めて広い． 本発明の化学修飾や固定化したエクオリン活性を有する
蛋白質の有用性は、当業者に自明であり、上記の開示に
より、当業者は特許請求された本発明を実施できる．し
かし、この発明の理解を増すために、本発明に１！要な
化学修飾エリクオリンの調製法に使われる手順を以下に
明らかにする． ［実施例］ 実施例１［共有結合法によるエクオリンのアミノ基修飾
担体への固定化］ 担体として、アミノ基修飾担体を使用した．担体１０Ｑ
ｍｇをｌ．ｓ＋ｉｊｌエツベンドルフチェーブ中で１
ｍＭ ＨＣＩで１５分間膨潤させた後、遠心分頗により
余分の１ ｍＭ ＩＩＣＩを除去した．ついで、１ ａ
Ｍ ＨＣＩ２０ｍｊＺを担体に２０回に分けて加えその
度に１１１１０Ｉを遠心分離で除去して担体を洗浄した
．次ぎに、０．５Ｍ ＮａＣＩ／０．ＩＭ ＮａＨＣＯ
ｓ（Ｇｌ｝１８．３）１１衝液で担体を洗浄し、直ちに
アボエクオリン３．０９ｍｇを含む０．ＳＭ ＮａＣ１
／０．ＩＭ ＮａＨＣＯｓ（ＰＨＩＩ．３）｝３１衝液
に担体を移し、２５℃で２時間反応させた． このときは用いたアボエクオゾンは、以下の方法により
調製した．組換えＤＮＡの手法により製造したアボエク
オリン （特開昭８３−１０２．８９５）を、陰イオン
交換クロマトグラフィー法により処理し（特開平１ −
１３２，３９７） 、さらに逆相｝ＩＰＬｃにより精製
した． 逆相ＩＩ Ｐ Ｌ Ｃは、コスモシル１０Ｃ４−３００
（ ＩＯＸ １５０ｍ＋＊）のカラムに、溶媒系とし
て水／アセトニトリル（共に ０．１％トリフルオロ酢
酸を含む）系を用い、アセトニトリルのグラジエントは
２０〜８０％で行い、アボエクオリンビークを分取した
．このアボエクオリン画分を凍結乾燥してアボエクオリ
ンを調整し、−２０℃で保存したものを使用した．２時
間反応させた後、遠心分離を行ｔ４い、担体と上澄に分
けた．次ぎに、過剰の活性基を除去するためにＯ．ＳＭ
ＮａＣｌ／０．２Ｍグリシンと担体を４℃で１６時間
反応させた後、遠心分離をして上澄を除去した．この後
、遊離のアポエクオリンを除去するために、０．５Ｍ
ＮａＣｌ／０．ＩＭ酢１１Ｉｉ！（ｐＨ４．０） ｌ！
街液と０．５Ｍ ＮａＣ１／０．ＩＭ ＮａＨＣＯｓ（
９１｛８．３）ｕｆｆｉ液で交互に４回担体を洗浄した
．以上の操作によりアミノ基修飾担体に固定化されたア
ポエクオリンが得られた． 実施例２［共有結合法によるエクオリンのチオール基修
飾担体への固定化］ 担体として、チオール基修飾担体を使用した．担体１［
１０Ｂを１．５ｍｊ２エツベンドルフチューブ中で２０
ｍＭ Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ（ｐ１１７．０））！［１液で
１５分間膨潤させた後、遠心分離により余分の２０ｓ＆
ｌ Ｔｒ１ｓ−ＨＣＩ（ＰＩＩ７．Ｏ）緩衝液を除去し
た． ついで、２０ｍＭ Ｔｒ修飾−｝１０１（ｐＨ７．０）
ＡＩｉｉｔ液２０■℃を担体に２０回に分けて加えその
度に２０ｍＭ Ｔｒ修飾−ＩＩｃＩ（ｐ｝１７．０）
１１衝液を遠心分離で除去して担体を洗浄した．次ぎに
、２０ｓＭ Ｔｒ１ｓ−ＨＣＩ （ｐ！｛７．８）１１
衝液で担体を洗浄し、直ちにアポエクオリン１．６３
Ｂを含む２ｈＭ Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．６）ｉＪ
ｌ衝液に担体を移し、２５℃で２時間反応させた． このときに用いたアボエクオリンは、以下の方法により
Ｗ製した．組換えＤＮＡの手法により製造したアポエク
オリン （特開昭６３−１０２，６９５）を、陰イオン
交換クロマトグラフイー法により処理し（特開平１ −
１３２，３９７） 、ざらに逆相ＨＰＬＣにより精製し
た． 逆相ＨＰＬＣは、コスモシルｌＯｃ４−３０（１ （
ＩＯＸ Ｌ５ＧａｍｌＯカラムに、溶媒系として水／ア
セトニトリル（共に ０．１％トリフルオロ酢酸を含む
）系を用い、アセトニトリルのグラジエントは２０〜８
０％で行い、アボエクオリンピークを分取した．このア
ポエクオリン画分を凍結乾燥してアポエクオリンを調整
し、−２０℃で保存したものを使用した．２時間反応さ
せた後、遠心分離を行ない、担体と上澄に分けた．次ぎ
Ｃ１過剰の活性基を除去するために２−メルカブトエタ
ノール１μ℃を含む０．５Ｍ ＮａＣＩ／０．ＩＭ酢酸
（ｐ｝１４．０） １ｉ街液１００μ１と担体を２５℃
で３０分間反応させた後、遠心分離をして上澄を除去し
た．この後、遊離のアポエクオリンを除去するために、
２０ｍＭ Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．ｏ）ｌＪ［街液
で担体を洗浄した．以上の操作によりチオール基修飾担
体に固定されたアボエクオリンが得られた． 実施例３［アボエクオリンのアくノ基修飾担体及びチオ
ール基修飾担体への結合量の測定］実施例１及び２で得
られた上澄につき、エクオリン活性を測定し、これ．よ
り各担体への結合量を求めた．反応液１００μｆ中に２
０１丁ｒｌｓ−Ｉｔ：１（ｐ｝１７．６），１０ｍＭ
ＥＤＴＡ １ｉ街液、２μｇ ／ａｌｌセレンテラジン
５μ角、２−メルカプトエタノール１μｌ１上澄を含む
． ４℃に２時間放置したのち、反応液の一部をルミフォト
メーター（ＴＤ−４０００，ラボサイエンス社）のキエ
ベット（外径１０Ｘ ６５ｍｍ）中に移し、３０−ＭＣ
ａＣｌ２／３０ｍＭ Ｔｒ修飾−ＨＣＩ（ｐＨ７．６）
をｔｏｏ／Ｊｕｌ注入し、その発光量を測定した． また、２−メルカブトエタノールを含む２ｈＭＴｒｌｓ
−ＨＣＩ （ｐ｝１７．８） ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ
ｉ１衝液中で、固定化されたエクオリンの脱離が起こる
か否かを調べるために、２０＠Ｍ Ｔｒ修飾−ＨＣＩ（
ｐＨ７．８），１０ｍＭ ＥＤＴＡｉｌｍ液、２μｇ／
一ｋセレンテラジン５μｌ、２−メルカブトエタノール
１μｌを含む反応液１００μｌを、実施例１および２で
得られたアポエクオリン固定化担体の１部に加え、４℃
で２時間放置した後、遠心分離を行い上澄の１部を分取
してそのエクオリン活性を調べた． その結果から、各担体に対する結合量を求め、さらに全
アポエクオリン中での固定化アポエクオリンの割合を求
めたものが前述の第１表である．結合量及び結合した割
合共に、アミノ基修飾によって固定化されたものの方が
高かった．実施例４［アミノ基修飾担体及びチオール基
修飾担体による発光の散乱の影響の測定］ 担体に固定化されたアポエクオリンの相対活性を測定す
る際に、担体による発光の散乱等により、測定値が実際
の発光量よりも低い値として測定される．そこで、担体
による発光の散乱等の影響を見るために以下の測定を行
なった．実施例１及び２で使用した担体と同一かつ同量
の担体を実施例１′Ｅｔ．び２と同様の方法で膨潤、洗
浄、残留活性基の除去及びａｍアポエクオリンの除去を
行った．次に、 ２０ｍＭ Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ （ｐｌ
ｌ７．Ｂ） ．１０ｍＭ ＥＤＴＡ ＩＩ街液、２μｇ
／ＩＩＪＺセレンテラジン５μフ、２−メルカブトエタ
ノール１μ角、アポエクオリン５０μｇを含む反応液１
００μＡを４℃で２時間放置したのち、これを上記の担
体と素早く混合し、混合直後のエクオリン活性を測定し
た．この操作に於て、担体と反応液の混合からエクオリ
ン活性測定までに要する時間（約ｉｏ秒）では、エクオ
リンの結合及び吸着は殆ど起こっていないことも確認済
みであるので、この測定の結果から、結合及び吸着をし
ていないエクオリンの発光が各相体によりどの程度、散
乱等によって低い値として測定されるかが求められた．
この結果を示したのが前述の第２表である． 実施例５［ア主ノ基修飾担体及びチオール基修飾担体に
固定化されたエクオリンの相対活性測定］２０ｍＶ Ｔ
ｒｌｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．６），ｔｏｍＭ ＥＤＴＡｉ
ｌ衝液、２μｇ ／ｓｊ！セレンテラジン５μ１、２−
メルカプトエタノール１μ１を含む反応液１００μｌを
、実施例１および２で得られたアボエクオリン固定化担
体の１部に加え、４℃で２時間放置した後、そのエクオ
リン活性を調べた． この結果と、先の実施例３で得られた各相体に対する結
合量と実施例４で得られた各担体による散乱等の影響の
結果から、固定化エクオリンの相対活性を求めた．この
結果を第３表（前述）に示す． 両方の担体で、固定化後もエクオリン活性を保持してい
ることが確認されたが、アミノ基を修飾した場合よりも
チオール基を修飾した場合の方が相対活性が高く、チオ
ール基修飾担体を用いた方が固定化には有利であると考
えられた．実施例６［共有結合法によるポリエチレング
リコール修飾アポエクオリンの作製］ ０．８５％ＮａＣｌを含む５０ｉＭ ＫＨｚＰ０４（Ｉ
ＩＨ７．２）綴Ｉ液８ｓｉｔにアポエクオリンを溶解し
た後、このうちの６ ■ｌを分取し、これにメトキシポ
リエチレングリコールーＮ−サクシニ主ヂルサクシネー
ト１５０ｍｊｌを加え、室温で攪伴しながら反応させる
．反応開始後５、ｌＯ、２Ｇ， ３０、６０、１２Ｇ、
１８０分後に５００μＡずつ分取し、０．８５％ＮａＣ
１を含む５０ｍＭ ＫＨ＊Ｐ０４１１ｉ街液９．５ｍＩ
Ｌに加えて反応を止める．以上の操作によりポリエチレ
ングリコールに修飾されたアポエクオリンが得られた．
（第４図参照）．実施例７［ポリエチレングリコール修
飾アポエクオリンの修飾率の決定］ ポリエチレングリコール修飾アポエクオリン及び非修飾
アボエクオリン（ｌＯ〜２００μｇ ／Ｉｌｉｌ ）
（Ｄ５０μｓ／ｍｉ溶液２５ｍＡに４％ＮａＨＣＯ３．
０．２５ｍｊ！ ， ０．１％トリニトロベンゼンス
ルホン酸０．２５一ｌを加え、２時間４０℃で攪伴した
． 次に、１０％ドデシル硫酸ナトリウム０．２５ｍｊｌ
，Ｉ Ｎ ＩＣＩ Ｏ．１２！＋ｓＪ２を加え、３３Ｓ
ｎａでの吸光度を測定した． 非修飾アポエクオリンの吸光度から検量線を作成し、こ
の検量線とポリエチレングリコール修飾アボエクオリン
の吸光度より該蛋白質の脩飾率を求めた． 実施例８［ポリエチレングリコール修飾エクオリンの相
対活性の測定］ 実施例６で得られたポリエチレングリコール修飾アポエ
クオリン及び非修飾アポエクオリンのエクオリン活性を
測定し、これよりポリエチレングリコール修飾エクオリ
ンの非修飾エクオリンに蛋白ｘ＆：対する相対活性を求
めた．反応液１００μＡ中に２０ｍＭ Ｔｒｌｓ−ＨＣ
Ｉ（ｐＨ７．６）．ｌＯｓＭ ＥＤＴＡｉＩ街液、２μ
ｇ ／ｔｓｌｔセレンテラジン５μＡ１２−メルカプト
エタノール１μＡ１ポリエチレングリコール修飾アボエ
クオリンあるいは非修飾アポエクオリンを含む． ４℃に２時間放置したのち、反応液の一部をルミフ才ト
メーター（ ＴＤ−４０００，ラボサイエンス社）のキ
ュベット中に移し、 ３０ｍｉＪ ＣａＣｌ２／３０ｍ
Ｍ Ｔｒｌｓ−１１ＣＩ（１１１１７．６）を１００μ
２注入し、その発光量を測定した． この結果より求めたポリエチレングリコール修飾エクオ
リンの相対活性及び先の実施例７で求めた該蛋白質の修
飾率を示したものが第４表（前述）である．修飾率の増
加にともない相対活性が減少しているものの明らかにエ
クオリン活性は有していた． 以上の実施各例の結果を総合すると、化学修飾ざれたア
ポエクオリンはエクオリン活性を有し、アポエクオリン
の化学修１！Ｉ＆：於いては、チオール基による修飾が
有利であると考えられた．また、エクオリン活性は、エ
クオリン活性を有する蛋白質と該蛋白質の基質となり得
る発光体が複合体を形成することによって初めて示され
るが、本発明の実施例により、エクオリン活性を有する
蛋白質と該蛋白質の基質となり得る発光体の複合体が固
定化され、かつエクオリン活性を有することは、明らか
である． 以上、本発明により化学修飾されたエクオリン活性を有
する蛋白賞、および該蛋白質と該蛋白質の基質となり得
る発光体との複合体とその調製法が提供された．
第１図は、本発明の実施例（係るエクオリン活性を有す
るアミノ基修飾担体（固定化されたアポエクオリンの調
製法を示す工程図（フローシ一ト）である． 第２図は、本発明ｋ係るエクオリン活性を有するチオー
ル基修Ｉ！Ｉ担体に固定化されたアポエクオリンの調製
法を示す工程図（フローシ一ト）である． ′Ｍ３図は、共有結合法Ｃより高分子の担体に固定化さ
れたアポエクオリンを模式的Ｃ示したものである．同図
（Ａ）は、アミノ基修飾担体と７ボエクオリンとの結合
を表わしている．アポエクオリンのりジン残基の側鎖の
アミノ基がアミノ基修飾担体と反応してイソウレア結合
を形成して固定化される．同図（Ｂ）は、チオール基修
飾担体とアポエクオリンとの結合を表わしている．アポ
エクオリンのシスティン残基の側鎖のチオール基がチオ
ール基修飾担体の活性チオール基とチオールージスルフ
ィド交換反応し、混合ジスルフィドを形威して固定化さ
れる． 第４図は、本発明の実施例に係るエクオリン活性を有す
るポリエチレングリコールに修飾されたアボエクオリン
の調製法を示す工程図（フローシ一ト）である． 第５図は、ポリエチレングリコールにより化学修飾され
たアボエクオリンを示す．アボエクオリンのアミノ基と
アよノ基修飾ポリエチレングリコールのカルポキシル基
とが酸アミド結合を形成して、アポエクオリンがボリエ
チレングリコールによって修飾される． 以上
るアミノ基修飾担体（固定化されたアポエクオリンの調
製法を示す工程図（フローシ一ト）である． 第２図は、本発明ｋ係るエクオリン活性を有するチオー
ル基修Ｉ！Ｉ担体に固定化されたアポエクオリンの調製
法を示す工程図（フローシ一ト）である． ′Ｍ３図は、共有結合法Ｃより高分子の担体に固定化さ
れたアポエクオリンを模式的Ｃ示したものである．同図
（Ａ）は、アミノ基修飾担体と７ボエクオリンとの結合
を表わしている．アポエクオリンのりジン残基の側鎖の
アミノ基がアミノ基修飾担体と反応してイソウレア結合
を形成して固定化される．同図（Ｂ）は、チオール基修
飾担体とアポエクオリンとの結合を表わしている．アポ
エクオリンのシスティン残基の側鎖のチオール基がチオ
ール基修飾担体の活性チオール基とチオールージスルフ
ィド交換反応し、混合ジスルフィドを形威して固定化さ
れる． 第４図は、本発明の実施例に係るエクオリン活性を有す
るポリエチレングリコールに修飾されたアボエクオリン
の調製法を示す工程図（フローシ一ト）である． 第５図は、ポリエチレングリコールにより化学修飾され
たアボエクオリンを示す．アボエクオリンのアミノ基と
アよノ基修飾ポリエチレングリコールのカルポキシル基
とが酸アミド結合を形成して、アポエクオリンがボリエ
チレングリコールによって修飾される． 以上
Claims (3)
- （１）エクオリン活性を有する蛋白質に有機質を共有結
合させることを特徴とする化学修飾されたエクオリン活
性を有する蛋白質の調製法。 - （２）特許請求の範囲第（１）項に記載の調製法により
調製されてなる化学修飾されたエクオリン活性を有する
蛋白質。 - （３）特許請求の範囲第（２）項に記載の蛋白質と該蛋
白質の基質となり得る発光体とを結合させて得られる該
蛋白質と該発光体との複合体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30947889A JPH03169897A (ja) | 1989-11-29 | 1989-11-29 | 化学修飾エクオリンとその調製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30947889A JPH03169897A (ja) | 1989-11-29 | 1989-11-29 | 化学修飾エクオリンとその調製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03169897A true JPH03169897A (ja) | 1991-07-23 |
Family
ID=17993468
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30947889A Pending JPH03169897A (ja) | 1989-11-29 | 1989-11-29 | 化学修飾エクオリンとその調製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03169897A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5486455A (en) * | 1993-02-12 | 1996-01-23 | Sealite Sciences, Inc. | Photoprotein conjugates and methods of use thereof |
| US5648218A (en) * | 1993-02-12 | 1997-07-15 | Sealite Sciences, Inc. | Preparation of photoprotein conjugates and methods of use thereof |
-
1989
- 1989-11-29 JP JP30947889A patent/JPH03169897A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5486455A (en) * | 1993-02-12 | 1996-01-23 | Sealite Sciences, Inc. | Photoprotein conjugates and methods of use thereof |
| US5648218A (en) * | 1993-02-12 | 1997-07-15 | Sealite Sciences, Inc. | Preparation of photoprotein conjugates and methods of use thereof |
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