JP2009516163A - 凝集アッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
i.2つ以上の第一結合パートナーが結合しているハブであって、それぞれの第一結合パートナーが分析物の第一エピトープに結合することができるハブと、
ii.第二エピトープに結合している、または結合することができる第二結合パートナーを含む部分であって、検出可能な粒子にも結合している、または結合することができる部分と
を含む。
i)2つ以上の第一結合パートナーが結合しているハブであって、それぞれの第一結合パートナーが、分析物の第一エピトープに結合することができるハブと、
ii)分析物の第二エピトープに結合することができ、検出可能な粒子に結合しているか、検出可能な粒子に結合することができる第二結合パートナーと
を含む。
i.a)2つ以上の第一結合パートナーが結合しているハブであって、それぞれの第一結合パートナーが、分析物の第一エピトープに結合することができるハブと
b)分析物の第二エピトープに結合することができる第二結合パートナーを含む部分であって、凝集性粒子に結合しているか結合することができる部分と、
c)検出可能な粒子と
を、サンプルと接触させるステップと、
ii.上記ハブと、第二結合パートナーを含む部分と、サンプルと、検出可能な粒子とを反応させるステップと、
iii.上記ハブと、コンジュゲートと、凝集性粒子と、分析物との凝集を検出するステップとを含む。
i.2つ以上の第一結合パートナーと結合しているハブであって、それぞれの第一結合パートナーは、分析物の第一エピトープと結合することができるハブ;および、分析物の第二エピトープに結合することができ、検出可能な粒子に結合しているか結合することができる第二結合パートナー;および、サンプル;および/または、任意選択的に、検出可能な粒子を多孔質担体と接触させるステップと、
ii.上記ハブ、第二結合パートナー、サンプル、および任意選択的に上記検出可能な粒子を反応させるステップと、
iii.多孔質担体内の上記ハブと、第二結合パートナーと、分析物との凝集を検出するステップであって、凝集はそのサンプル中の分析物の存在および/または量を示すステップとを含む。
(1)1.6×15cm G25M Sephadexカラムを使用して、0.1Mのリン酸緩衝液(pH7.5)で抗hCG(αサブユニット)を脱塩し、濃度および収率を決定する。
(2)8モル当量のNHS−PEG−MALを使用して、その抗hCG抗体を活性化させる。2時間、20℃でその反応混合物をインキュベートする。100モル当量のグリシンで反応を停止させ、1.6×15cm G50F Sephadexカラムを2回使用して5mMのEDTP、PBS緩衝液(PH7.3)でマレイミド活性化抗hCGを脱塩する。活性化抗体の濃度および収率を決定する。
(3)1000モル当量の2−イミノチオラン(2−IT)を使用して、500kダルトンのアミノデキストランを活性化させる。110分間、20℃でその反応混合物をインキュベートする。G25M Sephadex媒体を使用して、5mMのEDTA、PBS緩衝液(pH7.3)でそのチオール活性化アミノデキストランを脱塩する。Ellmanのアッセイを使用して、チオール:アミノデキストランの配合比率を決定する。
(4)25モル当量のマレイミド活性化抗hCG抗体をチオール活性化アミノデキストランに添加し、16時間、15℃でその反応混合物をインキュベートする。1000当量のN−エチルマレイミドでその反応混合物の反応を停止させる。50mMのPBS緩衝液(pH7.2)を溶離剤として使用して2.6×50cm Superdex 200PGカラムでそのコンジュゲートを精製する。コンジュゲートの濃度および収率を決定し、その後、0.2μmのMinisartフィルターによって濾過する。
(1)1.6×15cm G25M Sephadexカラムを使用して、0.1Mのリン酸緩衝液(pH7.5)で抗hCG(αサブユニット)を脱塩し、濃度および収率を決定する。
(2)8モル当量のNHS−PEG−MALを使用して、その抗hCG抗体を活性化させる。2時間、20℃でその反応混合物をインキュベートする。100モル当量のグリシンで反応を停止させ、1.6×15cm G50F Sephadexカラムを2回使用して5mMのEDTA、PBS緩衝液(PH7.3)でマレイミド活性化抗hCGを脱塩する。活性化抗体の濃度および収率を決定する。
(3)1000モル当量の2−イミノチオラン(2−IT)を使用して、500kダルトンのアミノデキストランを活性化させる。110分間、20℃でその反応混合物をインキュベートする。G25M Sephadex媒質を使用して、5mMのEDTA、PBS 緩衝液(pH7.3)でそのチオール活性化アミノデキストランを脱塩する。Ellmanのアッセイを使用して、チオール:アミノデキストランの配合比率を決定する。
(4)25モル当量のマレイミド活性化抗hCG抗体をチオール活性化アミノデキストランに添加し、16時間、15℃でその反応混合物をインキュベートする。
(5)8モル当量のmPEG−SMB(10kダルトン)を使用して、「PEG」基でそのコンジュゲートをコーティングする。2時間、20℃でその反応混合物をインキュベートする。グリシンおよびN−エチルマレイミドを使用して反応を停止させる。50mMのPBS緩衝液(pH7.2)を溶離剤として使用して2.6×50cm Superdex 200PGカラムでそのコンジュゲートを精製する。コンジュゲートの濃度および収率を決定し、その後、0.2μmのMinisartフィルターによって濾過する。
膜材料を次のとおりのサイズに切断した。
(i)芯、例えば、Surewick G028−14(Millipore)、30mm×60mm。
(ii)凝集物捕捉膜、例えば、Fusion 5(Whatman)、5mm×60mm。
(iii)吸収シンク、例えば、Absorbent Pad 222(Ahlstrom)、55mm×60mm。
(iv)自己粘着性プラスチック(×2)
例えば、D/C親水性PSAを伴う0.04’’透明ポリエステル(G&L)、70mm×100mm。
以下の試薬混合物を、6mm×50mmの寸法の、コンジュゲート放出パッド(例えば、Ahlstrom 8964)のストリップ上にピペットで添加した。
75μL 抗hCGイムノゴールド(B.A.bHCG40、BBI)
50μL 抗hCGハブ試薬(実施例1または2において説明したとおり調製される)
42μL 1MのTris−HCl(pH8.2)、20%トレハロース。
(i)芯(×2)、
例えば、コンジュゲート放出パッド8964(Ahlstrom)、7mm×50mm。
(ii)凝集物捕捉膜、例えば、Fusion 5(Whatman)、5mm×50mm。
(iii)吸収シンク、例えば、Tweenで処理されたGF/D(Whatman)、50mm×50mm。
(iv)自己粘着性プラスチック(×2)、
例えば、D/C親水性PSAを伴う0.04’’透明プラスチック(G&L)、80mm×60mm。
次の試薬混合物を微量遠心管の中で併せ、その後、膜ストリップ(実施例3において説明したとおりに調製される)の芯端部に適用した。
5μL 抗hCGイムノゴールド(B.A.bHCG40、BBI)
5μL 抗hCGハブ試薬(実施例1において説明したとおりに調製される)。
乾燥試薬を含有する膜ストリップを、ハブ試薬1(実施例1参照)を使用して、実施例4において説明したとおり調製した。0〜25IU/mLのhCG(hCG濃度値は、第4のI.S.,NIBSCと対照して割り当てられた)を含有する模擬サンプル(合成尿)にそれぞれのストリップの芯端部を浸漬し、そのストリップを縦向きにして進ませることによって、試験を行った。
イムノゴールドと抗hCGハブの試薬混合物を緩衝液/添加剤と前もって混合し、6mm×50mmの寸法の試薬放出パッド(例えば、Ahlstrom 8964)のストリップ上にピペットで添加した。それらのストリップを、乾燥剤および湿度指示薬が入っている密封容器の中に置き、一晩、28℃で放置して乾燥させた。
(ii)8モル当量の4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(SMCC)を抗グリコホリン抗体に添加し、その反応物を70分間、20℃でインキュベートした。100モル当量のグリシンを使用して反応を停止させ、マレイミド活性化抗グリコホリン抗体を、G25M Sephadex媒体を使用して5mMのEDTA、PBS緩衝液(pH6.5)で脱塩した。
(iii)2.0モル当量のN−スクシンイミジルS−アセチルチオアセテート(SATA)を抗hCG抗体に添加し、その反応混合物を75分間、20℃でインキュベートした。50mMのEDTA、2.5Mのヒドロキシルアミン緩衝液(pH7.0)を使用して、反応を停止させた。そのチオール活性化抗hCG抗体を、G25M Sephadex媒体を使用して5mMのEDTA、PBS緩衝液(pH6.5)で脱塩し、チオール:抗体の配合比率を決定した。
(iv)5モル当量のチオール活性化抗hCG抗体をマレイミド活性化抗グリコホリン抗体に添加し、その混合物を17時間、2〜8℃でインキュベートした。その反応混合物をN−エチルマレイミドで反応停止させ、抗グリコホリン:抗hCGコンジュゲートを、10mMのPBS緩衝液(pH7.2)を溶離剤として使用してSuperdex 200PG媒体で精製した。そのコンジュゲートの濃度を280nmでのUV吸収によって決定した。Proclin 300を1%(w/w)まで添加し、そのコンジュゲートを濾過して0.2μmにした。
(i)混合しながら、2時間、抗hCGα抗体を、20%エタノールを含有する10mMリン酸緩衝液(pH7.4)中で、3μmのポリスチレンラテックスマイクロスフェアに、10×表面結合能力で受動的に吸着させた。
(ii)余剰表面結合部位を1%BSAで1時間、ブロックした。
(iii)マイクロスフェアを7000×gでの10分間の遠心分離によってペレット化し、その後、ラテックス希釈緩衝液(HEPES pH7.4)中で3回洗浄した。
(iv)抗体吸着を、hCG−アルカリホスファターゼコンジュゲートに関連して、アルカリホスファターゼアッセイにより、および抗hCGβラテックスとhCGを混合した、スライド凝集アッセイによって、確認した。
〔実施例10〕
(i)ストレプトアビジンおよびビオチン化抗hCG抗体を、10mMのPBS(pH7.4)/0.1%のBSA中で併せ、2時間、4℃でインキュベートして、複合体を形成させた。
WO200408359に開示されている毛細管装置を、超音波処理により50%エタノール中で浄化し、その後、Tween20の溶液中で洗浄して表面を親水性にすることにより作製した後、試薬を置いた。Tweenで処理した試験装置を、使用する前に、乾燥させ、感圧接着テープを使用して封止した。
ヒト血液(20μL、所望の濃度のhCGでスパイクしたもの)を同量の可溶性「ハブ」複合体(試薬3、実施例3)および5μLの試薬1(0.1mg/mL)と混合した。2〜5分後、その混合物の20μLを顕微鏡用スライドガラスに移し、30秒間、振動/回転させた。反応混合物を100倍の倍率で見て、凝集の程度を評価した。
毛細管装置は、実施例4に従って作製した。
試薬1は、実施例1に従って調製した。
試薬3は、実施例2に従って調製した。
60μL 抗hCGαラテックス3%懸濁液(試薬1)
60μL ヒト全血(hCG含有)
15μL 抗体コンジュゲート(99ng/μL)(試薬3)。
試薬1は、実施例1に従って調製した。
試薬3は、実施例3に従って調製した。
毛細管装置は、感圧接着テープで封止する前に試薬1および3をその装置の試験毛細管トラックに置き、インサイチュで乾燥させたことを除き、実施例4に従って作製した。対照トラックには試薬を置かなかった。その装置は、WO200408359に記載されているように封止し、いつでも使用できる状態で閉じた。
(i)作製した試験装置の毛細管の始点に、20μLのヒト血液(所望の濃度のhCGを混合したもの)を導入した。(流体は、毛細管現象によってトラックの最初の10cmに(それぞれのトラックに約10μL)引き込まれた)。
(ii)2分後、0.5mLのPBSをその装置の流体タンクに導入した。(これにより毛細管の流れを再開させた)。
(iii)PBSの導入から、流体が毛細管トラックの末端に到達するためにかかる時間を記録した。
図5に示すように、2つの別の実験において、毛細管走行時間は、血液サンプル(n=12)中にhCG(5 IU/mL)が存在したとき、平均87(実験1)および141(実験2)秒遅かった。エラーバーは、標準偏差を表す。
Claims (54)
- i.2つ以上の第一結合パートナーが結合しているハブであって、それぞれの前記第一結合パートナーが分析物の第一エピトープに結合することができるハブと、
ii.第二エピトープに結合している、または結合することができる第二結合パートナーを含む部分であって、検出可能な粒子にも結合することができる部分と
を含む、サンプル中の分析物を検出するために凝集アッセイを行うためのキット。 - 第二エピトープに結合することができる前記部分が、検出可能な粒子に結合している、請求項1に記載のキット。
- 第二結合パートナーを含む前記部分が、検出可能な粒子に結合することができる第三結合パートナーをさらに含む、請求項1または2のいずれかに記載のキット。
- 前記部分が、前記第二結合パートナーと前記第三結合パートナーとのコンジュゲートを含む、請求項3に記載のキット。
- 前記分析物の前記第一エピトープと前記第二エピトープとが異なる、請求項1〜5のいずれかに記載のキット。
- 前記エピトープが前記分析物の異なるドメイン上に存在する、請求項5に記載のキット。
- 前記第二結合パートナーが、対応する第一結合パートナーがターゲットにするエピトープとは異なる前記分析物上のエピトープに結合する、請求項1〜6のいずれかに記載のキット。
- 前記第二エピトープが前記分析物に特異的である、請求項1〜7のいずれかに記載のキット。
- 多孔質担体をさらに含む請求項1〜8のいずれかに記載のキット。
- 2つ以上の第一結合パートナーであって、それぞれが、第一分析物、第二分析物およびさらなる分析物のうちの1つに結合することができる第一結合パートナーと、2つ以上の第二結合パートナーであって、それぞれが、前記第一分析物、第二分析物およびさらなる分析物のうちの1つに結合することができ、それぞれの第二結合パートナーが、検出可能な粒子に結合している、または検出可能な粒子に結合することができる第二結合パートナーとを含む、単一サンプル中の第一分析物と、第二分析物と、さらなる分析物とを検出するための、請求項1〜9のいずれかに記載のキット。
- それぞれの前記第二結合パートナーが、異なる検出可能な粒子に結合している、または異なる検出可能な粒子に結合することができる、請求項10に記載のキット。
- 前記ハブが、第一結合パートナーを付着させることができる安定な担体を含む、請求項1〜11のいずれかに記載のキット。
- 前記ハブが可溶性である、請求項1〜12のいずれかに記載のキット。
- 前記ハブがタンパク質または多糖類である、請求項13に記載のキット。
- 前記ハブが、アミノデキストランまたはその誘導体を含む、請求項14に記載のキット。
- 前記ハブが、赤血球、ラテックスビーズ、金ゾルまたは高分子である、請求項1〜12のいずれかに記載のキット。
- 前記結合パートナーが、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、抗原、タンパク質、酵素、受容体、アプタマー、オリゴヌクレオチド、糖およびそれらのフラグメントから選択される、請求項1〜16のいずれかに記載のキット。
- 前記検出可能な粒子が凝集性粒子である、請求項1〜17のいずれかに記載のキット。
- 凝集性粒子をさらに含む請求項1〜18のいずれかに記載のキット。
- 前記第三結合パートナーが、凝集性粒子上のグリコホリン分子に結合することができる、請求項3〜19のいずれかに記載のキット。
- 前記検出可能な粒子が、微生物、細胞、高分子、金属ゾル粒子、ビーズ、木炭、カオリナイトまたはベントナイトである、請求項1〜20のいずれかに記載のキット。
- 前記検出可能な粒子が金ゾルである、請求項21に記載のキット。
- 多孔質担体をさらに含む請求項1〜22のいずれかに記載のキット。
- 前記多孔質担体が固体マトリックスである、請求項23に記載のキット。
- 前記多孔質担体が繊維状である、請求項24に記載のキット。
- 前記多孔質担体が検出ゾーンを含み、前記検出ゾーンが、前記検出ゾーンの下流への凝集物の移動を防止する細孔径を有する、請求項23〜25のいずれかに記載のキット。
- 前記検出ゾーンの上流の細孔径が、前記ハブと、第二結合パートナーと、サンプルと、任意の凝集物とが自由に移動できるために十分なものである、請求項26に記載のキット。
- 反応装置をさらに含む、請求項1〜27のいずれかに記載のキット。
- 前記反応装置が毛細管試験装置である、請求項28に記載のキット。
- 毛細管装置が2つの経路を含む、請求項29に記載のキット。
- それぞれの経路が上流端部および下流端部を含み、試薬のサンプルの適用のためのゾーンが上流端部に設けられている、請求項30に記載のキット。
- 前記試薬の一方または両方が、毛細管装置の経路に、製造中に予め適用される、請求項29〜31のいずれかに記載のキット。
- 検出手段と、シグナル処理手段と、表示手段と、電源とのうちの1つ以上をさらに含む、請求項1〜32のいずれかに記載のキット。
- 前記検出手段と、シグナル処理手段と、表示手段と、電源とのうちの1つ以上が、前記反応装置の一体化された部分である、請求項33に記載のキット。
- 前記検出手段、シグナル処理手段、表示手段および電源のうちの1つ以上が、脱着可能および動作可能に前記装置と接続することができる分離した読取装置として設けられる、請求項33に記載のキット。
- 緩衝液、適用手段(例えば、ピペット)、使用説明書、チャート、乾燥剤、対照サンプル、染料またはバッテリーのうちの1つ以上をさらに含む請求項1〜35のいずれかに記載のキット。
- サンプルを受け取るための近位端部と、サンプルが多孔質担体に沿って、移動してくる遠位端部とを含み、前記多孔質担体が、2つ以上の第一結合パートナーが結合しているハブを、乾燥された再構成可能な形態で含み、それぞれの第一結合パートナーが、分析物の第一エピトープに結合することができる、サンプル中の分析物を検出するための凝集アッセイ用の装置。
- 前記多孔質担体に、好ましくは乾燥された再構成可能な形態で、予め適用された第二結合パートナー、検出可能な粒子および/または他の試薬をさらに含む請求項37に記載の装置。
- 装置またはレセプタクルに収容されている、請求項37または38のいずれかに記載の装置。
- 手持ち式である請求項39に記載の装置。
- 前記ハブ、結合パートナー、検出可能な粒子および分析物が、請求項1〜22に記載のとおりである、請求項37〜40のいずれかに記載の装置。
- i.a)2つ以上の第一結合パートナーが結合しているハブであって、それぞれの前記結合パートナーが、分析物の第一エピトープに結合することができるハブと、
b)前記分析物の第二エピトープに結合することができる第二結合パートナーを含む部分であって、凝集性粒子にも結合することができる部分と、
c)検出可能な粒子と
に、サンプルを接触させるステップと、
ii.前記ハブと、第二結合パートナーを含む部分と、サンプルと、検出可能な粒子とを反応させるステップと、
iii.前記ハブと、コンジュゲートと、凝集性粒子と、分析物との凝集を検出するステップと
を含む、サンプル中の分析物を検出するための凝集アッセイ。 - 第二エピトープに結合することができる前記部分が、検出可能な粒子に結合している、請求項42に記載のアッセイ。
- 第二結合パートナーを含む前記部分が、検出可能な粒子に結合することができる第三結合パートナーをさらに含む、請求項42または請求項43のいずれかに記載のアッセイ。
- 前記部分が、前記第二結合パートナーと第三結合パートナーとのコンジュゲートを含む、請求項42〜44のいずれかに記載のアッセイ。
- 前記凝集性粒子がサンプル中に天然に存在する、請求項42〜45のいずれかに記載のアッセイ。
- 前記凝集性粒子が赤血球である、請求項46に記載のアッセイ。
- 前記試薬およびサンプルが、前記反応装置に適用される前に混合され、所定時間後、緩衝液が適用される、請求項42〜47のいずれかに記載のアッセイ。
- 前記表示手段が所定期間後に読み取られる、請求項42〜48のいずれかに記載のアッセイ。
- i.2つ以上の第一結合パートナーが結合しているハブであって、それぞれの前記第一結合パートナーは、分析物の第一エピトープに結合することができるハブ;および、前記分析物の第二エピトープに結合することができる第二結合パートナーであって、検出可能な粒子に結合している、または結合することができる第二結合パートナー;および、サンプル;および/または任意選択的に検出可能な粒子と、多孔質担体とを接触させるステップと、
ii.前記ハブ、第二結合パートナー、サンプル、および任意選択的に、検出可能な粒子を反応させるステップと、
iii.前記多孔質担体中の前記ハブと、第二結合パートナーと、分析物との凝集を検出するステップであって、凝集がサンプル中の分析物の存在および/または量を示すステップと
を含む、サンプル中の分析物を検出するための凝集アッセイ。 - 前記ハブ、第二結合パートナー、サンプルおよび/または検出可能な粒子が、前記アッセイの開始前に多孔質担体に適用される、請求項50に記載の凝集アッセイ。
- 凝集の検出が、バンドまたはシグナルの可視化による、請求項50または51のいずれかに記載の凝集アッセイ。
- 前記ハブ、結合パートナー、検出可能な粒子および分析物が、請求項1〜22に記載のとおりである、請求項50〜52のいずれかに記載の凝集アッセイ。
- 請求項37〜41のいずれかに記載の1つ以上の装置と、前記装置と同数のアッセイのために十分な試薬とを含むパッケージ。
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