JP2806924B2 - 粒子分離方法 - Google Patents
粒子分離方法Info
- Publication number
- JP2806924B2 JP2806924B2 JP61305165A JP30516586A JP2806924B2 JP 2806924 B2 JP2806924 B2 JP 2806924B2 JP 61305165 A JP61305165 A JP 61305165A JP 30516586 A JP30516586 A JP 30516586A JP 2806924 B2 JP2806924 B2 JP 2806924B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- particles
- magnetic
- charged
- magnetic particles
- analyte
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
- G01N33/54333—Modification of conditions of immunological binding reaction, e.g. use of more than one type of particle, use of chemical agents to improve binding, choice of incubation time or application of magnetic field during binding reaction
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
- B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
- B03C1/00—Magnetic separation
- B03C1/005—Pretreatment specially adapted for magnetic separation
- B03C1/01—Pretreatment specially adapted for magnetic separation by addition of magnetic adjuvants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
- G01N33/538—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody by sorbent column, particles or resin strip, i.e. sorbent materials
Description
【発明の詳細な説明】
［発明の背景］
この発明は、磁場勾配を用いることにより物質、通常
は粒子を流体媒質から分離する方法に関するものであ
る。この発明は、生物体液、例えば血液、リンパ液、
尿、細胞培養物等からの細胞分離に特に適用性を有す
る。 生物体液、例えば血清または尿の試料中における分析
質の存在または量を測定するための多くの技術が知られ
ている。これらの技術で最も一般的なのはインビトロア
ッセイ方法である。これらの技術の多くは、測定するべ
き分析質およびこのような分析質の標識（された）類似
体の、特異的受容体例えば抗体の結合部位への競合的結
合をともなう。これらの技術の多くは、非結合標識類似
体を結合（した）標識類似体から分離し、そして結合ま
たは非結合類似体において標識により生じたシグナルに
ついて検査する分離段階を含む。シグナルは、試料中の
分析質の量に関連して生産される。 結合または非結合フラクションを分離する技術がいく
つか知られている。例えば、結合および遊離フラクショ
ンの示差泳動、例えば、クロマト電気泳動、ゲル濾過
等、例えば有機溶媒、塩、酸等による結合または遊離フ
ラクションの化学的沈殿およびこれに続く濾過または遠
心分離、例えば二重抗体技術による結合フラクションの
免疫学的沈殿およびこれに続く濾過または遠心分離、例
えば木炭、シリケート類、樹脂等の選択吸着媒質への結
合または遊離フラクションの吸着、磁気分離技術などを
用いることができる。 一般に磁気分離法は２種の総括的カテゴリーに分類さ
れる。分離される物質が本質的に磁性を帯びている場合
の分離法が存在する。他方、磁気反応体を近づけること
により混合物の１種またはそれ以上の成分に磁性を帯び
させることができる。生化学的分離の場合、興味の対象
である物質は一般に充分には磁性を帯びていないため、
抗体、レクチンおよび他の標的粒子と結合した磁性粒子
がこれらの物質の多くを単離する為に用いられてきた。
特異的粒子に対して標的とされた磁性粒子もまた様々な
イムノアッセイに用いられている。 イムノアッセイで用いられる分離技術の多くは比較的
長くて複雑な方法である。このような方法を用いるとオ
ペレーターの効率は低下し、処理量は減少し、試験コス
トは高くつく、迅速で簡単な他の分離技術の場合、結合
および遊離フラクションを充分には識別しないため、イ
ムノアッセイには不適であるかまたは限られた数の試験
にのみ用いられ得る。 2.関連技術の記載 磁性反応性で、透過性で、固体で水に難溶性のミクロ
粒子を用いた。生物体液における物質（例、薬剤、ホル
モン、ビタミンおよび酵素）の濃度測定方法が米国特許
第4115534号に開示されている。塩化第一鉄および塩化
第二鉄からなる混合物を含む酸性水溶液にキトサンのよ
うなムコ多糖類を溶かすことにより生成される官能性磁
性粒子が米国特許第4285819号に開示されている。ミク
ロスフイアを用いてキレート形成により廃水流から溶解
したイオンを除去することができる。米国特許第393399
7号では、抗ジゴキシン抗体を磁気反応性粒子と結合さ
せる、ジゴキシンの固相ラジオイムノアッセイが記載さ
れている。米国特許第3970518号の場合、抗体層で被覆
された小磁性粒子を用いることにより特殊生物および細
胞をその集合体から選別および分離するための大きな、
そして広く分布した表面領域がもたらされる。米国特許
第4018886号の開示では、小磁性粒子を用いて溶液から
特殊蛋白質を分離するための大きくて広い分布した表面
領域を得ることにより特殊蛋白質を検出することができ
る。特殊蛋白質と特異的に相互反応する蛋白質で粒子を
被覆する。米国特許第4070246号は、生物活性蛋白質と
共有結合し得る基質に安定した水不溶性コーティングを
ほどこした組成物について記載しているが、その結果生
成物は蛋白質の生物特性および基質の構造特性、例えば
金属支持体の磁性特性を有することになる。普通に分離
可能な蛋白質−被覆粒子の混合物を用いる診断方法が米
国特許第4115535号に記載されている。メタクリル酸お
よび／またはヒドロキシエチルメタクリレートのような
親水性コモノマーによるアクロレインホモポリマーおよ
びコポリマーのミクロスフイアが米国特許第4413070号
に記載されている。米国特許第4452773号は、抗体、酵
素および他の生物粒子と共有結合し得、磁場により細胞
および他の生物粒子および分子を標識および分離するの
に用いられ得る磁性鉄−デキストランミクロスフイアを
開示している。被覆された磁化しうるミクロ粒子、その
可逆性けん濁液およびそれに関する方法が米国特許第44
54234号に記載されている。米国特許第4523996号には、
各々のイオン性ビーズが複雑に混入した強磁性物質を用
い、混合樹脂ベッドにおいてアニオン性ビーズからカチ
オン性ビーズを分離する方法が記載されている。磁性粒
子コロイドを用いる磁気分離方法が米国特許第4526681
号に記載されている。米国特許出願GB215266Aは磁気ア
ッセイ試薬を開示している。 鉄−デキイトラン粒子と抗体分子の共有結合によりつ
くられた電子高密度抗体コンジュゲートがダットン等
（1979年）「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ」（Proc.Natl.
Acad.Sci.）76:3392−2396に記載されている。イタキッ
シオス等は、「クリニカル・ケミストリー」（Clin.Che
m.）23:2072〜2079（1977年）でラジオアッセイにおけ
る磁性ミクロ粒子含有蛋白質の使用について記載してい
る。高勾配磁性クロマトグラフィーを用いる免疫特異性
鉄デキストランミクロスフイアで標識された細胞の分離
は、モルディ等による（1984年）「フェブス」（FEBS）
170:232〜238に開示されている。「ジャーナル・オブ・
イミュノロジカル・メソッズ（J.Immunol.Meth.）5:353
〜367（1982年）でモルディ等は、細胞の標識および磁
性分離に用いる免疫特異性強磁性鉄デキストラン試薬に
ついて記載している。細胞の標識および分離における磁
性ミクロスフイアの適用もまたモルディ等により「ネイ
チュアー」（Nature）268:437〜438（1977年）に開示さ
れている。ヒトアルブミンおよび生物体液の固相フルオ
ロイムノアッセイは、ナルゲッシ等により（1978年）
「クリニカ・キミカ・アクタ」（Clin.Chim.Acta.）89:
455〜460に記載されている。「クリニカ・キミカ・アク
タ「Clin.Chim.Acta.）69:387〜396（1976年）でナイ等
は固相磁性粒子ラジオイムノアッセイについて開示して
いる。「サイエンティフィック・アメリカン」（Scien.
Amer.）10:136〜194（1983年）でローゼンバイクは磁性
流体について記載している。磁性蛋白質Ａミクロスフイ
アおよび細胞分離方法におけるそれらの用途がウィッダ
ー等により（1979年）「クリニカル・イミュノロジー・
アンド・イミュノバソロジー」（Clin.Immunol.and Imm
unopath.）14:395〜400に開示されている。 ［発明の要約］ この発明による方法は、物質に極微小磁性粒子との結
合を起させることにより液体媒質から物質を分離するこ
とを目的とする。この発明は、分析質を含有する疑いの
ある試料における分析質の測定方法において利用する、
液体媒質から分散した非磁性粒子を電荷相互作用を利用
して分離する技術に関するものである。本発明によれ
ば、非磁性粒子と磁性粒子とを同種荷電し、反対荷電の
化学的手段を加えて、非特異的結合を生起させ、次に媒
質に磁場勾配を与えることにより、媒質から分析質を含
有する粒子を分離する。 達成され、可逆性である。 この発明による方法は、有機および生化学分析質特に
体液分析において必要となる分析質のアッセイに特に適
用性を有する。特に利用価値が高いのは、分析質が粒子
表面と結合した、または結合し得る特異的結合対（sb
p）のメンバーである場合のアッセイである。分析質が
表面成分であるかまたは非磁性粒子と結合している場
合、この方法は、非磁性および磁性粒子を結合し、磁性
粒子の非特異的凝集を化学的に誘発する条件下で、アッ
セイ媒質中で、試料、分析質が非磁性粒子と結合すると
きにはこの非磁性粒子および磁性粒子を合わせることを
含む。非磁性粒子または磁性粒子は通常sbpメンバーと
結合している。非磁性粒子のsbpメンバーが分析質に対
して相補的でない場合、相補sbpメンバーもまた加えら
れる。次に、アッセイ媒質に磁場勾配を与えることによ
り媒質から粒子を分離する。分離後、sbpメンバーの存
在または量について媒質または粒子を検査するが、これ
は試料中の分析質の存在により影響される。通常、sbp
メンバーは、試料中の分析質の量に関係（比例）してシ
グナルを発するシグナル発生系を用いることにより生じ
たシグナルを通じて検出される。媒質から分離された粒
子を試験前に洗浄することができる。さらに、粒子を媒
質から分離後、続いて処理することにより粒子の非特異
結合を解離することができる。 この発明による方法は、非磁性粒子と磁性粒子の化学
的に制御された非特異的可逆結合により媒質から非磁性
粒子を分離する方法を提供する。磁性粒子のサイズが小
さいため、分離されるべき物質の非常に速い結合もまた
もたらされる。次に粒子をアグリゲートすることにより
従来の方法を用いた場合よりもかなり速くて完全な磁気
分離が達成される。 この発明は、本発明方法を行なうための、特に分析質
を含有する疑のある試料における分析質の測定アッセイ
を行なうための組成物およびキットを包含する。 ［実施態様の記載］ この発明は、液体媒質からけん濁した粒子に結合した
物質を分離する方法に関するものである。この方法に
は、荷電磁性粒子および荷電磁性粒子相互の化学的に制
御された非特異結合が関与する。普通、分離されるべき
物質は荷電非磁性粒子に結合しているかまたは結合させ
られる。荷電非磁性粒子および荷電磁性粒子間または磁
性粒子間の荷電非特異結合を達成するための好ましいア
プローチは電荷相互作用である。結合した粒子は磁場勾
配の使用により媒質から分離される。分離された粒子は
洗浄され、物理的または化学的方法により試験され得
る。また粒子を処理して非特異結合を解離させることも
できる。非磁性粒子を用いる場合、結合解離後遊離磁性
粒子を分離することにより磁性粒子からの非磁性粒子分
離が行われる。 本発明方法は、けん濁した粒子を媒質から分離する分
野、特に細胞および微生物のような生物学的物質を分離
する分野並びにイムノアッセイおよび血液型分類の分野
に広い適用性を示す。この発明は、遠心分離、濾過およ
び従来の磁気分離方法よりも便利で速く、また粒子不含
有液体媒質または分離された粒子の分析を行なうことが
望まれる場合のけん濁液の前処理に特に適用できる分離
方法を提供する。またこの発明は、分離段階が必要とさ
れる場合の試料中の分析質アッセイに対する適用性も有
する。 さらに本発明の実施態様の記載を行なう前に、若干の
用語の定義を行なう。 分析質（アナライト）…測定されるべき化合物または組
成物、興味ある物質。分析質は、特異的結合対（spb）
のメンバーであり得、また配位子（リガンド）であり得
るが、これは一価または多価で、普通抗原性またはハプ
テン性であり、また少なくとも１個のエピトープまたは
決定部位を共通にする単一化合物または複数の化合物で
ある。また分析質は、粒子の成分であり得るがまたはア
ッセイ中に粒子と結合し得る。粒子の成分である分析質
の例は、血液群抗原（Ａ、Ｂ、AB、Ｏ、Ｄ等）のような
細胞表面の抗原またはHLA抗原である。アッセイ中に粒
子と結合する分析質の例は、相補sbpメンバーが、粒
子、レクチンが粒子と結合している場合糖蛋白質または
グリコリピド、プロテインＡが粒子と結合している場合
抗体などである場合のsbpメンバーである。分析質が粒
子と結合しているときに必要な結合は、特異的または非
特異的、免疫学的または非免疫学的であり得る。 多価配位子分析質は普通、ポリ（アミノ酸）、すなわ
ちポリペプチドおよび蛋白質、多糖類、核酸およびこれ
らの組み合わせである。このような組み合わせは、細
菌、ウイルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、核、
細胞膜等の成分を含む。 分析質の幾つかの正確な性質およびその多くの例は、
トリマン等による米国特許第4299916号、特にカラム16
〜23に記載されている。 大抵の場合、本発明で用いられるポリエピトープ配位
子分析質は少なくとも約5000、さらに普通は少なくとも
約10000の分子量を有する。ポリ（アミノ酸）カテゴリ
ーの場合、興味あるポリ（アミノ酸）は一般に約5000〜
5000000の分子量、さらに普通は約20000〜1000000の分
子量を有する。興味あるホルモンの中で、分子量は普通
約5000〜60000分子量の範囲である。 類似した構造上の特徴を有する蛋白質、特定の生物学
的機能を有する蛋白質、特異的微生物特に病気の原因と
なる微生物と関連のある蛋白質等の分類に関して広範な
種類の蛋白質が考えられ得る。 一般にモノエピトープ配位子分析質は約100〜2000の
分子量、さらに普通は125〜1000の分子量である。興味
ある分析質には、薬剤、中間代謝物、農薬、汚染物質な
どがある。興味深い薬剤にはアルカロイド類が挙げられ
る。アルカロイド類には、モルヒネ、コデイン、ヘロイ
ン、デキストロメトルファン、それらの誘導体および中
間代謝物を含むモルヒネアルカロイド類、コカインおよ
びベンゾイルエクゴニン、それらの誘導体および中間代
謝物を含むコカインアルカロイド類、リセルグ類ジエチ
ルアミドを含む麦角アルカロイド類、ステロイドアルカ
ロイド類、イミナゾイルアルカロイド類、キナゾリンア
ルカロイド類、イソキノリンアルカロイド類、キニンお
よびキニジンを含むキノリンアルカロイド類、ジテルペ
ンアルカロイド類、それらの誘導体および中間代謝物が
ある。 次群の薬剤には、ステロイド類、例えばエストロゲ
ン、エストゲン、アンドロゲン、アンドレオコルチカル
ステロイド、胆汁酸、強心性グリコシドおよびアグリコ
ン、例えばジゴキシンおよびジゴキシゲニン、サポニン
およびサポゲニン、それらの誘導体および中間代謝物が
ある。またジエチルスチルベストロールのようなステロ
イド疑似物質も含まれる。 次群の薬剤には、バルビツエート類、例えばフェノバ
ルビタールおよびセコバルビタール、ジフェニルヒダン
トニン、プリミドン、エトサクシミドおよびそれらの中
間代謝物を含む、５〜６員環のラクタムがある。 次群の薬剤には、２〜３個の炭素原子を有するアルキ
ルを含むアミノアルキルベンゼン類、例えばアンフェタ
ミン、カテコールアミン、例えばエフェドリン、Ｌ−ド
ーパ、エピネフリン、ナルセイン、パパベリンおよびそ
れらの中間代謝物がある。 次群の薬剤には、ベンズ複素環、例えばオキサゼパ
ム、クロルプロマジン、テグレトール、イミプラミン、
それらの誘導体および中間代謝物があり、複素環はアゼ
ピン、ジアゼピンおよびフェノチアジンである。 次群の薬剤には、プリン類、例えばフオフイリン、カ
フェイン、それらの中間代謝物および誘導体がある。 次群の薬剤には、カンナビノールおよびテトラヒドロ
カンナビノールを含む、マリファナから得られたものが
ある。 次群の薬剤には、ビタミン類、例えばＡ、Ｂ、例えば
B12、Ｃ、Ｄ、Ｅおよび、Ｋ、葉酸、チアミンがある。 次群の薬剤には、水酸化および不飽和性の程度および
部位が異なるプロスタグランジン類がある。 次群の薬剤には、抗生物質、例えばペニシリン、クロ
ロマイセチン、アンチノマイセチン、テトラサイクリ
ン、テラマイシン、それらの中間代謝物および誘導体が
ある。 次群の薬剤には、ヌクレオシドおよびヌクレオチド、
例えば適当な糖および燐酸置換基を有するATP、NAD、FM
N、アデノシン、グアノシン、チミジンおよびシチジン
がある。 次群の薬剤には、種々雑多な個々の薬剤、例えば、メ
タドン、メプロバメート、セロトニン、メペリジン、ア
ミトリプチリン、ノルトリプチリン、リドカイン、プロ
カインアミド、アセチルプロカインアミド、プロプラノ
ロール、グリセオフルビン、バルプロ酸、ブチロフェノ
ン、抗ヒスタミン剤、抗コリンエステラーゼ剤、例えば
アトロピン、それらの中間代謝物および誘導体がある。 疾患状態と関連のある中間代謝物には、スペルミン、
ガラクトース、フェニルピルビン酸およびポルフイリン
タイプ１がある。 次群の薬剤には、アミノグリコシド類、例えばゲンタ
マイシン、カナマイシン、トブラマイシンおよびアミカ
シンがある。 興味深い農薬には、ポリハロゲン化ビフェニール類、
燐酸エステル類、チオホスフェート類、カルバメート
類、ポリハロゲン化スルフェナミド類、それらの中間代
謝物および誘導体がある。 受容体分析質の場合、分子量は一般に10000〜２×1
08、さらに普通は10000〜106の範囲である。免疫グロブ
リン、IgA、IgG、IgEおよびIgMの場合、一般に分子量は
約160000〜約106の範囲である。酸素は通常約10000〜10
00000の範囲の分子量を有する。天然受容体は広範に変
化するが、一般に少なくとも約25000の分子量であり、1
06またはそれ以上の分子量であり得、例えばアビジン、
DNA、RNA、チロキシン結合グロブリン、チロキシン結合
プレアルブミン、トランスコルチン等のような物質が挙
げられる。 配位子類似体または分析質類似体…受容体に対して類似
配位子または分析質と競合し得る修飾された配位子もし
くは配位子代用物または修飾された分析質もしくは分析
質代用物。修飾により配位子類似体または分析質類似体
を別の粒子と結合させる手段がもたらされる。普通、配
位子類似体または分析質類似体は、配位子類似体または
分析質類似体をハブ（hub）または標識と連結する結合
により１個以上の水素を置換する以外の点でも配位子ま
たは分析質とは異なるが、これは必要なことではない。
配位子代用物または分析質代用物の語は、配位子または
分析質と相補的な受容体を非特異結合する能力を有する
化合物を意味する。すなわち、配位子代用物または分析
質代用物は、配位子または分析質と同様に受容体と結合
することができる。例えば代用物は、配位子または分析
質に対する抗体のイデイオタイプに対する抗体であり得
る。 ポリ（配位子類似体）…一緒になって通常ハブ核と共有
結合した複数の配位子類似体。ハブ核は多官能性物質で
あり、普通結合部位として複数の官能基、例えばヒドロ
キシル、アミノ、メルカプト、エチレン基等を有する通
常はポリマーである。ハブ核は、水溶性または水不溶
性、好ましくは水溶性であり得、通常少なくとも約3000
0の分子量であり、1000万またはそれ以上の分子量であ
り得る。ハブ核の例としては、多糖類、ポリペプチド類
（蛋白質を含む）、核酸類、アニオン交換樹脂などがあ
る。また水に不溶性のハブ核には、容器壁、例えばガラ
スまたはプラスチック、ガラスビーズ、付加および縮合
ポリマー、セファデックス（Sephadex）およびアガロー
ス（Agarose）ビーズなどがある。 特異的結合対のメンバー（「sbpメンバー」）…表面ま
たは空洞部分に、特異的結合することにより他方の分子
の特定の空間的および極性機構と相補的なものとして定
義される領域を有する２種の異なる分子の一方の分子。
特異的結合対の成分を配位子（リガンド）および受容体
（抗配位子、アンチリガンド）と称する。これらは普通
抗原と抗体のような免疫学的対の成分であるが、免疫学
的対ではない他の特異的結合対、例えばビチオンとアビ
シン、ホルモンとホルモン受容体、核酸デュプレック
ス、IgGとプロテインＡ、DANとDAN、DNAとRNAなどもこ
の発明に含まれる。 配位子（リガンド）…受容体が天然に存在するかまたは
製造され得る有機化合物。 受容体（「アンチリガンド」）…分子の特定の空間的お
よび極性機構、例えばエピトープまたは決定部位を認識
することができる化合物または組成物。受容体の例に
は、天然受容体、例えばチロキシン結合グロブリン、抗
体、酸素、Fab断片、レクチン、核酸、プロテインＡ、
補体成分C1qなどがある。 非磁性粒子…普通１×105emu/0ecm3未満の磁化率（χ）
を有する反磁性または常磁性粒子。一般に非磁性粒子は
少なくとも約0.02ミクロン以上で約100ミクロン未満、
通常少なくとも約0.05ミクロン以上で約20ミクロン未
満、好ましくは約0.3〜10ミクロンの直径を有する。非
磁性粒子は、有機または無機で、膨張性または非膨張
性、多孔性または非多孔性で、好ましくは水に近い密
度、一般的には約0.7〜約1.5g/mlであり、透明、部分的
に透明または不透明であり得る物質を成分とし得る。普
通、非磁性粒子はプラスまたはマイナスの電荷を有し、
表面にsbp成分を有し得る。通常、非磁性粒子は、細胞
および微生物のような生物学的物質、例えば赤血球、白
血球、リンパ球、ハイブリドーマ、連鎖球菌（ストレプ
トコッカス）、スタフィロコッカス・アウレウス（Stap
hylococcus aureus）、大腸菌（エシエリヒア・コリ E.
coli）、ウイルスなどである。また、非磁性粒子は、有
機および無機ポリマー、リポソーム、ラテックス粒子、
リン脂質小胞、キロミクロン、リポ蛋白質などからなる
粒子でもあり得る。 通常、ポリマー（重合体）は付加または縮合ポリマー
である。これらに由来する非磁性粒子はアッセイ媒質に
容易に分散可能であり、また、吸着性または官能性化し
得るものであるため直接的または間接的にsbp成分また
は磁性粒子を結合できる。 非磁性粒子は、分析質であるか、分析質と結合してい
るか、またはアッセイ（実施）中に分析質と結合するこ
とが多い。最初分析質と結合していない非磁性粒子は、
天然物質、合成修飾された天然物質および合成物質から
得ることができる。特に興味深い有機ポリマーには、多
糖類、特に交叉結合した多糖類、例えばアガロース［セ
ファロース（Sepharose）の名できる市販されてい
る］、デキストラン［セフアデックス（Sephadex）およ
びセファクリル（Sephacryl）として市販されてい
る］、セルロース、澱粉などがある。付加重合体には、
例えばポリスチレン、ポリビニルアルコール、アクリレ
ートおよびメタクリレート誘導体のホモポリマーおよび
コポリマー、特に遊離ヒドロキシル官能性を有するエス
テルおよびアミド等がある。 アッセイで用いる非磁性粒子は普通多官能性であり、
sbpメンバー、例えば抗体、アビシン、ビオチン、レク
チン、プロテインＡなどと結合してしまうかまたは特異
的非共有結合し得る。広範な種類の官能基が用いられ得
るかまたは結合され得る。官能基には、カルボン酸、ア
ルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキ
シル基、メルカプト基などがある。広範な種類の化合物
と粒子の結合形式はよく知られており、文献に詳細に示
されている。例えばカウトレカサス、「ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー」（J.Biol.Chem.）
245巻、3059頁（1970年）参照。結合基の長さは広い範
囲で変化し得、結合される化合物の性質、sbpメンバー
および分析質の結合上の結合される化合物および粒子間
の距離の影響などにより異なる。 通常非磁性粒子はプラスまたはマイナスの電荷を有す
る。粒子は、本質的に荷電し得るかまたは化学的もしく
は物理的処理により電荷が取り込み得る。例えば、カル
ボキシル、スルホネート、ホスフェート、アミノなどの
ような基は、当業界で公知の技術により粒子と化学的に
結合するかまたは粒子上に形成され得る。細胞は、通常
細胞表面にシアル酸残基が存在するため負電荷を帯びて
いる。ラテックス粒子は正または負電荷を帯び得るが、
通常、官能基の導入または荷電ポリマー例えばポリペプ
チド、蛋白質、ポリアクリレートなどの吸収の結果負電
荷を有する。 非磁性粒子は、蛍光性または非蛍光性であり得、普通
は非蛍光性であるが、直接蛍光化されるかまたは蛍光化
合物もしくは蛍光剤を常法で粒子と結合させることによ
り蛍光性となり得る。普通、蛍光剤を溶かし入れるかま
たは非磁性粒子と共有もしくは非共有結合させ、実質的
に均等に粒子に結合させることが多い。蛍光化されたラ
テックス粒子は米国特許第3853987号に記載されてお
り、コバレント・テクノロジー社からコバスフィア（Co
vasphere）として市販されている。 興味深い蛍光剤は、一般に約350nm、普通約400nmおよ
び好ましくは約450nmの波長の光を放射する。望ましく
は、蛍光剤は高い量子収率、大きなストークシフトを有
し、またコンジュゲートおよび使用条件下化学的に安定
している。蛍光剤の語は、電磁放射による活性化または
化学的活性化の際に光を放射する物質を含むものとし、
蛍光性および燐光性物質、シンチレーターおよび化学光
物質が含まれる。 興味ある蛍光剤は、ある種の１次官能性を有する様々
なカテゴリーに分類される。これらの１次官能性には、
１−および２−アミノナフタレン、p,p−ジアミノスチ
ルベン類、ピレン類、第４級フェナントリジン塩類、９
−アミノアクリジン類、p,p′−ジアミノスチルベン
類、イミン類、アントラセン類、オキサカルボシアニ
ン、メロシアニン、３−アミノエキレニン、ペリレン、
ビス−ベンズオキサゾール、ビス−ｐ−オキサゾリルベ
ンゼン、1,2−ベンゾフェナジン、レチノール、ビス−
３−アミノピリジニウム塩類、ヘレブリゲニン、テトラ
サイクリン、ステロフェノール、ベンズイミダゾリルフ
ェニルアミン、２−オキソ−３−クロメン、インドー
ル、キサンテン、７−ヒドロキシクマリン、4,5−ベン
ズイミダゾール、フェノキサジン、サリチレート、スト
ロファンチジン、ポルフイリン類、トリアリールメタン
類、フラビン並びに希土類元素キレート酸化物および塩
がある。蛍光剤の例は米国特許第4318707号カラム７お
よび８に列挙されているが、この内容を引用して説明の
一部とする。またスクアライン染料も蛍光剤として有用
であり、1985年９月６日出願の米国特許出願第773401号
（これは、1985年９月６日の優先権主張の1986年９月５
日出願されたヨーロッパ特許出願第86306859.9、日本特
許出願第210516/1986号、オーストラリア特許出願第623
65号およびカナダ特許出願に対応するもので、発明の名
称は「スクアレート染料を用いた新規配位子受容体アッ
セイ」で当社の表示番号は25200である）に記載されて
いる。この関連文献は、スクアレート染料および特異的
結合対（spb）のメンバーの新規コンジュゲートを開示
しており、これらは特異的結合対メンバー分析質を含む
疑のある試料におけるこのような分析質の存在または量
を測定するアッセイで用いられるとしている。スクアレ
ート染料は、当技術分野で周知の技術によりsbpメンバ
ーにコンジュゲートさせ得る。 さらに、少なくとも直径約10nmの固体難溶性粒子であ
る光吸収性非磁性粒子を用いることができる。 多くの異なる型の粒子が使用され得る。特に興味深い
ものは、炭素粒子、例えば木炭、ランプブラック、グラ
ファイト、コロイド状炭素などである。炭素粒子以外に
金属ゾル、特に貴金属、金、銀、および白金のゾルも使
用され得る。 標識…sbpメンバーとコンジュゲートするシグナル発生
系のメンバー。標識は、アイソトープまたは非アイソト
ープ、普通は非アイソトープであり得、触媒、例えば酵
素、色素原、例えば蛍光剤、染料または化学発光剤、放
射性物質、粒子などがある。 シグナル発生系…シグナル発生系は、１個またはそれ以
上の成分を含み得、少なくとも一成分が標識である。シ
グナル発生系は、試料中の分析質の存在または量に関連
するシグナルを発する。シグナル発生系は、測定可能な
シグナルを発生するのに必要な試薬をすべて含む。標識
が分析質と類似のsbpメンバーにコンジュゲートされな
い場合、通常標識は分析質と類似のsbpメンバーに相補
的なsbpメンバーに結合する。シグナル発生系の他の成
分には、基質、エンハンサー、活性剤、化学発光化合
物、コファクター、阻害剤、スカベンジャー、金属イオ
ン、シグナル発生物質の結合に必要な特異的結合物質な
どが含まれ得る。シグナル発生系の他の成分は、補酵
素、酵素製品および他の酵素および触媒と反応する物質
などであり得る。シグナル発生系は、外的手段により、
好ましくは粒子のアグリゲーション程度の測定により、
または電磁放射の使用により、望ましくは視覚試験によ
り検出可能なシグナルを提供する。大抵の場合、シグナ
ル発生系は、粒子、例えば蛍光粒子または他の光吸収粒
子、発色基質および酵素を含むが、発色基質は、紫外線
もしくは可視領域の光を吸収する染料、燐光体、蛍光剤
または化学発光剤に酵素変換される。 シグナル発生系は、少なくとも１種の触媒、普通は酵
素および少なくとも１種の基質を含み得、また２種また
はそれ以上の触媒および複数の基質を含み得、また酵素
の組み合わせを含み得るが、ただしこの場合一方の酵素
の基質は他方の酵素の生成物である。シグナル発生系の
作用は、試料中の分析質の量に関連した検出可能なシグ
ナルを提供する生成物をもたらすことである。 シグナル発生系に有用な多数の酵素および補酵素は、
米国特許第4275149号（カラム19〜23）および米国特許
第4318980号（カラム10〜14）に示されている。幾つか
の酵素組み合わせは米国特許第4275149号カラム23〜28
に記載されているが、これらの組み合わせは本発明でも
用いられ得る。 特に興味深いものは、過酸化水素の生成および染料前
駆体を酸化して染料とするための過酸化水素の使用にと
もなう酵素である。特定の組合わせには、サッカリドオ
キシダーゼ、例えばグルコースおよびガラクトースオキ
シダーゼまたは複素環オキシダーゼ、例えばウリカーゼ
およびキサンチンオキシダーゼを、過酸化水素を用いて
染料前駆体を酸化する酵素、すなわちペルオキシダーゼ
例えば西洋わさび（ホースラディッシュ）ペルオキシダ
ーゼ、ラクトペルオキシダーゼまたはミクロペルオキシ
ダーゼと結合したものが含まれる。前記以外の酵素の組
合わせは、引用された内容に含まれている。単一酵素を
標識として用いるとき、他の酵素、例えばヒドロラー
ゼ、トランスフェラーゼおよびオキシドレダクターゼ、
好ましくはアルカリ性ホスフアターゼおよびβ−ガラク
トシダーゼのようなヒドロラーゼを用いることができ
る。別法として、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフ
エラーゼおよび細菌ルシフェラーゼを用いることができ
る。 使用される補酵素の例には、NAD［Ｈ］、NADP
［Ｈ］、燐酸ビリドキサール、FAD［Ｈ］、FMN［Ｈ］等
があり、普通、補酵素は閉環反応をともなうが、詳しく
は米国特許第4318980号参照。 酵素反応の生成物は、普通は染料または蛍光剤であ
る。多数の蛍光剤の例が米国特許第4275149号（カラム3
0および31）に示されている。 磁性粒子…本質的に磁気反応性であるか、または例えば
磁気反応性物質に付着させるかまたはこのような物質を
粒子に混入することにより磁性化された粒子。磁性粒子
は、常磁性、強磁性または超常磁性、普通は常磁性であ
り得、少なくとも５×105emu/0ecm3は、普通は少なくと
も４×104emu/0ecm3の磁化率（ｘ）を有する。粒子の直
径は小さく、一般的には約5nm〜１ミクロン、好ましく
は約10〜250nm、さらに好ましくは約20〜100nmの範囲で
あり、最も好ましくはコロイド状である。 本質的に磁性または磁気反応性である粒子の磁気成分
の例には、錯塩および高い磁化率を有する鉄、コバル
ト、ニッケルおよび希土類元素の酸化物、ホウ化物およ
び硫化物、例えば赤鉄鉱、フェライトがある。他のこの
ような粒子の磁気成分には、純金属またはこれらの元素
の１個またはそれ以上を含む合金がある。 大抵の場合磁性粒子は、ヒドロキシル、シリケート、
カルボキシレート、スルフェート、アミノ、ホスフェー
ト等のような表面官能基をともなう磁気成分のコアを含
む。表面と共有または非共有結合した付加的表面コーテ
ィングを用いることが多い。表面コーティングは、アニ
オン性またはカチオン性の、普通はアニオン性のデター
ジェントであり得る。またはコーティングは、蛋白質、
例えばアルブミン、免疫グロブリン、アビジン、フエツ
インなどであり得る。またはコーティングは炭水化物、
例えばデキストラン、キトサン、アミロースなど、また
はこれらの組み合わせまたはこれらの物質の自然形態ま
たは電荷および親水性を制御するために官能性化された
形態であり得る。別法として、粒子は、リポ多糖類、オ
クチルグルコシド等のような他の両親媒性物質で被覆さ
れ得る。 別法として、磁気成分は、例えば、ポリマー性マトリ
ックスに物質を含浸させるなど、粒子に混入され得る。
しかしながら、この方法は、この発明の磁性粒子より大
きな粒子をもたらすことが多い。この方法による磁性粒
子の製造のさらに詳細な記載は、ホワイトサイド等、
（1983年）「トレンズ・イン・バイオテクノロジー」
（Trends in Biotechnology）、１巻（５）、144〜148
頁およびそこに引用された参考事項に見られる。 直径が100ナノメーター未満の好ましい磁性粒子は、
多糖類または蛋白質のようなコーティングの存在または
非存在下に酸化鉄を沈殿させることにより製造され得
る。直径が数ミクロンの磁性粒子もまたボールミル方法
を行ない、興味あるサイズ範囲外の物質を除去すること
により製造され得る。一般的に、この後者の方法で生成
した磁性粒子は、全く多分散性であるため一般に有用性
のあるものではない。これより有用な単分散性金属酸化
物けん濁液は、沈殿プロセス中においてpH、温度および
濃度を注意深く制御することにより製造され得る。磁性
粒子を巨大分子で被覆すると、粒子のコロイド安定剤を
増すことができる。これは、高分子量ポリマーの直接吸
着によるかまたは粒子表面を官能化し、次いで巨大分子
を官能基と結合させることにより行なわれ得る。エマル
ジョンポリマー化およびグラフト技術により磁性粒子を
ポリマーで被覆する手段が得られる。 一般に、所定の課題に最善である磁性粒子は、第一に
分離されるべき粒子のサイズおよび特性により決定され
る。イムノアッセイまたは細胞単離の場合、磁性粒子は
好ましくは容易にけん濁可能であり、安定した、好まし
くはコロイド状のけん濁液を形成し、高い磁化率を有し
ているべきである。sbpメンバーが表面と結合している
場合、相補的spbとの結合能力が保有され、時間が経過
しても安定しているべきである。 小さい（＜100nm）磁性粒子は、イムノアッセイおよ
び細胞分離方法において有利に用いられる。これらの粒
子は、好ましくは金属、金属酸化物または他の金属化合
物の均質コアを有する。コロイド状で安定していると
き、小粒子は長時間けん濁し得る。表面対容量の比類が
大きく、拡散速度が比較的高いため、粒子は媒質に分散
している分子および粒子と急速に結合できる。また小磁
性粒子は、大きな適用磁場にさらされた後の残余磁気モ
ーメントのために大きな磁性粒子よりもアグリゲーショ
ンしにくい。また、このような小粒子をコロイド状で安
定させる方法も知られている。 また、中間サイズ（100〜1000nm）の磁性粒子を用い
ることもできる。これらは容易にけん濁し得、これらよ
り小さい粒子の場合よりも低い表面荷電密度で自発的ア
グリゲーションを妨げ得る。このサイズ範囲の磁性粒子
は、エマルジョンポリマー化により製造され得、グラフ
ティングによろうと、巨大分子と表面の共有結合によろ
うと表面が容易に修飾されるという利点を有する。しか
しながら、これらの粒子はけん濁している時間が短く、
また表面対容量の比率が低いため分離されるべき物質と
の結合速度が減少する。 磁性流体…磁場により容易には分離されない液体担体中
磁性粒子のコロイドけん濁液。生成した液体は、磁性物
質のバルク（bulk）特性を有する。流体は、外部磁場の
存在下で自発的に磁化する。またこの液体は、流体とし
て作用し、容器の形をとり、流動し、障害物のまわりを
動くことができる。磁性流体の例としては、けん濁した
粒子が強磁性粒子であるフェロ（含鉄または強磁性）流
体（ferrofluid）がある［例えば、ローゼンバイク、前
出および米国特許第4019994号（この内容を引用して説
明の一部とする）、およびカラフルオラ等、（1980年）
「IEEE・トランサクションズ・オン・マグネティックス
（Transactions on Magnetics）、MAG−16」178−183頁
参照］。 コロイド磁性粒子は、蛋白質物質等、例えば血清蛋白
質例えばアルブミン、ガンマグロブリン等で被覆され得
る。コロイド磁性粒子を蛋白質の水性緩衝液と混合する
ことにより蛋白質被覆コロイド磁性粒子を製造すること
ができる。物理的（例、吸収）または化学的結合により
磁性粒子を蛋白質で被覆することがてきる。 非特異（的）結合…特異的表面構造が相対的に独立し
たものである粒子間の非共有結合。普通、このような非
特異的結合は、同種電荷を有する粒子間では粒子と反対
の電荷を有する化学的手段、例えば、ポリイオン性試薬
を用いる場合における電荷相互作用の結果生じるもので
ある。また非特異結合は粒子間の疎水性相互作用の結果
でも生じ得る。 ポリイオン性試薬…無機または有機、天然または合成
で、少なくとも２個の同じ電荷、ポリアニオンまたはボ
リカチオン、好ましくは少なくとも10個の同じ電荷を有
する化合物、組成物または素材、例えば高分子電解質。 ポリカチオン性試薬の例としては、ポリアルキレンア
ミン類例えばポリエチレンイミンおよびポリプロピレン
イミン並びにそれらの低級アルキルアンモニウム塩類例
えばポリブレン、（−Ｎ（CN3）2CH2CH2N（CH3）2CH2CH
2CH2CH2−）ｎ、金属イオン、例えばカルシウムおよび
バリウムイオン、アミノデキストラン、プロタミン、正
電荷リポソーム、ポリリジンなどがある。 ポリアニオン性試薬の例としては、ヘパリン、デキス
トランスルフェート、負電荷燐脂質小胞、ポリカルボン
酸、例えばポりアクリレート、ポリグルタメートなどが
ある。前記の物質およびそれらのまたは単離法は当業界
ではよく知られており、多くは市販されている。 解離剤…粒子間の非特異結合を解離させる、すなわち粒
子を解離することができる天然または合成、有機または
無機の化合物、組成物または素材。解離剤は、粒子間の
非特異結合に作用する。例えば、非特異結合が電荷相互
作用によるものである場合、解離剤は培地のpH値を電荷
相互作用に不適または相容れない値に変えることができ
る。したがって解離剤は、無機酸もしくは有機酸のよう
な酸または無機塩基もしくは有機塩基のような塩基であ
り得る。他方、解離剤はイオン相互作用を防御すること
ができるため高イオン強度溶液またはデキストランのよ
うな中性ポリマー溶液であり得る。他方、解離剤は、粒
子および磁性粒子間の非特異結合を崩壊する電荷を有し
得る。この例としては、高分子電解質塩、例えばクエン
酸塩、ポリアクリレート、デキストランスルフェートな
どがある。ポリイオンブリッジにより粒子が結合してい
る場合、解離剤は、反対の電荷を有するポリイオン性剤
であるかまたはポリイオン試薬を解重合する試薬であり
得る。 補助物質…様々な補助物質がこの発明によるアッセイで
用いられることが多い。例えば、通常、アッセイ媒質に
は緩衝剤並びにアッセイ媒質およびアッセイ成分に対す
る安定剤が存在する。これらの添加物に加えて、さらに
蛋白質、例えばアルブミン、または界面活性剤、特に非
イオン性界面活性剤、結合促進剤等、例えばポリアルキ
レングリコール類がしばしば含まれ得る。 本発明は、液体媒体中で荷電非磁性粒子と荷電磁性粒
子を合わせ、荷電磁性粒子を荷電非磁性粒子と結合さ
せ、さらに当該媒質を磁場勾配にかけて、媒質から結合
粒子を分離することよりなる、分析質を含有する疑のあ
る試料における分析質の測定方法において利用する、液
体媒質から分散した荷電非磁性粒子を分離する方法であ
って；当該磁性粒子を当該荷電非磁性粒子と同種荷電さ
せ、当該媒質中でそれらを合わせた後、非磁性粒子と磁
性粒子を電荷相互作用により非特異的に結合させるため
に、反対荷電のポリイオン性試薬のような化学的手段を
その媒質に加えて結合を生起させることを特徴とする方
法、ならびに該分離方法を利用する測定方法、測定用組
成物、および測定用キットである。 前述したように、この発明は液体媒質から物質を分離
する方法を含む。この方法は物質を荷電磁性粒子と結合
させ、荷電磁性粒子を非特異的結合およびアグリゲート
させる条件下で（ただし化学的手段を用いてけん濁した
磁性粒子を互いに非特異結合させる）、物性を含有する
液体媒質を好ましくは磁性液体として分散した磁性粒子
と合わせることからなる。分離されるべき物質は、非磁
性粒子であることが多く、または非磁性粒子と結合して
いる。普通非特異結合は、好都合には電荷の相互作用の
結果として得られるが、これはまた非磁性粒子を磁性粒
子と非特異結合させる役割を果たし得る。 粒子および磁性粒子が同じ電荷を有する場合、反対の
電荷を有するポリイオン性試薬を媒質に加えることによ
り非磁性粒子および磁性粒子間並びに磁性粒子間に非特
異結合をもたらすことができる。前記の結合が形成後培
地に磁場勾配を用いることにより粒子を培地から分離す
る。 この方法を実施するとき、普通は水性の液体媒質を用
いる。他の極性溶媒、例えば普通は、１〜６個さらに一
般的には１〜４個の炭素原子を有する酸素化有機溶媒、
例えばアルコール、エーテルなども用いられ得る。通
常、これらの共溶媒は、約40重量パーセント未満、さら
に普通は約20重量パーセントの割合で存在する。普通、
媒質については、分離前の磁性粒子の非特異的結合およ
びアグリゲーションを促進するようなpH値が選ばれる。
粒子が負に帯電している場合にpHを増やすと、電荷が増
加し、また非特異的疎水性およびファンデルワールス相
互作用により起こる自発的アグリゲーションを妨げるこ
とが多い。この逆のことが正に帯電した粒子に当てはま
る。反対に帯電した高分子電解質を加えることによりア
グリゲーションさせる場合、高分子電解質の電荷を増加
させるpH値の変化は、しばしば粒子の電荷を減少させる
ため、この試薬の過剰量の使用を避けるような最適pHを
選ばなければならない。一般に５〜10、さらに普通は６
〜９のpH範囲が用いられる。アッセイの際、pH値に関し
て他に考慮するべきことは、シグナル発生能力を最も効
果的にする一方で重要なsbpメンバーの結合レベルを維
持することである。場合により、これらの条件間で妥協
がなされる。様々な緩衝剤を用いることにより望ましい
pHを達成し、測定の間そのpHを維持することができる。
緩衝剤の例には、ボレート、ホスフェート、カーボネー
ト、トリス、バルビタールなどがある。この発明の場合
使用される具体的な緩衝剤は厳密ではない。しかしなが
ら、個々の分離または個々のアッセイにおいては他のも
のよりも好ましい緩衝剤が存在し得る。非磁性粒子が含
まれる場合、分離完了後に粒子と磁性粒子の結合の解離
を促進する試薬が加えられ得る。 この方法を行なうためには通常、温度は中位でこの方
法を行なう間普通は一定に保たれる。一般的に、分離前
に粒子の非特異結合を促進するような温度が選ばれる。
特にアッセイをともなうこの方法における温度は一般に
約０゜〜50℃、さらに普通は約15゜〜40℃の範囲であ
る。また、分離完了後に粒子および磁性粒子の結合逆転
を促進する温度が選ばれ得る。 媒質における磁性粒子の濃度は、粒子であろうとなか
ろうと分離されるべき媒質中の物質の量、望ましい分離
速度、磁場勾配および場の強さ、磁性粒子の磁化率など
により異なる。一般に、磁性粒子濃度の高い方が、効果
的で速い分離をもたらすが、濃度が高すぎると媒質の過
剰な同伴を生じる。通常、濃度は経験的に測定され、一
般に約0.1〜1000μg/ml、さらに普通は約0.5〜200μg/m
l、多くは約１〜50μg/mlの範囲で変化する。 非磁性粒子を媒質から分離するべき場合、非磁性粒子
の濃度は必要に応じて広範に変化し得る。例えば、血液
から細胞を分離する場合、細胞容量は、血液の総容量の
50％を示し得る。対照的に、水の試料から1ml当たりわ
ずか1000個の細菌を分離することも要望され得る。アッ
セイの場合のように比較的媒質から遊離している非磁性
粒子を得る必要があるとき、普通非磁性粒子の総容量は
媒質の５％未満であるべきである。分析質が粒子の一成
分であるかまたは粒子と結合するアッセイにおいて、一
般に分析質は約10-4〜10-14モル、さらに普通は約10-6
〜10-12モルの範囲で変化する。分析質と会合した天然
粒子以外の非磁性粒子を媒質に加える場合、濃度は、粒
子サイズおよび表面領域、分析質濃度、分析質または相
補sbpとの望ましい反応速度など多くの要因により異な
る。一般に、加えられた非磁性濃度は、約0.01〜100μg
/ml、さらに普通は約0.1〜20μg/mlである。通常、分析
質濃度、非特異結合作用、望ましい反応速度、温度、溶
解度、粘度などを考慮して他のアッセイ試薬濃度を決定
する。 一般に様々な試薬の濃度は分離されるべき粒子の興味
ある濃度範囲またはアッセイにおける分析質の濃度範囲
により決定されるが、各々の試薬の最終濃度は通常、粒
子の分離速度および範囲並びにアッセイの場合には興味
の対象である範囲を越える感受性および特異性を最も適
したものにするべく経験的に決定される。 粒子間の非特異結合を形成するための化学的手段は通
常液体媒質に含まれている。この化学的手段は普通粒子
とは反対の電荷を有するポリイオン性試薬である。加え
られるポリイオン性試薬の量は、実質的に全部の粒子が
アグリゲート（凝集）またはコアグリゲート（凝結）す
るのに充分なものであるべきである。この濃度は経験的
に決定されなければならない。一般的に過剰の試薬は粒
子の完全なアグリゲーションを防げるため、避けられな
ければならない。一般的に、ポリイオン性試薬の液体媒
質における濃度は、ポリマーと会合するイオンの数をも
たらすのに充分なものであり、これは媒質中の全粒子に
おける反対の電荷の総数と等しい。 アッセイにおいて、水性媒質はまた１個またはそれ以
上のシグナル発生系メンバーを含有し得る。前述したよ
うに、シグナル発生系の様々なメンバーの濃度は、分析
質の興味ある濃度範囲および必要な測定またはアッセイ
のタイプにより変化する。一般的なポイントとして、シ
グナル発生系の様々なメンバーの濃度は、分析質の興味
ある濃度範囲に関連して発生されるシグナルを最適にす
るように選ばれる。 非磁性粒子と磁性粒子間または磁性粒子間の結合はpH
により影響される。また結合は、他の要因、例えばイオ
ン強度およびイオン性および非イオン性ポリマーの存在
により影響される。一般的に、非特異結合が電荷相互作
用による場合、イオン強度はまず粒子間の結合を容易に
するように選ばれるべきである。このためにはイオン強
度は一般に低く、0.001〜0.5モル、好ましくは0.005〜
0.1モルの範囲内である得る。分離完了後、イオン強度
を高く調節することにより粒子および磁性粒子のカップ
リングの逆転を容易にすることができる。このために
は、媒質のイオン強度は通常約0.1〜３モル、好ましく
は約0.15〜１モルである。粒子をアグリゲートさせるか
またはけん濁状態にしておくための原則はコロイド科学
分野でよく知られている。 磁性粒子との特異的結合を必要とするアッセイのため
液体媒質において磁性粒子を合わせた後、結合が生じる
のに充分な時間液体媒質を放置する。通常、これには0.
5〜120分、より一般的には１〜60分を要する。続いて化
学的に誘発された磁性粒子の非特異的アグリゲーション
および粒子の非特異結合のみが必要なときには粒子の非
特異的コアグリゲーションが実質上即座に起こり、そし
て普通は混合物を60秒、多くの場合15秒未満放置すれば
充分である。好ましくは混合後直ちに磁場を適用する。
粒子および磁性粒子間または磁性粒子間の結合程度が磁
気分離の効率を左右する。 粒子のアグリゲーション後、磁場を適応することによ
り媒質から粒子を分離させる。媒質への磁場の適用は、
高い磁場勾配をもたらす常法にしたがい行なわれ得る。
通常、この方法は、非磁性材料、例えばガラスまたはプ
ラスチック製の容器中で行なわれる。磁場を適用する
際、反応容器は、電磁石または永久磁石、好ましくは永
久磁石に極めて接近して置かれ得るが、これはけん濁液
内の場の強さおよび勾配を最大にするジオメトリーを有
する。磁場の強さが強く勾配が高くほど分離は速くな
る。通常、約２〜50mm、好ましくは約３〜15mmの直径の
管において、少なくとも約200エルステッドおよび好ま
しくは少なくとも約１キロエルセテッドの場の強さに普
通少なくとも約20キロエルステッド/cmの磁場勾配を実
際に与える程度１個またはそれ以上の永久磁石を管に近
づけて分離を行なうのが好都合である。磁場は、粒子を
媒質から望ましい程度分離させるのに充分な時間適用さ
れる。ジオメトリー、場の強さ、粒子の磁化率などによ
り、磁場は約２秒〜１時間、好ましくは約５秒〜60秒の
間適用される。 粒子が容器の一部分に集められてしまえば、けん濁し
ている液体媒質を常套手段、例えば傾しゃ、ピペットな
どにより粒子から分離することができる。 液体媒質から分離された粒子を処理し、結合の解離を
容易にするための試薬を加えて液体媒質に粒子をけん濁
することにより粒子間の非特異結合を解離させることが
できる。一つのアプローチとして、粒子がイオン相互作
用により結合している場合、イオン強度および媒質のpH
を調節することにより結合の解離を容易にすることがで
きる。一般的に、イオン強度を高めると静電気結合は解
離される。粒子が負に帯電している場合、pHを減らすと
荷電は低下し、結合の相互作用は減少する。別法とし
て、ポリカチオン性アグリゲート剤を用いる場合、pHを
増やすと電荷を中和し、結合を解離することができる。
すなわち、pH値を試薬の安定性により許容される程度の
高いまたは低い値、普通はpH4程度またはpH10より大き
い値に変えることが望ましい。 粒子および磁性粒子間の結合の解離は、粒子間の非特
異結合の性質に左右される。非特異結合が電荷相互作用
に起因する場合、薬剤を加えることにより非特異結合の
原因である電荷相互作用を解離させることができる。例
えば、解離剤が加えられ得る。粒子が同じ電荷を有し、
反対に帯電した高分子電解質が粒子を結合させる化学的
手段であった場合、粒子上の電荷と同じ電荷の高分子電
解質を用いて粒子を解離することができる。高分子電解
質は、例えばポリアニオン類、例えばデキストランスル
フェート、ヘパリン、ポリグルタメート、ポリアクリレ
ート、燐脂質小胞、カルボキシメチルデキストランであ
り得る。用いられ得るポリカチオンの例としては、アミ
ノデキストラン、キトサン、ポリブレン、ポリエチレン
イミン、およびカチオン性リポソームがある。 ポリカチオンを用いて粒子および磁性粒子間または磁
性粒子間の非特異結合を起こした場合、ポリアニオンを
用いて結合を解離することができる。他方、ポリアニオ
ンを用いて粒子および磁性粒子間または磁性粒子間の非
特異結合を起こした場合、ポリカチオンを用いて結合を
解離することができる。例えば、ポリブレンまたはバリ
ウムイオンのようなポリカチオンを用いた場合、解離剤
は、クエン酸イオンまたは硫酸イオンのようなポリアニ
オンであり得る。デダージエントは、リポソームに対
し、また主として疎水性相互作用により粒子が非特異的
にアグリゲートしているとき解離剤として作用し得る。 解離剤の濃度は、粒子間の非特異結合の実質的または
完全な解離をもたらすのに充分なものであるべきであ
る。解離剤の濃度は一般に粒子および磁性粒子間の結合
の性質並びに粒子の性質により異なる。一般的に、解離
剤の濃度は、少なくとも粒子上のイオンまたは疎水性部
位の濃度に等しく、好ましくは少なくとも10倍高い値で
ある。 アグリゲートから解離後の粒子に対する損害を最小に
するかまたは避けるためには、アグリゲート中の粒子の
性質に従って解離剤を選ぶことが重要である。 粒子をアグリゲートから分離してしまえば、希望によ
り粒子を使用することができる。例えば、アッセイにお
いて、分離された粒子により試料中の分析質の量と関連
性のある検出可能なシグナルの存在について検査するこ
とができる。所望にしたがい使用することができる分離
された粒子は細胞であり得る。例えば、分離された粒子
は赤血球であり得る。 この発明の好ましい態様において、磁性粒子は磁性液
体、例えばフェロ流体（強磁性、含鉄流体）として提供
される。分離される粒子を磁性液体と合わせる。 この方法の重要な適用例は、細胞を含有する試料から
の細胞の除去、例えば全血からの赤血球の除去である。
この方法の場合、限定するわけではなく一例として血液
全体を用いるが、磁性粒子と細胞を非特異結合させる条
件下で全血試料を帯電した磁性粒子と液体媒質中で合わ
せる。普通、細胞は、細胞表面上のシアル酸残基などの
存在により負電荷を有している。好ましくは、磁性粒子
を負電荷を有する。この場合媒質中にポリカチオン試薬
を含有させることにより細胞および磁性粒子間の非特異
結合条件がもたらされる。この方法における有用なポリ
カチオン試薬は、例えばポリブレン、ポリアルキレンイ
ミン、アミノデキストラン、キトサンおよび正に帯電し
たリポソームであり得る。全血から細胞を除去する場合
に好ましいポリカチオン試薬はポリブレンまたはポリエ
チレンイミンである。 次に、媒質に磁場勾配を与えることにより媒質から細
胞を分離することができる。磁場を適用すると容器の一
部分に細胞−磁性粒子アグリゲートが集まるため、例え
ば傾しゃ、ピペット等により前記アグリゲートを残留細
胞不含有媒質から除去することができる。 次いで分離された細胞磁性粒子アグリゲートを前記の
ように処理することによりアグリゲートから細胞を分離
することができる。ポリカチオン性結合剤としてポリブ
レンまたはポリエチレンイミンを用いる場合、好ましい
解離剤はシトレートまたはポリアクリレートである。 この方法は、遠心分離せずに血漿を製造する方法を提
供するためオートメーション化した血液型分類方法にと
って特に有益である。また免疫グロブリン含有血漿を、
まず試験細胞と合わせ、次に血漿からの抗体が細胞と結
合したかどうかを測定するために完全に除去しなければ
ならないクームス抗グロブリンテストにおいても有用で
ある。この方法の場合、磁性粒子および非特異結合剤を
血漿および試験細胞からなる混合物に加えた後分離した
細胞を解離剤の助けにより再けん濁する。さらに、この
方法は、sbpメンバーを粒子と結合させ、そして遠心分
離せずに粒子を分離および洗浄することが望ましいイム
ノアッセイにおいて用いられ得る。粒子は、磁性または
非磁性であり得る。 この発明は、分析質を含有する疑のある試料における
分析質のアッセイに適用性を有する。分析質はsbpメン
バーである。アッセイの場合、試料をアッセイ媒質中で
分析質に相捕的なsbpメンバーと合わせるが、その際分
析質または相補的sbpメンバーの少なくとも一方は非磁
性粒子（普通、細胞、ラテックス粒子）の表面に結合し
ている。この発明の場合、磁性粒子の非特異的結合およ
びアグリゲーション条件下で帯電した磁性粒子を媒質と
合わせる点に改善が認められる。しばしば非特異結合の
条件は、ポリイオン性試薬を合わせせ磁性粒子間の非特
異結合を起こすことを含む。通常、アッセイは、試料中
の分析質の量と関連性のある検出可能なシグナルを発す
るシグナル発生系を必要とする。普通、シグナル発生系
は標識されたsbpメンバーを含む。さらに媒質を１個ま
たはそれ以上のシグナル発生系メンバーと合わせ得る
が、合わせないこともあり得る。媒質に磁場勾配を与え
ることにより媒質から磁性粒子を含むアグリゲートを分
離する。分離されたアグリゲートまたは媒質における検
出可能なシグナルの存在について検査することができ
る。このような測定の場合、上記で加えられなかったシ
グナル発生系の残りのメンバーがあればこれを加える必
要もあり得る。上記条件にしたがい分離されたアグリゲ
ートを処理することにより、検出可能なシグナルの存在
を検査する前に磁性粒子から非磁性粒子を分離すること
ができる。磁性粒子から非磁性粒子を分離した後、試料
中の分析質の量に関連して発生された検出可能な粒子の
存在について非磁性粒子を検査することができる。この
ため粒子を、検出可能なシグナルを発生するために上記
で加えられなかったシグナル発生系の残りのメンバーと
合わせ得る。 さらにこの発明は、sbpメンバーが結合しており、し
かも（ｂ）磁性粒子と非特異的に静電気結合する（ａ）
非磁性粒子のアグリゲートを含む組成物を含む。さらに
組成物は、磁性粒子および非磁性粒子（ただし非磁性粒
子および磁性粒子が同じ電荷を有する場合）と反対の電
荷を有するポリイオン性試薬を含み得る。一般的に組成
物のアグリゲートは、解離剤を用いることにより組成粒
子に解離され得る。他方、この発明の組成物は、sbpメ
ンバーと結合する磁性粒子および磁性粒子を互いに非特
異結合させるポリイオン性試薬を含み得る。 便宜のために、アッセイを行なうための試薬は、分析
質についてアッセイするとき用いるために予め測定され
た量のパッケージを組み合わせたキットの形で提供され
得る。キットは、（ａ）分析質に相補的なsbpメンバ
ー、（ｂ）分析質も相補的sbpメンバーも荷電粒子と結
合していない場合荷電粒子に結合したsbpメンバーおよ
び（ｃ）粒子が磁性でない場合荷電磁性粒子を含み得
る。またキットは、試料中の分析質の量と関連したシグ
ナルを発生させる試薬を含み得る。さらに、キットは、
全粒子が同じ電荷を有するときに粒子とは反対の電荷を
有するポリイオン性試薬を含み得る。これに加えてキッ
トはさらに、粒子間の結合を逆行させる解離剤を含み得
る。 ［実施例］ 以下実施例をあげてこの発明についてさらに記載す
る。実施例における部およびパーセンテージは特記しな
い限り容量に関するものである。温度は摂氏（℃）であ
る。 実施例１ 血漿の製造 永久磁石により生じた磁場に置かれた容器に凝固して
いない全血（480μ、16mg/ml）およびフェロ（含鉄）
流体（250μ、4.5mg（Fe）/ml）を続けて加えた。磁
場のマグニチュードは4.0キロガウスであった。磁極に
向って赤血球−粒子アグリゲートが移動し、血液中に存
在する赤血球の99％以上が除去された。澄明な血漿を傾
しゃにより別の容器に移した。175の対象から血液に関
する結果が得られた。完全な分離に要する時間は15〜85
秒の範囲で変化した。フェロ流体は、スクシニル化うし
血清アルブミンで被覆された鉄磁性粒子を主成分とし
た。フェロ流体は実施例４にしたがい製造された。実施
例４の記載と同様にスクシニル化うし血清アルブミンを
製造した。 実施例２ 抗Rh抗体アッセイ 実施例１で製造された血漿にポリアクリル酸（10μ
、2mg/ml）およびスクアレート染料で染色されたRh陽
性試験細胞を加えた。50μのスクアレート染料（10-4
モル、DMFに溶解）を赤血球1mlのけん濁液に加えた。
［スクアレート染料は、２−（ｐ−ジブチル−アミノ−
ｍ−ヒドロキシフェニル）−４−（４−ジエチルイモニ
オン−２−ヒドロキシ−2,5−シクロヘキサジエニリデ
ン）−３−オキソ−１−シクロブテノレートであり、ｎ
−ブタノール：トルエン（2:1）中スクアリン酸を３−
N,N−ジブチル−アミノフェノールと縮合し、次いで水
を共沸除去することにより製造された。］混合物を37℃
で８分間インキュベートした。次に続いて緩衝液（16g/
グリシン、0.03モルNaCl、0.015モルホスフェート、p
H6.7）（500μ）、フェロ流体およびポリブレン（10
μ、16mg/ml）を加え、前記と同じ強さの磁場の存在
下に試験細胞を分離した。（この発明によるアグリゲー
ションにより容器の端に集められた）試験細胞を緩衝液
［低イオン強度食塩水、ホスフェート（0.003モル）、p
H6.7、0.24モルのグリシンおよび0.03モルのNaCl含有］
で２回洗浄した。次にポリアクリル酸（10μ、2mg/m
l）、次いで１％ポリビニルピロリドン（PVP）含有抗ヒ
ト免疫グロブリンを加えた。３分間25℃でインキュベー
ション後、反応混合物をクエン酸（800μ、0.2モル）
で希釈し、ブリッグス等による「ジャーナル・オブ・イ
ミュノロジー」（J.Immunol.）81巻、73−81頁（1985
年）および米国特許第4564598号記載のファイバーオプ
ティック粒子血球計算法により分析した。 要するに、米国特許第4564598号の場合、興味の対象
の物質の存在または量の検出に関して分散中の粒子の存
在を測定するための方法および装置が示されている。オ
プティカルフアィバーを用いて、蛍光が受容および分析
され得る比較的小さい容量を定めている。この容量は、
予測された揺動をもたらす単一粒子のみが存在しやすい
容量と関連性を有する。試料中の分析質の存在に関連し
た蛍光揺動の変化をもたらす様々な技術を用いることに
より、存在する分析質の量が測定され得る。揺動を一定
期間にわたって静止モードで、または試料において複数
の容量を試すことにより観察する。既知量の分析質を有
するアッセイ溶液で得られた結果と上記観察結果を比較
することにより、分析質の量を定量的に測定することが
できる。 上記実験から得られた結果を要約して下表に示す。 これらの結果は、抗Rh抗体の感受性アッセイがこの発
明にしたがい行なわれ得ることを示す。 実施例３ 抗トリヨードチロニン（T3）で標識されたビーズの分離 A.試薬および略語 1.PB−αT3（125I）＝EDACカップリングにより（放射性
ヨウ素化された）抗−T3抗体で標識されたカルボキシ置
換ポリスチレンビーズ。 2.MP＝磁性粒子 ａ）PGA＝ホスフェートによりグルクロン酸で誘導体
化された磁鉄鉱（0.2〜0.8μｍ） ｂ）CM−Dex3（「Feフェロ流体」）＝カルボキシメチ
ルデキストラン−磁鉄鉱（0.030〜0.45μｍ）、米国特
許第4452773号記載と同様の方法により製造。 ｃ）M4100BioMag−COOH（0.2〜1.0μｍ）＝アドバン
スト・マグネティック社製M4100BioMag粒子、粒子の遊
離アミン基がスクシニル化。 3.ポリブレン＝ヘキサジメトリンブロミド、シグマ・ケ
ミカル社製。 4.アッセイ緩衝液＝PBS/0.1％BSA。 5.正常なヒト血清。 B.方法 55μｇのビーズを含有する250μのPB−αT3
（125I）に50μのアッセイ緩衝液または正常ヒト血清
を加えた。この混合物を室温で20分間インキュベート
後、0.2mgのFeを含有する100μのMP（PGA、CM−Dexm
またはBioMag−COOH）を加えた。この反応混合物に50μ
のポリブレン（様々な濃度で）を加えた。約３分間振
盪後、2.6キロガウスの強さを有する磁場に管を５分間
置いた。分離後、上清を傾しゃし、ベックマン（Beckma
n）ガンマ5500カウンターを用いて沈殿物を数えた。 C.結果 抗T3抗体で被覆された0.26μｍのポリスチレンビーズ
を、ポリブレンを用いて負に帯電した磁性粒子とコアグ
リゲートさせることにより反応混合物から除去。 抗T3抗体で被覆された0.51〜1.2マイクロメーターの
ポリスチレンビーズを、ポリブレンを用いて負に帯電し
た磁性粒子とコアグリゲートさせることにより反応混合
物から除去。 抗T3抗体で被覆された0.26μｍのスクシニル化ポリス
チレンビーズを、ポリブレンを用いて負に帯電した磁性
粒子とコアグリゲートさせることにより反応混合物から
除去。 D.検討 抗T3抗体で被覆されたポリスチレンビーズは、ポリブ
レンおよび磁場を用いて負に帯電した磁性粒子と非特異
的にコアグリゲートすることにより反応混合物から効果
的に除去され得ることが示された。 第２、３および４表で示された結果から、大きなポリ
スチレンビーズの方が小さいビーズよりも効率よく反応
混合物から除去され得ることがわかる。また、スクシニ
ル化および非スクシニル化ポリスチンレンビーズ間の除
去効率の差から、微粒子表面上の電荷分布がコアグリゲ
ーションすなわち除去効率に寄与することが示される。 ポリスチレンビーズの分離に対するイオン強度および
ポリスチレン濃度の影響を示す結果を第５および６表に
示す。NaCl濃度が高い場合、粒子のコアグリゲーション
およびポリスチレンビーズの除去は実質的に低下した。
これは、コアグリゲーションが負および正に帯電した基
の間の相互作用に基くものであったことを示す。第６表
は、ポリブレンの最適濃度が存在し、そして濃度が高す
ぎるかまたは低すぎるとアグリゲーションを起こす能力
が低下してしまうことを示す。 抗T3抗体で被覆されたポリスチレンビーズは（アグリ
ゲーション時間および磁性分離時間を含めて）１分以内
に反応混合物から効果的に除去され得ることが示され
た。 この方法は、例えば、抗体または抗原で標識された微
小ビーズが用いられるヘテロジニアスイムノアッセイに
おいて結合フラクションを反応混合物から除去するため
の魅力的なアプローチであり得る。 実施例４ 含鉄流体の製造 A.コロイド状磁性酸化鉄（Feフェロ流体）の製造 20mlの２モルFeCl3、10mlの２モルFeCl2および20mlの
１モルHClからなる溶液を５分間かけて撹拌しながら25m
lの濃NH4OHおよび500mlの水からなる溶液に滴下した。
沈殿が終ると上清を傾しゃした。残留物を２分間500ml
の２モルHClO4と撹拌し、再び放置した。上清を傾しゃ
し、残留物を水に吸収させ、10ミリモルのHClO4に対し
て透析した。生成したコロイドは80mlの容量で、鉄成分
は28mg/mlであった。ダイナミック光スキャッターによ
り測定された平均粒子サイズは60nmであった。参考文
献：マッサートによる、「コント・ランデユ・ド・ラカ
デミー・ド・シヤンス・パリ」（C.R.Acad.Sci.pari
s）、291C、１（1980年）。 B.蛋白質によるコロイド状磁性酸化鉄の被覆 ウサギ血清アルブミン（RSA）:11mg/ml RSAの溶液（2
ml）を上記コロイド状磁性酸化鉄と水の1:4希釈液2mlに
加えた。５分後、0.50mlの550ミリモルトリス−HCl、pH
8.0を加えた。生成したコロイドは認識できる粒状物を
含んでいなかった。 スクシニル化ウシ血清アルブミン（sBAS）：水中9.5m
g/mlのsBSA（250mlの0.1モル燐酸ナトリウム、pH8.0中
5.0gのBSAを0.20のコハク酸無水物で処理することによ
り製造）105mlの溶液を0.1モルHClO4で調節することに
よりpH3.38とした。10ミリモルHClO4中35mg/mlのコロイ
ド状磁性酸化鉄30mlの溶液を75mlの水で希釈し、sBSA溶
液に加えた。次いで溶液のpHを１モルNMe4OHによりpH9.
06に調節した。生成したコロイドの平均粒子サイズをダ
イナミック光スキャッタで測定すると63nmであった。 実施例５ フェロ流体およびラテックスビーズの凝集一連の試験
管に、100μのDC16AS（1,3−ビス［４−（ジヘキサデ
シルアミ）］−2,4−ジヒドロキシシクロブテンジイリ
ウムジヒドロキシド）、ビス（内部塩）染色カルボキシ
ルラテックスビーズ（外径0.455μ、推定値約1.5×108
ビーズ/ml、実施例７、Ａ項記載の方法により製造）（P
BS緩衝液中）、700μの希フレオン処理正常ヒト血清
（2.5％、PBS中）および100μの新たに希釈された市
販の、水ベース含鉄流体EMG805（200g）（フエロフルイ
ディクス社製、ナシュア、ニューハンプシャー、PBS中1
0％、鉄分の測定値〜17mg/ml）をピペットにより入れ
た。次いで0.011モルのβ−CD（β−シクロデキストラ
ン）を含有するPBS中0.5％ポリブレン100μをうず上
に加えた。直ちに、2.6キロガウスの磁場の強さを有す
るコーニング（Corning）磁気分離器中に試験管を置い
た。次いで異なる分離時間で、分離された液体の500μ
アリコートを試験管から採取し、等容量のPBS緩衝液
で希釈し、実施例２記載にしたがい蛍光を測定した。対
照として、磁性粒子を用いずに全蛍光を測定すると6042
0KHzであった。結果の要約を第７表に示す。 結果は、この発明によるポリブレン凝集率が１分で99
％を越えることを示す。 実施例６ フェロ流体およびラテックスビーズの凝集に対するラテ
ックスビーズ濃度の影響 実施例５と同様のプロトコルを用いた。様々な濃度の
ラテックスビーズけん濁液を調製した（約107〜1010ビ
ーズ/ml）。各ストックけん濁液100μを試験管に取っ
た。次いで各試験管に700μの希釈血清（PBS中2.5
％）および100μの希釈含鉄流体を加えた。0.001モル
のβ−CDを含有するPBS中0.5％ポリブレン100μを加
えた後、混合物を渦巻かせ（〜３秒）磁気分離器に入れ
る前に全部で10秒になるまでプレインキュベートした。
ポリブレンを加えて正確に１分後（磁気分離時間50
秒）、分離された液体の500μアリコートを採取し、1
mlに希釈し、蛍光を測定した。対照は磁性粒子を用い
ず、測定前に適当な濃度に希釈した。 結果の要約を第８表に示す。 上記実施例は、1010ビーズ/ml以下の濃度のラテック
スビーズがこの発明によると１分未満で効率的に除去さ
れ得ることを示す。 実施例７ Ｂ型肝炎表面抗原（HBsAg）のアッセイ このアッセイについて記載する前に若干の用語を定義
する。 RT−室温、 EDAC−１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カリボジイミド、 PBS−燐酸緩衝食塩水、 DTE−ジチオトリエトール、 EDTA−エチレンジアミンテトラアセテート、ナトリウ
ム塩、 BSA−ウシ血清アルブミン、 IgM−免疫グロブリンＭ、 IgG−免疫グロブリンＧ、 NHS−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、 MP−磁性粒子、 LISS−グリシン18g/リットル、燐酸カリウム230mg/リ
ットル、燐酸ナトリウム、 スクアライン染料−DC16AS。 A.スクアライン染料ラテックスビーズの製造 一律0.716ミクロン直径のカルボキシル化ポリスチレ
ン粒子（ビーズ）をデューク・サイエンティフイック社
（カリフオルニア94304、パロ・アルト）から購入し
た。粒子はダウ・ケミカル社（コロラド80239、デンバ
ー）製であり、脱イオン水中10重量％のけん濁固体およ
び痕跡量の非イオン性界面活性剤を含む15mlのバイアル
に包装されている。 染色するためにビーズを、遠心分離（15000rpm、10分
間）および上清液の傾しゃにより製造した。沈殿物をエ
チレングリコールに再けん濁して遠心分離前と同じ容量
にした。 スクアラン染料は、還流するｎ−ブタノール−ベンゼ
ン中水を共沸除去しながらスクアリン酸をジヘキサデシ
ルフェニルアミン（モル比2:1）と縮合することにより
製造された。 500マイクログラムのスクアライン染料を、140゜に維
持された油浴中に固定された小さな管またはバイアル
（磁性撹拌棒付）中の、0.5mlの熱ベンジルアルコール
に溶かした。染料溶液を1mlのエチレングリコールでゆ
っくりと希釈した。 １ミリリットルのエチレングリコールビーズけん濁液
を激しく撹拌しながら熱染料溶液を滴下した。15分間撹
拌を続けた。次いで混合物をピペットにより70％エタノ
ール水溶液５〜10mlに入れた。染色されたビーズを遠心
分離し、70％エタノールで２回洗浄し、次いで遠心分離
後ビーズを音波処理して分散させた。ビーズを脱イオン
水で２回洗浄し、次に脱イオン水中に1ml当たり固体100
mgを越えない濃度で貯蔵した。 B.アビジンビオチン相互作用によるスクアレート染色ラ
テックスビーズへの抗体付着 1.スクアレートラテックスビーズへのアビジンの共有結
合 スクアレート染色ラテックスビーズ（0.85ml、2.3×1
011ビーズ/ml、0.716μｍ直径）を2mlの蒸留水にけん濁
し、カルボキシル基を３〜４分間室温でEDAC（シグマ、
18.75mgをビーズけん濁液に加えた）と反応させること
により活性化した。次いで活性化ビーズをアビジンＤ溶
液（ベクター、アイオワ52302、マリオン、3mlの0.1モ
ルNaCl中1.5mg）に加え、ときどき音波処理しながら反
応を室温で一夜行なった。ビーズを遠心分離により洗浄
し、１％BSA（シグマ、ミズーリ63118、セントルイス、
RIAグレード）を含有する緩衝液（0.17モルグリシン、
0.1モルNaCl、pH9.2）にけん濁することによりBSAで被
覆した。ビーズを遠心分離により洗浄し、次いで１時間
室温でインキュベーションし、BSAを含まない前記緩衝
液（3ml）に再けん濁した。 ビオチン結合能14C−ビオチンを用いて測定すると６
×108個のビーズに対し77ピコモルを示した。 2.ビオチニル化抗HBsAgモノクローナル抗体の製造 抗HBsAgモノクローナル抗体IgG1（セルテクまたはロ
イヤル・フリー・ホスピタル、イギリス、ロンドン、蛋
白質Ａアフイニティー・クロマトグラフィーにより精
製、0.1モル燐酸緩衝液中1.0mg/ml、pH8.2）を室温で４
時間25倍モル過剰ビオチニル−NHS（シグマ、ミズーリ6
3118、セントルイス、DMF中3.4mg/ml）と反応させた。 3.アビジンスクアラインラテックスビーズ上におけるビ
オチニル化抗体の固定化 ビオチニル化抗HBsAgモノクローナル抗体（0.4mg、0.
1モル燐酸緩衝液、pH8.2）を室温で２時間アビジンラテ
ックスビーズ（1.25×1010ビーズ）とインキュベートし
た。遠心分離によりビーズを洗浄し、0.01モルグリシ
ン、0.01モルNaCl、pH8.2、0.2％BSA、0.05％トウィー
ン（Tween）20に再けん濁した（最終ビーズ濃度6.25×1
09/ml）。 C.スクシニル化磁性粒子の製造 200mgの磁性粒子（アドバンスト・マグネティック
社、マサチューセッツ02138、キャンブリッジ、BioMag4
100、4ml）を磁気分離により洗浄し（３×40ml 0.1モル
燐酸緩衝液、pH7.0）、15mlの上記緩衝液に再けん濁し
た。粒子をコハク酸無水物（DMF中１モル、5ml）と２時
間にわたって５アリコート加えることにより（加えるた
びにpHを7.0に調節した）反応させた。スクシニル化さ
れた粒子を磁気分離により洗浄し（３×40mlの0.1モル
燐酸緩衝液、pH7.0および２×40ml LISS）、20mlのLISS
に再けん濁し、0.02％アジドを用いて４℃で貯蔵した。 F.アッセイプロトコル 試薬 1.スクアレート染色ラテックスビーズ（直径0.716ミク
ロン、詳細な製法は前出）に共有結合した抗HBsAgIgG1
モノクローナル抗体（セルテクまたはロイヤル・フリー
・ホスピタル、イギリス国ロンドンから入手）（スクァ
ライン−ラテックスビーズ−抗HBsAg）。 2.HBsAg（アボット（Abbott）正制御、アスザイム（ASU
ZYME）II、6ng/ml）。 3.磁性粒子:Succ（スクシニル化）−BioMag（100mg/m
l）、前記と同様に製造。 4.ポリブレン（シグマ、ミズーリ63118、セントルイ
ス、平均分子量5000）LISS中10mg/ml。 5.0.2モルシトレート、pH8.2。 6.IgM抗HBsAgモノクローナル抗体（セルテク）、２×PB
S中0.5〜1.0mg/ml中。 G.アッセイ手順 1. スクアレート−ラテックスビーズ−抗HBsAg（５μ
、３×107個のビーズ含有）を100μの試料［LISS中
50％血清、抗原含有または不含有（1.5または3ng/m
l）］に加え、RTで８分間インキュベートした。 2. ラテックスビーズと磁性粒子を、10μのスクシニ
ル化BioMag、次いで10μのポリブレンを加えることに
より凝集させた。 3. 2.3キロガウス（１分）の磁場勾配においてラテッ
クス−MPコアグリゲートを磁気分離した。結果を下記第
９表に示す。 4. 50μのシトレート中でラテックス−MPコアグリゲ
ートの解離を行なった。 5. IgM抗HBsAg（５μｇ）を加え、RTで５分間インキュ
ベーションすることにより抗原依存凝集させた。 6. ラテックスビーズからスクシニル化BioMagを磁気分
離した。 7. 0.2モルのシトレート、pH8.2で希釈し、レーザ光ス
キャッタリング（Nicomp HN5−90）によりスクアライン
ラテックス凝集を測定した。結果を下記第10表に示す。 H.結果 1. 50％血清から抗HBsAg−スクアレートラテックスビ
ーズの分離効率 磁気分離後血清中に残存する抗HBsAg−スクアレート
ラテックスビーズの量を蛍光分光光度計により測定し
た。 上記結果は、この発明により媒質から染色ラテックス
ビーズが効率的に分離されたことを示す。 2. HBsAgアッセイ結果の要約を下表に示す。 上記結果は、この発明による分離法を用いてHBsAgの
感受性アッセイが行なわれ得ることを示す。HBsAgが媒
質に存在するとき、実質的に高いレベルの凝集が観察さ
れた。 実施例８ 甲状腺刺激ホルモンのアッセイ A. 略語および幾つかの材料、 TSH−甲状腺刺激ホルモン、ヒト（ｈ）、 MP−磁性粒子、 FF−フエロフルイディクス社製含鉄流体（EMG805、20
0g）、 LC−長鎖、 11C6または9D7−hTSHのαサブユニットに対するモノ
クローナル抗体、 ％Ｂ−％125I−TSH結合（特異結合）、 ％NSB−％非特異結合、 BMP−アドバンスト・マグネティック社製BioMag粒
子、 緩衝液Ａ−PBS＋0.1％BSA＋0.05％トウィーン（Twee
n）20、pH7.4、 PB−ポリブレン、 r.t.−室温、 Ab−抗体、 Ag−抗原、 血清−TSH不含有血清、イミュノーサーチ社製。 B. 125I−TSHとFF−アビジンの結合 100μのFFアビジン（FF上にアビジンを吸収させる
ことにより製造）および緩衝液Ａ中ビチオン−LC−11C
6、100μ（〜１μｇ抗体）および緩衝液Ａまたは血清
中125I−TSH100μ（〜１μg/ml）を室温で15分（緩衝
液）または25分（血清）インキュベートした。 PBS中ポリブレン50μを加えた。緩衝液の場合、PB
＝1.6mg/ml、１分間。血清の場合、PB＝25mg/ml、３分
間。 コーニング磁気分離器中で３分間材料に2.1〜2.6キロ
ガウスの磁場を用いた。材料を0.5ml PBS＋0.05％トウ
ィーン（Tween）20で１回洗浄し、MPを数えた。結果を
第11表に要約する。 上記結果は、この発明によると、アビジンと被覆され
た含鉄流体が、抗体に結合したビオチンと合わせ、ポリ
ブレンを加えて粒子を非特異的に凝集させることにより
分離され得ることを示す。 C. アビジンを加える125I−TSHとFFの結合 50μアビジン（２μｇ）、100μ125I−TSH（緩衝
液ＡまたはTSH不含有血清中）および100μビオチン−
LC−11C6（緩衝液Ａ中）をr.t.で15分間インキュベート
した。 50μのフェロ流体（〜200μのFe含有）、次いで5
0μのポリブレンを加えた。緩衝液におけるアッセイ
の場合1.6mg/ml、血清におけるアッセイの場合12.5mg/m
l。 コーニング磁気分離器中で３分間材料に2.1〜2.8キロ
ガウスの磁場を作用させ、１回洗浄し、数えた。結果を
第12表で要約する。 上記結果は、この発明により含鉄流体を、抗体に結合
したビオチンおよびアビジンとを合せ、ポリブレンを加
えて粒子を非特異的に凝集させることにより分離するこ
とができることを示す。 D. FF−アビジンとの競合的TSHアッセイ 血清中0.200ng、２μｇ、20μｇおよび200μg/mlの割
合のTSH50μ（すなわち0.10ng、100ng、１μｇおよび
10μg/アッセイ）、血清中50μの125I−TSH（2ng/m
l、0.1ng/アッセイ）、緩衝液Ａ中ビオチン−LC−9D7、
100μ（１μgAb/アッセイ）および前記にしたがい製
造されたFF−アビジンを合わせ、室温で15分間インキュ
ベートした。12.5mg/mlの割合のポリブレン50μを加
えた。３分後、材料に2.1〜2.6キロガウスの磁場を作用
させ、分離し、洗浄し、カウントした（前記と同様）。 結果を第13表に要約する。 上記結果は、この発明による分離法を用いてTSHのア
ッセイが行なわれ得ることを示す。TSHが媒質に存在す
る場合、実質的に低いパーセントの結合が観察された。 E. アビジンを加えたFFとの競合的TSHアッセイ 血清中0.200ng、２μｇ、20μｇおよび200μg/mlの割
合のTSH50μ（すなわち、0.10ng、100ng、１μｇおよ
び10μg/アッセイ）、血清中50μの125I−TSH（2ng/m
l、0.1ng/アッセイ）、緩衝液Ａ中100μのビオチン−
LC−9D7（１μgAb/アッセイ）および50μのアビジン
（２μg/アッセイ）を15分間室温でインキュベートし
た。次いで、50μのFF（200μｇのFe含有）を加え、
５分後12.5mg/mlのポリブレン50μを加えた。３分後
材料に2.1〜2.6キロガウスの磁場を作用させ、分離し、
洗浄し、カウントした（前記と同様）。 結果を第14表に要約する。 上記結果は、この発明により分離を用いてTSHのアッ
セイが行なわれ得ることを示す。TSHが媒質に存在する
場合、実質的に低いパーセントの結合が観察された。 前記発明について明確に理解できるようにある程度詳
しく実例および実施例により説明したが、ある種の変化
または修正が特許請求の範囲内で行なわれ得ることは明
らかであろう。
は粒子を流体媒質から分離する方法に関するものであ
る。この発明は、生物体液、例えば血液、リンパ液、
尿、細胞培養物等からの細胞分離に特に適用性を有す
る。 生物体液、例えば血清または尿の試料中における分析
質の存在または量を測定するための多くの技術が知られ
ている。これらの技術で最も一般的なのはインビトロア
ッセイ方法である。これらの技術の多くは、測定するべ
き分析質およびこのような分析質の標識（された）類似
体の、特異的受容体例えば抗体の結合部位への競合的結
合をともなう。これらの技術の多くは、非結合標識類似
体を結合（した）標識類似体から分離し、そして結合ま
たは非結合類似体において標識により生じたシグナルに
ついて検査する分離段階を含む。シグナルは、試料中の
分析質の量に関連して生産される。 結合または非結合フラクションを分離する技術がいく
つか知られている。例えば、結合および遊離フラクショ
ンの示差泳動、例えば、クロマト電気泳動、ゲル濾過
等、例えば有機溶媒、塩、酸等による結合または遊離フ
ラクションの化学的沈殿およびこれに続く濾過または遠
心分離、例えば二重抗体技術による結合フラクションの
免疫学的沈殿およびこれに続く濾過または遠心分離、例
えば木炭、シリケート類、樹脂等の選択吸着媒質への結
合または遊離フラクションの吸着、磁気分離技術などを
用いることができる。 一般に磁気分離法は２種の総括的カテゴリーに分類さ
れる。分離される物質が本質的に磁性を帯びている場合
の分離法が存在する。他方、磁気反応体を近づけること
により混合物の１種またはそれ以上の成分に磁性を帯び
させることができる。生化学的分離の場合、興味の対象
である物質は一般に充分には磁性を帯びていないため、
抗体、レクチンおよび他の標的粒子と結合した磁性粒子
がこれらの物質の多くを単離する為に用いられてきた。
特異的粒子に対して標的とされた磁性粒子もまた様々な
イムノアッセイに用いられている。 イムノアッセイで用いられる分離技術の多くは比較的
長くて複雑な方法である。このような方法を用いるとオ
ペレーターの効率は低下し、処理量は減少し、試験コス
トは高くつく、迅速で簡単な他の分離技術の場合、結合
および遊離フラクションを充分には識別しないため、イ
ムノアッセイには不適であるかまたは限られた数の試験
にのみ用いられ得る。 2.関連技術の記載 磁性反応性で、透過性で、固体で水に難溶性のミクロ
粒子を用いた。生物体液における物質（例、薬剤、ホル
モン、ビタミンおよび酵素）の濃度測定方法が米国特許
第4115534号に開示されている。塩化第一鉄および塩化
第二鉄からなる混合物を含む酸性水溶液にキトサンのよ
うなムコ多糖類を溶かすことにより生成される官能性磁
性粒子が米国特許第4285819号に開示されている。ミク
ロスフイアを用いてキレート形成により廃水流から溶解
したイオンを除去することができる。米国特許第393399
7号では、抗ジゴキシン抗体を磁気反応性粒子と結合さ
せる、ジゴキシンの固相ラジオイムノアッセイが記載さ
れている。米国特許第3970518号の場合、抗体層で被覆
された小磁性粒子を用いることにより特殊生物および細
胞をその集合体から選別および分離するための大きな、
そして広く分布した表面領域がもたらされる。米国特許
第4018886号の開示では、小磁性粒子を用いて溶液から
特殊蛋白質を分離するための大きくて広い分布した表面
領域を得ることにより特殊蛋白質を検出することができ
る。特殊蛋白質と特異的に相互反応する蛋白質で粒子を
被覆する。米国特許第4070246号は、生物活性蛋白質と
共有結合し得る基質に安定した水不溶性コーティングを
ほどこした組成物について記載しているが、その結果生
成物は蛋白質の生物特性および基質の構造特性、例えば
金属支持体の磁性特性を有することになる。普通に分離
可能な蛋白質−被覆粒子の混合物を用いる診断方法が米
国特許第4115535号に記載されている。メタクリル酸お
よび／またはヒドロキシエチルメタクリレートのような
親水性コモノマーによるアクロレインホモポリマーおよ
びコポリマーのミクロスフイアが米国特許第4413070号
に記載されている。米国特許第4452773号は、抗体、酵
素および他の生物粒子と共有結合し得、磁場により細胞
および他の生物粒子および分子を標識および分離するの
に用いられ得る磁性鉄−デキストランミクロスフイアを
開示している。被覆された磁化しうるミクロ粒子、その
可逆性けん濁液およびそれに関する方法が米国特許第44
54234号に記載されている。米国特許第4523996号には、
各々のイオン性ビーズが複雑に混入した強磁性物質を用
い、混合樹脂ベッドにおいてアニオン性ビーズからカチ
オン性ビーズを分離する方法が記載されている。磁性粒
子コロイドを用いる磁気分離方法が米国特許第4526681
号に記載されている。米国特許出願GB215266Aは磁気ア
ッセイ試薬を開示している。 鉄−デキイトラン粒子と抗体分子の共有結合によりつ
くられた電子高密度抗体コンジュゲートがダットン等
（1979年）「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ」（Proc.Natl.
Acad.Sci.）76:3392−2396に記載されている。イタキッ
シオス等は、「クリニカル・ケミストリー」（Clin.Che
m.）23:2072〜2079（1977年）でラジオアッセイにおけ
る磁性ミクロ粒子含有蛋白質の使用について記載してい
る。高勾配磁性クロマトグラフィーを用いる免疫特異性
鉄デキストランミクロスフイアで標識された細胞の分離
は、モルディ等による（1984年）「フェブス」（FEBS）
170:232〜238に開示されている。「ジャーナル・オブ・
イミュノロジカル・メソッズ（J.Immunol.Meth.）5:353
〜367（1982年）でモルディ等は、細胞の標識および磁
性分離に用いる免疫特異性強磁性鉄デキストラン試薬に
ついて記載している。細胞の標識および分離における磁
性ミクロスフイアの適用もまたモルディ等により「ネイ
チュアー」（Nature）268:437〜438（1977年）に開示さ
れている。ヒトアルブミンおよび生物体液の固相フルオ
ロイムノアッセイは、ナルゲッシ等により（1978年）
「クリニカ・キミカ・アクタ」（Clin.Chim.Acta.）89:
455〜460に記載されている。「クリニカ・キミカ・アク
タ「Clin.Chim.Acta.）69:387〜396（1976年）でナイ等
は固相磁性粒子ラジオイムノアッセイについて開示して
いる。「サイエンティフィック・アメリカン」（Scien.
Amer.）10:136〜194（1983年）でローゼンバイクは磁性
流体について記載している。磁性蛋白質Ａミクロスフイ
アおよび細胞分離方法におけるそれらの用途がウィッダ
ー等により（1979年）「クリニカル・イミュノロジー・
アンド・イミュノバソロジー」（Clin.Immunol.and Imm
unopath.）14:395〜400に開示されている。 ［発明の要約］ この発明による方法は、物質に極微小磁性粒子との結
合を起させることにより液体媒質から物質を分離するこ
とを目的とする。この発明は、分析質を含有する疑いの
ある試料における分析質の測定方法において利用する、
液体媒質から分散した非磁性粒子を電荷相互作用を利用
して分離する技術に関するものである。本発明によれ
ば、非磁性粒子と磁性粒子とを同種荷電し、反対荷電の
化学的手段を加えて、非特異的結合を生起させ、次に媒
質に磁場勾配を与えることにより、媒質から分析質を含
有する粒子を分離する。 達成され、可逆性である。 この発明による方法は、有機および生化学分析質特に
体液分析において必要となる分析質のアッセイに特に適
用性を有する。特に利用価値が高いのは、分析質が粒子
表面と結合した、または結合し得る特異的結合対（sb
p）のメンバーである場合のアッセイである。分析質が
表面成分であるかまたは非磁性粒子と結合している場
合、この方法は、非磁性および磁性粒子を結合し、磁性
粒子の非特異的凝集を化学的に誘発する条件下で、アッ
セイ媒質中で、試料、分析質が非磁性粒子と結合すると
きにはこの非磁性粒子および磁性粒子を合わせることを
含む。非磁性粒子または磁性粒子は通常sbpメンバーと
結合している。非磁性粒子のsbpメンバーが分析質に対
して相補的でない場合、相補sbpメンバーもまた加えら
れる。次に、アッセイ媒質に磁場勾配を与えることによ
り媒質から粒子を分離する。分離後、sbpメンバーの存
在または量について媒質または粒子を検査するが、これ
は試料中の分析質の存在により影響される。通常、sbp
メンバーは、試料中の分析質の量に関係（比例）してシ
グナルを発するシグナル発生系を用いることにより生じ
たシグナルを通じて検出される。媒質から分離された粒
子を試験前に洗浄することができる。さらに、粒子を媒
質から分離後、続いて処理することにより粒子の非特異
結合を解離することができる。 この発明による方法は、非磁性粒子と磁性粒子の化学
的に制御された非特異的可逆結合により媒質から非磁性
粒子を分離する方法を提供する。磁性粒子のサイズが小
さいため、分離されるべき物質の非常に速い結合もまた
もたらされる。次に粒子をアグリゲートすることにより
従来の方法を用いた場合よりもかなり速くて完全な磁気
分離が達成される。 この発明は、本発明方法を行なうための、特に分析質
を含有する疑のある試料における分析質の測定アッセイ
を行なうための組成物およびキットを包含する。 ［実施態様の記載］ この発明は、液体媒質からけん濁した粒子に結合した
物質を分離する方法に関するものである。この方法に
は、荷電磁性粒子および荷電磁性粒子相互の化学的に制
御された非特異結合が関与する。普通、分離されるべき
物質は荷電非磁性粒子に結合しているかまたは結合させ
られる。荷電非磁性粒子および荷電磁性粒子間または磁
性粒子間の荷電非特異結合を達成するための好ましいア
プローチは電荷相互作用である。結合した粒子は磁場勾
配の使用により媒質から分離される。分離された粒子は
洗浄され、物理的または化学的方法により試験され得
る。また粒子を処理して非特異結合を解離させることも
できる。非磁性粒子を用いる場合、結合解離後遊離磁性
粒子を分離することにより磁性粒子からの非磁性粒子分
離が行われる。 本発明方法は、けん濁した粒子を媒質から分離する分
野、特に細胞および微生物のような生物学的物質を分離
する分野並びにイムノアッセイおよび血液型分類の分野
に広い適用性を示す。この発明は、遠心分離、濾過およ
び従来の磁気分離方法よりも便利で速く、また粒子不含
有液体媒質または分離された粒子の分析を行なうことが
望まれる場合のけん濁液の前処理に特に適用できる分離
方法を提供する。またこの発明は、分離段階が必要とさ
れる場合の試料中の分析質アッセイに対する適用性も有
する。 さらに本発明の実施態様の記載を行なう前に、若干の
用語の定義を行なう。 分析質（アナライト）…測定されるべき化合物または組
成物、興味ある物質。分析質は、特異的結合対（spb）
のメンバーであり得、また配位子（リガンド）であり得
るが、これは一価または多価で、普通抗原性またはハプ
テン性であり、また少なくとも１個のエピトープまたは
決定部位を共通にする単一化合物または複数の化合物で
ある。また分析質は、粒子の成分であり得るがまたはア
ッセイ中に粒子と結合し得る。粒子の成分である分析質
の例は、血液群抗原（Ａ、Ｂ、AB、Ｏ、Ｄ等）のような
細胞表面の抗原またはHLA抗原である。アッセイ中に粒
子と結合する分析質の例は、相補sbpメンバーが、粒
子、レクチンが粒子と結合している場合糖蛋白質または
グリコリピド、プロテインＡが粒子と結合している場合
抗体などである場合のsbpメンバーである。分析質が粒
子と結合しているときに必要な結合は、特異的または非
特異的、免疫学的または非免疫学的であり得る。 多価配位子分析質は普通、ポリ（アミノ酸）、すなわ
ちポリペプチドおよび蛋白質、多糖類、核酸およびこれ
らの組み合わせである。このような組み合わせは、細
菌、ウイルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、核、
細胞膜等の成分を含む。 分析質の幾つかの正確な性質およびその多くの例は、
トリマン等による米国特許第4299916号、特にカラム16
〜23に記載されている。 大抵の場合、本発明で用いられるポリエピトープ配位
子分析質は少なくとも約5000、さらに普通は少なくとも
約10000の分子量を有する。ポリ（アミノ酸）カテゴリ
ーの場合、興味あるポリ（アミノ酸）は一般に約5000〜
5000000の分子量、さらに普通は約20000〜1000000の分
子量を有する。興味あるホルモンの中で、分子量は普通
約5000〜60000分子量の範囲である。 類似した構造上の特徴を有する蛋白質、特定の生物学
的機能を有する蛋白質、特異的微生物特に病気の原因と
なる微生物と関連のある蛋白質等の分類に関して広範な
種類の蛋白質が考えられ得る。 一般にモノエピトープ配位子分析質は約100〜2000の
分子量、さらに普通は125〜1000の分子量である。興味
ある分析質には、薬剤、中間代謝物、農薬、汚染物質な
どがある。興味深い薬剤にはアルカロイド類が挙げられ
る。アルカロイド類には、モルヒネ、コデイン、ヘロイ
ン、デキストロメトルファン、それらの誘導体および中
間代謝物を含むモルヒネアルカロイド類、コカインおよ
びベンゾイルエクゴニン、それらの誘導体および中間代
謝物を含むコカインアルカロイド類、リセルグ類ジエチ
ルアミドを含む麦角アルカロイド類、ステロイドアルカ
ロイド類、イミナゾイルアルカロイド類、キナゾリンア
ルカロイド類、イソキノリンアルカロイド類、キニンお
よびキニジンを含むキノリンアルカロイド類、ジテルペ
ンアルカロイド類、それらの誘導体および中間代謝物が
ある。 次群の薬剤には、ステロイド類、例えばエストロゲ
ン、エストゲン、アンドロゲン、アンドレオコルチカル
ステロイド、胆汁酸、強心性グリコシドおよびアグリコ
ン、例えばジゴキシンおよびジゴキシゲニン、サポニン
およびサポゲニン、それらの誘導体および中間代謝物が
ある。またジエチルスチルベストロールのようなステロ
イド疑似物質も含まれる。 次群の薬剤には、バルビツエート類、例えばフェノバ
ルビタールおよびセコバルビタール、ジフェニルヒダン
トニン、プリミドン、エトサクシミドおよびそれらの中
間代謝物を含む、５〜６員環のラクタムがある。 次群の薬剤には、２〜３個の炭素原子を有するアルキ
ルを含むアミノアルキルベンゼン類、例えばアンフェタ
ミン、カテコールアミン、例えばエフェドリン、Ｌ−ド
ーパ、エピネフリン、ナルセイン、パパベリンおよびそ
れらの中間代謝物がある。 次群の薬剤には、ベンズ複素環、例えばオキサゼパ
ム、クロルプロマジン、テグレトール、イミプラミン、
それらの誘導体および中間代謝物があり、複素環はアゼ
ピン、ジアゼピンおよびフェノチアジンである。 次群の薬剤には、プリン類、例えばフオフイリン、カ
フェイン、それらの中間代謝物および誘導体がある。 次群の薬剤には、カンナビノールおよびテトラヒドロ
カンナビノールを含む、マリファナから得られたものが
ある。 次群の薬剤には、ビタミン類、例えばＡ、Ｂ、例えば
B12、Ｃ、Ｄ、Ｅおよび、Ｋ、葉酸、チアミンがある。 次群の薬剤には、水酸化および不飽和性の程度および
部位が異なるプロスタグランジン類がある。 次群の薬剤には、抗生物質、例えばペニシリン、クロ
ロマイセチン、アンチノマイセチン、テトラサイクリ
ン、テラマイシン、それらの中間代謝物および誘導体が
ある。 次群の薬剤には、ヌクレオシドおよびヌクレオチド、
例えば適当な糖および燐酸置換基を有するATP、NAD、FM
N、アデノシン、グアノシン、チミジンおよびシチジン
がある。 次群の薬剤には、種々雑多な個々の薬剤、例えば、メ
タドン、メプロバメート、セロトニン、メペリジン、ア
ミトリプチリン、ノルトリプチリン、リドカイン、プロ
カインアミド、アセチルプロカインアミド、プロプラノ
ロール、グリセオフルビン、バルプロ酸、ブチロフェノ
ン、抗ヒスタミン剤、抗コリンエステラーゼ剤、例えば
アトロピン、それらの中間代謝物および誘導体がある。 疾患状態と関連のある中間代謝物には、スペルミン、
ガラクトース、フェニルピルビン酸およびポルフイリン
タイプ１がある。 次群の薬剤には、アミノグリコシド類、例えばゲンタ
マイシン、カナマイシン、トブラマイシンおよびアミカ
シンがある。 興味深い農薬には、ポリハロゲン化ビフェニール類、
燐酸エステル類、チオホスフェート類、カルバメート
類、ポリハロゲン化スルフェナミド類、それらの中間代
謝物および誘導体がある。 受容体分析質の場合、分子量は一般に10000〜２×1
08、さらに普通は10000〜106の範囲である。免疫グロブ
リン、IgA、IgG、IgEおよびIgMの場合、一般に分子量は
約160000〜約106の範囲である。酸素は通常約10000〜10
00000の範囲の分子量を有する。天然受容体は広範に変
化するが、一般に少なくとも約25000の分子量であり、1
06またはそれ以上の分子量であり得、例えばアビジン、
DNA、RNA、チロキシン結合グロブリン、チロキシン結合
プレアルブミン、トランスコルチン等のような物質が挙
げられる。 配位子類似体または分析質類似体…受容体に対して類似
配位子または分析質と競合し得る修飾された配位子もし
くは配位子代用物または修飾された分析質もしくは分析
質代用物。修飾により配位子類似体または分析質類似体
を別の粒子と結合させる手段がもたらされる。普通、配
位子類似体または分析質類似体は、配位子類似体または
分析質類似体をハブ（hub）または標識と連結する結合
により１個以上の水素を置換する以外の点でも配位子ま
たは分析質とは異なるが、これは必要なことではない。
配位子代用物または分析質代用物の語は、配位子または
分析質と相補的な受容体を非特異結合する能力を有する
化合物を意味する。すなわち、配位子代用物または分析
質代用物は、配位子または分析質と同様に受容体と結合
することができる。例えば代用物は、配位子または分析
質に対する抗体のイデイオタイプに対する抗体であり得
る。 ポリ（配位子類似体）…一緒になって通常ハブ核と共有
結合した複数の配位子類似体。ハブ核は多官能性物質で
あり、普通結合部位として複数の官能基、例えばヒドロ
キシル、アミノ、メルカプト、エチレン基等を有する通
常はポリマーである。ハブ核は、水溶性または水不溶
性、好ましくは水溶性であり得、通常少なくとも約3000
0の分子量であり、1000万またはそれ以上の分子量であ
り得る。ハブ核の例としては、多糖類、ポリペプチド類
（蛋白質を含む）、核酸類、アニオン交換樹脂などがあ
る。また水に不溶性のハブ核には、容器壁、例えばガラ
スまたはプラスチック、ガラスビーズ、付加および縮合
ポリマー、セファデックス（Sephadex）およびアガロー
ス（Agarose）ビーズなどがある。 特異的結合対のメンバー（「sbpメンバー」）…表面ま
たは空洞部分に、特異的結合することにより他方の分子
の特定の空間的および極性機構と相補的なものとして定
義される領域を有する２種の異なる分子の一方の分子。
特異的結合対の成分を配位子（リガンド）および受容体
（抗配位子、アンチリガンド）と称する。これらは普通
抗原と抗体のような免疫学的対の成分であるが、免疫学
的対ではない他の特異的結合対、例えばビチオンとアビ
シン、ホルモンとホルモン受容体、核酸デュプレック
ス、IgGとプロテインＡ、DANとDAN、DNAとRNAなどもこ
の発明に含まれる。 配位子（リガンド）…受容体が天然に存在するかまたは
製造され得る有機化合物。 受容体（「アンチリガンド」）…分子の特定の空間的お
よび極性機構、例えばエピトープまたは決定部位を認識
することができる化合物または組成物。受容体の例に
は、天然受容体、例えばチロキシン結合グロブリン、抗
体、酸素、Fab断片、レクチン、核酸、プロテインＡ、
補体成分C1qなどがある。 非磁性粒子…普通１×105emu/0ecm3未満の磁化率（χ）
を有する反磁性または常磁性粒子。一般に非磁性粒子は
少なくとも約0.02ミクロン以上で約100ミクロン未満、
通常少なくとも約0.05ミクロン以上で約20ミクロン未
満、好ましくは約0.3〜10ミクロンの直径を有する。非
磁性粒子は、有機または無機で、膨張性または非膨張
性、多孔性または非多孔性で、好ましくは水に近い密
度、一般的には約0.7〜約1.5g/mlであり、透明、部分的
に透明または不透明であり得る物質を成分とし得る。普
通、非磁性粒子はプラスまたはマイナスの電荷を有し、
表面にsbp成分を有し得る。通常、非磁性粒子は、細胞
および微生物のような生物学的物質、例えば赤血球、白
血球、リンパ球、ハイブリドーマ、連鎖球菌（ストレプ
トコッカス）、スタフィロコッカス・アウレウス（Stap
hylococcus aureus）、大腸菌（エシエリヒア・コリ E.
coli）、ウイルスなどである。また、非磁性粒子は、有
機および無機ポリマー、リポソーム、ラテックス粒子、
リン脂質小胞、キロミクロン、リポ蛋白質などからなる
粒子でもあり得る。 通常、ポリマー（重合体）は付加または縮合ポリマー
である。これらに由来する非磁性粒子はアッセイ媒質に
容易に分散可能であり、また、吸着性または官能性化し
得るものであるため直接的または間接的にsbp成分また
は磁性粒子を結合できる。 非磁性粒子は、分析質であるか、分析質と結合してい
るか、またはアッセイ（実施）中に分析質と結合するこ
とが多い。最初分析質と結合していない非磁性粒子は、
天然物質、合成修飾された天然物質および合成物質から
得ることができる。特に興味深い有機ポリマーには、多
糖類、特に交叉結合した多糖類、例えばアガロース［セ
ファロース（Sepharose）の名できる市販されてい
る］、デキストラン［セフアデックス（Sephadex）およ
びセファクリル（Sephacryl）として市販されてい
る］、セルロース、澱粉などがある。付加重合体には、
例えばポリスチレン、ポリビニルアルコール、アクリレ
ートおよびメタクリレート誘導体のホモポリマーおよび
コポリマー、特に遊離ヒドロキシル官能性を有するエス
テルおよびアミド等がある。 アッセイで用いる非磁性粒子は普通多官能性であり、
sbpメンバー、例えば抗体、アビシン、ビオチン、レク
チン、プロテインＡなどと結合してしまうかまたは特異
的非共有結合し得る。広範な種類の官能基が用いられ得
るかまたは結合され得る。官能基には、カルボン酸、ア
ルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキ
シル基、メルカプト基などがある。広範な種類の化合物
と粒子の結合形式はよく知られており、文献に詳細に示
されている。例えばカウトレカサス、「ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー」（J.Biol.Chem.）
245巻、3059頁（1970年）参照。結合基の長さは広い範
囲で変化し得、結合される化合物の性質、sbpメンバー
および分析質の結合上の結合される化合物および粒子間
の距離の影響などにより異なる。 通常非磁性粒子はプラスまたはマイナスの電荷を有す
る。粒子は、本質的に荷電し得るかまたは化学的もしく
は物理的処理により電荷が取り込み得る。例えば、カル
ボキシル、スルホネート、ホスフェート、アミノなどの
ような基は、当業界で公知の技術により粒子と化学的に
結合するかまたは粒子上に形成され得る。細胞は、通常
細胞表面にシアル酸残基が存在するため負電荷を帯びて
いる。ラテックス粒子は正または負電荷を帯び得るが、
通常、官能基の導入または荷電ポリマー例えばポリペプ
チド、蛋白質、ポリアクリレートなどの吸収の結果負電
荷を有する。 非磁性粒子は、蛍光性または非蛍光性であり得、普通
は非蛍光性であるが、直接蛍光化されるかまたは蛍光化
合物もしくは蛍光剤を常法で粒子と結合させることによ
り蛍光性となり得る。普通、蛍光剤を溶かし入れるかま
たは非磁性粒子と共有もしくは非共有結合させ、実質的
に均等に粒子に結合させることが多い。蛍光化されたラ
テックス粒子は米国特許第3853987号に記載されてお
り、コバレント・テクノロジー社からコバスフィア（Co
vasphere）として市販されている。 興味深い蛍光剤は、一般に約350nm、普通約400nmおよ
び好ましくは約450nmの波長の光を放射する。望ましく
は、蛍光剤は高い量子収率、大きなストークシフトを有
し、またコンジュゲートおよび使用条件下化学的に安定
している。蛍光剤の語は、電磁放射による活性化または
化学的活性化の際に光を放射する物質を含むものとし、
蛍光性および燐光性物質、シンチレーターおよび化学光
物質が含まれる。 興味ある蛍光剤は、ある種の１次官能性を有する様々
なカテゴリーに分類される。これらの１次官能性には、
１−および２−アミノナフタレン、p,p−ジアミノスチ
ルベン類、ピレン類、第４級フェナントリジン塩類、９
−アミノアクリジン類、p,p′−ジアミノスチルベン
類、イミン類、アントラセン類、オキサカルボシアニ
ン、メロシアニン、３−アミノエキレニン、ペリレン、
ビス−ベンズオキサゾール、ビス−ｐ−オキサゾリルベ
ンゼン、1,2−ベンゾフェナジン、レチノール、ビス−
３−アミノピリジニウム塩類、ヘレブリゲニン、テトラ
サイクリン、ステロフェノール、ベンズイミダゾリルフ
ェニルアミン、２−オキソ−３−クロメン、インドー
ル、キサンテン、７−ヒドロキシクマリン、4,5−ベン
ズイミダゾール、フェノキサジン、サリチレート、スト
ロファンチジン、ポルフイリン類、トリアリールメタン
類、フラビン並びに希土類元素キレート酸化物および塩
がある。蛍光剤の例は米国特許第4318707号カラム７お
よび８に列挙されているが、この内容を引用して説明の
一部とする。またスクアライン染料も蛍光剤として有用
であり、1985年９月６日出願の米国特許出願第773401号
（これは、1985年９月６日の優先権主張の1986年９月５
日出願されたヨーロッパ特許出願第86306859.9、日本特
許出願第210516/1986号、オーストラリア特許出願第623
65号およびカナダ特許出願に対応するもので、発明の名
称は「スクアレート染料を用いた新規配位子受容体アッ
セイ」で当社の表示番号は25200である）に記載されて
いる。この関連文献は、スクアレート染料および特異的
結合対（spb）のメンバーの新規コンジュゲートを開示
しており、これらは特異的結合対メンバー分析質を含む
疑のある試料におけるこのような分析質の存在または量
を測定するアッセイで用いられるとしている。スクアレ
ート染料は、当技術分野で周知の技術によりsbpメンバ
ーにコンジュゲートさせ得る。 さらに、少なくとも直径約10nmの固体難溶性粒子であ
る光吸収性非磁性粒子を用いることができる。 多くの異なる型の粒子が使用され得る。特に興味深い
ものは、炭素粒子、例えば木炭、ランプブラック、グラ
ファイト、コロイド状炭素などである。炭素粒子以外に
金属ゾル、特に貴金属、金、銀、および白金のゾルも使
用され得る。 標識…sbpメンバーとコンジュゲートするシグナル発生
系のメンバー。標識は、アイソトープまたは非アイソト
ープ、普通は非アイソトープであり得、触媒、例えば酵
素、色素原、例えば蛍光剤、染料または化学発光剤、放
射性物質、粒子などがある。 シグナル発生系…シグナル発生系は、１個またはそれ以
上の成分を含み得、少なくとも一成分が標識である。シ
グナル発生系は、試料中の分析質の存在または量に関連
するシグナルを発する。シグナル発生系は、測定可能な
シグナルを発生するのに必要な試薬をすべて含む。標識
が分析質と類似のsbpメンバーにコンジュゲートされな
い場合、通常標識は分析質と類似のsbpメンバーに相補
的なsbpメンバーに結合する。シグナル発生系の他の成
分には、基質、エンハンサー、活性剤、化学発光化合
物、コファクター、阻害剤、スカベンジャー、金属イオ
ン、シグナル発生物質の結合に必要な特異的結合物質な
どが含まれ得る。シグナル発生系の他の成分は、補酵
素、酵素製品および他の酵素および触媒と反応する物質
などであり得る。シグナル発生系は、外的手段により、
好ましくは粒子のアグリゲーション程度の測定により、
または電磁放射の使用により、望ましくは視覚試験によ
り検出可能なシグナルを提供する。大抵の場合、シグナ
ル発生系は、粒子、例えば蛍光粒子または他の光吸収粒
子、発色基質および酵素を含むが、発色基質は、紫外線
もしくは可視領域の光を吸収する染料、燐光体、蛍光剤
または化学発光剤に酵素変換される。 シグナル発生系は、少なくとも１種の触媒、普通は酵
素および少なくとも１種の基質を含み得、また２種また
はそれ以上の触媒および複数の基質を含み得、また酵素
の組み合わせを含み得るが、ただしこの場合一方の酵素
の基質は他方の酵素の生成物である。シグナル発生系の
作用は、試料中の分析質の量に関連した検出可能なシグ
ナルを提供する生成物をもたらすことである。 シグナル発生系に有用な多数の酵素および補酵素は、
米国特許第4275149号（カラム19〜23）および米国特許
第4318980号（カラム10〜14）に示されている。幾つか
の酵素組み合わせは米国特許第4275149号カラム23〜28
に記載されているが、これらの組み合わせは本発明でも
用いられ得る。 特に興味深いものは、過酸化水素の生成および染料前
駆体を酸化して染料とするための過酸化水素の使用にと
もなう酵素である。特定の組合わせには、サッカリドオ
キシダーゼ、例えばグルコースおよびガラクトースオキ
シダーゼまたは複素環オキシダーゼ、例えばウリカーゼ
およびキサンチンオキシダーゼを、過酸化水素を用いて
染料前駆体を酸化する酵素、すなわちペルオキシダーゼ
例えば西洋わさび（ホースラディッシュ）ペルオキシダ
ーゼ、ラクトペルオキシダーゼまたはミクロペルオキシ
ダーゼと結合したものが含まれる。前記以外の酵素の組
合わせは、引用された内容に含まれている。単一酵素を
標識として用いるとき、他の酵素、例えばヒドロラー
ゼ、トランスフェラーゼおよびオキシドレダクターゼ、
好ましくはアルカリ性ホスフアターゼおよびβ−ガラク
トシダーゼのようなヒドロラーゼを用いることができ
る。別法として、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフ
エラーゼおよび細菌ルシフェラーゼを用いることができ
る。 使用される補酵素の例には、NAD［Ｈ］、NADP
［Ｈ］、燐酸ビリドキサール、FAD［Ｈ］、FMN［Ｈ］等
があり、普通、補酵素は閉環反応をともなうが、詳しく
は米国特許第4318980号参照。 酵素反応の生成物は、普通は染料または蛍光剤であ
る。多数の蛍光剤の例が米国特許第4275149号（カラム3
0および31）に示されている。 磁性粒子…本質的に磁気反応性であるか、または例えば
磁気反応性物質に付着させるかまたはこのような物質を
粒子に混入することにより磁性化された粒子。磁性粒子
は、常磁性、強磁性または超常磁性、普通は常磁性であ
り得、少なくとも５×105emu/0ecm3は、普通は少なくと
も４×104emu/0ecm3の磁化率（ｘ）を有する。粒子の直
径は小さく、一般的には約5nm〜１ミクロン、好ましく
は約10〜250nm、さらに好ましくは約20〜100nmの範囲で
あり、最も好ましくはコロイド状である。 本質的に磁性または磁気反応性である粒子の磁気成分
の例には、錯塩および高い磁化率を有する鉄、コバル
ト、ニッケルおよび希土類元素の酸化物、ホウ化物およ
び硫化物、例えば赤鉄鉱、フェライトがある。他のこの
ような粒子の磁気成分には、純金属またはこれらの元素
の１個またはそれ以上を含む合金がある。 大抵の場合磁性粒子は、ヒドロキシル、シリケート、
カルボキシレート、スルフェート、アミノ、ホスフェー
ト等のような表面官能基をともなう磁気成分のコアを含
む。表面と共有または非共有結合した付加的表面コーテ
ィングを用いることが多い。表面コーティングは、アニ
オン性またはカチオン性の、普通はアニオン性のデター
ジェントであり得る。またはコーティングは、蛋白質、
例えばアルブミン、免疫グロブリン、アビジン、フエツ
インなどであり得る。またはコーティングは炭水化物、
例えばデキストラン、キトサン、アミロースなど、また
はこれらの組み合わせまたはこれらの物質の自然形態ま
たは電荷および親水性を制御するために官能性化された
形態であり得る。別法として、粒子は、リポ多糖類、オ
クチルグルコシド等のような他の両親媒性物質で被覆さ
れ得る。 別法として、磁気成分は、例えば、ポリマー性マトリ
ックスに物質を含浸させるなど、粒子に混入され得る。
しかしながら、この方法は、この発明の磁性粒子より大
きな粒子をもたらすことが多い。この方法による磁性粒
子の製造のさらに詳細な記載は、ホワイトサイド等、
（1983年）「トレンズ・イン・バイオテクノロジー」
（Trends in Biotechnology）、１巻（５）、144〜148
頁およびそこに引用された参考事項に見られる。 直径が100ナノメーター未満の好ましい磁性粒子は、
多糖類または蛋白質のようなコーティングの存在または
非存在下に酸化鉄を沈殿させることにより製造され得
る。直径が数ミクロンの磁性粒子もまたボールミル方法
を行ない、興味あるサイズ範囲外の物質を除去すること
により製造され得る。一般的に、この後者の方法で生成
した磁性粒子は、全く多分散性であるため一般に有用性
のあるものではない。これより有用な単分散性金属酸化
物けん濁液は、沈殿プロセス中においてpH、温度および
濃度を注意深く制御することにより製造され得る。磁性
粒子を巨大分子で被覆すると、粒子のコロイド安定剤を
増すことができる。これは、高分子量ポリマーの直接吸
着によるかまたは粒子表面を官能化し、次いで巨大分子
を官能基と結合させることにより行なわれ得る。エマル
ジョンポリマー化およびグラフト技術により磁性粒子を
ポリマーで被覆する手段が得られる。 一般に、所定の課題に最善である磁性粒子は、第一に
分離されるべき粒子のサイズおよび特性により決定され
る。イムノアッセイまたは細胞単離の場合、磁性粒子は
好ましくは容易にけん濁可能であり、安定した、好まし
くはコロイド状のけん濁液を形成し、高い磁化率を有し
ているべきである。sbpメンバーが表面と結合している
場合、相補的spbとの結合能力が保有され、時間が経過
しても安定しているべきである。 小さい（＜100nm）磁性粒子は、イムノアッセイおよ
び細胞分離方法において有利に用いられる。これらの粒
子は、好ましくは金属、金属酸化物または他の金属化合
物の均質コアを有する。コロイド状で安定していると
き、小粒子は長時間けん濁し得る。表面対容量の比類が
大きく、拡散速度が比較的高いため、粒子は媒質に分散
している分子および粒子と急速に結合できる。また小磁
性粒子は、大きな適用磁場にさらされた後の残余磁気モ
ーメントのために大きな磁性粒子よりもアグリゲーショ
ンしにくい。また、このような小粒子をコロイド状で安
定させる方法も知られている。 また、中間サイズ（100〜1000nm）の磁性粒子を用い
ることもできる。これらは容易にけん濁し得、これらよ
り小さい粒子の場合よりも低い表面荷電密度で自発的ア
グリゲーションを妨げ得る。このサイズ範囲の磁性粒子
は、エマルジョンポリマー化により製造され得、グラフ
ティングによろうと、巨大分子と表面の共有結合によろ
うと表面が容易に修飾されるという利点を有する。しか
しながら、これらの粒子はけん濁している時間が短く、
また表面対容量の比率が低いため分離されるべき物質と
の結合速度が減少する。 磁性流体…磁場により容易には分離されない液体担体中
磁性粒子のコロイドけん濁液。生成した液体は、磁性物
質のバルク（bulk）特性を有する。流体は、外部磁場の
存在下で自発的に磁化する。またこの液体は、流体とし
て作用し、容器の形をとり、流動し、障害物のまわりを
動くことができる。磁性流体の例としては、けん濁した
粒子が強磁性粒子であるフェロ（含鉄または強磁性）流
体（ferrofluid）がある［例えば、ローゼンバイク、前
出および米国特許第4019994号（この内容を引用して説
明の一部とする）、およびカラフルオラ等、（1980年）
「IEEE・トランサクションズ・オン・マグネティックス
（Transactions on Magnetics）、MAG−16」178−183頁
参照］。 コロイド磁性粒子は、蛋白質物質等、例えば血清蛋白
質例えばアルブミン、ガンマグロブリン等で被覆され得
る。コロイド磁性粒子を蛋白質の水性緩衝液と混合する
ことにより蛋白質被覆コロイド磁性粒子を製造すること
ができる。物理的（例、吸収）または化学的結合により
磁性粒子を蛋白質で被覆することがてきる。 非特異（的）結合…特異的表面構造が相対的に独立し
たものである粒子間の非共有結合。普通、このような非
特異的結合は、同種電荷を有する粒子間では粒子と反対
の電荷を有する化学的手段、例えば、ポリイオン性試薬
を用いる場合における電荷相互作用の結果生じるもので
ある。また非特異結合は粒子間の疎水性相互作用の結果
でも生じ得る。 ポリイオン性試薬…無機または有機、天然または合成
で、少なくとも２個の同じ電荷、ポリアニオンまたはボ
リカチオン、好ましくは少なくとも10個の同じ電荷を有
する化合物、組成物または素材、例えば高分子電解質。 ポリカチオン性試薬の例としては、ポリアルキレンア
ミン類例えばポリエチレンイミンおよびポリプロピレン
イミン並びにそれらの低級アルキルアンモニウム塩類例
えばポリブレン、（−Ｎ（CN3）2CH2CH2N（CH3）2CH2CH
2CH2CH2−）ｎ、金属イオン、例えばカルシウムおよび
バリウムイオン、アミノデキストラン、プロタミン、正
電荷リポソーム、ポリリジンなどがある。 ポリアニオン性試薬の例としては、ヘパリン、デキス
トランスルフェート、負電荷燐脂質小胞、ポリカルボン
酸、例えばポりアクリレート、ポリグルタメートなどが
ある。前記の物質およびそれらのまたは単離法は当業界
ではよく知られており、多くは市販されている。 解離剤…粒子間の非特異結合を解離させる、すなわち粒
子を解離することができる天然または合成、有機または
無機の化合物、組成物または素材。解離剤は、粒子間の
非特異結合に作用する。例えば、非特異結合が電荷相互
作用によるものである場合、解離剤は培地のpH値を電荷
相互作用に不適または相容れない値に変えることができ
る。したがって解離剤は、無機酸もしくは有機酸のよう
な酸または無機塩基もしくは有機塩基のような塩基であ
り得る。他方、解離剤はイオン相互作用を防御すること
ができるため高イオン強度溶液またはデキストランのよ
うな中性ポリマー溶液であり得る。他方、解離剤は、粒
子および磁性粒子間の非特異結合を崩壊する電荷を有し
得る。この例としては、高分子電解質塩、例えばクエン
酸塩、ポリアクリレート、デキストランスルフェートな
どがある。ポリイオンブリッジにより粒子が結合してい
る場合、解離剤は、反対の電荷を有するポリイオン性剤
であるかまたはポリイオン試薬を解重合する試薬であり
得る。 補助物質…様々な補助物質がこの発明によるアッセイで
用いられることが多い。例えば、通常、アッセイ媒質に
は緩衝剤並びにアッセイ媒質およびアッセイ成分に対す
る安定剤が存在する。これらの添加物に加えて、さらに
蛋白質、例えばアルブミン、または界面活性剤、特に非
イオン性界面活性剤、結合促進剤等、例えばポリアルキ
レングリコール類がしばしば含まれ得る。 本発明は、液体媒体中で荷電非磁性粒子と荷電磁性粒
子を合わせ、荷電磁性粒子を荷電非磁性粒子と結合さ
せ、さらに当該媒質を磁場勾配にかけて、媒質から結合
粒子を分離することよりなる、分析質を含有する疑のあ
る試料における分析質の測定方法において利用する、液
体媒質から分散した荷電非磁性粒子を分離する方法であ
って；当該磁性粒子を当該荷電非磁性粒子と同種荷電さ
せ、当該媒質中でそれらを合わせた後、非磁性粒子と磁
性粒子を電荷相互作用により非特異的に結合させるため
に、反対荷電のポリイオン性試薬のような化学的手段を
その媒質に加えて結合を生起させることを特徴とする方
法、ならびに該分離方法を利用する測定方法、測定用組
成物、および測定用キットである。 前述したように、この発明は液体媒質から物質を分離
する方法を含む。この方法は物質を荷電磁性粒子と結合
させ、荷電磁性粒子を非特異的結合およびアグリゲート
させる条件下で（ただし化学的手段を用いてけん濁した
磁性粒子を互いに非特異結合させる）、物性を含有する
液体媒質を好ましくは磁性液体として分散した磁性粒子
と合わせることからなる。分離されるべき物質は、非磁
性粒子であることが多く、または非磁性粒子と結合して
いる。普通非特異結合は、好都合には電荷の相互作用の
結果として得られるが、これはまた非磁性粒子を磁性粒
子と非特異結合させる役割を果たし得る。 粒子および磁性粒子が同じ電荷を有する場合、反対の
電荷を有するポリイオン性試薬を媒質に加えることによ
り非磁性粒子および磁性粒子間並びに磁性粒子間に非特
異結合をもたらすことができる。前記の結合が形成後培
地に磁場勾配を用いることにより粒子を培地から分離す
る。 この方法を実施するとき、普通は水性の液体媒質を用
いる。他の極性溶媒、例えば普通は、１〜６個さらに一
般的には１〜４個の炭素原子を有する酸素化有機溶媒、
例えばアルコール、エーテルなども用いられ得る。通
常、これらの共溶媒は、約40重量パーセント未満、さら
に普通は約20重量パーセントの割合で存在する。普通、
媒質については、分離前の磁性粒子の非特異的結合およ
びアグリゲーションを促進するようなpH値が選ばれる。
粒子が負に帯電している場合にpHを増やすと、電荷が増
加し、また非特異的疎水性およびファンデルワールス相
互作用により起こる自発的アグリゲーションを妨げるこ
とが多い。この逆のことが正に帯電した粒子に当てはま
る。反対に帯電した高分子電解質を加えることによりア
グリゲーションさせる場合、高分子電解質の電荷を増加
させるpH値の変化は、しばしば粒子の電荷を減少させる
ため、この試薬の過剰量の使用を避けるような最適pHを
選ばなければならない。一般に５〜10、さらに普通は６
〜９のpH範囲が用いられる。アッセイの際、pH値に関し
て他に考慮するべきことは、シグナル発生能力を最も効
果的にする一方で重要なsbpメンバーの結合レベルを維
持することである。場合により、これらの条件間で妥協
がなされる。様々な緩衝剤を用いることにより望ましい
pHを達成し、測定の間そのpHを維持することができる。
緩衝剤の例には、ボレート、ホスフェート、カーボネー
ト、トリス、バルビタールなどがある。この発明の場合
使用される具体的な緩衝剤は厳密ではない。しかしなが
ら、個々の分離または個々のアッセイにおいては他のも
のよりも好ましい緩衝剤が存在し得る。非磁性粒子が含
まれる場合、分離完了後に粒子と磁性粒子の結合の解離
を促進する試薬が加えられ得る。 この方法を行なうためには通常、温度は中位でこの方
法を行なう間普通は一定に保たれる。一般的に、分離前
に粒子の非特異結合を促進するような温度が選ばれる。
特にアッセイをともなうこの方法における温度は一般に
約０゜〜50℃、さらに普通は約15゜〜40℃の範囲であ
る。また、分離完了後に粒子および磁性粒子の結合逆転
を促進する温度が選ばれ得る。 媒質における磁性粒子の濃度は、粒子であろうとなか
ろうと分離されるべき媒質中の物質の量、望ましい分離
速度、磁場勾配および場の強さ、磁性粒子の磁化率など
により異なる。一般に、磁性粒子濃度の高い方が、効果
的で速い分離をもたらすが、濃度が高すぎると媒質の過
剰な同伴を生じる。通常、濃度は経験的に測定され、一
般に約0.1〜1000μg/ml、さらに普通は約0.5〜200μg/m
l、多くは約１〜50μg/mlの範囲で変化する。 非磁性粒子を媒質から分離するべき場合、非磁性粒子
の濃度は必要に応じて広範に変化し得る。例えば、血液
から細胞を分離する場合、細胞容量は、血液の総容量の
50％を示し得る。対照的に、水の試料から1ml当たりわ
ずか1000個の細菌を分離することも要望され得る。アッ
セイの場合のように比較的媒質から遊離している非磁性
粒子を得る必要があるとき、普通非磁性粒子の総容量は
媒質の５％未満であるべきである。分析質が粒子の一成
分であるかまたは粒子と結合するアッセイにおいて、一
般に分析質は約10-4〜10-14モル、さらに普通は約10-6
〜10-12モルの範囲で変化する。分析質と会合した天然
粒子以外の非磁性粒子を媒質に加える場合、濃度は、粒
子サイズおよび表面領域、分析質濃度、分析質または相
補sbpとの望ましい反応速度など多くの要因により異な
る。一般に、加えられた非磁性濃度は、約0.01〜100μg
/ml、さらに普通は約0.1〜20μg/mlである。通常、分析
質濃度、非特異結合作用、望ましい反応速度、温度、溶
解度、粘度などを考慮して他のアッセイ試薬濃度を決定
する。 一般に様々な試薬の濃度は分離されるべき粒子の興味
ある濃度範囲またはアッセイにおける分析質の濃度範囲
により決定されるが、各々の試薬の最終濃度は通常、粒
子の分離速度および範囲並びにアッセイの場合には興味
の対象である範囲を越える感受性および特異性を最も適
したものにするべく経験的に決定される。 粒子間の非特異結合を形成するための化学的手段は通
常液体媒質に含まれている。この化学的手段は普通粒子
とは反対の電荷を有するポリイオン性試薬である。加え
られるポリイオン性試薬の量は、実質的に全部の粒子が
アグリゲート（凝集）またはコアグリゲート（凝結）す
るのに充分なものであるべきである。この濃度は経験的
に決定されなければならない。一般的に過剰の試薬は粒
子の完全なアグリゲーションを防げるため、避けられな
ければならない。一般的に、ポリイオン性試薬の液体媒
質における濃度は、ポリマーと会合するイオンの数をも
たらすのに充分なものであり、これは媒質中の全粒子に
おける反対の電荷の総数と等しい。 アッセイにおいて、水性媒質はまた１個またはそれ以
上のシグナル発生系メンバーを含有し得る。前述したよ
うに、シグナル発生系の様々なメンバーの濃度は、分析
質の興味ある濃度範囲および必要な測定またはアッセイ
のタイプにより変化する。一般的なポイントとして、シ
グナル発生系の様々なメンバーの濃度は、分析質の興味
ある濃度範囲に関連して発生されるシグナルを最適にす
るように選ばれる。 非磁性粒子と磁性粒子間または磁性粒子間の結合はpH
により影響される。また結合は、他の要因、例えばイオ
ン強度およびイオン性および非イオン性ポリマーの存在
により影響される。一般的に、非特異結合が電荷相互作
用による場合、イオン強度はまず粒子間の結合を容易に
するように選ばれるべきである。このためにはイオン強
度は一般に低く、0.001〜0.5モル、好ましくは0.005〜
0.1モルの範囲内である得る。分離完了後、イオン強度
を高く調節することにより粒子および磁性粒子のカップ
リングの逆転を容易にすることができる。このために
は、媒質のイオン強度は通常約0.1〜３モル、好ましく
は約0.15〜１モルである。粒子をアグリゲートさせるか
またはけん濁状態にしておくための原則はコロイド科学
分野でよく知られている。 磁性粒子との特異的結合を必要とするアッセイのため
液体媒質において磁性粒子を合わせた後、結合が生じる
のに充分な時間液体媒質を放置する。通常、これには0.
5〜120分、より一般的には１〜60分を要する。続いて化
学的に誘発された磁性粒子の非特異的アグリゲーション
および粒子の非特異結合のみが必要なときには粒子の非
特異的コアグリゲーションが実質上即座に起こり、そし
て普通は混合物を60秒、多くの場合15秒未満放置すれば
充分である。好ましくは混合後直ちに磁場を適用する。
粒子および磁性粒子間または磁性粒子間の結合程度が磁
気分離の効率を左右する。 粒子のアグリゲーション後、磁場を適応することによ
り媒質から粒子を分離させる。媒質への磁場の適用は、
高い磁場勾配をもたらす常法にしたがい行なわれ得る。
通常、この方法は、非磁性材料、例えばガラスまたはプ
ラスチック製の容器中で行なわれる。磁場を適用する
際、反応容器は、電磁石または永久磁石、好ましくは永
久磁石に極めて接近して置かれ得るが、これはけん濁液
内の場の強さおよび勾配を最大にするジオメトリーを有
する。磁場の強さが強く勾配が高くほど分離は速くな
る。通常、約２〜50mm、好ましくは約３〜15mmの直径の
管において、少なくとも約200エルステッドおよび好ま
しくは少なくとも約１キロエルセテッドの場の強さに普
通少なくとも約20キロエルステッド/cmの磁場勾配を実
際に与える程度１個またはそれ以上の永久磁石を管に近
づけて分離を行なうのが好都合である。磁場は、粒子を
媒質から望ましい程度分離させるのに充分な時間適用さ
れる。ジオメトリー、場の強さ、粒子の磁化率などによ
り、磁場は約２秒〜１時間、好ましくは約５秒〜60秒の
間適用される。 粒子が容器の一部分に集められてしまえば、けん濁し
ている液体媒質を常套手段、例えば傾しゃ、ピペットな
どにより粒子から分離することができる。 液体媒質から分離された粒子を処理し、結合の解離を
容易にするための試薬を加えて液体媒質に粒子をけん濁
することにより粒子間の非特異結合を解離させることが
できる。一つのアプローチとして、粒子がイオン相互作
用により結合している場合、イオン強度および媒質のpH
を調節することにより結合の解離を容易にすることがで
きる。一般的に、イオン強度を高めると静電気結合は解
離される。粒子が負に帯電している場合、pHを減らすと
荷電は低下し、結合の相互作用は減少する。別法とし
て、ポリカチオン性アグリゲート剤を用いる場合、pHを
増やすと電荷を中和し、結合を解離することができる。
すなわち、pH値を試薬の安定性により許容される程度の
高いまたは低い値、普通はpH4程度またはpH10より大き
い値に変えることが望ましい。 粒子および磁性粒子間の結合の解離は、粒子間の非特
異結合の性質に左右される。非特異結合が電荷相互作用
に起因する場合、薬剤を加えることにより非特異結合の
原因である電荷相互作用を解離させることができる。例
えば、解離剤が加えられ得る。粒子が同じ電荷を有し、
反対に帯電した高分子電解質が粒子を結合させる化学的
手段であった場合、粒子上の電荷と同じ電荷の高分子電
解質を用いて粒子を解離することができる。高分子電解
質は、例えばポリアニオン類、例えばデキストランスル
フェート、ヘパリン、ポリグルタメート、ポリアクリレ
ート、燐脂質小胞、カルボキシメチルデキストランであ
り得る。用いられ得るポリカチオンの例としては、アミ
ノデキストラン、キトサン、ポリブレン、ポリエチレン
イミン、およびカチオン性リポソームがある。 ポリカチオンを用いて粒子および磁性粒子間または磁
性粒子間の非特異結合を起こした場合、ポリアニオンを
用いて結合を解離することができる。他方、ポリアニオ
ンを用いて粒子および磁性粒子間または磁性粒子間の非
特異結合を起こした場合、ポリカチオンを用いて結合を
解離することができる。例えば、ポリブレンまたはバリ
ウムイオンのようなポリカチオンを用いた場合、解離剤
は、クエン酸イオンまたは硫酸イオンのようなポリアニ
オンであり得る。デダージエントは、リポソームに対
し、また主として疎水性相互作用により粒子が非特異的
にアグリゲートしているとき解離剤として作用し得る。 解離剤の濃度は、粒子間の非特異結合の実質的または
完全な解離をもたらすのに充分なものであるべきであ
る。解離剤の濃度は一般に粒子および磁性粒子間の結合
の性質並びに粒子の性質により異なる。一般的に、解離
剤の濃度は、少なくとも粒子上のイオンまたは疎水性部
位の濃度に等しく、好ましくは少なくとも10倍高い値で
ある。 アグリゲートから解離後の粒子に対する損害を最小に
するかまたは避けるためには、アグリゲート中の粒子の
性質に従って解離剤を選ぶことが重要である。 粒子をアグリゲートから分離してしまえば、希望によ
り粒子を使用することができる。例えば、アッセイにお
いて、分離された粒子により試料中の分析質の量と関連
性のある検出可能なシグナルの存在について検査するこ
とができる。所望にしたがい使用することができる分離
された粒子は細胞であり得る。例えば、分離された粒子
は赤血球であり得る。 この発明の好ましい態様において、磁性粒子は磁性液
体、例えばフェロ流体（強磁性、含鉄流体）として提供
される。分離される粒子を磁性液体と合わせる。 この方法の重要な適用例は、細胞を含有する試料から
の細胞の除去、例えば全血からの赤血球の除去である。
この方法の場合、限定するわけではなく一例として血液
全体を用いるが、磁性粒子と細胞を非特異結合させる条
件下で全血試料を帯電した磁性粒子と液体媒質中で合わ
せる。普通、細胞は、細胞表面上のシアル酸残基などの
存在により負電荷を有している。好ましくは、磁性粒子
を負電荷を有する。この場合媒質中にポリカチオン試薬
を含有させることにより細胞および磁性粒子間の非特異
結合条件がもたらされる。この方法における有用なポリ
カチオン試薬は、例えばポリブレン、ポリアルキレンイ
ミン、アミノデキストラン、キトサンおよび正に帯電し
たリポソームであり得る。全血から細胞を除去する場合
に好ましいポリカチオン試薬はポリブレンまたはポリエ
チレンイミンである。 次に、媒質に磁場勾配を与えることにより媒質から細
胞を分離することができる。磁場を適用すると容器の一
部分に細胞−磁性粒子アグリゲートが集まるため、例え
ば傾しゃ、ピペット等により前記アグリゲートを残留細
胞不含有媒質から除去することができる。 次いで分離された細胞磁性粒子アグリゲートを前記の
ように処理することによりアグリゲートから細胞を分離
することができる。ポリカチオン性結合剤としてポリブ
レンまたはポリエチレンイミンを用いる場合、好ましい
解離剤はシトレートまたはポリアクリレートである。 この方法は、遠心分離せずに血漿を製造する方法を提
供するためオートメーション化した血液型分類方法にと
って特に有益である。また免疫グロブリン含有血漿を、
まず試験細胞と合わせ、次に血漿からの抗体が細胞と結
合したかどうかを測定するために完全に除去しなければ
ならないクームス抗グロブリンテストにおいても有用で
ある。この方法の場合、磁性粒子および非特異結合剤を
血漿および試験細胞からなる混合物に加えた後分離した
細胞を解離剤の助けにより再けん濁する。さらに、この
方法は、sbpメンバーを粒子と結合させ、そして遠心分
離せずに粒子を分離および洗浄することが望ましいイム
ノアッセイにおいて用いられ得る。粒子は、磁性または
非磁性であり得る。 この発明は、分析質を含有する疑のある試料における
分析質のアッセイに適用性を有する。分析質はsbpメン
バーである。アッセイの場合、試料をアッセイ媒質中で
分析質に相捕的なsbpメンバーと合わせるが、その際分
析質または相補的sbpメンバーの少なくとも一方は非磁
性粒子（普通、細胞、ラテックス粒子）の表面に結合し
ている。この発明の場合、磁性粒子の非特異的結合およ
びアグリゲーション条件下で帯電した磁性粒子を媒質と
合わせる点に改善が認められる。しばしば非特異結合の
条件は、ポリイオン性試薬を合わせせ磁性粒子間の非特
異結合を起こすことを含む。通常、アッセイは、試料中
の分析質の量と関連性のある検出可能なシグナルを発す
るシグナル発生系を必要とする。普通、シグナル発生系
は標識されたsbpメンバーを含む。さらに媒質を１個ま
たはそれ以上のシグナル発生系メンバーと合わせ得る
が、合わせないこともあり得る。媒質に磁場勾配を与え
ることにより媒質から磁性粒子を含むアグリゲートを分
離する。分離されたアグリゲートまたは媒質における検
出可能なシグナルの存在について検査することができ
る。このような測定の場合、上記で加えられなかったシ
グナル発生系の残りのメンバーがあればこれを加える必
要もあり得る。上記条件にしたがい分離されたアグリゲ
ートを処理することにより、検出可能なシグナルの存在
を検査する前に磁性粒子から非磁性粒子を分離すること
ができる。磁性粒子から非磁性粒子を分離した後、試料
中の分析質の量に関連して発生された検出可能な粒子の
存在について非磁性粒子を検査することができる。この
ため粒子を、検出可能なシグナルを発生するために上記
で加えられなかったシグナル発生系の残りのメンバーと
合わせ得る。 さらにこの発明は、sbpメンバーが結合しており、し
かも（ｂ）磁性粒子と非特異的に静電気結合する（ａ）
非磁性粒子のアグリゲートを含む組成物を含む。さらに
組成物は、磁性粒子および非磁性粒子（ただし非磁性粒
子および磁性粒子が同じ電荷を有する場合）と反対の電
荷を有するポリイオン性試薬を含み得る。一般的に組成
物のアグリゲートは、解離剤を用いることにより組成粒
子に解離され得る。他方、この発明の組成物は、sbpメ
ンバーと結合する磁性粒子および磁性粒子を互いに非特
異結合させるポリイオン性試薬を含み得る。 便宜のために、アッセイを行なうための試薬は、分析
質についてアッセイするとき用いるために予め測定され
た量のパッケージを組み合わせたキットの形で提供され
得る。キットは、（ａ）分析質に相補的なsbpメンバ
ー、（ｂ）分析質も相補的sbpメンバーも荷電粒子と結
合していない場合荷電粒子に結合したsbpメンバーおよ
び（ｃ）粒子が磁性でない場合荷電磁性粒子を含み得
る。またキットは、試料中の分析質の量と関連したシグ
ナルを発生させる試薬を含み得る。さらに、キットは、
全粒子が同じ電荷を有するときに粒子とは反対の電荷を
有するポリイオン性試薬を含み得る。これに加えてキッ
トはさらに、粒子間の結合を逆行させる解離剤を含み得
る。 ［実施例］ 以下実施例をあげてこの発明についてさらに記載す
る。実施例における部およびパーセンテージは特記しな
い限り容量に関するものである。温度は摂氏（℃）であ
る。 実施例１ 血漿の製造 永久磁石により生じた磁場に置かれた容器に凝固して
いない全血（480μ、16mg/ml）およびフェロ（含鉄）
流体（250μ、4.5mg（Fe）/ml）を続けて加えた。磁
場のマグニチュードは4.0キロガウスであった。磁極に
向って赤血球−粒子アグリゲートが移動し、血液中に存
在する赤血球の99％以上が除去された。澄明な血漿を傾
しゃにより別の容器に移した。175の対象から血液に関
する結果が得られた。完全な分離に要する時間は15〜85
秒の範囲で変化した。フェロ流体は、スクシニル化うし
血清アルブミンで被覆された鉄磁性粒子を主成分とし
た。フェロ流体は実施例４にしたがい製造された。実施
例４の記載と同様にスクシニル化うし血清アルブミンを
製造した。 実施例２ 抗Rh抗体アッセイ 実施例１で製造された血漿にポリアクリル酸（10μ
、2mg/ml）およびスクアレート染料で染色されたRh陽
性試験細胞を加えた。50μのスクアレート染料（10-4
モル、DMFに溶解）を赤血球1mlのけん濁液に加えた。
［スクアレート染料は、２−（ｐ−ジブチル−アミノ−
ｍ−ヒドロキシフェニル）−４−（４−ジエチルイモニ
オン−２−ヒドロキシ−2,5−シクロヘキサジエニリデ
ン）−３−オキソ−１−シクロブテノレートであり、ｎ
−ブタノール：トルエン（2:1）中スクアリン酸を３−
N,N−ジブチル−アミノフェノールと縮合し、次いで水
を共沸除去することにより製造された。］混合物を37℃
で８分間インキュベートした。次に続いて緩衝液（16g/
グリシン、0.03モルNaCl、0.015モルホスフェート、p
H6.7）（500μ）、フェロ流体およびポリブレン（10
μ、16mg/ml）を加え、前記と同じ強さの磁場の存在
下に試験細胞を分離した。（この発明によるアグリゲー
ションにより容器の端に集められた）試験細胞を緩衝液
［低イオン強度食塩水、ホスフェート（0.003モル）、p
H6.7、0.24モルのグリシンおよび0.03モルのNaCl含有］
で２回洗浄した。次にポリアクリル酸（10μ、2mg/m
l）、次いで１％ポリビニルピロリドン（PVP）含有抗ヒ
ト免疫グロブリンを加えた。３分間25℃でインキュベー
ション後、反応混合物をクエン酸（800μ、0.2モル）
で希釈し、ブリッグス等による「ジャーナル・オブ・イ
ミュノロジー」（J.Immunol.）81巻、73−81頁（1985
年）および米国特許第4564598号記載のファイバーオプ
ティック粒子血球計算法により分析した。 要するに、米国特許第4564598号の場合、興味の対象
の物質の存在または量の検出に関して分散中の粒子の存
在を測定するための方法および装置が示されている。オ
プティカルフアィバーを用いて、蛍光が受容および分析
され得る比較的小さい容量を定めている。この容量は、
予測された揺動をもたらす単一粒子のみが存在しやすい
容量と関連性を有する。試料中の分析質の存在に関連し
た蛍光揺動の変化をもたらす様々な技術を用いることに
より、存在する分析質の量が測定され得る。揺動を一定
期間にわたって静止モードで、または試料において複数
の容量を試すことにより観察する。既知量の分析質を有
するアッセイ溶液で得られた結果と上記観察結果を比較
することにより、分析質の量を定量的に測定することが
できる。 上記実験から得られた結果を要約して下表に示す。 これらの結果は、抗Rh抗体の感受性アッセイがこの発
明にしたがい行なわれ得ることを示す。 実施例３ 抗トリヨードチロニン（T3）で標識されたビーズの分離 A.試薬および略語 1.PB−αT3（125I）＝EDACカップリングにより（放射性
ヨウ素化された）抗−T3抗体で標識されたカルボキシ置
換ポリスチレンビーズ。 2.MP＝磁性粒子 ａ）PGA＝ホスフェートによりグルクロン酸で誘導体
化された磁鉄鉱（0.2〜0.8μｍ） ｂ）CM−Dex3（「Feフェロ流体」）＝カルボキシメチ
ルデキストラン−磁鉄鉱（0.030〜0.45μｍ）、米国特
許第4452773号記載と同様の方法により製造。 ｃ）M4100BioMag−COOH（0.2〜1.0μｍ）＝アドバン
スト・マグネティック社製M4100BioMag粒子、粒子の遊
離アミン基がスクシニル化。 3.ポリブレン＝ヘキサジメトリンブロミド、シグマ・ケ
ミカル社製。 4.アッセイ緩衝液＝PBS/0.1％BSA。 5.正常なヒト血清。 B.方法 55μｇのビーズを含有する250μのPB−αT3
（125I）に50μのアッセイ緩衝液または正常ヒト血清
を加えた。この混合物を室温で20分間インキュベート
後、0.2mgのFeを含有する100μのMP（PGA、CM−Dexm
またはBioMag−COOH）を加えた。この反応混合物に50μ
のポリブレン（様々な濃度で）を加えた。約３分間振
盪後、2.6キロガウスの強さを有する磁場に管を５分間
置いた。分離後、上清を傾しゃし、ベックマン（Beckma
n）ガンマ5500カウンターを用いて沈殿物を数えた。 C.結果 抗T3抗体で被覆された0.26μｍのポリスチレンビーズ
を、ポリブレンを用いて負に帯電した磁性粒子とコアグ
リゲートさせることにより反応混合物から除去。 抗T3抗体で被覆された0.51〜1.2マイクロメーターの
ポリスチレンビーズを、ポリブレンを用いて負に帯電し
た磁性粒子とコアグリゲートさせることにより反応混合
物から除去。 抗T3抗体で被覆された0.26μｍのスクシニル化ポリス
チレンビーズを、ポリブレンを用いて負に帯電した磁性
粒子とコアグリゲートさせることにより反応混合物から
除去。 D.検討 抗T3抗体で被覆されたポリスチレンビーズは、ポリブ
レンおよび磁場を用いて負に帯電した磁性粒子と非特異
的にコアグリゲートすることにより反応混合物から効果
的に除去され得ることが示された。 第２、３および４表で示された結果から、大きなポリ
スチレンビーズの方が小さいビーズよりも効率よく反応
混合物から除去され得ることがわかる。また、スクシニ
ル化および非スクシニル化ポリスチンレンビーズ間の除
去効率の差から、微粒子表面上の電荷分布がコアグリゲ
ーションすなわち除去効率に寄与することが示される。 ポリスチレンビーズの分離に対するイオン強度および
ポリスチレン濃度の影響を示す結果を第５および６表に
示す。NaCl濃度が高い場合、粒子のコアグリゲーション
およびポリスチレンビーズの除去は実質的に低下した。
これは、コアグリゲーションが負および正に帯電した基
の間の相互作用に基くものであったことを示す。第６表
は、ポリブレンの最適濃度が存在し、そして濃度が高す
ぎるかまたは低すぎるとアグリゲーションを起こす能力
が低下してしまうことを示す。 抗T3抗体で被覆されたポリスチレンビーズは（アグリ
ゲーション時間および磁性分離時間を含めて）１分以内
に反応混合物から効果的に除去され得ることが示され
た。 この方法は、例えば、抗体または抗原で標識された微
小ビーズが用いられるヘテロジニアスイムノアッセイに
おいて結合フラクションを反応混合物から除去するため
の魅力的なアプローチであり得る。 実施例４ 含鉄流体の製造 A.コロイド状磁性酸化鉄（Feフェロ流体）の製造 20mlの２モルFeCl3、10mlの２モルFeCl2および20mlの
１モルHClからなる溶液を５分間かけて撹拌しながら25m
lの濃NH4OHおよび500mlの水からなる溶液に滴下した。
沈殿が終ると上清を傾しゃした。残留物を２分間500ml
の２モルHClO4と撹拌し、再び放置した。上清を傾しゃ
し、残留物を水に吸収させ、10ミリモルのHClO4に対し
て透析した。生成したコロイドは80mlの容量で、鉄成分
は28mg/mlであった。ダイナミック光スキャッターによ
り測定された平均粒子サイズは60nmであった。参考文
献：マッサートによる、「コント・ランデユ・ド・ラカ
デミー・ド・シヤンス・パリ」（C.R.Acad.Sci.pari
s）、291C、１（1980年）。 B.蛋白質によるコロイド状磁性酸化鉄の被覆 ウサギ血清アルブミン（RSA）:11mg/ml RSAの溶液（2
ml）を上記コロイド状磁性酸化鉄と水の1:4希釈液2mlに
加えた。５分後、0.50mlの550ミリモルトリス−HCl、pH
8.0を加えた。生成したコロイドは認識できる粒状物を
含んでいなかった。 スクシニル化ウシ血清アルブミン（sBAS）：水中9.5m
g/mlのsBSA（250mlの0.1モル燐酸ナトリウム、pH8.0中
5.0gのBSAを0.20のコハク酸無水物で処理することによ
り製造）105mlの溶液を0.1モルHClO4で調節することに
よりpH3.38とした。10ミリモルHClO4中35mg/mlのコロイ
ド状磁性酸化鉄30mlの溶液を75mlの水で希釈し、sBSA溶
液に加えた。次いで溶液のpHを１モルNMe4OHによりpH9.
06に調節した。生成したコロイドの平均粒子サイズをダ
イナミック光スキャッタで測定すると63nmであった。 実施例５ フェロ流体およびラテックスビーズの凝集一連の試験
管に、100μのDC16AS（1,3−ビス［４−（ジヘキサデ
シルアミ）］−2,4−ジヒドロキシシクロブテンジイリ
ウムジヒドロキシド）、ビス（内部塩）染色カルボキシ
ルラテックスビーズ（外径0.455μ、推定値約1.5×108
ビーズ/ml、実施例７、Ａ項記載の方法により製造）（P
BS緩衝液中）、700μの希フレオン処理正常ヒト血清
（2.5％、PBS中）および100μの新たに希釈された市
販の、水ベース含鉄流体EMG805（200g）（フエロフルイ
ディクス社製、ナシュア、ニューハンプシャー、PBS中1
0％、鉄分の測定値〜17mg/ml）をピペットにより入れ
た。次いで0.011モルのβ−CD（β−シクロデキストラ
ン）を含有するPBS中0.5％ポリブレン100μをうず上
に加えた。直ちに、2.6キロガウスの磁場の強さを有す
るコーニング（Corning）磁気分離器中に試験管を置い
た。次いで異なる分離時間で、分離された液体の500μ
アリコートを試験管から採取し、等容量のPBS緩衝液
で希釈し、実施例２記載にしたがい蛍光を測定した。対
照として、磁性粒子を用いずに全蛍光を測定すると6042
0KHzであった。結果の要約を第７表に示す。 結果は、この発明によるポリブレン凝集率が１分で99
％を越えることを示す。 実施例６ フェロ流体およびラテックスビーズの凝集に対するラテ
ックスビーズ濃度の影響 実施例５と同様のプロトコルを用いた。様々な濃度の
ラテックスビーズけん濁液を調製した（約107〜1010ビ
ーズ/ml）。各ストックけん濁液100μを試験管に取っ
た。次いで各試験管に700μの希釈血清（PBS中2.5
％）および100μの希釈含鉄流体を加えた。0.001モル
のβ−CDを含有するPBS中0.5％ポリブレン100μを加
えた後、混合物を渦巻かせ（〜３秒）磁気分離器に入れ
る前に全部で10秒になるまでプレインキュベートした。
ポリブレンを加えて正確に１分後（磁気分離時間50
秒）、分離された液体の500μアリコートを採取し、1
mlに希釈し、蛍光を測定した。対照は磁性粒子を用い
ず、測定前に適当な濃度に希釈した。 結果の要約を第８表に示す。 上記実施例は、1010ビーズ/ml以下の濃度のラテック
スビーズがこの発明によると１分未満で効率的に除去さ
れ得ることを示す。 実施例７ Ｂ型肝炎表面抗原（HBsAg）のアッセイ このアッセイについて記載する前に若干の用語を定義
する。 RT−室温、 EDAC−１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カリボジイミド、 PBS−燐酸緩衝食塩水、 DTE−ジチオトリエトール、 EDTA−エチレンジアミンテトラアセテート、ナトリウ
ム塩、 BSA−ウシ血清アルブミン、 IgM−免疫グロブリンＭ、 IgG−免疫グロブリンＧ、 NHS−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、 MP−磁性粒子、 LISS−グリシン18g/リットル、燐酸カリウム230mg/リ
ットル、燐酸ナトリウム、 スクアライン染料−DC16AS。 A.スクアライン染料ラテックスビーズの製造 一律0.716ミクロン直径のカルボキシル化ポリスチレ
ン粒子（ビーズ）をデューク・サイエンティフイック社
（カリフオルニア94304、パロ・アルト）から購入し
た。粒子はダウ・ケミカル社（コロラド80239、デンバ
ー）製であり、脱イオン水中10重量％のけん濁固体およ
び痕跡量の非イオン性界面活性剤を含む15mlのバイアル
に包装されている。 染色するためにビーズを、遠心分離（15000rpm、10分
間）および上清液の傾しゃにより製造した。沈殿物をエ
チレングリコールに再けん濁して遠心分離前と同じ容量
にした。 スクアラン染料は、還流するｎ−ブタノール−ベンゼ
ン中水を共沸除去しながらスクアリン酸をジヘキサデシ
ルフェニルアミン（モル比2:1）と縮合することにより
製造された。 500マイクログラムのスクアライン染料を、140゜に維
持された油浴中に固定された小さな管またはバイアル
（磁性撹拌棒付）中の、0.5mlの熱ベンジルアルコール
に溶かした。染料溶液を1mlのエチレングリコールでゆ
っくりと希釈した。 １ミリリットルのエチレングリコールビーズけん濁液
を激しく撹拌しながら熱染料溶液を滴下した。15分間撹
拌を続けた。次いで混合物をピペットにより70％エタノ
ール水溶液５〜10mlに入れた。染色されたビーズを遠心
分離し、70％エタノールで２回洗浄し、次いで遠心分離
後ビーズを音波処理して分散させた。ビーズを脱イオン
水で２回洗浄し、次に脱イオン水中に1ml当たり固体100
mgを越えない濃度で貯蔵した。 B.アビジンビオチン相互作用によるスクアレート染色ラ
テックスビーズへの抗体付着 1.スクアレートラテックスビーズへのアビジンの共有結
合 スクアレート染色ラテックスビーズ（0.85ml、2.3×1
011ビーズ/ml、0.716μｍ直径）を2mlの蒸留水にけん濁
し、カルボキシル基を３〜４分間室温でEDAC（シグマ、
18.75mgをビーズけん濁液に加えた）と反応させること
により活性化した。次いで活性化ビーズをアビジンＤ溶
液（ベクター、アイオワ52302、マリオン、3mlの0.1モ
ルNaCl中1.5mg）に加え、ときどき音波処理しながら反
応を室温で一夜行なった。ビーズを遠心分離により洗浄
し、１％BSA（シグマ、ミズーリ63118、セントルイス、
RIAグレード）を含有する緩衝液（0.17モルグリシン、
0.1モルNaCl、pH9.2）にけん濁することによりBSAで被
覆した。ビーズを遠心分離により洗浄し、次いで１時間
室温でインキュベーションし、BSAを含まない前記緩衝
液（3ml）に再けん濁した。 ビオチン結合能14C−ビオチンを用いて測定すると６
×108個のビーズに対し77ピコモルを示した。 2.ビオチニル化抗HBsAgモノクローナル抗体の製造 抗HBsAgモノクローナル抗体IgG1（セルテクまたはロ
イヤル・フリー・ホスピタル、イギリス、ロンドン、蛋
白質Ａアフイニティー・クロマトグラフィーにより精
製、0.1モル燐酸緩衝液中1.0mg/ml、pH8.2）を室温で４
時間25倍モル過剰ビオチニル−NHS（シグマ、ミズーリ6
3118、セントルイス、DMF中3.4mg/ml）と反応させた。 3.アビジンスクアラインラテックスビーズ上におけるビ
オチニル化抗体の固定化 ビオチニル化抗HBsAgモノクローナル抗体（0.4mg、0.
1モル燐酸緩衝液、pH8.2）を室温で２時間アビジンラテ
ックスビーズ（1.25×1010ビーズ）とインキュベートし
た。遠心分離によりビーズを洗浄し、0.01モルグリシ
ン、0.01モルNaCl、pH8.2、0.2％BSA、0.05％トウィー
ン（Tween）20に再けん濁した（最終ビーズ濃度6.25×1
09/ml）。 C.スクシニル化磁性粒子の製造 200mgの磁性粒子（アドバンスト・マグネティック
社、マサチューセッツ02138、キャンブリッジ、BioMag4
100、4ml）を磁気分離により洗浄し（３×40ml 0.1モル
燐酸緩衝液、pH7.0）、15mlの上記緩衝液に再けん濁し
た。粒子をコハク酸無水物（DMF中１モル、5ml）と２時
間にわたって５アリコート加えることにより（加えるた
びにpHを7.0に調節した）反応させた。スクシニル化さ
れた粒子を磁気分離により洗浄し（３×40mlの0.1モル
燐酸緩衝液、pH7.0および２×40ml LISS）、20mlのLISS
に再けん濁し、0.02％アジドを用いて４℃で貯蔵した。 F.アッセイプロトコル 試薬 1.スクアレート染色ラテックスビーズ（直径0.716ミク
ロン、詳細な製法は前出）に共有結合した抗HBsAgIgG1
モノクローナル抗体（セルテクまたはロイヤル・フリー
・ホスピタル、イギリス国ロンドンから入手）（スクァ
ライン−ラテックスビーズ−抗HBsAg）。 2.HBsAg（アボット（Abbott）正制御、アスザイム（ASU
ZYME）II、6ng/ml）。 3.磁性粒子:Succ（スクシニル化）−BioMag（100mg/m
l）、前記と同様に製造。 4.ポリブレン（シグマ、ミズーリ63118、セントルイ
ス、平均分子量5000）LISS中10mg/ml。 5.0.2モルシトレート、pH8.2。 6.IgM抗HBsAgモノクローナル抗体（セルテク）、２×PB
S中0.5〜1.0mg/ml中。 G.アッセイ手順 1. スクアレート−ラテックスビーズ−抗HBsAg（５μ
、３×107個のビーズ含有）を100μの試料［LISS中
50％血清、抗原含有または不含有（1.5または3ng/m
l）］に加え、RTで８分間インキュベートした。 2. ラテックスビーズと磁性粒子を、10μのスクシニ
ル化BioMag、次いで10μのポリブレンを加えることに
より凝集させた。 3. 2.3キロガウス（１分）の磁場勾配においてラテッ
クス−MPコアグリゲートを磁気分離した。結果を下記第
９表に示す。 4. 50μのシトレート中でラテックス−MPコアグリゲ
ートの解離を行なった。 5. IgM抗HBsAg（５μｇ）を加え、RTで５分間インキュ
ベーションすることにより抗原依存凝集させた。 6. ラテックスビーズからスクシニル化BioMagを磁気分
離した。 7. 0.2モルのシトレート、pH8.2で希釈し、レーザ光ス
キャッタリング（Nicomp HN5−90）によりスクアライン
ラテックス凝集を測定した。結果を下記第10表に示す。 H.結果 1. 50％血清から抗HBsAg−スクアレートラテックスビ
ーズの分離効率 磁気分離後血清中に残存する抗HBsAg−スクアレート
ラテックスビーズの量を蛍光分光光度計により測定し
た。 上記結果は、この発明により媒質から染色ラテックス
ビーズが効率的に分離されたことを示す。 2. HBsAgアッセイ結果の要約を下表に示す。 上記結果は、この発明による分離法を用いてHBsAgの
感受性アッセイが行なわれ得ることを示す。HBsAgが媒
質に存在するとき、実質的に高いレベルの凝集が観察さ
れた。 実施例８ 甲状腺刺激ホルモンのアッセイ A. 略語および幾つかの材料、 TSH−甲状腺刺激ホルモン、ヒト（ｈ）、 MP−磁性粒子、 FF−フエロフルイディクス社製含鉄流体（EMG805、20
0g）、 LC−長鎖、 11C6または9D7−hTSHのαサブユニットに対するモノ
クローナル抗体、 ％Ｂ−％125I−TSH結合（特異結合）、 ％NSB−％非特異結合、 BMP−アドバンスト・マグネティック社製BioMag粒
子、 緩衝液Ａ−PBS＋0.1％BSA＋0.05％トウィーン（Twee
n）20、pH7.4、 PB−ポリブレン、 r.t.−室温、 Ab−抗体、 Ag−抗原、 血清−TSH不含有血清、イミュノーサーチ社製。 B. 125I−TSHとFF−アビジンの結合 100μのFFアビジン（FF上にアビジンを吸収させる
ことにより製造）および緩衝液Ａ中ビチオン−LC−11C
6、100μ（〜１μｇ抗体）および緩衝液Ａまたは血清
中125I−TSH100μ（〜１μg/ml）を室温で15分（緩衝
液）または25分（血清）インキュベートした。 PBS中ポリブレン50μを加えた。緩衝液の場合、PB
＝1.6mg/ml、１分間。血清の場合、PB＝25mg/ml、３分
間。 コーニング磁気分離器中で３分間材料に2.1〜2.6キロ
ガウスの磁場を用いた。材料を0.5ml PBS＋0.05％トウ
ィーン（Tween）20で１回洗浄し、MPを数えた。結果を
第11表に要約する。 上記結果は、この発明によると、アビジンと被覆され
た含鉄流体が、抗体に結合したビオチンと合わせ、ポリ
ブレンを加えて粒子を非特異的に凝集させることにより
分離され得ることを示す。 C. アビジンを加える125I−TSHとFFの結合 50μアビジン（２μｇ）、100μ125I−TSH（緩衝
液ＡまたはTSH不含有血清中）および100μビオチン−
LC−11C6（緩衝液Ａ中）をr.t.で15分間インキュベート
した。 50μのフェロ流体（〜200μのFe含有）、次いで5
0μのポリブレンを加えた。緩衝液におけるアッセイ
の場合1.6mg/ml、血清におけるアッセイの場合12.5mg/m
l。 コーニング磁気分離器中で３分間材料に2.1〜2.8キロ
ガウスの磁場を作用させ、１回洗浄し、数えた。結果を
第12表で要約する。 上記結果は、この発明により含鉄流体を、抗体に結合
したビオチンおよびアビジンとを合せ、ポリブレンを加
えて粒子を非特異的に凝集させることにより分離するこ
とができることを示す。 D. FF−アビジンとの競合的TSHアッセイ 血清中0.200ng、２μｇ、20μｇおよび200μg/mlの割
合のTSH50μ（すなわち0.10ng、100ng、１μｇおよび
10μg/アッセイ）、血清中50μの125I−TSH（2ng/m
l、0.1ng/アッセイ）、緩衝液Ａ中ビオチン−LC−9D7、
100μ（１μgAb/アッセイ）および前記にしたがい製
造されたFF−アビジンを合わせ、室温で15分間インキュ
ベートした。12.5mg/mlの割合のポリブレン50μを加
えた。３分後、材料に2.1〜2.6キロガウスの磁場を作用
させ、分離し、洗浄し、カウントした（前記と同様）。 結果を第13表に要約する。 上記結果は、この発明による分離法を用いてTSHのア
ッセイが行なわれ得ることを示す。TSHが媒質に存在す
る場合、実質的に低いパーセントの結合が観察された。 E. アビジンを加えたFFとの競合的TSHアッセイ 血清中0.200ng、２μｇ、20μｇおよび200μg/mlの割
合のTSH50μ（すなわち、0.10ng、100ng、１μｇおよ
び10μg/アッセイ）、血清中50μの125I−TSH（2ng/m
l、0.1ng/アッセイ）、緩衝液Ａ中100μのビオチン−
LC−9D7（１μgAb/アッセイ）および50μのアビジン
（２μg/アッセイ）を15分間室温でインキュベートし
た。次いで、50μのFF（200μｇのFe含有）を加え、
５分後12.5mg/mlのポリブレン50μを加えた。３分後
材料に2.1〜2.6キロガウスの磁場を作用させ、分離し、
洗浄し、カウントした（前記と同様）。 結果を第14表に要約する。 上記結果は、この発明により分離を用いてTSHのアッ
セイが行なわれ得ることを示す。TSHが媒質に存在する
場合、実質的に低いパーセントの結合が観察された。 前記発明について明確に理解できるようにある程度詳
しく実例および実施例により説明したが、ある種の変化
または修正が特許請求の範囲内で行なわれ得ることは明
らかであろう。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 バータン・イー・ガザロシアン
アメリカ合衆国カリフォルニア、パー
ロ・アルト、ラモナ・ストリート2642番
(72)発明者 ナリス・カーン
アメリカ合衆国カリフォルニア、パー
ロ・アルト、ブレア・コート978番
(72)発明者 リタイ・ウエン
アメリカ合衆国カリフォルニア、マウン
テン・ビュー、サン・ルイス・アベニュ
ー1416番
(56)参考文献 特開 昭60−210766（ＪＰ，Ａ)
特開 昭51−150779（ＪＰ，Ａ)
特開 昭59−4487（ＪＰ，Ａ)
特開 昭56−58935（ＪＰ，Ａ)
特開 昭59−139910（ＪＰ，Ａ)
特開 昭52−82723（ＪＰ，Ａ)
特表 昭58−501662（ＪＰ，Ａ)
米国特許4452773（ＵＳ，Ａ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．液体媒質中で荷電非磁性粒子と荷電磁性粒子を合わ
せ、荷電磁性粒子を荷電非磁性粒子と結合させ、さらに
当該媒質を磁場勾配にかけて、当該媒質から結合粒子を
分離することよりなる、分析質を含有する疑のある試料
中の分析質の測定方法において利用する液体媒質から分
散した荷電非磁性粒子を分離する方法であって；荷電磁
性粒子を荷電非磁性粒子と同種荷電させ、当該媒質中で
それらを合わせた後、荷電非磁性粒子と荷電磁性粒子を
電荷相互作用により非特異的に結合させるために、ポリ
ブレン、ポリエチレンイミン、カルシウムイオン、およ
びバリウムイオンからなる群から選ばれる反対荷電のポ
リイオン性試薬のような化学的手段を、その媒質に加え
て結合を生起させることを特徴とする方法。 ２．結合した荷電非磁性粒子が荷電磁性粒子との結合を
解離させる試薬で処理される、好ましくは結合を解離さ
せる試薬がポリカチオン性およびポリアニオン性試薬か
らなる群から選ばれたポリイオン性試薬である、特許請
求の範囲第１項記載の方法。 ３．荷電非磁性粒子が生物粒子および合成粒子からなる
群から選ばれ、好ましくは生物粒子が赤血球である、特
許請求の範囲第１項記載の方法。 ４．荷電非磁性粒子と合わせる前に荷電磁性粒子がフェ
ロ流体中に存在している、特許請求の範囲第１項記載の
方法。 ５．荷電非磁性粒子を含む試料が全血試料である、特許
請求の範囲第１項記載の方法。 ６．特異的結合対（sbp）の１メンバーである分析質を
含有する疑のある試料、当該分析質sbpメンバーと相補
的な標識されたsbpメンバー、荷電非磁性粒子、および
アッセイ媒質中の荷電非磁性粒子と同種荷電の磁性粒
子、ただし、当該分析質と相補的な標識されたsbpメン
バーが当該荷電非磁性粒子の表面に結合しているもので
ある、をアッセイ媒質中で合わせ、当該媒質に、ポリブ
レン、ポリエチレンイミン、カルシウムイオン、および
バリウムイオンからなる群から選ばれる反対荷電のポリ
イオン性試薬のような化学的手段を加えて、電荷相互作
用により、当該荷電磁性粒子と当該荷電非磁性粒子との
非特異的結合を生起させて、標識結合粒子をアグリゲー
トさせ、さらに当該媒質を磁場勾配にかけることによ
り、結合粒子を当該媒質から分離し、そして標識された
sbpメンバーの存在について媒質または結合粒子を検査
することからなる、分析質を含有する疑のある試料中の
分析質の測定方法。 ７．標識されたsbpメンバーが荷電非磁性粒子の表面に
存在しており、当該荷電非磁性粒子と荷電磁性粒子が非
特異的にアグリゲートする、特許請求の範囲第６項記載
の方法。 ８．荷電非磁性粒子が生物粒子および合成粒子からなる
群から選ばれ、好ましくは生物粒子が赤血球である、特
許請求の範囲第６項記載の方法。 ９．（ａ）配位子およびその相補的受容体からなる特異
的結合対（spb）の一方の標識されたメンバー、（ｂ）
該標識されたsbpメンバーが結合している荷電非磁性粒
子、（ｃ）この荷電非磁性粒子と同種荷電の磁性粒子ま
たは該同種荷電磁性粒子のアグリゲート、および、
（ｄ）これらの同種荷電粒子とは反対荷電を有し、これ
らの同種荷電粒子を媒質中において、電荷相互作用によ
り非特異的に結合させ得るものであって、ポリブレン、
ポリエチレンイミン、カルシウムイオン、およびバリウ
ムイオンからなる群から選ばれる化学的手段を含んで成
り、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）からなるア
グリゲートが磁場によって試料から分離できるものであ
り、その試料またはアグリゲートが標識sbpメンバーの
存在について検査されるものである、spbの他方のメン
バーである分析質を含有する疑のある試料中の分析質の
測定方法に用いる材料。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US81120285A | 1985-12-20 | 1985-12-20 | |
| US811202 | 1985-12-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62190466A JPS62190466A (ja) | 1987-08-20 |
| JP2806924B2 true JP2806924B2 (ja) | 1998-09-30 |
Family
ID=25205867
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61305165A Expired - Lifetime JP2806924B2 (ja) | 1985-12-20 | 1986-12-19 | 粒子分離方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0230768B1 (ja) |
| JP (1) | JP2806924B2 (ja) |
| AT (1) | ATE73690T1 (ja) |
| AU (1) | AU601386B2 (ja) |
| CA (1) | CA1304006C (ja) |
| DE (1) | DE3684448D1 (ja) |
| ES (1) | ES2030667T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200066790A (ko) * | 2018-12-03 | 2020-06-11 | 연세대학교 산학협력단 | 자성입자를 이용한 집진장치 |
Families Citing this family (49)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5512332A (en) * | 1985-10-04 | 1996-04-30 | Immunivest Corporation | Process of making resuspendable coated magnetic particles |
| JPS62197425A (ja) * | 1986-02-25 | 1987-09-01 | Toyo Soda Mfg Co Ltd | 球状熱可塑性樹脂の製造方法 |
| ZA877772B (en) * | 1986-10-23 | 1988-04-20 | Amoco Corporation | Target and background capture methods and apparatus for affinity assays |
| SE8701962D0 (sv) * | 1987-05-13 | 1987-05-13 | Bo Hakan Nygren | Sett att isolera och/eller bestemma halten av ett organiskt emne genom kovalent koppling av en for emnet specifik motreaktant till ytadsorberad, hydrofoberad vattenloslig polymer |
| US5136095A (en) * | 1987-05-19 | 1992-08-04 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Reversible agglutination mediators |
| US4812401A (en) * | 1987-05-19 | 1989-03-14 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Reversible agglutination mediators for separating cells from whole blood |
| EP0325413A3 (en) * | 1988-01-19 | 1990-10-24 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Method and device for separating plasma from red cells |
| US5459080A (en) * | 1988-01-29 | 1995-10-17 | Abbott Laboratories | Ion-capture assays using a specific binding member conjugated to carboxymethylamylose |
| US5459078A (en) * | 1988-01-29 | 1995-10-17 | Abbott Laboratories | Methods and reagents for performing ion-capture digoxin assays |
| US5866322A (en) * | 1988-01-29 | 1999-02-02 | Abbott Laboratories | Method for performing Rubella assay |
| AU609241B2 (en) * | 1988-01-29 | 1991-04-26 | Abbott Laboratories | Ion-capture assays and devices |
| US5087570A (en) * | 1988-05-10 | 1992-02-11 | Weissman Irving L | Homogeneous mammalian hematopoietic stem cell composition |
| US5108933A (en) * | 1988-09-16 | 1992-04-28 | Immunicon Corporation | Manipulation of colloids for facilitating magnetic separations |
| SE462454B (sv) * | 1988-11-10 | 1990-06-25 | Pharmacia Ab | Maetyta foer anvaendning i biosensorer |
| US5512439A (en) * | 1988-11-21 | 1996-04-30 | Dynal As | Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof |
| DE68913555T2 (de) * | 1988-11-21 | 1994-07-07 | Dynal As | Sonden aus nukleinsäuren. |
| CA1341592C (en) * | 1989-07-07 | 2009-04-14 | Abbott Laboratories | Ion capture reagents and methods for performing binding assays |
| US5698271A (en) * | 1989-08-22 | 1997-12-16 | Immunivest Corporation | Methods for the manufacture of magnetically responsive particles |
| US5541072A (en) * | 1994-04-18 | 1996-07-30 | Immunivest Corporation | Method for magnetic separation featuring magnetic particles in a multi-phase system |
| SE501013C2 (sv) * | 1990-10-01 | 1994-10-17 | Pharmacia Biosensor Ab | Förfarande för förbättring av analys med bindning till fast fas |
| US5242833A (en) * | 1991-03-20 | 1993-09-07 | Reference Diagnostics, Inc. | Lipid fractionation |
| US5795470A (en) * | 1991-03-25 | 1998-08-18 | Immunivest Corporation | Magnetic separation apparatus |
| FR2695939B1 (fr) * | 1992-09-24 | 1995-03-03 | Prolabo Sa | Cellules transformées, humaines, animales ou végétales encapsulant dans leurs cytoplasmes au moins une particule de latex. |
| DE69515675T2 (de) * | 1994-05-11 | 2000-07-20 | Genera Technologies Ltd | Verfahren zum Einfangen von einem Ligand aus einer Flüssigkeit und Vorrichtung zur dessen Ausführung |
| DE69812329T2 (de) | 1997-11-18 | 2004-02-12 | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules | Multiplex-zufluss-immunotest mit magnetischen teilchen als festphase |
| AU3555599A (en) * | 1998-04-13 | 1999-11-01 | Luminex Corporation | Liquid labeling with fluorescent microparticles |
| US6664042B1 (en) * | 1999-01-26 | 2003-12-16 | Cornell Research Foundation, Inc. | Determining viral load in double negative T cells |
| US7871597B2 (en) | 1999-04-09 | 2011-01-18 | Amag Pharmaceuticals, Inc. | Polyol and polyether iron oxide complexes as pharmacological and/or MRI contrast agents |
| US6599498B1 (en) | 1999-04-09 | 2003-07-29 | Advanced Magnetics, Inc. | Heat stable colloidal iron oxides coated with reduced carbohydrates and carbohdrate derivatives |
| WO2002027316A2 (en) * | 2000-09-25 | 2002-04-04 | Abbott Laboratories | Methods and kits for decreasing interferences of assays samples containing plasma or serum in specific binding assays by using a large polycation |
| FR2855613B1 (fr) * | 2003-05-26 | 2005-08-19 | Biocytex | Procede de detection et de quantification multiplex d'analytes dans un echantillon a l'aide de microspheres |
| JP2005296942A (ja) * | 2004-03-15 | 2005-10-27 | Hitachi Maxell Ltd | 磁性複合粒子およびその製造方法 |
| FR2869996B1 (fr) * | 2004-05-05 | 2006-12-15 | Diagast Soc Par Actions Simpli | Utilisation de ferrofluides pour le phenotypage sanguin et applications derivees |
| DE602005021135D1 (de) | 2004-10-12 | 2010-06-17 | Luminex Corp | Verfahren zur veränderung der oberflächeneigenschaften von mikrokügelchen |
| US8084275B2 (en) | 2005-02-08 | 2011-12-27 | Fujifilm Corporation | Magnetic composite body, production method thereof, method for removing substance with mannose on its surface, and method for concentrating substance with mannose on its surface |
| JP2007040978A (ja) * | 2005-06-30 | 2007-02-15 | Fujifilm Corp | 磁性体ナノ粒子を用いた目的成分の分離方法 |
| FR2892820B1 (fr) * | 2005-11-03 | 2008-02-01 | Diagast Soc Par Actions Simpli | Procede magnetique d'immunodiagnostic pour la mise en evidence de complexe anticorps/antigene, en particulier de groupe sanguin |
| US8030034B2 (en) | 2005-12-09 | 2011-10-04 | Promega Corporation | Nucleic acid purification with a binding matrix |
| GB0619645D0 (en) * | 2006-10-05 | 2006-11-15 | Smiths Group Plc | Sensors and substances |
| EP2645107B1 (en) * | 2007-06-08 | 2018-02-28 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Method for purifying lipoprotein suitable for analysis by differential charged-particle mobility |
| FR2918460B1 (fr) | 2007-07-02 | 2013-10-04 | Najim Chaibi | Nouveau dispositif permettant l'obtention des resultats des systemes abo,rhesus et autres pherotypes et systemes rares, rai. |
| FR2963108B1 (fr) | 2010-07-21 | 2017-06-23 | Diagast | Procede magnetique d'immunodiagnostic et kit pour la mise en evidence de complexe anticorps/antigene de groupe/phenotype sanguin |
| FR2963107B1 (fr) | 2010-07-21 | 2019-06-28 | Diagast | Complexe immuno-magnetique et son utilisation pour le groupage/phenotypage erythrocytaire |
| WO2014151836A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Ran Biotechnologies, Inc. | Methods and materials for microorganism capture |
| KR102352614B1 (ko) * | 2013-03-14 | 2022-01-18 | 랜 바이오테크놀러지스, 인크. | 생물제제의 검출을 위한 방법 및 물질 |
| JP6399632B2 (ja) * | 2013-10-02 | 2018-10-03 | 積水メディカル株式会社 | 赤血球含有サンプル中の対象物を検出するためのイムノクロマトグラフィー用テストストリップ、および該テストストリップを使用するイムノクロマトグラフィー |
| JP2015192995A (ja) * | 2014-03-27 | 2015-11-05 | 東ソー株式会社 | 磁性微粒子及びその分散液の製造方法 |
| CN107614565B (zh) | 2015-04-21 | 2021-04-09 | Ran生物技术公司 | 氟化表面活性剂 |
| CN114252613A (zh) * | 2021-12-13 | 2022-03-29 | 重庆大学 | 一种用于检测HBsAg抗原蛋白的组合物及其使用方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4452773A (en) | 1982-04-05 | 1984-06-05 | Canadian Patents And Development Limited | Magnetic iron-dextran microspheres |
Family Cites Families (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2232295A (en) * | 1938-07-14 | 1941-02-18 | Charles H Lewis | Process for treating liquids |
| CA940470A (en) * | 1969-07-29 | 1974-01-22 | Steven H. Corwin | Flocculation of fermentation broths |
| US3853987A (en) | 1971-09-01 | 1974-12-10 | W Dreyer | Immunological reagent and radioimmuno assay |
| US3933997A (en) | 1974-03-01 | 1976-01-20 | Corning Glass Works | Solid phase radioimmunoassay of digoxin |
| US4001197A (en) * | 1975-06-12 | 1977-01-04 | Sala Magnetics, Inc. | Magnetic separation method |
| US4018886A (en) | 1975-07-01 | 1977-04-19 | General Electric Company | Diagnostic method and device employing protein-coated magnetic particles |
| US3970518A (en) | 1975-07-01 | 1976-07-20 | General Electric Company | Magnetic separation of biological particles |
| US4019994A (en) | 1975-08-28 | 1977-04-26 | Georgia-Pacific Corporation | Process for the preparation of aqueous magnetic material suspensions |
| FR2334106A1 (fr) * | 1975-12-02 | 1977-07-01 | Pasteur Institut | Gel magnetique convenant pour dosages immunoenzymatiques |
| US4070246A (en) | 1976-04-09 | 1978-01-24 | Abbott Laboratories | Reactive matrices |
| US4115534A (en) | 1976-08-19 | 1978-09-19 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | In vitro diagnostic test |
| US4115535A (en) | 1977-06-22 | 1978-09-19 | General Electric Company | Diagnostic method employing a mixture of normally separable protein-coated particles |
| US4275149A (en) | 1978-11-24 | 1981-06-23 | Syva Company | Macromolecular environment control in specific receptor assays |
| US4318980A (en) | 1978-04-10 | 1982-03-09 | Miles Laboratories, Inc. | Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label |
| GB2019378A (en) * | 1978-04-20 | 1979-10-31 | Ici Ltd | Flocculation and removal of organic or inorganic matter from suspensions |
| US4318707A (en) | 1978-11-24 | 1982-03-09 | Syva Company | Macromolecular fluorescent quencher particle in specific receptor assays |
| FR2466282A1 (fr) * | 1979-10-02 | 1981-04-10 | Commissariat Energie Atomique | Procede d'elimination des elements metalliques lourds en suspension dans un liquide a l'aide d'un adjuvant ferromagnetique finement divise |
| US4299916A (en) | 1979-12-26 | 1981-11-10 | Syva Company | Preferential signal production on a surface in immunoassays |
| US4285819A (en) | 1980-01-28 | 1981-08-25 | California Institute Of Technology | Functional magnetic microspheres |
| US4413070A (en) | 1981-03-30 | 1983-11-01 | California Institute Of Technology | Polyacrolein microspheres |
| EP0090827A4 (en) * | 1981-10-13 | 1984-11-09 | Cockajemmy Pty Ltd | DEVICE AND METHOD FOR MAGNETIC DEPOSITION. |
| US4454234A (en) | 1981-12-30 | 1984-06-12 | Czerlinski George H | Coated magnetizable microparticles, reversible suspensions thereof, and processes relating thereto |
| JPS594487A (ja) * | 1982-06-28 | 1984-01-11 | Unyusho Daisan Kowan Kensetsu Kyokucho | 赤潮の処理方法 |
| US4564598A (en) | 1982-07-12 | 1986-01-14 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Limited volume method for particle counting |
| JPS59139910A (ja) * | 1983-01-27 | 1984-08-11 | Daido Steel Co Ltd | 磁気分離処理方法 |
| US4526681A (en) | 1983-10-31 | 1985-07-02 | Purdue Research Foundation | Magnetic separation method utilizing a colloid of magnetic particles |
| GB8400070D0 (en) | 1984-01-04 | 1984-02-08 | Serono Diagnostics Ltd | Magnetic assay reagents |
| US4523996A (en) | 1984-02-22 | 1985-06-18 | Westinghouse Electric Corp. | Method of separating cationic from anionic beads in mixed resin beds |
| SE8401125L (sv) * | 1984-03-01 | 1985-09-02 | Ulf Schroder | Sett vid diagnostisering in vitro och diagnostiskt medel |
| JPS61210516A (ja) | 1985-03-15 | 1986-09-18 | Hitachi Ltd | 磁気記録媒体およびその製造法 |
| US4806488A (en) | 1985-09-06 | 1989-02-21 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Ligand-receptor assays employing squarate dye compositions |
-
1986
- 1986-12-19 EP EP86309967A patent/EP0230768B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-19 AU AU66763/86A patent/AU601386B2/en not_active Ceased
- 1986-12-19 CA CA000525882A patent/CA1304006C/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-12-19 ES ES198686309967T patent/ES2030667T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-19 DE DE8686309967T patent/DE3684448D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-12-19 JP JP61305165A patent/JP2806924B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-19 AT AT86309967T patent/ATE73690T1/de not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4452773A (en) | 1982-04-05 | 1984-06-05 | Canadian Patents And Development Limited | Magnetic iron-dextran microspheres |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200066790A (ko) * | 2018-12-03 | 2020-06-11 | 연세대학교 산학협력단 | 자성입자를 이용한 집진장치 |
| KR102156171B1 (ko) * | 2018-12-03 | 2020-09-15 | 연세대학교 산학협력단 | 자성입자를 이용한 집진장치 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0230768A1 (en) | 1987-08-05 |
| AU6676386A (en) | 1987-06-25 |
| DE3684448D1 (de) | 1992-04-23 |
| ATE73690T1 (de) | 1992-04-15 |
| EP0230768B1 (en) | 1992-03-18 |
| AU601386B2 (en) | 1990-09-13 |
| ES2030667T3 (es) | 1992-11-16 |
| JPS62190466A (ja) | 1987-08-20 |
| CA1304006C (en) | 1992-06-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2806924B2 (ja) | 粒子分離方法 | |
| US5536644A (en) | Particle separation method | |
| US4935147A (en) | Particle separation method | |
| US5370993A (en) | Reversible agglutination mediators | |
| US5108933A (en) | Manipulation of colloids for facilitating magnetic separations | |
| JP5442544B2 (ja) | 特異的結合対のメンバー間の結合相互作用を促進する方法 | |
| US5279936A (en) | Method of separation employing magnetic particles and second medium | |
| JP3097866B2 (ja) | 標識試薬を使用した結合検定法 | |
| US6623982B1 (en) | Increased separation efficiency via controlled aggregation of magnetic nanoparticles | |
| JP4448642B2 (ja) | 多糖で被覆された担体、その製造および使用 | |
| US5660990A (en) | Surface immobilization of magnetically collected materials | |
| JP4163869B2 (ja) | 検出方法 | |
| RU2025732C1 (ru) | Способ иммуноанализа аналита в водном образце | |
| JP2736467B2 (ja) | 磁気応答ポリマー粒子の製造法およびその応用 | |
| JP4663957B2 (ja) | 磁性ナノ粒子の制御された凝集による増大した分離効率 | |
| JPH04503968A (ja) | 磁気応答性螢光ポリマー粒子及びその利用 | |
| CA1322067C (en) | Reversible agglutination mediators | |
| JP2844263B2 (ja) | 磁気応答性ポリマー粒子の製造方法及びその用途 | |
| JPH04212037A (ja) | 混合物中の成分の分離方法 | |
| Shen et al. | Development of magnetic microparticle antibodies and their application to RIA's for the evaluation of the thyroid function |