JPH04212037A - 混合物中の成分の分離方法 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景 １．発明の分野 本発明は、混合物中のある成分（粒子状であっても粒子
状でなくてもよい）を他成分から分離する方法に関する
。本発明はとくに、たとえば、血液、リンパ液、尿、細
胞培養液、懸濁された糞等のような生物学的液体からの
細胞、微生物、オルガネラ、分子集合体、核酸およびリ
ガンドを検定する目的での分離に応用される。

【０００２】とくに生物学的サンプルならびに食品およ
び薬品産物中の微生物の検出および同定は、疾患の臨床
的診断、疾患の伝染の予防および食品の品質管理に必要
である。旧来、細菌およびかびは、培養法によって検出
、同定されてきたが、この方法は著しく遅く、冗長であ
る。さらに最近になって、微生物抗原のイムノアッセイ
や核酸のプローブアッセイが開発されてきた。しかしな
がら、これらの方法は通常、特定の生物の検出の場合に
のみ可能である。敗血症の決定には、増殖の一般的指標
として、たとえば二酸加炭素の検定がしばしば使用され
る。これに続いて、生物の同定の培養方法、さらに抗生
物質感受性テストが行われる。もっと迅速かつ簡単に試
験結果を得ることが必要である。

【０００３】分離を行うにはいくつかの方法が知られて
いる。たとえば、遠心分離および洗浄、結合および遊離
分画の特異的移動、たとえばクロマト電気泳動、ゲル▲
ろ▼過等；結合または遊離分画の、たとえば有機溶媒、
塩、酸等による化学的沈殿、ついで▲ろ▼過または遠心
分離；結合分画の、たとえば二重抗体法による免疫学的
沈殿、ついで▲ろ▼過または遠心分離；結合または遊離
分画の、選択的吸着媒体たとえば炭末、珪酸塩、樹脂等
への吸着、磁性分離法等がある。

【０００４】イムノアッセイに用いられる分離法を含め
て、多くの分離法は、比較的長く、複雑な操作による。 このような操作が、オペレーターの効率を減少させ、一
定時間内の処理量を低下させ、試験の費用を増大させる
。他の迅速で簡単な分離法は、結合および遊離分画を適
切に識別せず、したがってイムノアッセイには不適当で
あるか、または限られた数の試験でしか使用できない。

【０００５】２．関連技術の説明 最近、Ｍｉｃｒｏｄｒｏｐ　　Ｃｏ．は、尿の全サンプ
ルを、アガロースまたは他のゲルの小ビーズに、各ビー
ズが少なくとも１個の生物を捕捉するように変換する方
法を発表した（Ｗｅａｖｅｒら：Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ、６：１０８４〜１０８９、１９８８）。ビー
ズは培養培地を包含し、油中に分散した。増殖は感染粒
子内での指示染料の生成によって直接検知された。この
方法は、個々の生物体を検知、分類、計数および検討す
る能力を提供する。しかしながら、この方法は繁雑で、
サンプル中における成長阻害物質からの細菌の分離は希
釈および拡散によってのみ生じる。

【０００６】細胞は一般に、高密度または高粘度媒体中
での遠心分離によって分離され、金の粒子を導入したラ
イソゾームはその密度の増大に基づき、庶糖密度勾配速
度遠心分離を用いて単離されている（Ｈｅｎｎｉｎｇら
：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，３５４
：１１４〜１２０，１９７４）。また、Ｄｏｒｎら（Ｊ
．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ，３：２５１〜２５７，１９７
６）は、細菌が不溶の細胞屑とともに、溶解血液サンプ
ルの可溶性成分から、懸濁液を下層に置いた庶糖溶液と
回転させると分離できることを明らかにしている。 これはＩ．Ｅ．ＤｕＰｏｎｔ　　ｄｅ　　Ｎｅｍｏｕｒ
ｓ　　ＣｏｍｐａｎｙからのＩＳＯＬＡＴＯＲと呼ばれ
る製品の基礎となっている。さらに、Ｌｅｄｕｃら（Ｂ
ｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ　　Ａｃｔａ，８８５：
２４８，１９８６）は、表面上にポリ−ＡＤＰ−リボー
スシンテターゼを有するポリヌクレオソームを、非結合
ポリヌクレオソームから、シンテターゼに特異的な抗体
を結合させ、混合物を金標識プロテインＡと混合し、金
結合ポリヌクレオソームがより急速に分離される庶糖勾
配速度沈降法で分離することによって分別した。Ｃｏｕ
ｒｔｏｙら（Ｊ．Ｃｅｌｌ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ，９８：
８７０〜８７６，１９８４）は、ペルオキシダーゼ含有
オルガネラの分析および精製のための操作において３，
３′−ジアミノベンジジン細胞化学によって誘発される
平衡密度のシフトについて記載している。

【０００７】発明の要約 本発明の方法は、興味ある物質と他の不溶性および／ま
たは可溶性成分を含有する混合物から、興味ある物質を
分離することを目的とするものである。本発明の方法は
、第一の液体媒体中で興味ある物質をビーズに結合させ
（ＭＩ−ビーズ）、液体系中ＭＩ−ビーズを与え、この
場合、ＭＩ−ビーズは、液体媒体からなる液体系よりも
密度が大となるようにする。液体系の少なくとも一部分
の密度は、液体系中の他の不溶性成分の密度より大にす
る。次に、液体系に、不溶性成分からＭＩ−ビーズを分
離するのに十分な遠心力を付与する。興味ある物質を他
の可溶性成分から分離したい場合には、第二の水性媒体
を第一の液体媒体に重層する。

【０００８】本発明の方法はとくに、たとえば細胞培養
液、体液等からの興味ある有機および生化学物質の分離
に応用できる。

【０００９】本発明の方法の一態様は、興味ある物質と
他成分を含有する混合物からの興味ある物質の分離方法
である。この方法は、興味ある物質を水性媒体中でビー
ズに結合させる（ＭＩ−ビーズ）。この場合、水性媒体
はＭＩ−ビーズの密度よりも小さいがその媒体中に不溶
性の他のいずれの成分の密度よりも大きい密度を有する
か、または上記工程後にそのように調整する。媒体を遠
心分離に付してＭＩ−ビーズを、他の成分から分離され
た媒体内もしくは外の領域に捕集するが、ただし、他成
分が水性媒体に可溶性の場合にはＭＩ−ビーズは媒体の
外部にのみ捕集する。

【００１０】本発明の方法の他の態様は、微生物と他成
分を含有する混合物から微生物を分離する方法である。 この方法は、微生物を、水性媒体中でビーズに結合させ
て、微生物−ビーズを形成させるものである。ビーズは
１．２ｇ／ｃｍ３を越える密度と、約１〜５０，０００
ｎｍの平均直径を有する。次に、媒体を遠心分離に付し
て微生物−ビーズを濃縮する。上述の他の態様において
は、水性媒体の密度は、媒体に不溶性の他のいずれの成
分の密度より大きく、微生物−ビーズの密度より小さく
なるように調整する。上述の他の態様においては、遠心
分離により、微生物−ビーズを媒体の外部の領域に集め
させる。この領域は他の成分の領域から分離されている
。上述の他の態様においては、水性媒体を遠心分離に付
す前に、水性媒体を水性媒体より粘度の高い媒体上に重
層する。

【００１１】本発明の他の態様は、微生物と他の成分を
含有する混合物から微生物を分離する方法に関する。こ
の方法は、微生物を第一の水性媒体中で数多くのビーズ
に結合させて、微生物−ビーズを形成させるものである
。ビーズは、１０ｇ／ｃｍ３を越える密度と、約１〜５
０ｎｍの平均直径を有する。第一の媒体を、第一の媒体
より大きいが微生物−ビーズよりも小さい密度を有する
第二の媒体と接触させる。接触した第一および第二の媒
体を遠心分離に付すと、微生物−ビーズは第一の媒体の
外側の領域に集められる。この領域は他の成分の領域と
は分離される。

【００１２】上述の他の態様においては、第一の媒体と
第二の媒体を混合し、混合した第一および第二の媒体よ
り高い粘度を有する第三の媒体上に重層する。

【００１３】本発明の他の態様は、水性媒体から微生物
を分離する方法であり、遠心分離工程を包含する方法で
あって、（ａ）上記微生物より密度の高い水性媒体を準
備し、（ｂ）遠心分離前に上記微生物をビーズに結合さ
せて、１個の生物体と多数のビーズからなる集合体を形
成させることからなる改良に関する。この方法はまた、
水性媒体を第二の液体媒体上に重層する場合も包含する
。

【００１４】本発明の他の態様は、被験物質のアッセイ
を実施する方法である。この方法は、被験物質または被
験物質の存在にその存在が関連する物質を、水性媒体中
でビーズ（Ａ−ビーズ）に結合させる。水性媒体は、Ａ
−ビーズの密度よりは小さいがその媒体中に不溶性の他
のいずれの成分の密度よりも大きい密度を有するか、ま
たは上記工程後にそのように調整する。媒体を遠心分離
に付してＡ−ビーズを他の成分から分離された媒体の内
もしくは外の領域に捕集するが、ただし、他の成分がこ
の媒体に可溶な場合には、Ａ−ビーズは媒体の外部に捕
集する。被験物質または他の物質をついで検出する。

【００１５】本発明はさらに、本発明の方法およびアッ
セイを実施するための組成物およびキットを包含する。

【００１６】図面の簡単な記述 図１は、ＰｅｒｃｏｌｌＴＭ勾配の密度検量を示す。図
２は、Ｐｅｒｃｏｌｌ−ジアトラゾエート勾配の重量測
定法による密度検量を示す。

【００１７】特定の態様の説明 本発明は一般的には、サンプル中の興味ある物質（ＭＩ
）を他の成分から分離する方法に関する。分離すべきＭ
Ｉはビーズ（ＭＩ−ビーズ）に結合させる。ビーズとＭ
Ｉの間の結合を達成する好ましいアプローチは、電荷相
互作用またはリガンド−受容体結合である。ＭＩはまた
、ビーズに、核酸ハイブリダイゼーションによっても結
合できる。ＭＩ−ビーズは、それが懸濁している液体媒
体の密度よりも大きな密度を有する。液体媒体の少なく
とも一部分の密度は、媒体中の不溶性の他成分の密度よ
り大きい。媒体は、ＭＩ−ビーズを他成分から空間的に
分離するのに十分な遠心力を付与する。分離されたＭＩ
−ビーズはさらに洗浄し、物理的または化学的方法によ
って調べる。ＭＩ−ビーズはまた、ＭＩとの結合が解除
されるように処理することもできる。結合の解除に続い
て遊離ビーズを分離すれば、ビーズからＭＩを分離する
方法が与えられる。

【００１８】本発明の方法は、サンプル中の他成分から
興味ある物質を分離または検定する分野に広く応用され
る。とくに生物学的物質たとえば細胞、微生物たとえば
細菌およびかび、オルガネラ、分子集合体等のような粒
子状物質、ならびに非粒子状物質たとえばリガンドおよ
び核酸の分離に応用できる。興味ある物質は生物学的サ
ンプルたとえば細胞培養液、体液等、食用製品、薬用製
品等の中に存在する。一般に、興味ある物質は、生物学
的液体または可溶化生物学的固体および他の可溶性成分
中に含まれる広範囲の粒状物質とともに存在する。本発
明は、遠心分離および従来の分離方法よりも便利で迅速
な分離方法を提供するものであり、他成分から分離され
た興味ある物質の分析の実施を所望の場合、懸濁液の前
処置にとくに適用できる。本発明は、分離工程が必要な
、サンプル中の被験物質の検定に適用できる。

【００１９】本発明の特定の態様についてさらに説明を
進める前に、多数の用語について以下に定義する。

【００２０】興味ある物質（ＭＩ）―分離すべき化合物
または組成物。興味ある物質は非粒状でも粒状でもよい
。非粒状ＭＩは特異的結合ペア（ｓｂｐ）の一員であっ
てもよく、１価もしくは多価、通常は抗原もしくはハプ
テン性のリガンドであり、少なくとも１個の共通のエピ
トープまたは決定部分を有する単一の化合物または複数
個の化合物である。ＭＩは粒子状であってもよい。粒子
状ＭＩの例には、血液型抗原たとえばＡ、Ｂ、Ｄ等もし
くはＨＬＡ抗原を有する細胞、または細菌、かび、原生
動物もしくはウイルスのような微生物である。ＭＩは、
１価（モノエピトープ）のまたは多価（ポリエピトープ
）のいずれかの被験物質であってもよい。多価リガンド
被験物質は通常、ポリ（アミノ酸）、すなわちポリペプ
チドおよび蛋白質、多糖、脂質、核酸、およびそれらの
混合物である。このような混合物には、細菌、かび、ウ
イルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、核、細胞膜
等の成分が包含される。

【００２１】多くの場合、本発明が適用できるポリエピ
トープリガンド被験物質は、少なくとも約５，０００、
通常は少なくとも約１０，０００の分子量を有する。ポ
リ（アミノ酸）の範疇では、興味あるポリ（アミノ酸）
は一般的に、約５，０００〜５，０００，０００、通常
は約２０，０００〜１，０００，０００の分子量を有す
る。興味のあるホルモンの場合、分子量は通常、約５，
０００〜６０，０００の範囲である。

【００２２】広範囲の多様な蛋白質が、類似の構造的特
性をもつ蛋白質、特定の生物学的機能を有する蛋白質、
特定の微生物とくに病原微生物に関連する蛋白質等の群
として考えることができる。

【００２３】モノエピトープリガンド被験物質は一般的
に約１００〜２，０００の分子量、通常は１２５〜２，
０００の分子量を有する。この被験物質には薬剤、代謝
物、有害生物殺滅剤、汚染物質等が包含される。興味あ
る薬剤にはアルカロイドがある。アルカロイドには、モ
ルフィン、コデイン、ヘロイン、デキストロメトロファ
ン、それらの誘導体および代謝物を包含するモルフィン
アルカロイド；コカインおよびベンゾイルエクゴニン、
その誘導体および代謝物を包含するコカインアルカロイ
ド；リゼルギン酸ジエチルアミドを包含する麦角アルカ
ロイド；ステロイドアルカロイド；イミナゾイルアルカ
ロイド；キナゾリンアルカロイド、イソキノリンアルカ
ロイド；キニンおよびキニジンを包含するキノリンアル
カロイド；ジテルペンアルカロイド、その誘導体および
代謝物がある。

【００２４】次の群の薬剤としては、エストロジェン、
アンドロジェン、副腎皮質ステロイドを包含するステロ
イド、胆汁酸、ジゴキシンおよびジゴキシゲニンを包含
する強心グリコシドおよびアグリコン、サポニンおよび
サポゲニン、その誘導体および代謝物がある。ここには
また、ステロイド模倣物質たとえばジエチルスチルベス
トロールも包含される。次の薬剤群は５〜６員の環を有
するラクタムであり、バルビツール酸たとえばフェノバ
ルビタールおよびセコバルビタール、ジフェニルヒダン
トイン、プリミドン、エトスキシミドおよびそれらの代
謝物が包含される。

【００２５】次の薬剤群は２〜３個の炭素原子をもつア
ルキル基を有するアミノアルキルベンゼンであり、アン
フェタミン、エフェドリン、Ｌ−ドーパ、エピネフリン
を包含するカテコールアミン、ナルセイン、パパベリン
およびそれらの代謝物である。

【００２６】次の薬剤群は、ベンズ異項環化合物であり
、オキサゼパム、クロルプロマジン、テグレトール、イ
ミプラミン、それらの誘導体および代謝物であり、この
場合の異項環はアゼピン、ジアゼピンおよびフェノチア
ジンである。

【００２７】次の薬剤群はプリン類であり、テオフィリ
ン、カフェイン、それらの代謝物および誘導体を包含す
る。

【００２８】次の薬剤群は、マリハナから誘導される薬
剤であり、カンナビノールおよびテトラヒドロカンナビ
ノールを包含する。

【００２９】次の薬剤群は、ビタミンたとえばＡ、Ｂた
とえばＢ１２、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＫ、葉酸、チアミンで
ある。

【００３０】次の薬剤群は、ヒドロキシル化および不飽
和の程度および部位が様々に異なるプロスタグランジン
類である。

【００３１】次の薬剤群は抗生物質であり、ペニシリン
、クロロマイセチン、アクチノマイセチン、テトラサイ
クリン、テトラマイシン、それらの代謝物および誘導体
を包含する。

【００３２】次の薬剤群はヌクレオシドおよびヌクレオ
チドであり、ＡＴＰ、ＮＡＤ、ＦＭＮ、アデノシン、グ
アノシン、チミジンおよびシチジンならびにそれらの適
当な糖およびリン酸置換体を包含する。次の薬剤群はそ
の他の個別の薬剤であり、メサドン、メプロバメート、
セロトニン、メペリジン、アミトリプチリン、ノルトリ
プチリン、リドカイン、プロカインアミド、アセチルプ
ロカインアミド、プロプラノロール、グリセオフルビン
、バルプロ酸、ブチロフェノン類、抗ヒスタミン剤、抗
コリン酸たとえばアトロピン、それらの代謝物および誘
導体を包含する。

【００３３】疾病状態に関連する代謝物としては、スペ
ルミン、ガラクトース、フェニルピルビン酸およびポル
フィリンＩ型がある。

【００３４】次の薬剤群はアミノグリコシド、たとえば
ゲンタマイシン、カナマイシン、トブラマイシンおよび
アミカシンである。

【００３５】興味ある有害生物殺滅剤としては、ポリハ
ロゲン化ビフェニル、リン酸エステル、チオリン酸エス
テル、カルバメート、ポリハロゲン化スルフェナミド、
それらの代謝物および誘導体がある。

【００３６】受容体被験物質の場合、分子量は一般には
１０，０００〜２×１０８、通常は１０，０００〜１０
６の範囲である。免疫グロブリン、ＩｇＡ、ＩｇＧ、Ｉ
ｇＥおよびＩｇＭの場合、分子量は一般的に約１６０，
０００から約１０６まで変動する。酵素は通常、約１０
，０００〜１，０００，０００の範囲の分子量を有する
。天然の受容体は広範囲に変動し、一般には分子量は少
なくとも約２５，０００で１０６またはそれ以上の分子
量の場合もあり、このような物質にはアビジン、ＤＮＡ
、ＲＮＡ、サイロキシン結合グロブリン、サイロキシン
結合プレアルブミン、トランスコルチン等がある。

【００３７】微生物の例を示せば次の通りである。

【００３８】特異的結合ペアのメンバー（ｓｂｐメンバ
ー）―他の分子と特異的に結合する表面上または空洞内
の領域を有し、他分子の特定の空間配置および極性機構
と相補性または相互性と定義される２個の異なる分子の
一方をいう。特異的結合ペアのメンバーはリガンドおよ
び受容体（抗リガンド）とも呼ばれる。これらは通常、
免疫学的ペアたとえば抗原−抗体のメンバーである。し
かしながら、他の特異的結合ペアたとえばビオチン−ア
ビジン、ホルモン−ホルモン受容体、レシチン−炭水化
物、核酸二重鎖、ＩｇＧ−プロテインＡ、ＤＮＡ−ＤＮ
Ａ、ＤＮＡ−ＲＮＡ等は免疫学的ペアではないが、本発
明に包含される。

【００３９】リガンド―受容体が天然に存在するか、ま
たは調製できる任意の有機化合物

【００４０】リガンド類縁体−類縁のリガンドと１種の
受容体を競合できる修飾リガンドで、修飾は通常、リガ
ンド類縁体に他の分子への接合手段を付与するように行
われる。リガンド類縁体は通常、リガンドとはリガンド
類縁体をハブまたは標識に連結する結合による水素の置
換以上の差を有するが、これは必須ではない。リガンド
類縁体はリガンドと同様の様式で受容体に結合できる。 類縁体はたとえば、そのリガンドに対するイディオタイ
プに向けられた抗体であってもよい。

【００４１】受容体（抗リガンド）―特定の分子の空間
的および極性的機構たとえばエピトープまたは決定部位
を認識できる任意の化合物または組成物。受容体の例に
は、天然の受容体たとえばサイロキシン結合グロブリン
、抗体、酵素、Ｆａｂフラグメント、レシチン、核酸、
プロテインＡ、補体成分Ｃ１ｑ等がある。

【００４２】粒状のＭＩ−粒状のＭＩは一般的に、直径
が少なくとも約０．１ミクロンで約１００ミクロンを越
えることなく、通常０．５〜２５ミクロンである。粒状
のＭＩは有機物でも無機物でもよく、膨潤性でも非膨潤
性でもよく、多孔性でも非多孔性でもよく、通常、密度
は水にほぼ等しく、一般的に約０．７〜約１．５ｇ／ｍ
ｌである。通常、粒状のＭＩは陽性または陰性の電荷を
有し、それらの表面に関しｓｂｐメンバーをもつことが
できる。通常、粒状のＭＩは生物学的物質・たとえば細
胞たとえば赤血球、白血球、リンパ球、ハイブリドーマ
、微生物たとえば、連鎖球菌、黄色ブドウ状球菌、大腸
菌、ウイルス、オルガネラたとえば核、ミトコンドリア
、ヌクレオソーム等である。粒状のＭＩは、有機および
無機ポリマーからなる粒子、リポソーム、ラテックス粒
子、リン脂質小泡、カイロミクロン、リポ蛋白等であっ
てもよい。

【００４３】ポリマーは通常、付加または縮合ポリマー
である。それらから誘導される粒状ＭＩは吸着性である
か、またはｓｂｐメンバーを直接もしくは間接的に結合
できるように機能化することができる。

【００４４】粒状ＭＩは被験物質でも、それに被験物質
が結合されていてもよい。また、被験物質が分離前また
は分離中、それに結合してもよい。粒状ＭＩは最初は被
験物質には結合していなくて、天然材料、合成的に改良
した天然材料および合成材料から誘導される。とくに興
味のある有機ポリマーとしては、多糖とくに架橋多糖、
たとえばＳｅｐｈａｒｏｓｅとして市販されているアガ
ロース、ＳｅｐｈａｄｅｘおよびＳｅｐｈａｃｒｙｌと
して市販されているセルロース、デンプン等、その他の
ポリマーたとえばポリスチレン、ポリビニルアルコール
、アクリル酸およびメタクリル酸の誘導体、とくに遊離
のヒドロキシル官能基を有するエステルおよびアミドの
ホモポリマーおよびコポリマー等を挙げることができる
。

【００４５】検定に使用するための粒子は通常、多官能
性で、ｓｂｐメンバーたとえば抗体、アビジン、ビオチ
ン、レシチン、プロテインＡ等に結合するか、または特
異的な非共有結合が可能である。官能基としてはカンボ
ン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、
ヒドロキシル基、メルカプト基等、広範囲の官能基が市
販されていて、導入可能である。粒子への広範囲の化合
物の結合の様式はよく知られていて、文献にしばしば例
示されている（たとえばＣｕａｔｒｅｃａｓａｓ：Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４５：３０５９，１９７０参照
）。連結基の長さは、連結される化合物の性質、連結さ
れる化合物とｓｂｐメンバーおよび被験物質等の結合し
た粒子との間の距離の効果によって、広範囲に変動させ
ることができる。

【００４６】特定のＭＩは、陽性または陰性の電荷をも
っていてもよい。粒子は本来荷電していてもよく、また
電荷を導入するように化学的または物理的に処理しても
よい。たとえば、カルボキシル、スルホネート、リン酸
、アミノ等の基は、本技術分野において公知の方法によ
り、粒子に化合的に結合させてもよく、また粒子上に形
成させてもよい。細胞は通常、細胞表面にシアール酸残
基が存在するため、陰性に荷電している。ラテックス粒
子は陽性にも陰性にも荷電できるが、通常は荷電ポリマ
ーたとえばポリペプチド、蛋白質、ポリアクリレート等
の官能基の導入または吸着の結果、陰性に荷電している
。

【００４７】粒子は着色してもよいし、蛍光性でも非蛍
光性でもよい。通常は非蛍光性であるが、蛍光性とする
場合には、直接蛍光性とするか、または慣用方法により
蛍光化合物または蛍光体を粒子に結合させることができ
る。

【００４８】標識―被験物質を包含するＭＩ、またはＭ
Ｉの存在にその存在が関連する物質に結合したまたは結
合させたシグナル生成系のメンバーである。標識はアイ
ソトープでも非アイソトープでもよく、通常は非アイソ
トープであり、触媒たとえば酵素、色素原たとえば蛍光
体、染料もしくは化学発光体、粒子等を包含する。

【００４９】シグナル生成系―シグナル生成系は１種ま
たは２種以上の成分を有し、その少なくとも１成分は標
識である。このシグナル生成系はＭＩまたはＭＩの存在
にその存在が関連する物質のサンプル中の存在または量
に関連してシグナルを発生する。シグナル生成系には測
定可能なシグナルの生成に必要なすべての試薬が包含さ
れる。シグナル生成系の他の成分には、基質、増感剤、
活性化剤、化学発光化合物、補因子、インヒビター、ス
カベンジャー、金属イオン、シグナル発生物質の結合に
必要な特異的結合物質等が包含される。シグナル生成系
の他の成分は、補酵素、酵素産物と反応する物質、他の
酵素および触媒等であってもよい。シグナル生成系は、
外部手段によって検知可能なシグナルを与える。好まし
くは、粒子の凝集程度の測定により、または電磁照射の
使用により、望ましくは肉眼的検査により検知可能なシ
グナルである。

【００５０】シグナル生成系に有用な多数の酵素および
補酵素が、米国特許第４，２７５，１４９号１９〜２３
欄および米国特許第４，３１８，９８０号１０〜１４欄
に示されている。これらの開示は参考として本明細書に
導入する。米国特許第４，２７５，１４９号２３〜２８
欄には、本発明に利用できる多数の酵素の組合せが開示
されている。この開示は参考として本明細書に導入する
。

【００５１】ビーズ―一般に少なくとも約１〜５０，０
００ｎｍ、通常は少なくとも約２０〜１０，０００ｎｍ
の粒子である。密度８ｇ／ｃｍ３未満のビーズは平均直
径１００〜５０，０００ｎｍであることが好ましい。密
度の高いビーズは通常、平均直径が５〜３０ｎｍ、好ま
しくは約１〜５０ｎｍである。ビーズは有機物でも無機
物でもよく、膨潤性でも非膨潤性でもよく、多孔性でも
非多孔性でもよい。ビーズは、透明の、半透明のまたは
不透明の材料から構成できる。ビーズは、その使用に適
した任意の形状、たとえば球形、卵形、また不規則な形
態等とすることができる。

【００５２】ビーズは、ＭＩ（粒子状でも粒子状でなく
ても）を結合できるものである。したがって、ビーズは
通常、その表面に、このような結合能を付与する剤を有
する。結合は特異的でも非特異的でも、共有結合でも非
共有結合でもよい。この剤にはｓｂｐメンバー、たとえ
ば特異的受容体または核酸が包含される。たとえば、ビ
ーズは表面に抗−免疫グロブリンを有し、微生物に対す
る抗体を結合の形成に利用できる。また、この剤は、と
くにＭＩが微生物である場合には、レシチンまたは多イ
オン試薬であってもよい。ビーズは、陽性または陰性の
電荷を有し、またその表面にｓｂｐメンバーをもってい
てもよい。

【００５３】ビーズは、ＭＩを分離すべき混合物中の他
の不溶性成分よりも高い密度を有するように選択される
。通常、ビーズの密度は少なくとも１．２ｇ／ｃｍ３で
あることが要求され、とくに粒状のＭＩを分離するとき
で、ビーズが粒状ＭＩより小さい場合には、さらに高い
密度通常少なくとも４ｇ／ｃｍ３が好ましい。主たる要
求は、１個または多数のビーズがＭＩに結合した集合体
が、ＭＩを分離すべき混合物中の他の不溶性成分の密度
より大きくなければならないことである。

【００５４】ビーズは天然の材料から、合成的に修飾し
た天然材料および合成材料から誘導できる。一つの種類
のビーズは、重金属すなわち原子番号が２０を越える金
属、たとえばＩＢ族金属たとえば金または銀から構成さ
れる。重金属は、金属ゾルの形（銀、金、水銀、鉛、パ
ラジウム等のコロイド性懸濁液）とすることもでき、ま
た金属塩、たとえば重金属たとえば鉛、バリウム、カル
シウム、チタン等の酸化物、硫化物、不溶性リン酸塩も
しくは硫酸塩であってもよい。他の種類のビーズはポリ
オールビーズ、すなわち、２個以上のヒドロキシ基を有
するポリマー化合物からなるビーズである。有機ポリマ
ー中とくに興味があるものは、多糖、とくに架橋多糖、
たとえばＳｅｐｈａｒｏｓｅとして市販されているアガ
ロース、ＳｅｐｈａｄｅｘおよびＳｅｐｈａｃｒｙｌと
して市販されているデキストラン、セルロース、デンプ
ン等、付加ポリマーたとえばポリスチレン、ポリビニル
アルコール、アクリル酸およびメタアクリル酸の誘導体
とくに遊離のヒドロキシル官能基を有するエステルおよ
びアミドのホモポリマーおよびコポリマー等である。本
発明に使用できるビーズの他の例としては、ガラス、ラ
テックス、ポリアクリルアミド、炭素、窒化ホウ素、カ
ルボラン、シリコンカーバイド、金属ケイ酸塩等からな
るシリカビーズを挙げることができるが、これらは単に
例示したものであって、本発明を限定するものではない
。

【００５５】比較的サイズの大きい細胞や微生物では、
とくにビーズが細胞や微生物に比べて実質的に小さい場
合、高密度のビーズの結合が要求される。好ましいビー
ズは重金属を含有し、不溶性で、コロイドが安定で、好
ましくは１Ｂ金属ゾル、とくに金ならびに金属酸化物お
よび硫化物、不溶性の硫酸塩たとえば、直径が５〜７０
ｎｍ、密度が１０ｇ／ｃｍ３以上のバリウムおよびカル
シウムの硫酸塩を含有する。また、もっと大きな、ラテ
ックス、シリカ、ガラス、アガロース、セルロース、Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ等からなるビーズも、興味ある物質に結
合させる場合の液体に不溶で、それよりも密度が大きい
限り、同様に使用できる。

【００５６】分離すべき興味ある物質へのビーズの結合
の速度および効率を高めるためには、ビーズの濃度を上
昇させる。著しく嵩高い沈殿を回避し、しかもビーズの
濃度を最大にするには、小さく、極めて高密度のビーズ
、通常、比重１０〜２０ｇ／ｃｍ３の１〜５０ｎｍの範
囲のものを使用するのが好ましい。

【００５７】ビーズは通常多官能性で、ｓｂｐメンバー
たとえば抗体、アビジン、ビオチン、レシチン、プロテ
インＡ等に結合しているか、またはそれらに特異的な非
共有結合が可能である。広範囲の官能基が利用されてい
て、また導入可能である。官能基には、カルボン酸、ア
ルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキ
シル基、メルカプト基等が包含される。広範囲の化合物
の粒子への連結様式はよく知らていて、文献に詳細に例
示されている（たとえばＣｕａｔｒｅｃａｓａｓ：Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４５：３０５９，１９７０参照
）。連結基の長さは、連結される化合物の性質、連結さ
れる化合物と粒子の間の距離がｓｂｐメンバーと被験物
質の結合に与える影響等に依存して、広範囲に変動させ
ることができる。

【００５８】ビーズは、陽性または陰性の電荷をもって
いてもよい。ビーズは本来荷電していてもよいし、また
電荷を道入するために化学的または物理的に処理するこ
ともできる。たとえば、カルボキシル、スルホネート、
ホスフェート、アミノ等のような基は、本技術分野でよ
く知られた方法により、粒子に化学的に結合させるかま
たは粒子上に形成させることができる。ラテックス粒子
は陽性にも陰性にも荷電できるが、通常、官能基の導入
または、ポリペプチド、蛋白質、ポリアクリレート等の
ような荷電ポリマーの吸着の結果、陰性の電荷を有する
。

【００５９】ビーズは蛍光性でも非蛍光性でもよく、通
常は蛍光性であるが、蛍光性である場合にはそれ自体が
蛍光性であるか、または慣用方法でビーズに蛍光化合物
または蛍光体が結合される。蛍光体は通常、ビーズ中に
溶解させるか、またはビーズに共有結合または非共有結
合で結合させ、多くの場合ビーズ全体に実質的に均一に
結合させる。蛍光を付与したラテックス粒子は米国特許
第３，８５３，９８７号に開示されている。

【００６０】興味ある蛍光体は、一般に３５０ｎｍ以上
の波長、通常は４００ｎｍ以上、好ましくは４５０ｎｍ
以上の光を発光する。蛍光体は、高い量子効率、大きな
ストークスシフトを有し、それが接合や使用の条件下に
化学的に安定であることが望ましい。蛍光体の語は、電
磁照射線による活性化または化学的活性化で光を発する
物質を包含する意図であり、蛍光およびリン光物質、シ
ンチレーターおよび化学発光物質を包含する。

【００６１】興味ある蛍光体は、ある種の一次官能性を
有する様々な種類に分類される。これらの一次官性には
１−および２−アミノナフタレン、ピレン類、四級フェ
ナンスリジン塩類、９−アミノアクリジン類、ｐ，ｐ′
−ジアミスチルベン類、イミン類、アントラセン類、オ
キサカルボシアニン、メロシアニン、３−アミノエクイ
レニン、ペリレン、ビス−ベンズオキサゾール、ビス−
ｐ−オキサゾリルベンゼン、１，２−ベンゾフェナジン
、レチノール、ビス−３−アミノピリジニウム塩類、ヘ
レブリゲニン、テトラサイクリン、ステロフェノール、
ベンズイミダゾリルフェニルアミン、２−オキソ−３−
クロメン、インドール、キサンテン、７−ヒドロキシク
マリン、４，５−ベンズイミダゾール類、フェノキサジ
ン、サリチレート、ストロファンチジン、ポルフィリン
類、トリアリールメタン類、フラビンならびに希土類キ
レート酸化物および塩類が包含される。蛍光体の例は米
国特許第４，３１８，７０７号７および８欄に列挙され
ている。米国特許第４，８０６，４８８号に記載されて
いるスクアレン染料も蛍光体として有用である。

【００６２】さらに、固体の不溶性粒子である光吸収性
ビーズも使用できる。

【００６３】ビーズは、本明細書においては、時に、本
発明を記述するのにより一般的な用語が適当な場合には
、粒子と呼ばれる。

【００６４】特異的結合―２種の異なる分子の一方によ
る他方の特異的認識であり、その他の分子は全く認識し
ない。一般にこれらの分子は、この２つの分子間に特異
的な認識を生じる領域を表面上または空洞内にもってい
る。主たる結合への影響は水素結合によって生じる。特
異的結合の例には、抗体−抗原相互作用、酵素−基質相
互作用等がある。

【００６５】非特異的結合―たとえば粒状ＭＩとビーズ
の間の、特異的表面構造に比較的無関係な非共有結合。 このような非特異的結合は通常、反対に荷電した粒子間
または、それと反対の電荷を有する多イオン試薬を用い
た場合には、同じ電荷を有する粒子間の電荷または電気
的相互作用によって生じる。非特異的結合はまた、分子
または粒子の表面の疎水性相互作用によっても生じる。

【００６６】多イオン試薬―無機または有機の、天然ま
たは合成の、少なくとも２個の同一の電荷を有し、多陰
イオン性でも多陽イオン性でもよく、好ましくは少なく
とも１０個の同一の電荷を有する化合物、組成物または
材料、たとえば多電解質である。

【００６７】多陽イオン性試薬の例としては、ポリエチ
レンイミンおよびポリプロピレンイミンのようなポリア
ルキレンアミン、ポリブレン（−Ｎ＋（ＣＨ３）２ＣＨ
２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−
）ｎのようなそれらの低級アルキルアンモニウム塩、カ
ルシウムおよびバリウムイオンのような金属イオン、ア
ミノデキストラン類、プロタミン、陽性に荷電したリポ
ソーム、ポリリジン等を挙げることができる。

【００６８】多陽イオン性試薬の例としては、ヘパリン
、デキストラン硫酸、陰性に荷電したリン脂質小胞、ポ
リカルボン酸たとえばポリアクリレート、ポリグルタメ
ート等を挙げることができる。上述の物質およびその製
造または単離法は本技術分野においてよく知られていて
、その多くは市販品を入手できる。

【００６９】放出剤―ＭＩとビーズの間の非特異的また
は特異的結合を解除できる。すなわちビーズからＭＩを
離脱させることができる。天然または合成の、有機また
は無機の化合物、組成物または材料。放出剤はＭＩとビ
ーズの間の特異的または非特異的結合に作用する。たと
えば、電荷の相互作用によって生じた非特異的結合の場
合は、放出剤は媒体のｐＨを電荷の相互作用に好ましく
ないまたは不適当な値に変えるように作用する。したが
って、放出剤は、鉱酸もしくは有機酸のような酸、また
は無機塩基もしくは有機塩基のような塩基であってよい
。また、放出剤は、イオンの相互作用を遮弊するように
働き、たとえば高イオン強度溶液またはデキストランの
ような天然ポリマーの溶液であってもよい。また、放出
剤は、粒状ＭＩとビーズの間の非特異的結合を分裂させ
る電荷をもっていてもよい。このような場合の例として
は、多電解質塩たとえばクエン酸塩、ポリアクリレート
、デキストラン硫酸等がある。粒子が多イオンブリッジ
によって結合している場合は、放出剤は逆の電荷の多イ
オン剤であるか、または多イオン剤を脱重合させる試薬
であってよい。ＭＩとビーズが逆の電荷をもつ場合には
、他の陽性または陰性に荷電した多電解質または高イオ
ン強度溶液を使用できる。

【００７０】特異的結合が関与する場合には、放出剤は
特異的相互作用を分裂させるもの、たとえばリガンド受
容体結合が関与している場合は過剰のリガンドもしくは
受容体またはリガンドもしくは受容体の模倣体；金属リ
ガンド結合を分裂できるキレート剤たとえばエチレンジ
アミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；還元剤たとえばジスルフィ
ド結合を分裂できるメルカプトエタノール；エステルを
分裂できる親核性試薬たとえばヒドロキシルアミン等で
あることができる。

【００７１】不溶性成分―検討すべき生物学的サンプル
または食用もしくは薬用製品に一般的に生じる、混合物
中のＭＩ以外の成分。これらの成分は通常、粒状物質で
あり、たとえば細胞屑、核、ミトコンドリア、ヌクレオ
ソーム、カイロミクロン、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）等
である。本発明の方法は血液に対してとくに有用であり
、可溶化剤および細胞の溶解剤によるサンプルの前処理
を包含する。これらの過程では、穏和な界面活性剤、浸
透圧ショックによる細胞分解、超音波処理、抗体および
補体、加圧等が使用される。このようにして調製された
懸濁液は通常、溶解した夾雑物質や細胞屑と同時に分離
すべき興味ある物質を含有する。

【００７２】補助剤―本発明による分離に際しては、多
くの場合、様々な補助剤が使用される。たとえば、緩衝
剤が液体媒体中に加えられ、また液体媒体および他の成
分のための安定剤が含有される。これらの添加物に加え
て、多くの場合、付加的な蛋白質たとえばアルブミン、
または界面活性剤とくに非イオン界面活性剤、結合増強
剤たとえばポリアルキレングリコール等を包含させるこ
とができる。

【００７３】上述のように、本発明は、ＭＩと不溶性成
分を含有する混合物からＭＩを分離する方法に関する。 この方法は、水性媒体中でＭＩをビーズに結合させるこ
とからなる（ＭＩ−ビーズ）。ＭＩ−ビーズは媒体より
大きい密度を有する。媒体は混合物中の不溶性成分より
も密度が大きい。分離しようとするＭＩは、ＭＩの性質
に応じて、特異的または非特異的結合によってビーズに
結合させる。非粒状ＭＩをビーズに結合させてＭＩ−ビ
ーズを形成させる場合には、特異的結合が用いられる場
合の方が多い。しかしながら、特異的結合はまた、粒子
状ＭＩのビーズへの結合にも関与する。通常、リガンド
−受容体結合が用いられる。ビーズはそれに非粒子状Ｍ
Ｉに対して相補性のｓｂｐメンバーを結合させることが
できる。非特異的結合は通常、粒状ＭＩについて都合よ
く採用され、電荷相互作用の結果として得られるのが好
ましい。たとえば、粒子状ＭＩとビーズは逆の電荷をも
ち、非特異的結合が自然に起こる。粒子状ＭＩとビーズ
が同じ電荷をもつ場合は、逆の電荷をもつ多イオン試薬
を媒体に添加して、粒子状ＭＩとビーズの間に非特異的
結合を起こさせることができる。

【００７４】次に、媒体に、不溶性成分とＭＩ−ビーズ
とを分離するのに十分な遠心力を付与する。この方法を
実施するには、水性媒体からなる液体媒体が使用される
。本明細書で用いられる「水性媒体」の語は、水が存在
する唯一の溶媒であるか、また水と他の極性溶媒、通常
は１〜６個通常は１〜４個の炭素原子を有する通常は酸
素化有機溶媒たとえばアルコール、エーテル等を含有す
る媒体とを包含する。通常、共溶媒が存在する場合には
、それは約４０重量％未満、さらに通常は約２０重量％
未満存在させる。媒体のｐＨは通常、分離前にはビーズ
へのＭＩの特異的または非特異的結合を促進するように
選択される。ビーズが陰性に荷電している場合は、ｐＨ
を上昇させると電荷は増大する傾向にあり、非特異的な
疎水性およびファンデルワールス相互作用によって生じ
る自発的凝集が防止される。陽性に荷電しているビーズ
では逆になる。結合を起こさせるために逆に荷電した多
電解質を添加する場合、多電解質の荷電を増大させるｐ
Ｈの変化はビーズの電荷を低下させることが多く、この
試薬の過剰量の使用を回避する至適ｐＨが選択されなけ
ればならない。一般的に５〜１０、さらに通常は−６〜
９のｐＨ範囲が使用される。リガンド−受容体結合につ
いては、ｓｂｐメンバーたとえば核酸の有意なレベルの
結合を維持するためにはｐＨに関して他の配慮が必要に
なる。所望のｐＨを達成し、測定時このｐＨを維持する
ためには、様々な緩衝剤が使用される。緩衝剤の例には
、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタール
等が包含される。使用される特定の緩衝液について本発
明には限定はないが、それぞれの分離においてある緩衝
液が他に比べて好ましいということはある。粒子状ＭＩ
が関与する場合、粒子状ＭＩとビーズの結合の解除を促
進する試薬を、分離の完了後に添加できる。この方法の
実施には中等度の温度が通常使用され、この方法の実施
中は通常一定の温度が保持される。一般的に、温度は、
分離前にはビーズへのＭＩの特異的または非特異的結合
を促進するように選択される。本発明の方法の温度は一
般的に約０℃〜５０℃、さらに通常には約１５℃〜４０
℃の範囲が用いられる。この場合も、分離後には、ＭＩ
とビーズの結合の解除を促進できる温度を選択すること
ができる。

【００７５】媒体中のビーズの濃度は、分離すべき媒体
中のＭＩの量およびそれが粒子状か非粒子状か、ビーズ
のサイズおよび結合能、所望の分離速度、遠心力の強度
、ならびにＭＩ−ビーズ、媒体および不溶性成分の相対
密度に依存する。一般的に、ビーズ濃度が高いと、ＭＩ
の結合は迅速になり、ＭＩが粒子状でビーズがＭＩより
小さい場合には、ビーズの濃度が高くなると分離の効率
も速度も高くなる。しかしながら、ビーズの濃度が高す
ぎると、媒体の過剰なエントレインメントを生じる。 濃度は通常、経験的に決定され、一般的に約１０４〜１
０１４以上／ｍｌ、さらに通常は約１０６〜１０１２／
ｍｌ、多くの場合約１０７〜１０１０／ｍｌの範囲で変
動する。

【００７６】粒子状ＭＩを媒体から分離する場合、粒子
状ＭＩの濃度は必要に応じて広範囲に変動させることが
できる。たとえば血漿から血球の分離の場合、細胞容量
は血液全容量の５０％である。これに対し、水サンプル
中からの細菌は１個／ｍｌのような微量の分離が望まし
い場合もある。検定される水性媒体中に比較的存在する
ことのない粒子状ＭＩを得ることが必要な場合には通常
、粒子状ＭＩの総容量は媒体の２０％未満でなければな
らない。ＭＩが非粒子状で、ビーズに結合する場合、Ｍ
Ｉは一般に約１０−４〜１０−１４Ｍ、さらに通常には
約１０−６〜１０−１２Ｍを変動する。ＭＩの濃度、特
異的および非特異的結合作用、所望の反応速度、温度、
溶解度、相対密度、遠心力等の考慮が通常、他の試薬の
濃度を決定する。

【００７７】各種試薬の濃度は一般的に、分離すべきＭ
Ｉの興味ある濃度範囲によって決定されるが、試薬それ
ぞれの最終的な濃度は通常、ＭＩの分離の速度および程
度が至適化するように経験的に定められる。

【００７８】非特異的結合が関与する場合には、粒子状
ＭＩとビーズの間の非特異的結合を形成する化学的手段
は通常、水性媒体中に包含される。ビーズ対して反対の
電荷を有する粒子状ＭＩを分離する場合を除いて、この
化学的手段は通常、ビーズの電荷と反対の電荷を有する
多イオン試薬である。添加される多イオン試薬の量は、
実質的にすべての粒子状ＭＩがビーズに結合するのに十
分な量でなければならない。この濃度は経験的に決定さ
れなければならない。過剰の試薬が粒子状ＭＩとビーズ
の間の完全な結合に干渉する場合には、一般にそれを回
避すべきである。一般的に、多イオン試薬は液体媒体中
に、ポリマーと会合するイオン数で、媒体中の全粒子と
逆の符号の電荷の総数に等しいイオン数を与えるのに十
分な濃度存在させる。ビーズと逆の電荷を有する粒子状
ＭＩを分離する場合には、粒子間に非特異的結合を形成
させる化学的手段は、多くの場合、低イオン強度の緩衝
液である。

【００７９】ビーズへのＭＩまたは粒子状ＭＩの結合は
ｐＨによって影響される。この結合はまた、他の因子た
とえばイオン強度ならびにイオン性および非イオン性ポ
リマーの存在によっても影響される。一般的に、非特異
的結合が電荷相互作用による場合には、イオン強度は最
初、両粒子間の結合を促進するように選択すべきである
。この目的では、イオン強度は一般に低く、０．００１
Ｍ〜０．５Ｍ、好ましくは０．００５Ｍ〜０．１Ｍとす
る。分離が完了したのち、イオン強度は粒子状ＭＩとビ
ーズのカップリングの解除を促進するように十方に調整
することができる。この目的では、媒体のイオン強度は
通常約０．１〜１０Ｍ、好ましくは約０．１５〜１Ｍと
される。粒子が凝集を起こすかまたは懸濁されたままで
残るかについての原理はコロイド科学の分野でよく知ら
れている。特異的結合が関与している場合には、イオン
強度は一般に重要ではなく、通常１０−３〜１０Ｍの範
囲またはそれ以上である。

【００８０】ビーズを水性媒体に添加したのち、ビーズ
へのＭＩの特異的結合を利用する場合には、水性媒体を
ついでこの結合が生じるのに十分な時間保持する。これ
は通常０．１〜１２０分、多くの場合１〜６０分を要す
る。ビーズへの化学的に誘導された非特異的な粒子状Ｍ
Ｉの結合が関与している場合には、このような結合はき
わめて迅速に起こり、通常は混合物をわずか数分間、し
ばしばわずか６０秒程度、多くの場合１５秒未満放置す
るだけで十分で、水性媒体にビーズおよび他の試薬を添
加して直ちに遠心力を適用するのが好ましい。ＭＩ、ま
たは粒子状のＭＩ、とビーズの間の結合の程度は、分離
の効率を制御する一因子である。

【００８１】水性媒体からなる液体媒体の少なくとも一
部の密度は、混合物中の不溶性成分の密度よりも大きい
。液体媒体は、均一な水性媒体でもよく、遠心分離によ
り密度勾配を与えることができる粒子の水性懸濁液、ま
た第二の通常はより粘稠な水性もしくは非水性液体媒体
を重層した水性媒体であってもよい。第二の媒体は、水
性媒体と少なくとも同密度であり、通常は水性媒体より
密度が高い。一般的に、液体媒体の少なくとも一部分、
好ましくは水性媒体の密度は、不溶性成分の密度の少な
くとも１．０５倍である。一般的に、不溶性成分の密度
は約０．７〜１．２ｇ／ｃｍ３、通常は１．０〜１．１
５ｇ／ｃｍ３である。もちろん、上述のしたように、液
体媒体の密度はＭＩ−ビーズの密度よりも小さくなけれ
ばならない。

【００８２】水性媒体の比較的高い密度は多数の異なる
方法によって達成できる。たとえば、所望の密度を達成
するためには、高密度の溶質を水性媒体に添加すること
ができる。好ましくは、高密度溶質は容易に細胞膜を通
過しないこと（細胞を分離する場合）、また媒体に実質
的にイオン強度を付加しないことである。このような高
密度溶質の例には、非イオン性または中性の水溶性、多
ヨード化有機溶質、たとえばＨｙｐａｑｕｅ▲Ｒ▼およ
びＮｙｃｏｄｅｎｚ▲Ｒ▼の商品名で市販されている製
品がある。その他の高密度溶質には、高分子量塩、すな
わち原子番号３４を超える原子から構成される塩たとえ
ば塩化セシウム塩；庶糖等が包含される。高分子量塩の
使用は、生きている微生物を分離するにはあまり望まし
くない。

【００８３】高密度水性媒体を製造する他のアプローチ
は、媒体への粒子状懸濁物たとえばシリカ粒子懸濁物の
添加である（Ｐｅｒｃｏｌｌ▲Ｒ▼等の商品名で市販さ
れている）。高密度非水性媒体の場合は、有機または無
機の液体たとえばハロ炭化水素、シリコン液体等の液体
からなるものであってもよい。

【００８４】上述のいずれの製造法による場合も、適当
な試薬の添加後、媒体に遠心力を付与する前に、必要に
応じて撹拌して水性媒体中への試薬の均一な分布を保証
し、水性媒体中の均一な密度を達成する。もちろん、Ｍ
Ｉとくに粒子状ＭＩたとえば細胞または微生物に害を生
じるような激しい撹拌は避けるべきである。

【００８５】別の態様においては、水性媒体は、少なく
とも水性媒体と密度が等しく、また層の混合を最小限に
するために水性媒体より高い粘度を有する第二の媒体と
重層することができる。第二の媒体は水性または非水性
であり、水性の場合には水性媒体について上述したよう
な極性溶媒を包含させることができる。

【００８６】第二の媒体のバルク粘度は水性媒体の粘度
の少なくとも１．５倍、通常約２〜１００倍、好ましく
は水性媒体の粘度の約２．５〜７５倍である。一般的に
、水性媒体の粘度は０．６〜１．３の範囲であり、第二
の媒体の粘度は１．５１００ｃｐである。

【００８７】第二の媒体の高粘度は、媒体の一部として
、バルク粘度を増大させる溶質、たとえばグリコールお
よびポリビニルアルコールのようなポリオール；単糖ま
たは多糖のような糖類、たとえばマンニトール、グルコ
ース、アガール、アガロース、スクロース、デンプン、
デキストラン（ただし、これらに限定されるものではな
い）；ポリエチレングリコール、ポリアクリレート、ポ
リビニルピロリドンのような親水性ポリマー等を包含さ
せることによって達成できる。第二の媒体の粘度は、溶
質の濃度および性質のみで制御されるのではなく、この
ような制御の実施が望ましい温度によっても制御できる
。第二の媒体の粘度は温度の調整による制御が可能で、
温度の上昇は通常、媒体の粘度を低下させる。 したがって、層を、下層がゲルであるかまたは比較的粘
稠もしくは固体である温度で作成し、遠心分離は他の通
常はもっと高く、粘度が低下するか媒体が液体となって
、ビーズがその層をより急速に通過するような温度で実
施することができる。層の分離はついで、下層を始めの
温度に戻すことによって容易になる。

【００８８】次に、上述のように、単独の水性媒体また
は第二の媒体と重ね合わせた水性媒体に遠心力が適用さ
れる。遠心力の強度は不溶性成分からＭＩ−ビーズを分
離すれば十分である。媒体への遠心力の適用は、遠心力
を与える任意の慣用方法を用い、たとえば媒体を含有す
る容器をその軸で慣用の遠心分離または回転を行うこと
によって実施される。この方法は、たとえばガラスまた
はプラスチックのような材料で作られた容器中で実施で
きる。遠心力の適用に際しては、反応容器を遠心分離器
内に置くことができる。遠心力が大きいほど、ＭＩ−ビ
ーズと不溶性成分の分離は速い。容器はその軸上で回転
させるのが好ましく、この場合、分離は直径約１〜１０
ｃｍ、好ましくは約１．５〜５ｃｍ管内で行うのが便利
である。遠心力の必要な強さ、すなわち回転の速度およ
び割合は、液体媒体中のＭＩ−ビーズの浮遊密度、液体
媒体の粘度、および所望の分離時間に基づいて変動され
る。遠心力は、ＭＩ−ビーズと不溶性成分の所望程度の
分離を提供するのに十分な時間適用する。

【００８９】水性媒体が不溶性成分より密度が大きいと
、遠心力の適用により、ＭＩ−ビーズと不溶性成分は媒
体内を反対の方向に動くことによって、ＭＩ−ビーズと
不溶性成分は分離される。ＭＩ−ビーズは密度が高いと
、媒体の外側たとえば媒体を含有する容器の底部まで移
動し、一方、不溶性成分は水性媒体の上方部分または遠
心軸の方向に移動する。

【００９０】第二の媒体を使用する場合には、ＭＩ−ビ
ーズは適当な遠心力下には、第二の媒体内に移動し、一
方、不溶性成分は水性媒体中に残留する。

【００９１】上述の他の態様においては、密度を調整す
るために処理するよりは、水性媒体を、ＭＩ−ビーズの
密度よりも密度は小さいが、水性媒体中の他の任意の不
溶性成分の密度よりは大きい媒体の層を置くことができ
る。この態様では、十分な強度の遠心力の適用によりＭ
Ｉ−ビーズはさらに密度の高い媒体中へ移動し、一方、
不溶性成分、および可溶性成分は、水性媒体中に残留す
る。

【００９２】たとえば、微生物と他の成分を含有する混
合物から、第一の水性媒体中の多数のビーズに微生物を
結合させて微生物−ビーズを形成させることにより、微
生物が分離できる。第一の媒体は、第一の媒体よりも密
度が大きいが微生物−ビーズよりも密度が小さい第二の
媒体と接触させる。接触させた第一および第二の媒体を
遠心分離に付し、第一の媒体の外側の領域に微生物−ビ
ーズを集める。この領域は他成分の領域と分離されてい
る。

【００９３】上述の他の態様においては、第一の水性媒
体と第二の媒体を混合し、混合した第一および第二の媒
体よりも粘度の高い第三の媒体上に重ねる。一例では、
第三の媒体は多糖を含有し、この層は第三の粘度の高い
媒体がゲルである温度で形成され、そして遠心分離の少
なくとも一部はその粘度の高い媒体がゲルではない温度
で実施される。その遠心分離の一時期のちに粘度の高い
媒体はゲルに復して、層が分離される。

【００９４】上述の他の態様においては、水性媒体は不
溶性成分よりも密度が高く、それは水性媒体よりも粘度
が高く、密度はそれと少なくとも等しい第二の媒体と重
層する。この後者の粘度の高い媒体は、前に第二の媒体
について述べたのと類似の性質を有する。十分な強度の
遠心力の適用により、ＭＩ−ビーズは第二の媒体中に移
動するが、一方、不溶性成分および可溶性成分は水性媒
体中に残留する。

【００９５】ＭＩ−ビーズが不溶性成分から分離したな
らば、ＭＩ−ビーズは媒体および不溶性成分から任意の
便利な方法で、たとえば傾瀉、ピペッティング等によっ
て分離することができる。

【００９６】第二の媒体を使用した場合には、ＭＩ−ビ
ーズは第二の媒体から任意の便利な方法で、たとえば▲
ろ▼過、傾瀉またはピペッティングによって分離できる
。分離されたＭＩ−ビーズは、ＭＩとビーズの間の結合
を解離するように処理することができる。粒子状または
非粒子状ＭＩとビーズの間の結合の解離は、粒子間の結
合の性質に依存する。たとえばＭＩ−ビーズを液体媒体
中に、結合の解離を促進するために加えた試薬とともに
懸濁する。一アプローチにおいては、粒子状ＭＩがイオ
ン相互作用によってビーズに結合している場合、媒体の
イオン強度およびｐＨを、結合の解離を促進するように
調整できる。一般的には、イオン強度が増大すると電気
的結合は解離する。粒子状ＭＩとビーズが逆に荷電して
いる場合にはｐＨの変化は一方の電荷を中和することに
なり、結合相互作用は低下する。また、陰性に荷電した
粒子状ＭＩを陰性に荷電したビーズに結合させるために
多陽イオン性結合剤を使用した場合には、ｐＨの低下は
電荷を中和し、結合を解離させる。すなわち、試薬によ
る安定化が可能なより高いまたは低い値のｐＨ、通常は
ｐＨ４未満またはｐＨ１０以上への変化が望ましい。

【００９７】電荷相互作用によって生じる非特異的結合
の場合には、非特異的結合の原因になっている電荷相互
作用を逆転させるために、酸または塩基以外の試薬を添
加することができる。たとえば、放出剤を添加すること
ができる。粒子が同じ電荷をもち、粒子を結合させるた
めの化学的手段が逆に荷電した多電解質である場合には
、粒子と同じ電荷をもつ多電解質が粒子の解離に使用で
きる。多電解質としてはたとえば、デキストラン硫酸、
ヘパリン、ポリグルタメート、ポリアクリレート、リン
脂質小胞、カルボキシメチルデキストランおよびクエン
酸のような多陰イオンを使用できる。アミノデキストラ
ン、キトサン、ポリブレン、ポリエチレンイミンおよび
陽イオンリポソームは使用できる多陽イオンの例である
。

【００９８】粒子状ＭＩとビーズの間の非特異的結合を
生成するために多陽イオンを使用した場合には、結合の
逆転には多陰イオンを使用できる。また、粒子間の非特
異的結合の形成に多陰イオンを使用した場合は、結合の
逆転に多陽イオンが使用できる。たとえばポリブレンま
たはバリウムイオンのような多陽イオンを使用した場合
には、放出剤はクエン酸塩または硫酸塩のような多陰イ
オンを使用できる。リポソームに対して、そして粒子が
疎水性相互作用によって主として非特異的に凝集してい
る場合には、界面活性剤が放出剤として作用する。

【００９９】リガンド−受容体結合を介してビーズに特
異的に結合している粒子状または非粒子状のＭＩの場合
（ＭＩ−ビーズを形成）、遊離のリガンドまたは受容体
が放出剤として働く。結合が共有結合である場合には、
共有結合を破壊できる加水分解またはレドックス試薬が
通常使用される。

【０１００】放出剤の濃度は、粒子状ＭＩとビーズの間
の結合の実質的または完全な逆転を生じるのに十分なも
のでなければならない。放出剤の濃度は一般に、粒子状
ＭＩとビーズの間の結合の性質およびＭＩの性質に依存
する。一般に、粒子状ＭＩの場合、放出剤の濃度は粒子
状ＭＩ上のイオン性または疎水性部位の濃度に少なくと
も等しく、好ましくは少なくともその１０倍である。

【０１０１】ＭＩ−ビーズからの放出後、とくに粒子状
ＭＩたとえば細胞または微生物である場合、ＭＩの傷害
を最小限にしまた回避するように、ＭＩの性質に関して
放出剤を選択することが重要である。

【０１０２】ＭＩがＭＩ−ビーズから放出されたならば
、それは所望のように使用できる。たとえば、放出され
たＭＩは、サンプル中の被験物質の量に関連する検出可
能なシグナルの存在ついて試験できる。一般的には、最
初にまたは次の検出工程で、標識が用いられる。放出さ
れた粒子状のＭＩは細胞でもよく、これは所望のように
使用できる。たとえば、放出された粒子状ＭＩは赤血球
細胞でも微生物でもよい。細胞または微生物の検出が所
望であれば、検出すべき物質の膜を通過して内部に導入
される試薬、たとえば染料が使用できる。たとえば、ス
クエアレート染料またはシアニン染料等のような挿入染
料が用いられる。

【０１０３】本発明の方法の重要な一特徴は、媒体中の
不溶性成分から、興味ある物質複数種の１種または２種
以上を分離することが可能なことである。これは、サイ
ズもしくは密度、または両者が異なるビーズのセットを
使用することによって達成できる。ビーズの各セットは
、上述のように特異的であれ非特異的であれ、興味ある
物質のひとつに対して結合親和性を有する。方法は上述
したように実施し、分離に使用した１種または２種以上
の媒体中に、様々なセットのビーズがそれぞれ別個の集
合体を形成する。別個の集合体を、興味ある単一の物質
について上述したと同様に分離して、処理した。

【０１０４】本発明の方法の一応用には、固体屑からの
微生物の除去、たとえば子宮頚部粘膜標本からの微生物
の除去がある。この方法では一例として子宮頚部粘膜を
使用するものであり、本発明はそれに限定されるもので
はないが、子宮頚部粘膜サンプルを水性媒体中ビーズと
、興味ある微生物がビーズと特異的に結合して微生物−
ビーズを形成する条件下に混合する。微生物はその表面
に抗原を有する。ビーズはその表面に、このような抗原
に対する抗体をもつので、微生物とビーズの間に特異的
な結合が生じる。水性媒体は、微生物−ビーズより密度
は小さいが、媒体中の他の不溶性成分よりは密度が大き
くなるように選択される。

【０１０５】次に、媒体を遠心力に付し、微生物−ビー
ズを媒体中の不溶性成分から分離させ、すなわち、不溶
性化合物からたとえば傾瀉、ピペッティング等による分
離が可能なようにする。

【０１０６】分離された微生物−ビーズはついで、上述
のようにして、ビーズから微生物が放出されるように処
理できる。

【０１０７】本発明は、被験物質の含有が疑われるサン
プル中の被験物質のアッセイに応用される。被験物質は
ｓｂｐメンバーである。被験物質は粒子状または非粒子
状ＭＩであり、ビーズに結合しているまたは結合する相
補性ｓｂｐメンバーによってビーズに結合して、ＭＩ−
ビーズを形成することができる。被験物質、またはその
存在が被験物質の存在に関連する物質、たとえば細胞の
表面から除去された抗原、被験物質に相互性のｓｂｐメ
ンバー等がＭＩになることができる。アッセイに際して
は、サンプルは水性媒体中で、通常、被験物質に相補性
のｓｂｐメンバーと混合される。被験物質または相補性
ｓｂｐメンバーの少なくとも一方が、媒体に添加される
ビーズに結合できるＭＩであり、ＭＩ−ビーズを形成す
る。

【０１０８】好ましくは、サンプルと接触させる前に、
水性媒体を処理してその密度を調整し、ついでまたはサ
ンプルと接触させた後、水性媒体を水性媒体より粘度の
高い第二の媒体と、本発明に従って接触させる。ＭＩが
ビーズに結合した後、ついで媒体を、サンプル中の他成
分からＭＩ−ビーズを分離するのに十分な遠心力に付す
。アッセイには通常、サンプル中の被験物質の量に関連
する検出可能なシグナルを生成するシグナル生成系が関
与する。シグナル生成系は通常、標識ｓｂｐメンバーを
包含する。ＭＩ−ビーズは、通常他の成分を含む媒体の
部分から分離したのち、何も加えないかまたはシグナル
生成系の１種もしくは２種以上のメンバーを加えて混合
する。ついで検出可能なシグナルの存在を調べる。この
ような測定には、上に添加しなかったシグナル生成系の
何らかの残りのメンバーの添加が必要なことがある。 また、検出可能なシグナルの存在を検査する前にＭＩ−
ビーズを処理して、ビーズからＭＩを分離させることも
できる。ＭＩがビーズから分離されたのち、ＭＩについ
てサンプル中の被験物質の量に関連して生成される検出
可能なシグナルの存在を検査することができる。このア
プローチはとくに粒子状のＭＩに適当である。この目的
では、検出可能なシグナルを発生させるために、上記の
場合には添加しなかったシグナル生成系の残りのメンバ
ーをＭＩと混合する。

【０１０９】この方法は、検定もしくは検出すべき物質
を、成長を阻害しまた検出を他の形で妨害する液体から
、急速に濃縮または分離することを可能にする。他の分
離方法、たとえば（１）微生物をビーズと結合させ、高
密度の媒体を用いないで遠心分離して固体屑から分離す
る方法、また（２）非粒子状物質を、これをビーズに結
合させ、サンプルを含まない第二の液体層を用いないで
遠心分離して、他の溶質から分離する方法では、良好な
分離は達成できない。本発明の方法は、分離される物質
の検定を行う目的で有利なばかりではなく、細胞混合物
から１種の細胞を分離する場合にも、たとえば純粋な抗
体を得る目的で他のハイブリドーマから特異的抗体を産
生するハイブリドーマを分離する場合にも有利である。 すなわち、分離される細胞よりも実質的に大きくない重
いビーズ、たとえば金ゾルまたはシリカ粒子の使用によ
り、細胞のパンニングによる分離で通常遭遇する非特異
的結合は最小限にすることができる。この方法は、移植
のための骨髄細胞から転移細胞およびＴ細胞を除去する
ため、または腫瘍の再発もしくは移植片対宿主病の予防
にも使用することができる。

【０１１０】本発明はまた、（１）興味ある物質が結合
したビーズ（ＭＩ−ビーズ）を含有する水性媒体からな
り、この媒体はＭＩ−ビーズの密度より小さく、媒体中
の他の不溶性成分の密度より大きい密度を有する組成物
を提供する。この組成物にはさらに、密度は水性媒体の
場合と少なくとも等しく、粘度は水性媒体よりも大きい
第二の媒体を包含させることができる。また、組成物は
（１）ＭＩ−ビーズを含有する水性媒体、および（２）
水性媒体と重層した第二の液体媒体からなるものであっ
てもよい。この場合、第二の媒体はＭＩ−ビーズよりは
小さいが水性媒体中の他の不溶性成分よりは大きい密度
を有する。また、本発明の組成物においては、ビーズは
それに結合したｓｂｐメンバーを介してＭＩに結合して
いてもよく、またビーズは多イオン試薬によってＭＩに
結合していてもよい。

【０１１１】便宜上、本発明による分離を実施するため
の試薬は、このような分離に用いられる既定量を組合せ
て包装したキットとして提供することができる。キット
の成分は、その成分の相互反応性によって、別個にまた
は１種もしくは２種以上のキット成分を一緒に包装する
ことができる。キットは、ビーズ、高密度液体媒体を与
えるための手段、液体媒体より高粘度の媒体を与えるた
めの手段を包含することができる。キットにはさらに、
ビーズを興味ある物質に結合させるための手段を包含さ
せることができる。たとえば、ビーズは表面にｓｂｐメ
ンバーが結合していてもよい。このｓｂｐメンバーはＭ
Ｉに相補性で、ＭＩをビーズに結合させる手段を提供す
る。キットには粒子状ＭＩをビーズに結合させるための
多イオン試薬を包含させることもできる。さらにビーズ
から粒子状ＭＩを放出させるための放出剤を包含させる
こともできる。

【０１１２】検定のためには、キットは（ａ）被験物質
と相補性のｓｂｐメンバー、（ｂ）このｓｂｐメンバー
または被験物質と相補性のｓｂｐメンバーが結合してい
るビーズからなることができる。また、キットは、すべ
ての粒子が同じ電荷をもつ場合には、荷電したビーズ、
および粒子状ＭＩと逆の電荷を有する多イオン試薬から
構成されていてもよい。さらに、キットには、粒子間の
結合を逆転させるための放出剤を包含させることができ
る。キットにはまた、サンプル中の被験物質の量に関連
するシグナルを発生する試薬を包含させることもできる
。必要に応じて補助剤を添加することもできる。

【０１１３】例 本発明をさらに以下の例示的実施例によって説明する。 実施例中とくに指示のない限り、すべての部および百分
率は容量によるものである。温度は摂氏（℃）である。

【０１１４】材料および方法 記載するすべての実験で、大腸菌、Ｋ−１２株、ＡＴＣ
Ｃ１０７９８を使用した。細菌はＴｒｉｐｔｉｃ　　Ｓ
ｏｙアガール（ＴＳＡ）プレート上、５％ＣＯ２インキ
ュベーター中、３７℃で増殖させた。細菌は１ｍｌのリ
ン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．５中に懸濁し、Ｍ
ｉｃｒｏｆｕｇｅ中室温で２分間遠心分離して洗浄した
。 細菌のペレット１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）および５０μｇ／
ｍｌのポリクローナルウサギ抗−大腸菌（ＤＡＫＯ）含
有、ｐＨ７．５のＰＢＳ中１０９ＣＦＵ／ｍｌに懸濁し
、細菌を室温で３０分間インキュベートした。細菌を上
述のようにして遠心分離し、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ、ｐＨ
７．５を用いて３回洗浄し、過剰の非結合ウサギ抗体を
除去した。

【０１１５】コロイド性金の結合 抗体被覆細菌は、ヤギ−抗−ウサギＩｇＧ−コロイド性
金接合体の様々なサイズ（５，２０，３０ｎｍ粒子サイ
ズ）を含有する１００μｌのＰＢＳ−１％ＢＳＡ，ｐＨ
７．５中でインキュベートした。細菌をコロイド性金試
薬中に再懸濁したのち、細胞を室温で３０〜４５分間イ
ンキュベートした。

【０１１６】４μｍシリカ粒子結合 抗体被覆細菌を４μｍヤギ−抗ウサギ−ＩｇＧ−シリカ
粒子（３．６×１０７／ｍｌ）含有の５０μｌのＰＢＳ
−１％ＢＳＡ，ｐＨ７．５中でインキュベートした。細
菌をシリカ粒子懸濁液中に懸濁したのち、サンプルをロ
ータリーシェーカー上、室温で１５〜６０分間混合した
。

【０１１７】保存Ｐｅｒｃｏｌｌ▲Ｒ▼（Ｓｉｇｍａ　
　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍ
Ｏ）は、市販Ｐｅｒｃｏｌｌを２．５Ｍスクロースを用
いて９：１の比に希釈して作成した。この保存Ｐｅｒｃ
ｏｌｌはピペットでオークリッジ管に取り、勾配はＳｏ
ｒｖａｌｌ　　ＲＣ−５Ｂ遠心分離器により、１２，５
００ｒｐｍ、２０℃で３０分間遠心分離した。密度マー
カービーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａ
ｙ，Ｎ．Ｊ．）を用いて、勾配を肉眼で検量した。直接
勾配密度の測定には、遠心分離直後に０．２５ｍｌのサ
ンプルを勾配の上部から順次、正排出ピペットを用いて
採取し、メトラー天秤で秤量した。ピペットは蒸留水を
用いて検量し、密度は直接算出した。

【０１１８】　　保存Ｎｙｃｏｄｅｎｚ（Ｎｙｃｏｍｅ
ｄ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）は、固体を蒸留水に溶解
し、ｐＨを７．５に調整して作成した。保存溶液を５５
．５％（ｗ／ｖ）に希釈して様々な密度（１．２〜１．
３ｇ／ｍｌ）の溶液を生成させ、ポリビニルピロリドン
（ＰＶＰ）（９０Ｋ）を加えて最終濃度を１ｍｇ／ｍｌ
とした。Ｎｙｃｏｄｅｎｚ／ＰＶＰ溶液２ｍｌをオーク
リッジ管の底に加え、粒子（金またはシリカ）および細
菌を含有するサンプルをＰＢＳ０．５ｍｌ中にとって覆
い、管を上述のようにＰｅｒｃｏｌｌ勾配に対して遠心
分離した。

【０１１９】生存細菌を様々な分画の勾配で評価した勾
配について、１ｍｌの分画を勾配管の上部から順次採取
し、ＰＢＳ中に必要に応じて系列希釈し（１０倍希釈）
、サンプル１ｍｌを予め乾燥したＴＳＡプレート上にプ
レーティングした。プレートを一夜３７℃でインキュベ
ートし、翌日肉眼で見えるコロニーを数えてコロニー形
成単位（ＣＦＵ）を求めた。

【０１２０】ＤＮＡ分析のためには、サンプルを、２５
ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１０ｍＭＥＤＴＡ，２５０μ
ｇ／ｍｌプロテナーゼＫ含有１％ＳＤＳ中で溶解し、５
０℃で３０分間インキュベートした。これで大部分の細
胞屑は可溶化した。ＤＮＡはＨｏｅｆｅｒ　　ＴＫＯ　
　Ｍｉｎｉ蛍光計を用い、ビベンズイミダゾール法で測
定した（Ｃｅｓａｒｏｎｅら：Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１００：１８８〜１９７，１９７９）。非切断ラム
ダＤＮＡを蛍光計の検定用の標準として使用した。

【０１２１】かなり新鮮な（１週未満）の全血を、Ｉｓ
ｏｌａｔｏｒ▲Ｒ▼（ｄｕＰｏｎｔ）を用いて５〜１０
分間溶解させ、ＥＤＴＡを最終濃度５ｍＭになるように
加えた。この溶解血液サンプルを、溶解血液成分からの
細菌の分離をチェックするための実験に使用した。この
場合、通常５０％（ｖ／ｖ）のサンプルは溶解血液であ
った。

【０１２２】結果 細菌の密度はコロイド性金の結合で増大する　　Ａ．Ｐ
ｅｒｃｏｌｌ勾配 大腸菌細胞をウサギ抗体で被覆し、ヤギ抗−ウサギＩｇ
Ｇをもつコロイド性金粒子で処理した。５，２０および
３０ｎｍコロイド性金粒子を細菌の密度を増大させるた
めに使用し、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配（開始密度＝１．１２
４ｇ／ｍｌ）を用いて過剰のコロイド性金粒子を、コロ
イド性金で被覆された大腸菌から分離した。Ｐｅｒｃｏ
ｌｌ勾配は肉眼で検査した。いくつかの点が注目される
。

【０１２３】１．細菌の密度は細胞へのコロイド性金粒
子の結合によって増大する。コロイド性金接合体で処理
しなかったかまたはその表面にウサギ抗体が結合されな
かった大腸菌は勾配の最上部にバンドを生じ、一方、コ
ロイド性金の結合は細菌のバンドを勾配内の位置に生じ
させた。

【０１２４】２．細菌に結合するコロイド性金粒子のサ
イズが増大するに従い、細菌の見掛けの密度もまた増大
した。５ｎｍ粒子で被覆された細菌は、１．１１９〜１
．１２１ｇ／ｍｌの範囲の密度をもつ不均一なバンドと
して観察された。２０ｎｍ粒子で被覆された細菌は１．
１５２にバンド、一方、３０ｎｍ粒子で被覆された細菌
は＞１．１６ｇ／ｍｌのバンドとして観察された。

【０１２５】３．Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配の密度検定が開発
され、５ｎｍ粒子で被覆された細菌は勾配の浅い領域に
、２０および３０ｎｍ粒子で被覆された細菌は勾配の底
部に位置することが明らかにされた（図１）。

【０１２６】Ｂ．Ｐｅｒｃｏｌｌ−ジアトラゾエート勾
配 ２０および３０ｎｍコロイド性金粒子で被覆された大腸
菌のさらに正確な密度測定値を得るために、密度１．１
９ｇ／ｍｌに始まるＰｅｒｃｏｌｌ含有ジアトラゾ酸ナ
トリウム（Ｈｙｐａｑｕｅ）で分離を実施した。コロイ
ド性金のサイズが増大するに従い、密度も増大した。５
ｎｍ粒子で被覆された大腸菌は１．１３７７にバンドを
示し、一方、２０ｎｍ粒子は１．１９０７および１．２
０２３ｇ／ｍｌの密度を与えた。３０ｎｍ粒子は１．１
９６３〜１．２１７３ｇ／ｍｌの密度を与えた。Ｐｅｒ
ｃｏｌｌ−ジアトラゾエート勾配の重量測定密度検定を
図２に示す。

【０１２７】Ｃ．Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配 大腸菌細胞をウサギ抗体で被覆し、ヤギ抗−ウサギＩｇ
Ｇをもつ金粒子で処理した。遊離の細菌を分離するため
に、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配（開始密度＝１．１２４ｇ／ｍ
ｌ）を使用した。勾配を分画化し、各分画をプレーティ
ングして細菌の位置を決定した。結果は表１に示す。

【表１】

【０１２８】細菌の密度は４μｍシリカ粒子の結合によ
って増大する Ａ．Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配 大腸菌細胞はウサギ抗体で被覆し、ヤギ抗−ウサギＩｇ
Ｇをもつシリカ粒子で処理した。Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配（
開始密度＝１．１２４ｇ／ｍｌ）を用いて遊離の細菌を
シリカ粒子（密度＝約１．４ｇ／ｍｌ）から分離した。 勾配を分画化し、分画をプレーティングして細菌の位置
を決定した。結果は表２に示す。

【０１２９】細菌の密度はシリカ粒子の結合によって増
大した。シリカ粒子で処理されない、またウサギ抗体が
表面に結合していない大腸菌は勾配の最頂部にバンドを
生じたが、一方、シリカの結合を生じた細菌は勾配の底
部にペレットを生じた。

【表２】

【０１３０】密度＞１．２３の液体層は血液由来の細胞
屑を浮遊させる 上に得られたデータは、３０ｎｍコロイド性金粒子によ
る大腸菌の標識は細菌の密度を１．２ｇ／ｍｌ以上に増
大させることを示している。

【０１３１】全血をＩｓｏｌａｔｏｒ（ｄｕＰｏｎｔ　
　ｄｅ　　Ｎｅｍｏｕｒｓ　　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｗｉｌ
ｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅ）管を用いて溶解し
、溶解した血液を異なる様々の密度の等容量のＮｙｃｏ
ｄｅｎｚクッションの頂部にのせた。これらの管をつい
で遠心分離に付し、管の外観を検査した。溶解した血液
を密度１．０のクッション上で遠心分離すると、血液由
来細胞屑の大量のペレットを生じた。液体媒体の密度を
＞１．２３に増大させると、細胞屑はクッションの頂部
に残るようになった。ペレットのＤＮＡ分析により、最
初のサンプル中に存在したＤＮＡの＞９５％は、密度＞
１．２３ｇ／ｍｌの媒体中で遠心分離したのちにはペレ
ット中に存在しなかった。

【０１３２】密度１．２の液体層は、金標識細菌をペレ
ット化させる：Ｎｙｃｏｄｅｎｚクッション大腸菌細胞
をウサギ抗体で被覆し、ヤギ抗−ウサギＩｇＧをもつコ
ロイド状金粒子（３０ｎｍ）で処理した。Ｎｙｃｏｄｅ
ｎｚクッションを用いて遊離の細菌をコロイド性金粒子
から分離した。Ｎｙｃｏｄｅｎｚ勾配を分画化し、各分
画をプレーティングして細菌の位置を決定した。結果は
表３に示す。

【０１３３】細菌の密度は３０ｎｍコロイド性金粒子へ
の結合によって上昇した。コロイド性金で処理されなか
ったかまたはその表面にウサギ抗体を結合していなかっ
た大腸菌はＮｙｃｏｄｅｎｚクッション内に入らなかっ
たが、コロイド性金の結合は細菌を勾配の底部のペレッ
トに移動させた。＞９３％の細菌が捕捉され、効率的に
管の底部に分離された（表３）。

【表３】

【０１３４】密度１．３の液体層はシリカ結合細菌をペ
レット化させる：Ｎｙｃｏｄｅｎｚクッション大腸菌細
胞をウサギ抗体で被覆し、ヤギ抗−ウサギＩｇＧをもつ
シリカ粒子で、５０％溶解血液の存在下または非存在下
に処理した。Ｎｙｃｏｄｅｎｚクッションを使用して、
遊離細菌をシリカ粒子（密度約１．４ｇ／ｍｌ）から分
離した。Ｎｙｃｏｄｅｎｚ勾配を分画化し、各分画をプ
レーティングして細菌の位置を決定した。結果を表４に
示す。細菌の密度はシリカ粒子への結合によって増大し
た。シリカで処理されなかったかまたはその表面にウサ
ギ抗体が結合されなかった大腸菌はＮｙｃｏｄｅｎｚク
ッション（ｄ＝１．３ｇ／ｍｌ）に入らなかったが、シ
リカの結合は細菌を勾配の底部にペレット化した。表４
に示すように、＞９８％の細菌はシリカによって捕捉さ
れ、Ｎｙｃｏｄｅｎｚ、ｄ＝１．３の使用により血液成
分から分離された。

【表４】

【０１３５】以上説明した本発明は、サンプル中の興味
ある物質を他の成分からの簡単、効果的かつ完全な分離
を提供する。本発明の有意な利点は、他の成分を含まな
い興味ある物質の洗浄が一つの媒体から高密度および／
または高粘度の媒体への通過の間に起こることである。

【０１３６】上述の本発明は、明確化と理解の目的で例
示および実施例を用いて詳細に説明したが、特許請求の
範囲内において改変および修飾が実施可能であることは
自明のとおりである。

【図面の簡単な説明】

【０１３７】図１はＰｅｒｃｏｌｌ勾配の密度の検量を
示す図である。分画番号（フラクション）ごとの非希釈
Ｐｅｒｃｏｌｌの検量を表わす。

【０１３８】図２はＰｅｒｃｏｌｌ−ジアトラゾエート
勾配の重量測定による密度の検量を示す図である。縦軸
は密度を、横軸は分画番号（フラクション）を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】興味ある物質（ＭＩ）と不溶性成分を含有
   する混合物からＭＩを分離する方法において、水性媒体
   中で上記混合物中のＭＩをビーズに結合させて（ＭＩ−
   ビーズ）水性媒体とＭＩ−ビーズからなる液体系を与え
   、この場合、ＭＩ−ビーズの密度は上記液体系よりも大
   きく、上記液体系の少なくとも一部分の密度は上記不溶
   性成分よりも大きくなるようにし、上記液体系に上記不
   溶性成分からＭＩ−ビーズを単離するのに十分な遠心力
   を付与することを特徴とする方法。 【請求項２】興味ある物質は、微生物、細胞、オルガネ
   ラ、分子集合体、核酸およびリガンドからなる群より選
   ばれる「請求項１」記載の方法。 【請求項３】混合物は、生物学的サンプル、食用産物お
   よび薬用産物からなる群より選ばれる「請求項１」記載
   の方法。 【請求項４】ビーズは、重金属含有ビーズ、ラテックス
   ビーズ、シリカビーズ、ガラスビーズ、ポリオールビー
   ズおよびポリアクリルアミドビーズからなる群より選ば
   れる「請求項１」記載の方法。 【請求項５】液体系は、水性媒体の成分として高密度溶
   質を付与することによって不溶性成分より大きく、ＭＩ
   −ビーズより小さい密度をもたせた水性媒体からなる「
   請求項１」記載の方法。 【請求項６】液体系は、第一の液体媒体と同一もしくは
   それ以上の粘度を有する媒体で液体系に遠心力を付与す
   る前に重ねた水性媒体からなる「請求項１」記載の方法
   。 【請求項７】水性媒体は、水性媒体より密度の高い第二
   の媒体と重層する「請求項１」記載の方法。 【請求項８】興味ある物質（ＭＩ）と他の成分を含有す
   る混合物からＭＩを分離する方法において、水性媒体中
   でＭＩをビーズに結合させ（ＭＩ−ビーズ）、この場合
   、水性媒体の密度は、ＭＩ−ビーズのそれよりも小さい
   がその媒体中に不溶性の他の成分のいずれのそれよりも
   大きいかまたは上述の結合工程後にそのように調整し、
   ついで媒体を遠心分離に付してＭＩ−ビーズを上述の他
   の成分から分離された媒体内もしくは外領域に捕集し、
   ただし他の成分が可溶性の場合にはＭＩ−ビーズを媒体
   の外部に捕集することを特徴とする方法。 【請求項９】（ａ）ビーズ、（ｂ）高粘度または高密度
   液体媒体を生成するための手段、および（ｃ）（ｂ）の
   液体媒体よりも低い粘度または密度を有する水性媒体を
   生成するための手段を組合せてパックしてなるキット【
   請求項１０】ビーズを興味ある物質に結合させるための
   手段、好ましくは標識に接合させた特異的結合対の一員
   からなる「請求項９」記載のキット。 【請求項１１】興味ある物質が結合するビーズ（ＭＩ−
   ビーズ）を含有する水性媒体であって、その水性媒体の
   密度はＭＩ−ビーズよりも小さいがその媒体中の他の不
   溶性成分よりは大きい水性媒体からなる組成物。 【請求項１２】ＭＩ−ビーズよりも密度は小さいが、水
   性媒体とは接触しても実質的に混合しない第二の液体媒
   体をさらに包含する「請求項１１」記載の組成物。 【請求項１３】第二の液体媒体は水性媒体と少なくとも
   等しい密度、水性媒体より高い粘度を有する「請求項１
   ２」記載の組成物。 【請求項１４】被験物質のアッセイを行う方法において
   、水性媒体中で被験物質またはその存在が被験物質の存
   在に関連する物質をビーズに結合させ（Ａ−ビーズ）、
   この場合、水性媒体の密度はＡ−ビーズのそれよりも小
   さいがその媒体中に不溶性の他のいずれのそれよりも大
   きいかまたは上述の結合工程後にそのように調整し、つ
   いで媒体を遠心分離に付してＡ−ビーズを上述の他の成
   分から分離された媒体内または外領域に捕集し、ただし
   他の成分が可溶性の場合にはＡ−ビーズを媒体の外部に
   捕集し、ついで上記被験物質または上記物質を検出する
   ことを特徴とする方法。 【請求項１５】被験物質または物質はシグナル生成系を
   用いて検出し、この場合好ましくは、シグナル生成系は
   標識を包含する「請求項１４」記載の方法