FR2656233A1 - Procede pour separer des constituants dans un melange. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne la liaison d'une matière intéressante (MI) à une bille (ensemble MI-billes) dans un milieu liquide. L'ensemble MI-billes possède une densité supérieure à celle du milieu aqueux; la densité de ce dernier, ou d'un second milieu liquide en contact avec celui-ci, est supérieure à celle des constituants insolubles dans le milieu. Puis le milieu est soumis à une force centrifuge suffisante pour séparer l'ensemble MI-billes des autres constituants. Application: séparation d'une MI d'un mélange contenant cette matière et d'autres constituants insolubles ou solubles.

Description

La présente invention a pour objet des procédés pour la séparation d'un

constituant, qui peut être ou non sous forme de particules, d'autres constituants présents dans un mélange La présente invention peut être appliquée particulièrement à la séparation, par exemple à des fins d'analyse, de cellules de liquides biologiques telles que le sang, le liquide lymphatique, l'urine, des cultures de cellules, des matières fécales en suspension, etc, des

micro-organismes, des organites, des aggrégats moléculai-

res, des acides nucléiques et des ligands.

La détection et l'identification de micro-

organismes, en particulier dans des échantillons biologi-

ques, des produits alimentaires et des produits médicamen-

teux, sont nécessaires pour le diagnostic clinique d'une maladie, la prévention de la transmission d'une maladie et la qualité des aliments Les bactéries et les champignons sont détectés et identifiés habituellement par des méthodes

de culture, qui sont notoirement lentes et laborieuses.

Plus récemment, des analyses immunologiques d'antigènes microbiens et des analyses utilisant des sondes d'acides nucléiques ont été élaborées Cependant, ces méthodes

permettent habituellement de détecter seulement un micro-

organisme particulier Dans la mise en évidence d'une septicémie, une analyse destinée à un indicateur général de croissance, tel que l'anhydride carbonique, est souvent utilisée Cette analyse est suivie par des méthodes de culture destinées à identifier le micro-organisme, puis par des tests de sensibilité aux antibiotiques Il existe un besoin d'obtenir des résultats d'essais plus rapidement et

avec moins d'efforts.

Plusieurs techniques sont connues pour la mise en oeuvre de séparations Par exemple, il est possible d'utiliser une centrifugation et un lavage; une migration différentielle de fractions liées et de fractions libres, par exemple une chromato-électrophorèse, une filtration sur gel, etc; une précipitation chimique de la fraction liée ou de la fraction libre, par exemple au moyen de solvants

organiques, de sels, d'acides, etc, suivie d'une filtra-

tion ou d'une centrifugation; une précipitation immu-

nologique de la fraction liée, par exemple par la technique à deux anticorps, suivie d'une filtration ou d'une centrifugation; une absorption de la fraction liée ou de la fraction libre sur des milieux présentant une sorption sélective, par exemple le charbon, des silicates, des résines, etc; des techniques de séparation magnétique, etc. La plupart des techniques de séparation,

comprenant celles utilisées dans les analyses immunologi-

ques, sont des modes opératoires relativement longs et complexes Ces modes opératoires diminuent le rendement de l'opérateur, réduisent la cadence et accroissent les coûts des tests D'autres techniques de séparation qui sont rapides et simples ne permettent pas de différencier de manière adéquate la fraction liée de la fraction libre et, en conséquence, ne conviennent pas pour des analyses immunologiques ou bien peuvent être utilisées seulement

dans un nombre limité de tests.

Récemment, Microdrop Co a publié un procédé pour transformer la totalité d'un échantillon d'urine en petites billes d'agarose ou d'un autre gel, de sorte que chaque bille piège au plus un micro-organisme (Weaver et collaborateurs, Bio/Technology ( 1988) 6:1084-1089) Les perles renfermaient un milieu de culture et ont été dispersées dans une huile La croissance a été directement détectée par la formation d'un colorant indicateur dans les particules infectées Le procédé permet de détecter, trier,

compter et étudier des micro-organismes distincts.

Cependant, le procédé est laborieux et la séparation des bactéries des substances inhibitrices de croissance dans l'échantillon se produit seulement par dilution et diffusion. Des cellules sont couramment séparées par centrifugation dans des milieux à haute densité ou forte viscosité, et des lysosomes auxquels ont été incorporées des particules d'or ont été isolés du fait de leur densité accrue au moyen de la centrifugation rapide en gradient de

densité de saccharose (Henning et collaborateurs, Biochim.

Biophys Acta 354 ( 1974) 114-120) De même, Dorn et collaborateurs, J Clin Micro 3 ( 1976) 251-257, ont

démontré que des bactéries associées à des débris cel-

lulaires insolubles peuvent être séparées des constituants solubles d'un échantillon de sang lysé par centrifugation de la suspension avec une couche sous-jacente de solution de saccharose Cela constitue la base d'un produit de I E.

Du Pont de Nemours Company désigné sous le nom de ISOLATOR.

En outre, Leduc et collaborateurs (Biochim Biophys Acta.

885 ( 1986) 248) ont séparé des polynucléosomes portant de

la poly-ADP-ribose-synthétase sur leur surface de polynu-

cléosomes non liés en provoquant la liaison d'anticorps spécifiques contre la synthétase, en associant le mélange à de la protéine A marquée avec de l'or et en effectuant une séparation par sédimentation rapide en gradient de saccharose, ce qui a provoqué une séparation plus rapide des polynucléosomes liés à l'or Courtoy et collaborateurs, (J Cell Biology, 98 ( 1984) 870-876) ont décrit le décalage

de densité à l'équilibre induit par cytochimie de la 3,3 '-

diaminobenzidine dans un mode opératoire pour l'analyse et

la purification d'organites contenant une peroxydase.

Le procédé de la présente invention concerne la séparation d'une matière intéressante d'un mélange contenant la matière intéressante et d'autres constituants insolubles et/ou solubles Le procédé consiste à lier dans un premier milieu liquide la matière intéressante à une bille (MI-bille) et à introduire l'ensemble MI-bille dans une composition liquide dans laquelle l'ensemble MI-bille possède une densité supérieure à celle de la composition liquide, qui est constituée du milieu liquide La densité d'au moins une partie de la composition liquide est supérieure à celle des autres constituants insolubles présents dans la composition liquide Puis la composition liquide est soumise à une force centrifuge suffisante pour

séparer l'ensemble MI-bille des constituants insolubles.

Lorsque la matière intéressante doit être séparée d'autres constituants solubles, un second milieu liquide est

introduit en couche, avec le premier milieu liquide.

Le procédé de la présente invention peut être utilisé particulièrement pour séparer des matières organiques et biochimiques intéressantes, par exemple de cultures de cellules, de liquides biologiques, etc. Une forme de réalisation d'un procédé conforme à la présente invention consiste en un procédé pour la séparation d'une matière intéressante d'un mélange

contenant la matière intéressante et d'autres constituants.

Le procédé consiste à provoquer la liaison de la matière intéressante à une bille (ensemble MI-bille> dans un milieu

aqueux Le milieu aqueux possède, ou est amené ultérieure-

ment à posséder, une densité inférieure à celle de l'ensemble MI-bille mais supérieure à celle de n'importe lequel des autres constituants qui sont insolubles dans le milieu Le milieu est soumis à une centrifugation pour provoquer le rassemblement de l'ensemble MI-bille dans une zone à l'intérieur ou à l'extérieur du milieu, séparée des autres constituants, sous réserve que, lorsque les autres

constituants sont solubles dans le milieu aqueux, l'en-

semble MI-bille est amené à se rassembler seulement à

l'extérieur du milieu.

Une autre forme de réalisation d'un procédé conforme à la présente invention consiste en un procédé pour la séparation d'un micro-organisme d'un mélange contenant le micro-organisme et d'autres constituants Le procédé consiste à lier le micro-organisme à des billes

dans un milieu aqueux pour former un ensemble micro-

organisme-bille Les billes possèdent une masse volumique supérieure à 1,2 g/cm 3 et un diamètre moyen d'environ 1 à 50 000 nm Puis le milieu est soumis à une centrifugation pour concentrer l'ensemble micro-organismebille Dans une autre forme de réalisation du procédé précité, la densité du milieu aqueux est ajustée de manière à être supérieure à celle de n'importe lequel des autres constituants qui sont insolubles dans le milieu, mais inférieure à celle de l'ensemble micro-organisme-bille Dans une autre forme de réalisation du procédé précité, la centrifugation provoque le rassemblement de l'ensemble micro-organisme-bille dans une zone à l'extérieur du milieu La zone est séparée de la zone renfermant les autres constituants Dans une autre forme de réalisation du procédé précité, le milieu aqueux est placé sous forme de couche sur un milieu ayant une plus forte viscosité que celle du milieu aqueux, avant de

soumettre le milieu aqueux à une centrifugation.

Une autre forme de réalisation de la présente

invention fait intervenir un procédé pour séparer un micro-

organisme d'un mélange contenant le micro-organisme et

d'autres constituants Le procédé consiste à lier le micro-

organisme à un grand nombre de billes dans un premier

milieu aqueux pour former un ensemble micro-organisme-

bille Les billes possèdent une masse volumique supérieure à 10 g/cm 3 et un diamètre moyen d'environ 1 à 50 nm Le premier milieu est mis en contact avec un second milieu ayant une densité supérieure à celle du premier milieu,

mais inférieure à celle de l'ensemble micro-organisme-

bille Les premier et second milieux mis en contact sont soumis à une centrifugation pour provoquer le rassemblement de l'ensemble microorganisme-bille dans une zone à l'extérieur du premier milieu La zone est séparée de celle

renfermant les autres constituants.

Dans une autre forme de réalisation du procédé précité, le premier milieu aqueux et le second milieu sont réunis et placés en couche sur un troisième milieu ayant une viscosité supérieure à celle des premier et second milieux réunis. Une autre forme de réalisation de la présente invention fait intervenir un procédé pour séparer des micro-organismes d'un milieu aqueux, procédé qui comprend

l'étape de centrifugation, et dans lequel le perfectionne-

ment consiste (a) à fournir un milieu aqueux plus dense que

lesdits micro-organismes et (b) avant ladite centrifuga-

tion, à provoquer la liaison desdits micro-organismes à des billes pour former des agrégats consistant en un seul micro-organisme et en un grand nombre de billes Ledit procédé peut comprendre également la mise sous forme de

couche dudit milieu aqueux sur un second milieu liquide.

Un autre aspect de la présente invention consiste en un procédé pour effectuer llanalyse d'un analyte Le procédé consiste à provoquer la liaison de l'analyte, ou d'une substance dont la présence est liée à la présence de l'analyte, à une bille (ensemble A-bille) dans un milieu aqueux Le milieu aqueux possède, ou est amené ultérieurement à posséder, une densité inférieure à celle de l'ensemble A-bille, mais supérieure à celle de

n'importe lequel des autres constituants qui sont inso-

lubles dans le milieu Le milieu est soumis à une centrifu-

gation pour provoquer le rassemblement de l'ensemble A-

bille dans une zone à l'intérieur ou à l'extérieur du milieu, séparée des autres constituants, sous réserve que, lorsque les autres constituants sont solubles dans le milieu, l'ensemble A-bille est amené à se rassembler à l'extérieur du milieu L'analyte ou l'autre substance est

ensuite détectée.

La présente invention comprend en outre des compositions et des kits destinés à la mise en oeuvre des

procédés et des analyses de la présente invention.

D'autres caractéristiques et avantages de la

présente invention ressortiront de la description détaillée

qui va suivre, faite en regard des dessins annexés, sur lesquels: la figure 1 représente un étalonnage de densité d'un gradient de Percoll TM; et la figure 2 représente un étalonnage de masse

volumique du gradient Percoll-diatrazoate.

La présente invention concerne de manière générale un procédé pour séparer une matière intéressante (MI) d'autres constituants présents dans un échantillon La

MI à séparer est amenée à se lier à une bille (ensemble MI-

bille) La voie préférée pour parvenir à la liaison entre les billes et la MI consiste en des interactions de charges ou une liaison ligandrécepteur La MI peut également être

liée aux billes par hybridation d'acides nucléiques.

L'ensemble MI-bille possède une densité supérieure à celle

d'un milieu liquide dans lequel elle est mise en suspen-

sion La densité d'au moins une partie du milieu liquide

est supérieure à la densité d'autres constituants inso-

lubles dans le milieu Le milieu est soumis à une force centrifuge suffisante pour séparer spatialement l'ensemble MI-bille des autres constituants L'ensemble MI-bille séparé peut être en outre lavé et examiné par des procédés physiques ou chimiques L'ensemble MI-bille peut également

être traité pour inverser la liaison avec la MI L'inver-

sion de la liaison peut être suivie par une séparation des billes libres pour fournir un moyen de séparation de la MI

des billes.

Le procédé de la présente invention trouve de nombreuses applications dans le domaine de la séparation d'une matière intéressante d'autres constituants dans un échantillon et de l'analyse de cette matière intéressante, en particulier pour la séparation de matières biologiques, telles qu'une matière en particules, par exemple des cellules, des microorganismes, tels que des bactéries et des champignons, des organites, des agrégats moléculaires, etc, et des matières non sous forme de particules, par exemple des ligands et des acides nucléiques La matière intéressante peut être présente dans des échantillons biologiques tels que des cultures de cellules, des liquides biologiques, etc; des produits alimentaires, des produits médicamenteux, etc En général, la matière intéressante est présente avec une large gamme de matières en particules qui sont présentes dans les liquides biologiques ou les substances solides biologiques solubilisées et d'autres constituants solubles La présente invention propose un procédé de séparation qui convient mieux et est plus rapide qu'une simple centrifugation, une simple filtration et les procédés antérieurs de séparation, et est applicable en particulier au prétraitement de suspensions dans lequel il

est désiré d'effectuer une analyse d'une matière intéres-

sante séparée d'autres constituants La présente invention peut être appliquée à l'analyse d'un analyte dans un échantillon, dans le cas o une étape de séparation est requise. Avant de procéder plus en détail à une

description des formes de réalisation particulières de la

présente invention, un certain nombre d'expressions seront définies. Matière intéressante (MI) le composé ou la composition à séparer La matière intéressante peut être non constituée de particules ou bien être sous forme de particules La MI non constituée de particules peut consister en un membre d'une paire à liaison spécifique (pls) et peut être un ligand, qui est mono ou polyvalent,

habituellement antigénique ou hapténique, et être cons-

tituée d'un seul composé ou de plusieurs composés qui partagent au moins un site épitopique ou déterminant commun La MI peut également être une particule Un exemple d'une MI qui est constituée d'une particule est une cellule portant un antigène de groupe sanguin, tel que A, B, D, etc, ou un antigène HLA, ou bien un micro-organisme tel qu'une bactérie, un champignon, un protozoaire ou un virus. La MI peut être un analyte, monovalent

(monoépitopique) ou bien polyvalent (polyépitopique).

L'analyte consistant en un ligand de polyvalent est habituellement constitué de poly(aminoacides), c'est-à-dire de polypeptides et de protéines, de polysaccharides, de lipides, d'acides nucléiques et de leurs mélanges Ces mélanges comprennent les constituants de bactéries, de champignons, de virus, de chromosomes, de gènes, de mitochondries, de noyaux, de membranes cellulaires, etc.

Dans la plupart des cas, les analytes consis-

tant en des ligands polyépitopiques auxquels la présente

invention peut être appliquée possèdent un poids molécu-

laire d'au moins environ 5000, le plus souvent d'au moins environ 10 000 Dans la catégorie des poly(aminoacides), les poly(aminoacides) intéressants ont généralement des poids moléculaires d'environ 5000 à 5 000 000, le plus souvent d'environ 20 000 à 1 000 000; parmi les hormones intéressantes, les poids moléculaires sont habituellement

compris dans l'intervalle d'environ 5000 à 60 000.

Une large gamme de protéines peut être prise en considération en ce qui concerne la catégorie des protéines ayant des caractéristiques structurales similaires, des protéines ayant des fonctions biologiques particulières, des protéines liées à des micro-organismes particuliers, notamment des micro-organismes responsables de maladies, etc.

Les analytes consistant en ligands mono-

épitopiques ont généralement des poids moléculaires d'environ 100 à 2000, le plus souvent de 125 à 1000 Les analytes comprennent des médicaments, des métabolites, des pesticides, des polluants, etc Parmi les médicaments intéressants, se trouvent les alcaloïdes Les alcaloïdes comprennent les alcaloïdes du type de la morphine, qui comprennent la morphine, la codéine, l'héroïne, le dextrométhorphane, leurs dérivés et métabolites; les alcaloïdes du type de la cocaïne, qui comprennent la cocaïne et la benzoylecgonine, leurs dérivés et leurs métabolites; les alcaloïdes dérivés de l'ergot, qui comprennent le diéthylamide de l'acide lysergique; les

alcaloïdes stéroidiens; les alcaloides du type imi-

nazoyle; les alcaloïdes dérivés de la quinazoline, les alcaloïdes dérivés de l'isoquinoline; les alcaloïdes dérivés de la quinoline, qui comprennent la quinine et la quinidine; les alcaloïdes diterpéniques, leurs dérivés et métabolites. Le groupe suivant de médicaments est constitué par les stéroides, qui comprennent les oestrogènes, les androgènes, les corticostéroides, les acides biliaires, les glycosides cardiotoniques et les aglycones, comprenant la digoxine et la digoxigénine, les saponines et sapogénines, leurs dérivés et métabolites Cela comprend également les

substances mimétiques des stéroides telles que le diéthyl-

stilboestrol. Le groupe suivant de médicaments est constitué par des lactames ayant 5 ou 6 éléments cycliques, qui comprennent les barbiturates, par exemple le phénobarbital et le sécobarbital, la diphénylhydantoïne, la primidone,

l'éthosuximide et leurs métabolites.

Le groupe suivant de médicaments est constitué d'aminoalkylbenzènes, renfermant des groupes alkyle ayant 2 ou 3 atomes de carbone, qui comprennent les amphétamines, les catécholamines, comprenant l'éphédrine, la L-dopa, l'épinéphrine, la narcéine, la papavérine, et leurs

métabolites.

Le groupe suivant de médicaments est constitué

des composés benzohétérocycliques qui comprennent l'oxa-

zépam, la chrorpromazine, le tégrétol, l'imipramine, leurs dérivés et métabolites, les noyaux hétérocycliques étant les azépines, diazépines et phénothiazines. Le groupe suivant de médicaments est constitué des purines, qui comprennent la théophylline, la caféine,

leurs métabolites et dérivés.

Le groupe suivant de médicaments est constitué des médicaments dérivés de la marijuana, qui comprennent le

cannabinol et le tétrahydrocannabinol.

Le groupe suivant de médicaments est constitué des vitamines telles que les vitamines A, B, par exemple

B 12, C, D, E et K, l'acide folique, la thiamine.

Le groupe suivant de médicaments est constitué des prostaglandines, qui diffèrent par le degré et les

sites d'hydroxylation et d'insaturation.

Le groupe suivant de médicaments est constitué des antibiotiques, qui comprennent la pénicilline, la chloromycétine, l'actinomycétine, la tétracycline, la

terramycine, leurs métabolites et dérivés.

Le groupe suivant de médicaments est constitué des nucléosides et nucléotides, qui comprennent l'ATP, le NAD, Le FMN, l'adénosine, la guanosine, la thymidine, et la cytidine avec leurs substituants glucidiques et phosphate appropriés. Le groupe suivant de médicaments est constitué de divers médicaments qui comprennent la méthadone, le méprobamate, la sérotonine, la mépéridine, l'amitriptyline,

la nortriptyline, la lidocaine, le procainamide, l'acétyl-

procainamide, le propranolol, la griséofulvine, l'acide valproique, les butyrophénones, les antihistaminiques, les médicaments anticholinergiques, tels que l'atropine, leurs

métabolites et dérivés.

Les métabolites liés à des états pathologiques

comprennent la spermine, le galactose, l'acide phényl-

pyruvique et la porphyrine de Type 1.

Le groupe suivant de médicaments est constitué d'aminoglycosides, tels que la gentamycine, la kanamycine, la tobramycine et l'amikacine. Parmi les pesticides intéressants se trouvent des diphényles polyhalogénés, des esters phosphoriques, des

thiophosphates, des carbamates, des sulfénamides polyhalo-

génés, leurs métabolites et dérivés.

Pour les analytes servant de récepteurs, les

poids moléculaires sont généralement compris dans l'inter-

valle de 10 000 à 2 X 108, plus souvent de 10 000 à 106.

Pour les immunoglobulines, Ig A, Ig G, Ig E et Ig M, les poids moléculaires varient généralement d'environ 160 000 à environ 106 Les enzymes ont habituellement des poids moléculaires compris dans l'intervalle d'environ 10 000 à

1 000 000 Les récepteurs naturels varient considérable-

ment, ayant généralement des poids moléculaires d'au moins environ 25 000 et pouvant atteindre 106 ou plus, ces récepteurs comprenant des matières telles que l'avidine, l'ADN, l'ARN, la globuline de liaison à la thyroxine, la préalbumine de liaison à la thyroxine, la transcortine, etc.

Des exemples

les suivants: Corynebacteria Corynebacterium diphteriae Pneumococci Diplococcus pneumoniae Streptococci Streptococcus pyrogenes Streptococcus salivarus Staphylococci Staphylococcus aureus Staphylococcus albus Neisseria Neisseria meningitidis Neisseria gonorrheae Enterobacteriaceae Escherichia coli Aerobacter aerogenes Klebsiella pneumoniae Salmonella typhosa Salmonella cholerae suis Salmonella typh Timurium Shigella dysenteriae Shigella schmitzii Shigella arabinotarda Shigella flexneri Shigella boydii Shigella sonnei Autres bacilles entériques Proteus vulgaris Proteus mirabilis Proteus morgani Pseudcmonas aeruginosa Alcaligenes faecalis Vibrio cholerae de micro-organismes comprennent Les bactéries coliformes Les salmonelles Les shigelles Les espèces du genre Proteus Groupe Hemophilus-Bordetella Hemophiilus influenzae, H ducryi Hemphi-us heanphilus Hemophilus aegyptius Hemoçhilus parainfluenzae Bordetella pertussis Pasteurellae Pasteurella pestis Pasteurella tularensis Brucellae Brucella mnelitensis Brucella abortus Brucella suis Bacilles sporogènes aérobies Bacillus anthracis Bacillus subtilis Bacillus megaterium Bacillus cereus Bacilles sporogènes anaérobies Clostridium botulinum Clostridiumn tetani Clostridium perfringens Clostridium novyi Clostridium septicum Clostridium histolyticum Clostridium tertium Clostridium bifermentans Clostridium sporogenes Mycobacteria Mycobacterium tuberculosis hominis Mycobacterium bovis Mycobacterium avium Mycobacterium leprae Mycobacterium paratuberculosis Actinoeycetes (bactéries analogues à des champignons) Actinomyces isaeli Actinomyces bovis Actinomyces naeslundii Nocardia asteroides Nocardia brasiliensis les Spirochètes Treponema pallidum Spirillum minus Treponema pertenue Streptobacillus moniliformis Treponema carateum Borrelia recurrentis Leptospira icterohemorrhagiae l Ieptospira canicola Trypanoso Eames Mycoplasmes Mycoplasma pneumoniae Rhizopus oryzae Rhizopus arrhizua Phycomycètes Rhizopus nigricans Sporotrichum schenkii Fonsecaea pedrosoi Fonsecaea compactum Fonsecaea dermatidis Cladosporium carrionii Phialophora verrucosa Aspergillus nidulans Madurella mycetomi Madurella grisea Allescheria boydii Phialophora jeanselmei Microsporum gypseum Trichophyton mentagrophytes Keratinomyces ajelloi Microsporum canis Trichophyton rubrum Microsporum audouini Virus Adenovirus Virus herpétiques Herpes simplex Varicella (varicelle) Herpes zoster (zona) Virus B Cytomegalovirus Poxvirus Variole (smallpox) Vaccinae Poxvirus bovis Paravaccinae Molluscum contagiosum Picornavirus Poliovirus Virus Coxsackie Echovirus Rhinovirus Myxovirus Influenza (A, B et C) Parainfluenza ( 1-4) Virus des oreillons Virus de la maladie de Newcastle Virus de la rougeole Virus de la peste bovine Virus de la maladie de Carré Virus syncytial respiratoire Virus de la rubéole Arbovirus Autres agents pathogènes Listeria monocytogenes Erysipelothrix rhusiopathiae Streptobacillus moniliformis Donvania granulomatis Bartonella bacilliformis Rickettsiae (parasites analogues Rickettsia Rickettsia Rickettsia Rickettsia à des bactéries) prowazekii mooseri rickettsii conori Rickettsia australis Rickettsia sibiricus Rickettsia akari Rickettsia tsutsugamushi Rickettsia burnetti Rickettsia quintana Chlamydia (parasites bactériens viraux atypiques) Agents du type Chlamydia (dénomination incertaine) Champignons Cryptococcus neoformans Blastoemyces dermatidis Hiseoplasma capsulatum Coccidioides immitis Paracoccidioides brasiliensis Candida albicans Aspergillus fumigatus Mucor corymbifer (Absidia corymbifera) Virus de l'encéphalite éguine nordaméricaine de l'Est Virus de l'encéphalite équine nord-américaine de l 'Ouest Virus Sindbis Virus Chikgunya Virus de la forét de Semliki Virus de l'encéphalite de Saint-louis Virus de l'encéphalite de Californie Virus de la fièvre à tiques du Colorado Virus de la fièvre jaune Virus de la dengue Réovirus Réovirus types 1-3 Rétrovirus Virus de l'immnodépression humaine (HIV) Virus lymphotropes I et II des lymphocytes T humains (HTLV) Hépatite Virus de l'hépatite A Virus de l'hépatite B Virus de l'hépatite non A-non B Virus tumoraux Virus de la leucémie de Rauscher Virus Gross Virus de la leucémie de Maloney Virus du papillome humain Elément d'une paire à liaison spécifique ("élément pls") l'une de deux molécules différentes, ayant une zone sur la surface ou dans une cavité qui se lie spécifiquement à, et est ainsi définie comme étant complémentaire ou réciproque de, une organisation spatiale et polaire particulière de l'autre molécule Les éléments de la paire à liaison spécifique sont désignés sous les noms de ligand et de récepteur (antiligand) Il s'agit habituellement de membres d'une paire immunologique telle qu'une paire antigène-anticorps, bien que d'autres paires à liaison spécifique, telles que la paire biotine-avidine, des paires hormones-récepteurs hormonaux, une paire lectine-glucide, des duplex d'acides nucléiques, une paire Ig G-protéine A, une paire ADN-ADN, une paire ADN-ARN, etc, ne soient pas des paires immunologiques mais entrent dans

le cadre de la présente invention.

Ligand n'importe quel composé organique pour lequel un récepteur existe naturellement ou peut être préparé. Analogue de ligand un ligand modifiéqui peut entrer en compétition avec le ligand analogue pour un récepteur, la modification offrant habituellement un moyen

de joindre un analogue de ligand à une autre molécule.

L'analogue de ligand diffère habituellement du ligand par une caractéristique autre que le simple remplacement d'un atome d'hydrogène par une liaison qui fixe l'analogue de ligand à un noyau central ou un marqueur, mais cela n'est pas obligatoire L'analogue de ligand peut se lier au

récepteur d'une manière similaire à celle du ligand.

L'analogue peut être, par exemple, un anticorps dirigé

contre l'idiotype d'un anticorps contre le ligand.

Récepteur ("antiligand") n'importe quel composé ou n'importe quelle composition capable de

reconnaître une organisation spatiale et polaire par-

ticulière d'une molécule, par exemple un site épitopique ou déterminant Des exemples de récepteurs comprennent des récepteurs naturels, par exemple la globuline de liaison à la thyroxine, des anticorps, des enzymes, des fragments Fab, des lectines, des acides nucléiques, la protéine A, le constituant Clq du complément, etc. MI en particules les MI en particules

possèdent généralement un diamètre d'au moins 0,1 micro-

mètre et non supérieur à environ 100 micromètres, habituel-

lement de 0,5 à 25 micromètres Les MI en particules peuvent être organiques ou inorganiques, présenter ou non une capacité de gonflement, être poreuses ou non poreuses, et être habituellement d'une masse volumique voisine de celle de l'eau, généralement d'environ 0,7 à environ 1,5 g/ml Habituellement, les MI en particules possèdent une charge, positive ou négative, et peuvent porter des éléments pîs sur leur surface Habituellement, les MI en particules sont des matières biologiques telles que des cellules comme, par exemple, des érythrocytes, des

leucocytes, des lymphocytes, des hybridomes, des micro-

organismes tels que, par exemple, des Streptococcus, Staphylococcus aureus, E coli, des virus; des organites tels que, par exemple, des noyaux, des mitochondries, des nucléosomes; etc Les MI en particules peuvent égalemnt être des particules constituées de polymères organiques et de polymères inorganiques, des liposomes, des particules de latex, des vésicules de phospholipides, des chylomicrons, des lipoprotéines, etc. Les polymères sont habituellement des polymères d'addition ou de condensation Les MI en particules

dérivées de ces polymères présentent une capacité d'adsorp-

tion ou de fonctionnalisation de manière à lier, directe-

ment ou indirectement, un élément pls.

La MI en particules peut être un analyte ou peut porter un analyte lié, ou bien un analyte peut se lier à cette MI avant ou pendant la séparation Les MI en particules peuvent être formées de particules non liées

initialement à l'analyte et dérivées de matières naturel-

les, de matières naturelles qui sont modifiées par synthèse, et de matières synthétiques Parmi les polymères organiques particulièrement intéressants se trouvent des polysaccharides, en particulier des polysaccharides réticulés, tels que l'agarose, qui est disponible sous le nom de Sepharose, le dextrane, disponible sous les noms de Sephadex et Sephacryl, la cellulose, l'amidon, etc; des polymères d'addition, tels que le polystyrène, l'alcool polyvinylique, des homopolymères et copolymères de dérivés d'acrylate et de méthacrylate, en particulier des esters et des amides ayant des fonctionnalités hydroxyle libres, etc. Les particules destinées à être utilisées dans les analyses sont habituellement polyfonctionnelles et présentent une liaison ou bien sont capables de présenter une liaison non covalente spécifique à un élément pls, tel que des anticorps, l'avidine, la biotine, des lectines, la protéine A, etc Des groupes fonctionnels très divers sont disponibles ou peuvent être incorporés Les groupes fonctionnels comprennent des acides carboxyliques, des aldéhydes, des groupes amino, des groupes cyano, des groupes éthylène, des groupes hydroxyle, des groupes mercapto, etc Le moyen de lier des composés très divers à des particules est bien connu et est amplement illustré dans la littérature Voir, par exemple, Cuatrecasas, J. Biol Chem 245 3059 ( 1970) La longueur d'un groupe de jonction peut varier considérablement suivant la nature du composé lié, l'effet de la distance entre le composé lié et la particule sur la liaison des éléments pîs et l'analyte, etc. Les MI en particules peuvent posséder une charge électronique, positive ou négative La particule peut être chargée par nature ou bien peut être traitée

chimiquement ou physiquement pour introduire une charge.

Par exemple, des groupes tels que des groupes carboxyle, sulfonate, phosphate, amino, etc, peuvent être liés

chimiquement ou formés sur les particules par des techni-

ques connues dans la pratique Les cellules sont habituel-

lement chargées négativement en raison de la présence de résidus acide sialique sur la surface cellulaire Les particules de latex peuvent être chargées positivement ou négativement, mais possèdent habituellement une charge

négative en résultat de l'introduction de groupes fonction-

nels ou de l'absorption de polymères chargés tels que des polypeptides, des protéines, un polyacrylate, etc.

Les particules peuvent être colorées, fluores-

centes ou non fluorescentes, habituellement non fluorescen-

tes, mais, lorsqu'elles sont fluorescentes, elles peuvent l'être directement ou au moyen de composés fluorescents ou corps engendrant une fluorescence liés à la particule par

des moyens classiques.

Marqueur Un élément d'un système engendrant un signal qui peut être lié, ou amené à se lier, à une MI comprenant des analytes, ou bien à une substance dont la présence est liée à la présence de la MI Le marqueur peut être isotopique ou non isotopique, habituellement non isotopique, ce marqueur comprenant des catalyseurs tels qu'un enzyme, un chromogène tel qu'un corps engendrant une fluorescence, un colorant ou un corps chimioluminescent, une particule, etc. Système engendrant un signal Le système engendrant un signal peut comprendre un ou plusieurs constituants, au moins un constituant étant un marqueur Le système engendrant un signal engendre un signal qui est proportionnel à la présence ou à la quantité de MI, ou bien une substance dont la présence est en rapport avec la présence d'une MI, dans un échantillon Le système engendrant un signal comprend tous les réactifs requis pour engendrer un signal mesurable D'autres constituants du système engendrant un signal peuvent comprendre des substrats, des renforçateurs, des activateurs, des composés chimioluminescents, des cofacteurs, des inhibiteurs, des accepteurs, des ions métalliques, des substances à liaison spécifique nécessaires pour la liaison des substances engendrant un signal, etc D'autres constituants du système engendrant un signal peuvent être des coenzymes, des substances qui réagissent avec des produits enzymatiques,

d'autres enzymes et catalyseurs, etc Le système engen-

drant un signal engendre un signal détectable par des moyens extérieurs, de préférence par la mesure du degré d'agrégation de particules ou bien par l'utilisation d'une radiation électromagnétique, avantageusement par examen visuel. Un grand nombre d'enzymes et de coenzymes utiles dans un système engendrant un signal est mentionné dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N' 4 275 149, colonnes 19 à 23, et le brevet des Etats-Unis d'Amérique

N O 4 318 980, colonnes 10 à 14, dont les descriptions sont

citées à titre de référence dans le présent mémoire Un certain nombre d'association d'enzymes est indiqué dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N O 4 275 149, colonnes 23 à 28, associations qui peuvent trouver une utilisation dans

la présente invention Cette description est citée à titre

de référence dans le présent mémoire.

Billes Des particules qui possèdent généralement un diamètre d'au moins environ 1 à 50 000 nm, habituellement d'au moins environ 20 à 10 000 nm Des billes ayant une masse volumique inférieure à 8 g/cm 3 possèdent de préférence un diamètre moyen de 100 à 000 nm Des billes plus denses possèdent habituellement un diamètre moyen de 5 à 30 nm, de préférence d'environ 1 à nm La bille peut être organique ou inorganique, posséder ou non une capacité de gonflement, être poreuse ou non poreuse Les billes peuvent être constituées d'une matière qui est transparente, partiellement transparente ou opaque Les billes peuvent avoir n'importe quelle forme convenable pour leur utilisation, telle qu'une forme ronde, ovale, irrégulière, etc. Les billes sont capables de lier la MI (qu'elle soit ou non en particules) En conséquence, les billes possèdent habituellement sur leur surface un agent qui confère une capacité de liaison La liaison peut être

spécifique ou non spécifique, covalente ou non covalente.

L'agent peut comprendre un élément pîs, tel qu'un récepteur spécifique ou un acide nucléique Par exemple, les billes peuvent porter une antiimmunoglobuline sur leur surface et des anticorps contre un microorganisme peuvent être utilisés pour provoquer la liaison En variante, l'agent peut être une lectine ou un réactif polyionique, en particulier lorsque la MI est un micro-organisme Les billes peuvent porter une charge, positive ou négative, et peuvent également comprendre des éléments pls sur leur surface. Les billes sont choisies de manière à avoir une masse volumique supérieure à celle de n'importe lequel autre constituant insoluble dans le mélange duquel la MI doit être séparée Habituellement, il est nécessaire que les billes possèdent des masses volumiques d'au moins 1,2 g/cm 3 et des masses volumiques bien supérieures, habituellement d'au moins 4 g /cm 3, sont préférées, en particulier lorsque la MI en particules doit être séparée

et que les billes sont plus petites que la MI en par-

ticules L'impératif principal est que l'agrégat d'une ou de plusieurs billes lié à la MI possède une masse volumique supérieure à la masse volumique des autres constituants

insolubles dans le mélange duquel la MI doit être séparée.

Les billes peuvent être dérivées de matières naturelles, de matières naturelles qui sont modifiées par synthèse, et de matières synthétiques Un groupe de billes comprend celles constituées d'un métal lourd, c'est-àdire d'un métal de numéro atomique supérieur à 20 tel qu'un métal du Groupe IB, par exemple l'or ou l'argent Le métal lourd peut être sous forme d'un sol métallique (suspensions colloïdales d'argent, d'or, de mercure, de plomb, de palladium, etc), ou bien peut être un sel métallique tel qu'un oxyde, un sulfure, un phosphate ou sulfate insoluble, par exemple un sel de plomb, de baryum, de calcium, de titane, etc Un autre groupe de billes comprend des billes de polyols, c'est-à-dire des billes constituées de composés polymériques renfermant plus d'un groupe hydroxyle Parmi les polymères organiques particulièrement intéressants se

trouvent des polysaccharides, en particulier des polysac-

charides réticulés, tels que l'agarose, qui est disponible sous le nom de Sepharose, le dextrane, disponible sous les noms de Sephadex et Sephacryl, la cellulose, l'amidon, etc. des polymères d'addition, tels qu'un polystyrène, un alcool polyvinylique, des homopolymères et copolymères de dérivés d'acrylate et de méthacrylate, en particulier des esters et des amides ayant des fonctionnalités hydroxyle libres, etc D'autres exemples de billes qui peuvent être utilisées dans la présente invention à titre d'illustration et non à titre limitatif sont des billes de silice, des

billes constituées de verre, d'un latex, d'un polyacryl-

amide, de carbone, de nitrure de bore, de carborane, de carbure de siliicum, de silicates métalliques, etc. Les dimensions relativement grandes des cellules et des micro-organismes nécessitent la liaison de billes de densités particulièrement élevées, lorsque les billes sont notablement plus petites que les cellules ou les micro-organismes Les billes préférées contiennent des métaux lourds et sont insolubles et stables du point de vue colloïdal, ces billes étant constituées de préférence de sols de métaux du groupe 1 B, en particulier d'or et d'oxydes de métaux et sulfures métalliques, ainsi que de sulfates insolubles tels que les sulfates de baryum et de calcium, ces billes possédant un diamètre de 5 à 70 nm et des masses volumiques supérieures à 10 g/cm 3 En variante, il est possible d'utiliser des billes plus volumineuses qui peuvent être constituées d'un latex, de silice, de verre, d'agarose, de cellulose, de Sephadex, etc, sous réserve seulement que ces billes soient insolubles dans, et plus denses que, le milieu liquide lors de la liaison à la

matière intéressante.

De plus grandes vitesses et une plus grande efficacité de liaison des billes à la matière intéressante à séparer sont obtenues avec de plus fortes concentrations en billes Lorsqu'il est désiré d'éviter des sédiments excessivement volumineux et de parvenir encore à une concentration maximale en billes, il est préférable d'utiliser de petites billes extrêmement denses, ayant habituellement un diamètre compris dans l'intervalle de 1 à

nm et des masses volumiques de 10 à 20 g/cm 3.

Les billes sont habituellement polyfonctionnel-

les et peuvent se lier, ou sont capables de présenter une liaison non covalente spécifique, à un membre pls, tel que des anticorps, l'avidine, la biotine, des lectines, la protéine A, etc Des groupes fonctionnels très divers sont disponibles ou peuvent être incorporés Les groupes fonctionnels comprennent des acides carboxyliques, des aldéhydes, des groupes amino, des groupes cyano, des groupes éthylène, des groupes hydroxyle, des groupes mercapto, etc Le moyen de lier des composés très divers à des particules est bien connu et est amplement illustré dans la littérature Voir, par exemple, Cuatrecasas, J. Biol Chem, 245 3059 ( 1970) La longueur d'un groupe de jonction peut varier largement suivant la nature du composé lié, l'effet de la distance entre le composé lié et la particule sur la liaison de membres pls et l'analyte, etc. La bille peut avoir une charge électronique, positive ou négative Les billes peuvent être chargées par

nature ou peuvent être traitées chimiquement ou physique-

ment pour introduire une charge Par exemple, des groupes tels que des groupes carboxyle, sulfonate, phosphate, amino, etc, peuvent être liés chimiquement à, ou formés sur, les particules par des techniques connues dans la pratique Les particules de latex peuvent être chargées positivement ou négativement mais possèdent habituellement une charge négative en résultat de l'introduction de groupes fonctionnels ou de l'absorption de polymères chargés tels que des polypeptides, des protéines, un polyacrylate, etc. Les billes peuvent être fluorescentes ou non fluorescentes, habituellement non fluorescentes, mais, lorsqu'elles sont fluorescentes, elles peuvent l'être

directement ou du fait de la présence de composés fluores-

cents ou de corps engendrant une fluorescence liés à la bille par des moyens classiques Les corps engendrant une fluorescence sont habituellement dissous dans, ou liés de manière covalente ou non covalente à, la bille et sont fréquemment liés de manière pratiquement uniforme à travers

la bille Des particules de latex traitées à la fluores-

céine sont décrites dans le brevet des Etats-Unis d'Améri-

que N O 3 853 987.

Les corps intéressants engendrant une fluores-

cence émettent généralement de la lumière à une longueur d'ondes supérieure à 350 nm, habituellement supérieure à

400 nm et, de préférence, supérieure à 450 nm Avantageuse-

ment, les corps engendrant une fluorescence possèdent un haut rendement quantique, un décalage de Stokes important et sont chimiquement stables dans les conditions de leur conjugaison et de leur utilisation L'expression "corps engendrant une fluorescence" est destinée à désigner des substances qui émettent de la lumière par activation par une radiation électromagnétique ou par activation chimique,

et désigne des substances fluorescentes et phosphores-

centes, des substances engendrant une scintillation et des

substances chimioluminescentes.

Les corps intéressants engendrant une fluores- cence se répartissent dans différentes catégories ayant certaines fonctionnalités principales Ces fonctionnalités principales comprennent les 1 et 2-aminonaphtalènes, les

pyrènes, des sels de phénanthridine quaternaire, des 9-

amino-acridines, des p,p'-diaminostilbènes, des imines, des

anthracènes, l'oxacarbocyanine, la mérocyanine, la 3-

aminoéquilénine, le pérylène, le bis-benzoxazole, le bis-p-

oxazolylbenzène, la 1,2-benzophénazine, le rétinol, des sels de bis-3aminopyridinium, l'hellébrigénine, la

tétracycline, le stérophénol, la benzimidazolylphényl-

amine, le 2-oxo-3-chromène, l'indole, le xanthène, la 7-

hydroxycoumarine, des 4,5-benzimidazoles, la phénoxazine, un salicylate, la strophanthidine, des porphyrines, des triarylméthanes, la flavine et des oxydes et sels de chélates de terres rares Des exemples de corps engendrant

une fluorescence sont énumérés dans le brevet des Etats-

Unis d'Amérique N 4 318 707, colonnes 7 et 8 Les colorants du type squaraine décrits dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 806 488 sont également utiles

comme corps engendrant une fluorescence.

En outre, il est possible d'utiliser des billes absorbant la lumière, qui sont des particules solides insolubles. Les billes sont parfois désignées dans la présente invention sous le nom de particules lorsqu'un

terme plus général est approprié dans la description de la

présente invention.

Liaison spécifique La reconnaissance spécifique d'une ou deux molécules différentes pour l'autre molécule, à l'exclusion d'autres molécules En général, les molécules possèdent une zone sur la surface ou dans une cavité permettant une reconnaissance spécifique entre les deux molécules La caractéristique de liaison primaire provient d'une liaison hydrogène Des exemples de liaisons spécifiques sont des interactions anticorpsantigène, des interactions enzyme-substrat, etc. Liaison non spécifique liaison non covalente entre, par exemple, une MI en particules et des billes, qui est relativement indépendante des structures de surface

* spécifiques Cette liaison non spécifique résulte habituel-

lement d'interactions de charge ou d'interactions électro-

niques entre des particules de charges opposées ou bien entre des particules ayant la même charge lorsqu'un réactif polyionique ayant une charge opposée à ces particules est utilisé La liaison non spécifique peut également résulter d'interactions hydrophobes de molécules

ou de particules avec une surface.

Réactif polyionique un composé, une composition ou une matière, inorganique ou organique, naturelle ou synthétique, comprenant au moins deux charges identiques, que cette substance soit polyanionique ou

polycationique, de préférence au moins 10 charges identi-

ques, par exemple un polyélectrolyte.

Des exemples de réactifs polycationiques sont des polyalkylène-amines, telles que la polyéthylène-imine et la polypropylène-imine, et leurs sels d'alkyl-ammonium inférieur tels que le polybrène

(-N+(CH 3)2 CH 2 CH 2 N+(CH 3)2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2-)n, des ions métalli-

ques tels que l'ion calcium et l'ion baryum, des amino-

dextranes, la protamine, des liposomes chargés positive-

ment, la polylysine, etc. Des exemples de réactifs polyanioniques sont l'héparine, le sulfate de dextrane, des vésicules de

phospholipides chargées négativement, des acides polycar-

boxyliques, tels qu'un polyacrylate, un polyglutamate, etc. Les matières précitées et leur préparation ou leur séparation sont bien connues dans la pratique et de

nombreuses sont disponibles dans le commerce.

Agent de libération un composé, une composition ou une matière, naturel ou synthétique, organique ou inorganique, capable d'inverser la liaison non

spécifique ou spécifique entre la MI et les billes, c'est-

à-dire de dissocier la MI des billes L'agent de libération agit sur la liaison spécifique ou non spécifique entre la MI et les billes Par exemple, lorsque la liaison non spécifique résulte d'interactions entre des charges, l'agent de libération peut avoir pour rôle de modifier le p H du milieu en l'amenant à une valeur qui est défavorable ou incompatible avec les interactions entre les charges En conséquence, l'agent de libération peut être un acide tel qu'un acide minéral ou un acide organique ou bien une base telle qu'une base minérale ou une base organique En variante, l'agent de libération peut avoir pour rôle de masquer des interactions ioniques et, ainsi, peut être une solution de grande force ionique ou bien une solution d'un polymère neutre, telle qu'un dextrane En variante, l'agent de libération peut avoir une charge qui rompt la liaison non spécifique entre la MI en particules et les billes Des exemples de ce dernier sont des sels polyélectrolytiques tels qu'un citrate, un polyacrylate, le sulfate de dextrane, etc Lorsque les particules sont liées par un pont polyionique, l'agent de libération peut être un agent polyionique de charge opposée ou peut être un réactif qui dépolymérise le réactif polyionique Lorsque la MI et les billes sont de charge opposée, d'autres polyélectrolytes chargés positivement ou négativement ou des solutions de

grande force ionique peuvent être utilisées.

Lorsqu'une liaison spécifique est impliquée, l'agent de libération peut être un agent qui rompt les interactions spécifiques tel que, par exemple, un excès de ligand ou de récepteur ou bien une substance mimétique du ligand ou du récepteur lorsqu'une liaison ligand-récepteur

est impliquée; des agents de chélation, tels que l'éthy-

lènediaminetétra-acétate (EDTA), qui peuvent rompre la liaison métalligand; des agents réducteurs tels que le mercaptoéthanol, qui peut rompre les liaisons disulfure; des réactifs nucléophiles tels que l'hydroxylamine, qui peuvent rompre les liaisons ester; etc. Constituants insolubles des constituants dans un mélange, autres que la MI, provenant généralement de l'échantillon biologique ou d'un produit alimentaire ou

médicamenteux à l'étude Ces constituants sont habituelle-

ment une matière en particules et peuvent être, par

exemple, des débris cellulaires, des noyaux, des mitochon-

dries, des nucléosomes, des chylomicrons, des lipoprotéines basse densité (LDL), etc Le procédé de la présente invention est particulièrement utile pour le sang et peut faire intervenir le prétraitement d'échantillons au moyen d'agents solubilisants et d'agents destinés à lyser les cellules Ces procédés peuvent comprendre l'utilisation de détergents doux, une lyse cellulaire par un choc osmotique,

un traitement par ultrasons, des anticorps et le complé-

ment, une pression, etc Les suspensions ainsi préparées contiennent habituellement des impuretés solubles et des débris cellulaires, ainsi que la matière intéressante à séparer.

Substances accessoires Différentes substan-

ces accessoires sont fréquemment utilisées dans une séparation conforme à la présente invention Par exemple, des tampons sont souvent présents dans le milieu liquide, ainsi que des stabilisants pour le milieu liquide et les autres constituants Fréquemment, en plus de ces additifs, des protéines supplémentaires, telles que des albumines, ou bien des surfactants, en particulier des surfactants non ioniques, des renforçateurs de liaison, par exemple des

polyalkylèneglycols, etc, peuvent être incorporés.

De la manière précitée, la présente invention fait intervenir un procédé de séparation d'une MI d'un mélange contenant la MI et des constituants insolubles Le procédé consiste à produire dans un milieu aqueux une MI liée à une bille (ensemble MI-billes) L'ensemble MI-billes possède une densité supérieure à celle du milieu Le milieu est plus dense que les constituants insolubles présents dans le mélange La MI à séparer est liée aux billes par une liaison spécifique ou non spécifique suivant la nature de la MI Une liaison spécifique est plus fréquemment utilisée pour la liaison d'une MI non constituée de

particules à des billes pour former un ensemble MI-billes.

Cependant, une liaison spécifique peut également être appliquée dans la liaison d'une MI en particules à des billes Habituellement, une liaison ligand-récepteur est utilisée Les billes peuvent porter un membre pîs lié, complémentaire de la MI non sous forme de particules Une liaison non spécifique est habituellement utilisée convenablement pour une MI en particules et est de préférence réalisée en résultat d'interactions entre charges Par exemple, la MI en particules et les billes peuvent avoir des charges électroniques opposées et une liaison non spécifique se produit spontanément Lorsque la MI en particules et les billes possèdent la même charge, un réactif polyionique de charge opposée peut être ajouté au milieu pour provoquer une liaison non spécifique entre la

MI en particules et les billes.

Puis le milieu est soumis à une force centri-

fuge suffisante pour séparer les constituants insolubles et

l'ensemble MI-billes.

Dans la mise en oeuvre du procédé, un milieu

liquide consistant en un milieu aqueux est utilisé.

L'expression "milieu aqueux", telle qu'elle est utilisée dans la présente invention, désigne des milieux dans lesquels le seul solvant présent est l'eau ou bien des milieux contenant de l'eau et d'autres solvants polaires, habituellement des solvants organiques oxygénés ayant 1 à 6, plus souvent 1 à 4, atomes de carbone, comprenant des alcools, des éthers, etc Habituellement, lorsqu'ils sont présents, ces cosolvants sont présents en une quantité inférieure à environ 40 % en poids, le plus souvent en une quantité inférieure à environ 20 % en poids Le p H du milieu est habituellement choisi de manière à activer la liaison spécifique ou non spécifique de la MI aux billes avant séparation Lorsque les billes sont chargées négativement, l'élévation du p H tend à accroître la charge et à éviter l'agrégation spontanée provoquée par des

interactions hydrophobes non spécifiques et des interac-

tions de Van der Waals L'inverse s'applique aux billes chargées positivement Lorsqu'un polyélectrolyte de charge

opposée est ajouté pour provoquer la liaison, des varia-

tions de p H qui augmentent la charge du polyélectrolyte diminuent souvent la charge des billes et il est nécessaire de choisir un p H optimal qui évite l'utilisation de quantités excessives de ce réactif En général, une plage

de p H de 5 à 10, le plus souvent de 6 à 9, est utilisée.

Pour une liaison ligand-récepteur, d'autres considérations concernant le p H consistent à maintenir un degré important de liaison de membres pls, par exemple, ou d'acides nucléiques Différents tampons peuvent être utilisés pour atteindre le p H désiré et maintenir le p H au cours de la détermination Des exemples de tampons comprennent les tampons au borate, au phosphate, au carbonate, au tris, au barbital, etc Le tamponparticulier utilisé n'est pas déterminant pour la présente invention; cependant, dans des séparations données, un tampon peut être préféré à un autre Lorsqu'une MI en particules est impliquée, un réactif qui favorise l'inversion de la liaison de la MI en particules et des billes peut être ajouté une fois la

séparation réalisée.

On utilise normalement des températures

modérées pour la mise en oeuvre du procédé et, habituelle-

ment, des températures constantes au cours de la période de mise en oeuvre du procédé En général, les températures sont choisies de manière à favoriser la liaison spécifique ou non spécifique de la MI aux billes avant séparation La

température pour la mise en oeuvre du procédé est générale-

ment comprise dans l'intervalle d'environ O à 500 C, plus fréquemment d'environ 15 à 40 'C De même, une fois la séparation effectuée, une température qui favorise l'inversion de la liaison de la MI et des billes peut alors

être choisie.

La concentration des billes dans le milieu dépend de la quantité de MI dans le milieu qui doit être séparée et de la nature de la MI, qu'elle soit sous forme de particules ou non, des dimensions et de la capacité de liaison des billes, de la vitesse de séparation qui est désirée, de l'intensité de la force centrifuge et de la densité relative de l'ensemble MI-billes, du milieu et des constituants insolubles En général, de plus fortes concentrations de billes provoquent une liaison plus rapide à la MI et, lorsque la MI est sous forme de particules et les billes sont plus petites que la MI, de plus fortes concentrations de billes peuvent également provoquer des séparations plus efficaces et plus rapides Cependant, une trop forte concentration de billes peut provoquer un entraînement excessif du milieu La concentration est habituellement déterminée de manière empirique et varie généralement d'environ 104 à plus de 1014 par ml, plus fréquemment d'environ 106 à 1012 par ml, souvent d'environ

107 à 1010 par ml.

Lorsqu'une MI en particules doit être séparée d'un milieu, la concentration de la MI en particules peut varier largement suivant les besoins Par exemple, dans la séparation de cellules sanguines du plasma, le volume cellulaire peut représenter 50 % du volume total du sang A l'opposé, il peut être désiré de séparer une quantité aussi

faible qu'une bactérie/ml d'un échantillon d'eau Lors-

qu'il est nécessaire d'obtenir une MI en particules qui soit relativement débarrassée du milieu aqueux, comme dans

le cas d'une analyse, le volume total de la MI en par-

ticules doit habituellement être inférieur à 20 % du volume du milieu Lorsque la MI n'est pas sous forme de particules et se lie à une bille, la concentration de la MI varie généralement d'environ 1 o 4 à 10-14 M, plus fréquemment d'environ 10-6 à 10-12 M Des considérations telles que la concentration de la MI, des effets de liaison spécifique et de liaison non spécifique, la vitesse désirée de la réaction, la température, la solubilité, les densités

relatives, la force centrifuge, etc, déterminent habituel-

lement la concentration des autres réactifs.

Bien que les concentrations des différents réactifs soient généralement déterminées par la plage de concentrations intéressante de la MI à séparer, la

concentration finale de chacun des réactifs est habituelle-

ment déterminée empiriquement pour rendre optimaux la

vitesse et le degré de séparation de la MI.

Lorsqu'une liaison spécifique est impliquée, des moyens chimiques pour la formation de liaisons non spécifiques entre la MI en particules et les billes sont habituellement incorporés au milieu aqueux Sauf lorsqu'il est nécessaire de séparer des MI en particules qui possèdent une charge opposée à celle des billes, ces moyens

chimiques consistent habituellement en un réactif polyioni-

que ayant une charge opposée à celle des billes La

quantité de réactif polyionique ajoutée doit être suf-

fisante pour que pratiquement la totalité de la MI en particules se lie aux billes Cette concentration doit être déterminée empiriquement Un excès de réactif doit être généralement évité lorsqu'il interfère avec la liaison totale entre la MI en particules et les billes En général, le réactif polyionique possède une concentration dans le milieu liquide suffisante pour fournir un nombre d'ions associés au polymère égal au nombre total de charges de signe opposé sur toutes les particules présentes dans le milieu Lorsqu'il est nécessaire de séparer des MI en particules qui possèdent une charge opposée à celle des billes, les moyens chimiques pour la formation de liaisons non spécifiques entre les particules consistent fréquemment

en un tampon de faible force ionique.

La liaison de la MI ou de la MI en particules à des billes peut être influencée par le p H La liaison peut également être influencée par d'autres facteurs tels que la force ionique et la présence de polymères ioniques et non ioniques En général, lorsque la liaison non spécifique est due à des interactions entre charges, la force ionique doit être choisie initialement de manière à faciliter la liaison entre les particules A cette fin, la force ionique est généralement faible et peut être comprise dans l'intervalle de 0,001 à 0,5 M, de préférence de 0,005 à 0,l M Une fois la séparation terminée, la force ionique peut être accrue, cet ajustement étant destiné à faciliter l'inversion du couplage de la MI en particules et des billes A cette fin, la force ionique du milieu est habituellement d'environ 0,1 à 10 M, de préférence d'environ 0, 15 à 1 M Les principes régissant l'agrégation des particules ou la persistance de ces particules en suspension sont bien connus dans le domaine de la science des colloïdes Lorsqu'une liaison

spécifique est impliquée, la force ionique n'est générale-

ment pas déterminante et est habituellement comprise dans l'intervalle de 10-3 à IOM ou plus de 10 M. Une fois les billes ajoutées au milieu aqueux et lorsqu'une liaison spécifique de la MI aux billes est utilisée, le milieu aqueux est ensuite abandonné pendant un

temps suffisant pour que cette liaison se produise.

Habituellement, cela nécessite 0,1 à 120 minutes, plus fréquemment 1 à 60 minutes Lorsqu'une liaison non spécifique, induite chimiquement, d'une MI en particules à des billes est impliquée, cette liaison se produit habituellement très rapidement, et il suffit également de laisser le mélange au repos pendant seulement quelques

minutes, souvent pendant seulement 60 secondes, fréquem-

ment pendant moins de 15 secondes; de préférence, la force centrifuge est appliquée immédiatement après addition des billes et d'autres réactifs au milieu aqueux Le degré de liaison entre la MI, ou la MI en particules, et les billes constitue un facteur d'ajustement de l'efficacité de la séparation. La densité d'au moins une partie d'un milieu liquide qui est constituée du milieu aqueux est supérieure à celle des constituants insolubles présents dans le mélange Le milieu liquide peut être un milieu aqueux homogène, une suspension aqueuse de particules capable de produire un gradient de densité par centrifugation, un milieu aqueux recouvert d'une couche d'un second milieu liquide, aqueux ou non aqueux, habituellement plus visqueux Le second milieu est au moins aussi dense, et habituellement plus dense, que le milieu aqueux En général, la densité d'au moins une partie du milieu liquide, de préférence le milieu aqueux, est au moins égale à 1,05 fois la densité des constituants insolubles En général, la masse volumique des constituants insolubles est comprise dans l'intervalle d'environ 0,7 à 1,2 g/cm 3, habituellement dans l'intervalle de 1,0 à 1,15 g/cm 3 Bien entendu, de la manière précitée, la densité du milieu

liquide doit être inférieure à celle de l'ensemble MI-

billes. Il est possible de parvenir d'un certain nombre de manières différentes à des densités relativement plus fortes des milieux aqueux Par exemple, un soluté de haute densité peut être ajouté au milieu aqueux pour parvenir à la densité désirée De préférence, le soluté de haute densité ne traverse pas aisément les membranes cellulaires (lorsque des cellules doivent être séparées) et n'accroit pas non plus notablement la force ionique du milieu Des exemples de ces solutés de haute densité sont des solutés organiques polyiodés hydrosolubles, non ioniques ou neutres, qui sont disponibles dans le commerce sous les noms commerciaux HYPAQUE M et NYCODENZ È D'autres solutés de haute densité comprennent des sels de haut poids moléculaire, c'est-à-dire des sels constitués d'atomes de numéro atomique supérieur à 34, tels que le chlorure de césium, etc; le saccharose, etc L'utilisation de sels de haut poids moléculaire peut être moins avantageuse lorsque

des micro-organismes viables doivent être séparés.

Une autre voie dans la préparation d'un milieu aqueux de plus haute densité consiste en l'addition au milieu de suspensions de particules telles que des suspensions de particules de silice (disponibles dans le commerce sous les noms commerciaux PERCOLL D, etc) Des milieux non aqueux de haute densité peuvent être constitués de liquides organiques ou inorganiques, tels que des hydrocarbures halogénés, des fluides silicones, etc. Dans n'importe laquelle des préparations précitées, le milieu aqueux peut être agité, si nécessaire, après addition de l'agent approprié et avant de soumettre le milieu à une force centrifuge, pour garantir une distribution uniforme de l'agent dans le milieu aqueux, ce qui permet ainsi de parvenir à une densité uniforme dans le milieu aqueux Bien entendu, l'agitation ne doit pas être suffisamment forte pour avoir une action néfaste sur la MI, notamment une MI en particules telle que des cellules ou

des micro-organismes.

Dans une autre forme de réalisation, le milieu aqueux peut être recouvert d'une couche d'un second milieu qui est au moins aussi dense que le milieu aqueux et qui possède une viscosité supérieure à celle du milieu aqueux pour réduire au minimum le mélange des couches Le second milieu est aqueux ou non aqueux et, lorsqu'il est aqueux, il peut comprendre des solvants polaires, de la manière

décrite ci-dessus pour le milieu aqueux.

La viscosité apparente du second milieu est au moins égale à 1,5 fois la viscosité du milieu aqueux, habituellement comprise dans l'intervalle d'environ 2 à 100 fois la viscosité, de préférence d'environ 2,5 à 75 fois la viscosité, du milieu aqueux En général, la viscosité du milieu aqueux est comprise dans l'intervalle de 0,6 à 1,3 et celle du second milieu est comprise dans l'intervalle de

1,5 à 100 cp.

Il est possible de parvenir à une plus forte viscosité du second milieu en incorporant, comme partie du milieu, un soluté qui accroît la viscosité apparente, par

exemple un polyol tel qu'un glycol et l'alcool polyvinyli-

que, un saccharide, tel que des mono et polysaccharides comprenant, à titre d'exemple et non à titre limitatif, le mannitol, le glucose, l'agar, l'agarose, le saccharose, l'amidon, le dextrane, ou des polymères hydrophiles tels

qu'un polyéthylèneglycol, un polyacrylate, la polyvinylpyr-

rolidone; etc La viscosité du second milieu peut être ajustée non seulement par la concentration et la nature du soluté, mais également par la température à laquelle il est souhaité de parvenir à un tel ajustement La viscosité du second milieu peut être ajustée par un ajustement de température lorsqu'une élévation de température provoque

habituellement une diminution de la viscosité du milieu.

Ainsi, des couches peuvent être produites à une température

à laquelle la couche inférieure est un gel ou est relative-

ment visqueuse ou bien solide, et la centrifugation peut être effectuée à une autre température, habituellement plus élevée, à laquelle la viscosité est plus faible ou bien le milieu devient fluide et les billes passent plus rapidement à travers la couche La séparation des couches peut ensuite être facilitée en ramenant la couche inférieure à la température initiale. Puis une force centrifuge est appliquée au milieu aqueux, seul ou bien recouvert d'une couche d'un second milieu, de la manière précitée L'intensité de la

force centrifuge est suffisante pour séparer l'ensemble MI-

billes des constituants insolubles L'application d'une force centrifuge au milieu peut être effectuée de n'importe

quelle manière convenable qui engendre une force centri-

fuge, par exemple par une centrifugation classique ou une rotation sur son axe du récipient contenant le milieu Le procédé peut être mis en oeuvre dans un récipient constitué d'une matière telle que, par exemple, le verre ou une matière plastique Lors de l'application de la force

centrifuge, le réacteur peut être placé dans une centrifu-

geuse Plus la force centrifuge est grande, plus la séparation de l'ensemble MI-billes et des constituants insolubles est rapide De préférence, le récipient est soumis à une rotation sur son axe, la séparation pouvant être effectuée convenablement dans un tube ayant un diamètre d'environ 1 à 10, de préférence environ 1,5 à

5 cm L'intensité requise de la force centrifuge, c'est-à-

dire la vitesse et les rapports de rotation, varie en

fonction de la densité de flottation de l'ensemble MI-

billes dans le milieu liquide, de la viscosité du milieu liquide et du temps de séparation désiré La force centrifuge est appliquée pendant un temps suffisant pour

parvenir au degré désiré de séparation de l'ensemble MI-

billes et des constituants insolubles.

Lorsque le milieu aqueux est plus dense que les constituants insolubles, l'ensemble MI-billes et les constituants insolubles se séparent sous l'application d'une force centrifuge en raison de la migration de l'ensemble MI-billes et des constituants insolubles dans des sens opposés dans le milieu L'ensemble MI-billes plus dense migre vers l'extérieur dans le milieu, par exemple au fond d'un récipient contenant le milieu, tandis que les constituants insolubles migrent à la partie supérieure du

milieu aqueux ou vers l'axe de centrifugation.

Lorsqu'un second milieu est utilisé, l'ensemble MI-billes migre dans le second milieu, sous la force centrifuge appropriée, tandis que les constituants

insolubles restent dans le milieu aqueux.

Dans une autre forme de réalisation du procédé précité, le milieu aqueux, plutôt que d'être traité pour ajuster la densité, peut être recouvert d'une couche d'un milieu ayant une densité inférieure à celle de l'ensemble MI-billes mais supérieure à celle de n'importe lequel des autres constituants insolubles présents dans le milieu aqueux Dans cette forme de réalisation, l'application d'une force centrifuge d'intensité suffisante provoque la migration de l'ensemble MI-billes dans le milieu plus dense, tandis que les constituants insolubles, et les

constituants solubles, restent dans le milieu aqueux.

Par exemple, un micro-organisme peut être séparé d'un mélange contenant le micro-organisme et d'autres constituants, par liaison du micro- organisme à un grand nombre de billes dans un premier milieu aqueux pour former un ensemble micro-organisme-billes Le premier milieu est mis en contact avec un second milieu ayant une

densité supérieure à celle du premier milieu mais infé-

rieure à celle de l'ensemble micro-organisme-billes Les premier et second milieux mis en contact sont soumis à une centrifugation pour provoquer la séparation de l'ensemble micro-organisme-billes dans une zone à l'extérieur du premier milieu La zone est séparée de celle des autres

constituants.

Dans une autre forme de réalisation du procédé précité, le premier milieu aqueux et le deuxième milieu sont mélangés et recouverts d'une couche d'un troisième milieu ayant une viscosité supérieure à celle du mélange des premier et second milieux Dans un exemple, le troisième milieu contient un saccharide et lesdites couches sont formées à une température à laquelle le troisième milieu de plus forte viscosité est un gel et au moins une partie de la centrifugation est conduite à une température à laquelle ledit milieu de plus forte viscosité n'est pas un gel Après cette partie de la centrifugation, le milieu de plus forte viscosité peut être remis sous forme de gel

et les couches peuvent être séparées.

Dans une autre forme de réalisation du procédé

précité, le milieu aqueux est plus dense que les consti-

tuants insolubles et est recouvert d'une couche d'un second milieu de plus forte viscosité et ayant une densité au moins égale à celle du milieu aqueux Ce dernier milieu de

plus forte viscosité possède des caractéristiques similai-

res à celles décrites précédemment pour le second milieu.

L'application d'une force centrifuge d'intensité suffisante provoque la migration de l'ensemble MI-billes dans le second milieu, tandis que les constituants insolubles, ainsi que les constituants solubles, restent dans le milieu

aqueux.

Une fois l'ensemble MI-billes séparé des constituants insolubles, l'ensemble MI-billes peut être séparé du milieu et des constituants insolubles par n'importe quel moyen convenable tel que, par exemple, une décantation, un pipetage, etc. L'ensemble MI-billes peut être séparé du second milieu, lorsqu'un second milieu est utilisé, par n'importe

quel procédé convenable tel que, par exemple, une filtra-

tion, une décantation ou un pipetage L'ensemble MI-billes séparé peut être traité pour inverser la liaison entre la MI et les billes L'inversion de la liaison entre la MI, qu'elle soit sous forme de particules ou non, et les billes dépend de la nature de la liaison entre les particules Par exemple, l'ensemble MI-billes peut être mis en suspension dans un milieu liquide avec des réactifs ajoutés pour faciliter l'inversion de la liaison Dans une voie, lorsqu'une MI en particules est liée à des billes par des interactions ioniques, la force ionique et le p H du milieu peuvent être ajustés pour faciliter l'inversion de la liaison En général, l'accroissement de la force ionique inverse la liaison électrostatique Lorsque la MI en particules et les billes sont de charges opposées, une variation de p H peut neutraliser l'une des charges et réduire les interactions de liaison En variante, si un agent polycationique de liaison est utilisé pour lier négativement une MI en particules chargées à des billes chargées négativement, l'abaissement du p H peut neutraliser la charge et inverser la liaison Ainsi, il peut être souhaitable de faire varier le p H à une valeur aussi élevée ou aussi basse que le permet la stabilité des réactifs, habituellement non inférieure à p H 4 ou non supérieure à p H 10. Lorsqu'une liaison non spécifique résulte d'une interaction entre charges, un agent autre qu'un acide ou une base peut être ajouté pour inverser les interactions

entre charges responsables de la liaison non spécifique.

Par exemple, un agent de libération peut être ajouté.

Lorsque les particules possèdent des charges identiques et qu'un polyélectrolyte de charge opposée constituait le

moyen chimique pour la liaison des particules, un polyélec-

trolyte de même charge que les charges présentes sur les particules peut être utilisé pour la dissociation des particules Les polyélectrolytes peuvent être, par exemple, des polyanions tels que le sulfate de dextrane, l'héparine, un polyglutamate, un polyacrylate, des vésicules de phospholipides, le carboxyméthyldextrane et un citrate L'aminodextrane, le chitosane, le polybrène, la polyéthylène-imine, et des

liposomes cationiques constituent des exemples de polyca-

tions qui peuvent être utilisés.

Lorsqu'un polycation a été utilisé pour déclencher une liaison non spécifique entre la MI en particules et les billes, un polyanion peut être utilisé pour inverser la liaison En variante, lorsqu'un polyanion a été utilisé pour provoquer la liaison non spécifique entre les particules, un polycation peut être utilisé pour inverser la liaison Par exemple, lorsque des polycations tels que le polybrène ou l'ion baryum ont été utilisés, l'agent de libération peut être un polyanion tel qu'un citrate ou sulfate Des détergents peuvent jouer le râle d'agent de libération pour des liposomes et dans le cas o

des particules sont soumises à une agrégation non spécifi-

que principalement par des interactions hydrophobes.

Pour une MI sous forme de particules ou non qui est liée spécifiquement aux billes (pour former un ensemble MI-billes), par liaison ligandrécepteur, le ligand ou le

récepteur libre peut jouer le râle d'agent de libération.

Lorsque la liaison est covalente, un réactif hydrolytique

ou redox qui peut rompre la liaison covalente est habituel-

lement utilisé.

La concentration de l'agent de libération doit être suffisante pour avoir pour résultat une inversion forte ou totale de la liaison entre la MI en particules et les billes La concentration de l'agent de libération dépend généralement de la nature de la liaison entre la MI en particules et les billes et de la nature de la MI En général, pour une MI en particules, la concentration de l'agent de libération est au moins égale à, de préférence au moins 10 fois plus grande que, la concentration des

sites ioniques ou hydrophobes sur la MI en particules.

Il est important de choisir l'agent de libération en fonction de la nature de la MI de manière à réduire au minimum ou éviter une altération de la MI après libération de l'ensemble MI-billes, notamment lorsqu'une MI

en particules telle que des cellules ou des micro-organis-

mes est impliquée. Une fois la MI libérée de l'ensemble MI-billes, elle peut être utilisée de la manière désirée Par exemple, la MI libérée peut être examinée pour déterminer la présence d'un signal détectable en rapport avec la quantité d'un analyte dans l'échantillon En général, un marqueur est utilisé, initialement ou bien dans une étape ultérieure de détection La MI en particules libérée peut être constituée de cellules qui peuvent être utilisées de la manière désirée Par exemple, la MI en particules libérée peut être constituée d'hématies ou de micro-organismes Si une détection de cellules ou de micro-organismes est désirée, il est possible d'utiliser un agent qui est incorporé à la membrane de la matière à détecter, tel qu'un colorant Par exemple, des colorants d'intercalation tels que des colorants du type squarate ou des colorants du type

cyanine, etc, peuvent être utilisés.

Un aspect important du procédé conforme à la présente invention est qu'il est possible de séparer une ou

plusieurs matières, parmi un ensemble de matières intéres-

santes, des constituants insolubles présents dans un milieu Cela peut être effectué en utilisant des séries de billes de diamètres différents ou de densités différentes, ou bien de diamètres et de densités différents Chaque série de billes possède une affinité de liaison, qu'elle soit spécifique ou non spécifique, de la manière décrite ci- dessus, pour l'une des matières intéressantes Le procédé est mis en oeuvre de la manière décrite ci-dessus et les séries différentes de billes forment chacune un agrégat distinct, séparé, dans un ou plusieurs milieux utilisés dans la séparation Les agrégats distincts sont séparés et traités de la manière précitée pour déterminer

une seule matière intéressante.

Une application du procédé de la présente invention est la séparation de micro-organismes de débris solides tels que, par exemple, la séparation de micro- organismes d'un échantillon de mucosités cervicales Dans le procédé, en utilisant des mucosités cervicales à titre d'exemple et non à titre limitatif, un échantillon de mucosités cervicales est mélangé dans un milieu aqueux à des billes dans des conditions permettant la liaison spécifique des billes aux micro-organismes intéressants

pour former un ensemble micro-organismes-billes Les micro-

organismes portent un antigène sur leur surface Les billes portent un anticorps, contre un tel antigène, lié à leur surface, ce qui a pour résultat la liaison spécifique entre les micro-organismes et les billes Le milieu aqueux est

choisi de manière à être moins dense que l'ensemble micro-

organismes-billes, mais d'une densité supérieure à celle

des autres constituants insolubles présents dans le milieu.

Puis le milieu est soumis à une force centri-

fuge pour provoquer la séparation de l'ensemble micro-

organismes-billes des constituants insolubles présents dans le milieu, ce qui permet la séparation des composés insolubles, par exemple par décantation, pipetage, etc. L'ensemble micro-organisme-billes séparé peut ensuite être traité pour libérer le micro-organisme de la

bille, de la manière décrite ci-dessus.

La présente invention peut être appliquée à des analyses destinées à un analyte dans un échantillon suspecté de contenir l'analyte L'analyte est un membre pls L'analyte peut être une MI en particules ou non en particules et peut former un ensemble MI-billes par liaison à une bille au moyen d'un membre pîs complémentaire qui est lié ou se lie à la bille L'analyte, ou bien une substance dont la présence est liée à la présence de l'analyte, telle que, par exemple, un antigène éliminé de la surface d'une cellule, un membre pis réciproque de l'analyte, etc, peut constituer la MI Dans l'analyse, l'échantillon est mélangé habituellement, dans un milieu aqueux, à un membre pls complémentaire de l'analyte Au moins un composé, parmi l'analyte et le membre pis complémentaire, est une MI capable de se lier à des billes qui sont ajoutées au milieu

pour former un ensemble MI-billes.

De préférence, avant mise en contact avec l'échantillon, le milieu aqueux peut être traité de manière

à ajuster sa densité, puis, ou après contact avec l'échan-

tillon, le milieu aqueux est mis en contact avec un second milieu ayant une viscosité supérieure à celle du milieu aqueux conforme à la présente invention Après la liaison de la MI aux billes, le milieu est alors soumis à une force centrifuge suffisante pour séparer l'ensemble MI- billes des autres constituants présents dans l'échantillon L'analyse fait intervenir habituellement un système engendrant un signal destiné à la production d'un signal détectable en rapport avec la quantité d'analyte dans l'échantillon Le système engendrant un signal comprend habituellement un membre pis marqué L'ensemble MI-billes, habituellement après séparation de la partie du milieu contenant les autres constituants, peut en outre n'être mélangé à aucun des, ou bien être mélangé à un ou plusieurs, membres du système engendrant un signal Ce dernier peut être soumis à un examen pour mettre en évidence un signal détectable Une telle détermination peut nécessiter l'addition de tous les membres restants du système engendrant un signal, non ajoutés précédemment En variante, l'ensemble MI-billes peut être traité pour séparer la MI de la bille avant d'effectuer un examen pour déterminer la présence d'un signal détectable Une fois la MI séparée des billes, la MI peut être examinée pour déterminer la présence d'un signal détectable engendré en rapport avec laquantité d'analyte dans l'échantillon Cette dernière voie peut être appliquée de la manière la plus avantageuse à une MI en particules A cette fin, la MI peut être mélangée à n'importe quels membres restants du système engendrant un signal, non ajoutés précédemment, afin d'engendrer un signal détec-

table.

Le procédé permet une concentration et une séparation rapides de substances à analyser ou à détecter dans des fluides qui peuvent inhiber la croissance ou interférer d'une autre manière avec la détection D'autres procédés de séparation tels que, par exemple, ( 1) la séparation de micro-organismes de débris solides par liaison à des billes et centrifugation en l'absence d'un milieu à haute densité, ou ( 2) la séparation de matières non constituées de particules d'autres solutés par liaison de la matière à des billes et centrifugation, sans l'utilisation d'une seconde couche de liquide qui est dépourvue de l'échantillon, ne permettent pas de parvenir à une bonne séparation Le procédé présente un avantage non seulement pour la mise en oeuvre d'une analyse destinée à la matière à séparer, mais également pour la séparation d'un type de cellules d'un mélange de cellules tel que, par exemple, un hybridome produisant un anticorps spécifique, d'autres hybridomes à des fins de préparation d'anticorps purs Ainsi, par l'utilisation de billes lourdes qui ne sont pas notablement plus volumineuses que les cellules à séparer, telles que des sols d'or ou des particules de

silice, la liaison non spécifique se produisant habituelle-

ment dans la séparation de cellules par lavage peut être réduite au minimum Le procédé peut également être appliqué à la séparation de cellules métastatiques et de lymphocytes T des cellules de moelle osseuse pour une transplantation, pour éviter la réapparition d'une tumeur ou pour effectuer

une greffe contre la maladie de l'hâte.

La présente invention a également pour objet une composition comprenant ( 1) un milieu aqueux contenant des billes auxquelles est liée une matière intéressante

(ensemble MI-billes), le milieu ayant une densité in-

férieure à celle de l'ensemble MI-billes et supérieure à celle des autres constituants insolubles présents dans le milieu Cette composition peut comprendre en outre un second milieu ayant une densité au moins égale et une viscosité supérieure à celles du milieu aqueux En variante, la composition peut comprendre ( 1) un milieu aqueux contenant un ensemble MI-billes et ( 2) un second milieu liquide ajouté sous forme de couche au milieu aqueux, le second milieu ayant une densité inférieure à celle de l'ensemble MI-billes mais supérieure à celle des autres constituants insolubles présents dans le milieu aqueux En variante, dans la composition de la présente invention, les billes peuvent comprendre une MI liée à un membre pls fixé à ces billes ou bien les billes peuvent être liées à une MI par l'intermédiaire d'un réactif polyionique. Pour des raisons de commodité, les réactifs destinés à la mise en oeuvre d'une séparation conforme à la

présente invention peuvent être fournis à l'état condi-

tionné dans un kit, en des quantités prédéterminées pour l'utilisation dans une telle séparation Les constituants du kit peuvent être conditionnés séparément ou bien un ou plusieurs constituants du kit peuvent être conditionnés ensemble suivant l'interréactivité de ces constituants Le kit peut comprendre des billes, des moyens pour produire un milieu liquide de haute densité et des moyens pour produire un milieu de viscosité supérieure à celle du milieu liquide Le kit peut comprendre en outre des moyens pour

provoquer la liaison des billes à une matière intéressante.

Par exemple, les billes peuvent porter un membre pls, lié en surface Le membre pls est complémentaire d'une MI et fournit des moyens pour la liaison de la MI aux billes Le kit peut comprendre un réactif polyionique pour la liaison d'une MI en particules aux billes En outre, un agent de libération peut être incorporé pour la libération de la MI

en particules des billes.

Pour des analyses, le kit peut comprendre (a) un membre pls complémentaire de l'analyte, (b) des billes auxquelles est lié un membre pîs, membre pîs qui est complémentaire du membre pls ou de l'analyte En variante, le kit peut comprendre des billes chargées et un réactif polyionique ayant une charge opposée à celle de la MI en particules lorsque toutes les particules possèdent la même charge En outre, le kit peut comprendre un agent de libération destiné à inverser la liaison entre les particules Le kit peut comprendre également des réactifs destinés à engendrer un signal en rapport avec la quantité d'analyte dans l'échantillon Des agents accessoires

peuvent être incorporés si nécessaire.

EXEMPLES

La présente invention est décrite plus en détail par les exemples illustratifs suivants Toutes les parties et tous les pourcentages mentionnés dans la

présente invention sont exprimés en volume, sauf spécifica-

tion contraire Les températures sont mentionnées en degrés

centigrades ( O C).

MATERIELS ET METHODES

La souche K-12 de Escherichia coli, ATCC 10798, a été utilisée pour toutes les expériences décrites Les bactéries ont été cultivées sur des plaques de gélose trypticase-soja (GTS) pendant une nuit à 370 C dans un incubateur renfermant 5 % de C 02 Les bactéries ont été mises en suspension dans 1 ml de sérum physiologique tamponné avec un phosphate (STP), à p H 7,5, et ont été lavées par centrifugation dans une microcentrifugeuse pendant 2 minutes à température ambiante Le culot bactérien a été remis en suspension à 109 UFC/ml dans du STP, à p H 7,5, contenant 1 % de SAB (en poids/volume) et pg/ml d'anti-E coli polyclonal de lapin (DAKO), et les cellules ont été mises à incuber pendant 30 minutes à température ambiante Les bactéries ont été centrifugées de la manière décrite ci-dessus et lavées trois fois en utilisant du STP à 1 % de SAB, à p H 7,5, pour éliminer

l'anticorps de lapin non lié en excès.

Liaison d'or colloïdal Les bactéries revêtues d'anticorps ont été mises à incuber dans 100 Ml de STP 1 % de SAB, à p H 7,5, contenant des conjugués anti-Ig G de

lapin (de chèvre) or colloïdal ( 1012 à 1013 parti-

cules/ml) de différentes dimensions (diamètres des particules égaux à 5, 20 et 30 nm) Après remise en suspension des bactéries dans le réactif à l'or colloïdal, les cellules ont été mises à incuber à TA pendant 30 à

minutes.

Liaison de particules de silice de 4 m: Les bactéries revêtues d'anticorps ont été mises à incuber dans Ml de STP 1 % de SAB, à p H 7,5, contenant des particules de 4 gm d'anti-Ig G de lapin (de chèvre) silice ( 3,6 x 107/ml) Après mise en suspension des bactéries dans la suspension de particules de silice, l'échantillon a été mélangé sur un agitateur rotatif par secousses à TA pendant

un temps de 15 à 60 minutes.

Une solution de réserve de Percoll O (SIGMA Chemical Company, St Louis, MO) a été préparée en diluant le Percoll disponible dans le commerce au moyen de saccharose 2,5 M en un rapport de 9:1 Cette solution de réserve de Percoll a été introduite à la pipette dans des tubes Oak Ridge et les gradients ont été centrifugés dans une centrifugeuse Sorvall RC-5 B à 12 500 tr/min pendant minutes à 20 OC Des billes Density Marker (Pharmacia, Piscataway, N J) ont été utilisées pour étalonner visuellement les gradients Pour des mesures directes de la densité des gradients, immédiatement après centrifugation, des portions aliquotes de 0,25 ml ont été prélevées successivement à la partie supérieure du gradient en utilisant une pipette à déplacement positif et ont été pesées sur une balance Mettler La pipette a été étalonnée en utilisant de l'eau distillée et les densités ont été

calculées directement.

Une solution de réserve de Nycodenz (Nycomed, Oslo, Norvège) a été préparée en dissolvant la substance

solide dans de l'eau distillée et en ajustant le p H à 7,5.

La solution de réserve a été diluée à 55,5 % (en poids/vo-

lume) pour produire des solutions ayant différentes masses volumiques ( 1, 2 à 1,3 g/ml) et de la polyvinylpyrrolidone (PVP) ( 90 K) a été ajoutée à une concentration finale de 1 mg/ml 2 ml de la solution de Nycodens/PVP ont été introduits au fond de tubes Oak Ridge et les échantillons contenant des particules (or ou silice) et des bactéries ont été recouverts de 0,5 ml de STP et les tubes ont été centrifugés de la manière décrite ci-dessus pour les

gradients de Percoll.

Pour les gradients dans lesquels les bactéries viables ont été estimées dans les différentes fractions du

gradient, des fractions de 1 ml ont été prélevées succes-

sivement à la partie supérieure du tube renfermant les gradients, diluées en série dans du STP (dilutions au dixième), suivant les besoins, et des échantillons de 1 ml ont été déposés sur des plaques de GTS préalablement séchées Les plaques ont été mises à incuber à 370 C pendant une nuit et les colonnes visibles ont été comptées le jour suivant pour déterminer le nombre d'unités formant des

colonies (UFC).

Pour l'analyse de l'ADN, des échantillons ont été lysés dans une solution à 1 % de SDS contenant du Tris m M, à p H 8,0, de l'EDTA 10 m M, 250 gg/ml de Protéinase K et ont été mis à incuber à 500 C pendant 30 minutes Cela a permis la solubilisation de la plus grande partie des débris cellulaires et l'ADN a été dosé par le procédé au bisbenzimidazole en utilisant un minifluorimètre Hoefer TKO, Cesarone et collaborateurs, Anal Biochem 100:188-197 ( 1979) De l'ADN Lambda, sans coupure, a été utilisé comme substance de référence pour l'étalonnage du fluorimètre. Du sang entier qui était relativement frais (âgé de moins d'une semaine) a été lysé en utilisant un ISOLATOR (du Pont) pendant un temps de 5 à 10 minutes et de 1 'EDTA a été ajouté à une concentration finale de 5 m M. Cet échantillon de sang lysé a été utilisé pour des expériences dans lesquelles la séparation des bactéries de constituants du sang lysé a été contrôlée Habituellement, dans ces cas 50 % (en volume/volume) de l'échantillon

consistaient en sang lysé.

RESULTATS

La densité des bactéries est accrue par liaison à de l'or colloïdal A Gradients de Percoll Des cellules de E coli ont été revêtues d'anticorps de lapin et traitées avec des particules d'or colloïdal portant de l'antiIg G de lapin (de chèvre); des particules d'or colloïdal de 5, 20 et 30 nm ont été utilisées pour accroître la densité des bactéries, et des gradients de Percoll (masse volumique de départ = 1,124 g/ml) ont été utilisés pour séparer les particules d'or colloïdal en excès des cellules de E coli revêtues d'or colloïdal Les gradients de Percoll ont été examinés

visuellement Plusieurs points méritent d'être notés.

1 La densité des bactéries est accrue par liaison de particules d'or colloïdal aux cellules Les E. coli qui n'ont pas été traités avec le conjugué d'or colloïdal ou ne possédaient pas d'anticorps de lapin lié à leur surface se sont rassemblés en bande à la partie supérieure du gradient, tandis qu'une liaison avec de l'or colloïdal a provoqué le rassemblement des bactéries en

bandes à des positions situées à l'intérieur du gradient.

2 Lorsque les dimensions des particules d'or colloïdal utilisées pour la liaison aux bactéries ont été accrues, la densité apparente des bactéries a été également accrue; des bactéries revêtues de particules de 5 nm sont apparues sous forme d'une bande hétérogène avec des masses volumiques allant de 1,119 à 1,121 g/ml; des bactéries revêtues de particules de 20 nm sont apparues sous forme d'une bande à 1,152 g/ml, tandis que des bactéries revêtues de particules de 30 nm sont apparues sous forme d'une bande

à une masse volumique supérieure à 1,16 g/ml Les par-

ticules d'or colloïdal en excès ont été entraînées au fond

des tubes au cours de la centrifugation.

3 Un étalonnage des densités du gradient de Percoll a été élaboré et il a montré que les bactéries revêtues de particules de 5 nm étaient présentes dans une zone superficielle du gradient, tandis que les bactéries revêtues de particules de 20 et 30 nm étaient situées vers

le fond du gradient (figure 1).

B Gradients de Percoll-diatrazoate Pour parvenir à des déterminations plus précises des densités des cellules de E coli revêtues de particules d'or colloïdal de 20 et 30 nm, des séparations ont été effectuées dans du Percoll contenant du diatrazoate de sodium (Hypaque) ayant une masse volumique de départ de 1,19 g/ml Lorsque les dimensions de l'or colloïdal ont augmenté, la densité a augmenté Des cellules de E coli revêtues de particules de 5 nm sont apparues sous forme d'une bande à 1,1377 g/ml, tandis que des particules de 20 nm ont donné des masses volumiques de 1, 1907 et 1,2023 g/ml; des particules de 30 nm ont donné des masses

volumiques de 1,1963 à 1,2173 g/ml L'étalonnage gravimé-

trique de densité des gradients de Percoll-diatrazoate est

représenté sur la figure 2.

C Gradients de Percoll Des cellules de E coli ont été revêtues d'anticorps de lapin et traitées avec des particules d'or portant de l'anti-Ig G de lapin (de chèvre) Des gradients de Percoll (masse volumique de départ = 1,124 g/ml) ont été utilisés pour séparer les bactéries libres Les gradients ont été fractionnés et les fractions ont été étalées en plaques pour déterminer la position des bactéries Les

* résultats sont présentés sur le tableau 1.

TABLEAU 1

CAPTURE BACTERIENNE DANS UN TAMPON

SEPARATION PAR DES GRADIENTS DE PERCOLL

% DE BACTERIES

FRACTION +AB:+OR -AB:+OR

A (SOMMET) O 69,6

B O 17,2

C O 1,2

D 8,4 5,3

E (CULOT) 91,6 7,3

N = 2

MOYENNES DES ESSAIS EN DOUBLE

LA DENSITE DES BACTERIES EST ACCRUE PAR LIAISON A DES

PARTICULES DE SILICE DE 4 unm

A GRADIENTS DE PERCOLL

Des cellules de E coli ont été revêtues d'anticorps de lapin et traitées avec des particules de silice portant de l'anti-Ig G de lapin (de chèvre) Des gradients de Percoll (masse volumique de départ = 1,124 g/ml) ont été utilisés pour séparer les bactéries libres des particules de silice (masse volumique -1,4 g/ml) Les gradients ont été fractionnés et les fractions ont été étalées en plaques pour déterminer la position des bactéries Les résultats sont présentés sur le

tableau 2.

La densité des bactéries a été accrue par liaison à des particules de silice Les E coli qui n'ont pas été traités avec la silice ou qui ne portaient pas d'anticorps de lapin lié à leur surface se sont rassemblés en bande à la partie supérieure du gradient, tandis que la liaison à la silice a provoqué le rassemblement des bactéries sous forme d'un culot à la partie inférieure du gradient.

TABLEAU 2

CAPTURE BACTERIENNE AU MOYEN DE SILICE

SEPARATION DANS DU PERCOLL

% DE BACTERIES

FRACTION N' +AC -AC

1 (SOMMET) 10,7 80,0

2 6,8 13,0

3 0,7 2,0

4 5,7 O

5 (FOND) 76,0 4,4

Des couches de liquide de densité supérieure à 1,23 provoquent le flottement de débris cellulaires dérivés du sang Les résultats obtenus cidessus montrent que le marquage de E coli avec des particules d'or colloïdal de nm peut accroître la masse volumique des bactéries à une

valeur supérieure à 1,2 g/ml.

Du sang entier a été lysé en utilisant un tube ISOLATOR (du Pont de Nemours Company, Wilmington, Delaware) et le sang lysé a été appliqué en couche à la partie supérieure d'une strate de Nycodenz de volume égal, à différentes densités Puis ce tube a été soumis à une centrifugation et l'aspect du tube a été examiné La centrifugation du sang lysé sur une strate de densité égale à 1,0 a eu pour résultat un volumineux culot de débris cellulaires dérivés du sang L'accroissement de la densité du milieu liquide à une valeur supérieure à 1,23 a provoqué

la persistance des débris cellulaires à la partie supé-

rieure de la strate L'analyse de l'ADN du culot a montré que plus de 95 % de l'ADN présent dans l'échantillon initial étaient absents dans le culot après centrifugation

dans le milieu de masse volumique supérieure à 1,23 g/ml.

DES COUCHES DE LIQUIDES DE DENSITE EGALE A 1,2 PERMETTENT

LE RASSEMBLEMENT EN UN CULOT DE BACTERIES MARQUEES A L'OR

DANS DES STRATES DE NYCODENZ

Des cellules de E coli ont été revêtues d'anticorps de lapin et traitées avec des particules d'or colloïdal ( 30 nm) portant de l'anti-Ig G de lapin (de chèvre) Des strates de Nycodenz ont été utilisées pour

séparer les bactéries libres des particules d'or colloïdal.

Le gradient de Nycodenz a été fractionné et les fractions ont été étalées en plaques pour déterminer la position des

bactéries Les résultats sont présentés sur le tableau 3.

La densité des bactéries a été accrue par liaison à des particules d'or colloïdal de 30 nm Les E. coli qui n'ont pas été traités à l'or colloïdal ou qui ne possédaient pas d'anticorps de lapin lié sur leur surface n'ont pas pénétré dans la strate de Nycodenz, tandis que la liaison avec de l'or colloïdal a provoqué le rassemblement des bactéries en un culot au fond du gradient; plus de 93 % des bactéries ont été capturés et séparés efficacement

au fond du tube (tableau 3).

A.

TABLEAU 3

CAPTURE BACTERIENNE DANS UN TAMPON

SEPARATION PAR DES STRATES DE NYCODENZ

% DE BACTERIES

FRACTION +AC:+OR +AC:+OR -AC:+OR -AC:+OR

A (SOMMET) 1,5 0,5 76 76

B 0,4 3,7 18,2 18,4

C 1,1 -0 1,8 2,1

D 3,4 0,5 O 0,8

E (CULOT) 93,5 95,3 3,9 2,9

STRATES DE 4 ml DE NYCODENZ (masse volumique égale 1,2 g/ml)/1 mg/ml de PVP ( 90 K) ECHANTILLON EN UN VOLUME DE 1 ml

DES COUCHES DE LIQUIDE DE DENSITE EGALE A 1,3 PERMETTENT LE

RASSEMBLEMENT EN UN CULOT DE BACTERIES LIEES A DE LA SILICE

DANS DES STRATES DE NYCODENZ

Des cellules de E coli ont été revêtues d'anticorps de lapin et traitées avec des particules de silice portant de l'anti-Ig G de lapin (de chèvre) en la présence et en l'absence de 50 % de sang lysé Des strates de Nycodenz ont été utilisées pour séparer les bactéries libres des particules de silice (masse volumique 1,4 g/ml) Le gradient de Nycodenz a été fractionné et les fractions ont été étalées en plaques pour déterminer la position des bactéries Les résultats sont présentés sur le

tableau 4.

La densité des bactéries a été accrue par liaison à des particules de silice Les E coli qui n'ont pas été traités avec la silice ou qui ne possédaient pas d'anticorps de lapin lié à leur surface n'ont pas pénétré dans la strate de Nycodenz (masse volumique = 1,3 g/ml), tandis que la liaison à de la silice a provoqué le rassemblement des bactéries en un culot au fond du gradient Comme le montre le tableau 4, plus de 98 % des bactéries ont été capturées par la silice et séparées des constituants du sang au moyen de Nycodenz de densité égale

à 1,3.

TABLEAU 4

CAPTURE BACTERIENNE AU MOYEN DE SILICE

SEPARATION DANS 50 % DE SANG LYSE, EN PRESENCE DE NYCODENZ

% DE BACTERIES

FRACTION +AC:+SILICE +AC:+SILICE -AC:+SILICE -AC:+SILICE

1 (SOMMET) 0,4 1 90,7 85,2

2 0,4 0,5 5,3 4,1

3 (FOND) 99,2 98,6 4 10,7

L'invention décrite dans le présent mémoire permet une séparation simple, efficace et totale d'une matière intéressante d'autres constituants présents dans un échantillon Un avantage important de la présente invention est qu'il peut se produire un lavage de la matière intéressante, dépourvue d'autres constituants, au cours du passage d'un milieu à un autre milieu de plus haute densité

et/ou de plus forte viscosité.

Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées

sans sortir de son cadre.

Claims (10)

REVENDICATIONS

1 Procédé de séparation d'une matière intéressante (MI) d'un mélange contenant la MI et des constituants insolubles, caractérisé en ce qu'il consiste: à provoquer la liaison à une bille dans un milieu aqueux de ladite MI présente dans le mélange (ensemble MI-billes), à produire une composition liquide constituée dudit milieu aqueux et dudit ensemble MIbilles, dans laquelle la densité dudit ensemble MI-billes est supérieure à celle de ladite composition liquide, et la densité d'au moins une partie de ladite composition liquide est supérieure à celle desdits constituants insolubles; et à soumettre ladite composition liquide à une

force centrifuge suffisante pour séparer ledit ensemble MI-

billes desdits constituants insolubles.

2 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la matière intéressante est choisie dans le groupe comprenant des micro-organismes, des cellules, des organites, des agrégats moléculaires, des

acides nucléiques et des ligands.

3 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le mélange est choisi dans le groupe comprenant des échantillons biologiques, des produits

alimentaires et des produits médicamenteux.

4 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la bille est choisie dans le groupe comprenant des billes renfermant des métaux lourds, des billes de latex, des billes de silice, des billes de verre,

des billes de polyol et des billes de polyacrylamide.

Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la composition liquide consiste en ledit milieu aqueux, qui est amené à avoir une densité supérieure à celle des constituants insolubles mais inférieure à celle de l'ensemble MI-billes par utilisation d'un soluté de haute densité comme constituant dudit milieu aqueux. 6 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la composition liquide comprend le milieu aqueux recouvert d'une couche d'un milieu de plus forte viscosité que celle du premier milieu liquide, et au moins aussi dense que ce premier milieu liquide, avant que ladite composition liquide soit soumise à une force centrifuge. 7 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu aqueux est recouvert d'une couche d'un second milieu qui est plus dense que ledit

milieu aqueux.

8 Procédé de séparation d'une matière intéressante (MI) d'un mélange contenant la MI et d'autres constituants, caractérisé en ce qu'il consiste à provoquer la liaison de ladite MI à une bille (ensemble MI- billes) dans un milieu aqueux, ledit milieu aqueux ayant, ou étant amené ultérieurement à avoir, une densité inférieure à celle dudit ensemble MI- billes mais supérieure à celle de n'importe lequel desdits autres constituants qui sont insolubles dans ledit milieu; et à soumettre ledit milieu à une centrifugation pour provoquer le rassemblement dudit ensemble MI-billes dans une zone, à l'intérieur ou à l'extérieur dudit milieu, séparée desdits autres constituants, sous réserve que, lorsque ces autres constituants sont solubles, ledit ensemble MI-billes est amené à se rassembler à l'extérieur

dudit milieu.

9 Kit, caractérisé en ce qu'il comprend un conditionnement renfermant, en association (a) des billes, (b) des moyens pour produire un milieu liquide de forte viscosité ou de haute densité, et (c) des moyens pour produire un milieu aqueux ayant une viscosité ou une densité inférieure à celle du milieu liquide du

paragraphe (b).

10 Kit suivant la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens pour provoquer la liaison des billes à une matière intéressante, de préférence un membre d'une paire à liaison spécifique conjugué à un marqueur. 11 Composition, caractérisée en ce qu'elle comprend: (a) un milieu aqueux contenant des billes

auquel est liée une matière intéressante (ensemble MI-

billes), la densité dudit milieu étant inférieure à celle dudit ensemble MI-billes mais supérieure à celle des autres

constituants insolubles dudit milieu.

12 Composition suivant la revendication 11, caractérisé en ce qu'elle comprend en outre un second milieu liquide, ayant une densité inférieure à celle de l'ensemble MI-billes, en contact mais pratiquement sans

mélange avec le milieu aqueux.

13 Composition suivant la revendication 12, dans laquelle le second milieu liquide possède une densité au moins égale et une viscosité supérieure à celles du

milieu aqueux.

14 Procédé pour effectuer une analyse d'un analyte, caractérisé en ce qu'il consiste: à provoquer la liaison dudit analyte, ou d'une substance dont la présence est en rapport avec la présence dudit analyte, à une bille (ensemble A-billes) dans un milieu aqueux, ledit milieu aqueux ayant, ou étant amené ultérieurement à avoir, une densité inférieure à celle dudit ensemble A-billes mais supérieure à celle de n'importe quels autres constituants qui sont insolubles dans ledit milieu; à soumettre ledit milieu à une centrifugation pour provoquer le rassemblement dudit ensemble A-billes dans une zone, à l'intérieur ou à l'extérieur dudit milieu, séparée desdits autres constituants, sous réserve que, lorsque ces autres constituants sont solubles, l'ensemble A-billes est amené à se rassembler à l'extérieur dudit milieu; et

à détecter ledit analyte ou ladite substance.

Procédé suivant la revendication 14, caractérisé en ce que l'analyte ou la substance est détectée au moyen d'un système engendrant un signal, ledit système engendrant un signal comprenant de préférence un marqueur.