JPS62190466A - 粒子分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ この発明は、磁場勾配を用いることにより物質、通常は
粒子を流体媒質から分離する方法に関する乙のである。

この発明は、生物体液、例えば血液、リンパ液、尿、細
胞培養物等からの細胞分離に特に適用性を有する。

生物体液、例えば血清または尿の試料中における分析質
の存在または量を測定するための多くの技術が知られて
いる。これらの技術で最も一般的なのはインビトロアッ
セイ方法である。これらの技術の多くは、測定するべき
分析質およびこのような分析質の標識（された）類似体
の、特異的受容体例えば抗体の結合部位への競合的結合
をともなう。これらの技術の多くは、非結合標識類似体
を結合（した）標識類似体から分離し、そして結合また
は非結合類似体において標識により生じたングナルにつ
いて検査する分離段階を含む。ングチルは、試料中の分
析質の量に関連して生産される。

結合または非結合フラクションを分離する技術がいくつ
か知られている。例えば、結合および遊離フラクション
の示差泳動、例えば、クロマト電気泳動、ゲル濾過等、
例えば有機溶媒、塩、酸等による結合または遊離フラク
ションの化学的沈殿およびこれに続く濾過または遠心分
離、例えば二重抗体技術による結合フラクションの免疫
学的沈殿およびこれに続く濾過または遠心分離、例えば
木炭、シリケート類、樹脂等の選択吸着媒質への結合ま
たは遊離フラクションの吸着、磁気分離技術などを用い
ることができる。

一般に磁気分離法は２種の総括的カテゴリーに分類され
る。分離される物質が本質的に磁性を帯びている場合の
分離法が存在する。他方、磁気反応体を近づけることに
より混合物の１種またはそれ以上の成分に磁性を帯びさ
せることができる。

生化学的分離の場合、興味の対象である物質は一般に充
分には磁性を帯びていないため、抗体、レクチンおよび
他の標的粒子と結合した磁性粒子がこれらの物質の多く
を単離する為に用いられてきた。特異的粒子に対して標
的とされた磁性粒子もまた様々なイムノアッセイに用い
られている。

イムノアッセイで用いられる分離技術の多くは比較的長
くて複雑な方法である。このような方法を用いるとオペ
レーターの効率は低下し、処理量は減少し、試験コスト
は高くつく、迅速で簡単な他の分離技術の場合、結合お
よび遊離フラクションを充分には識別しないため、イム
ノアッセイには不適であるかまたは限られた数の試験に
のみ用いられ得る。

２、関連技術の記載 磁性反応性で、透過性で、固体で水に難溶性のミクロ粒
子を用いた。生物体液における物質（例、薬剤、ホルモ
ン、ビタミンおよび酵素）の濃度測定方法が米国特許第
４１１５５３４号に開示されている。塩化第一鉄および
塩化第二鉄からなる混合物を含む酸性水溶液にキトサン
のようなムコ多糖類を溶かすことにより生成される官能
性磁性粒子が米国特許第４２８５８１９号に開示されて
いる。ミクロスフイアを用いてキレート形成により廃水
流から溶解したイオンを除去することができる。米国特
許第３９３３９９７号では、抗ジゴキノン抗体を磁気反
応性粒子と結合させる、ジゴキシンの固相ラジオイムノ
アッセイが記載されている。米国特許第３９７０５１８
号の場合、抗体層で被覆された小磁性粒子を用いること
により特殊生物および細胞をその集合体から選別および
分離するための大きな、そして広く分布した表面領域が
もたらされる。米国特許第４０１８８８６号の開示では
、小磁性粒子を用いて溶液から特殊蛋白質を分離するた
めの大きくて広い分布した表面領域を得ることにより特
殊蛋白質を検出することができる。特殊蛋白質と特異的
に相互反応する蛋白質で粒子を被覆する。米国特許第４
０７０２４６号は、生物活性蛋白質と共有結合し得る基
質に安定した水不溶性コーティングをほどこした組成物
について記載しているが、その結果生成物は蛋白質の生
物特性および基質の構造特性、例えば金属支持体の磁性
特性を有することになる。普通に分離可能な蛋白質−被
覆粒子の混合物を用いる診断方法が米国特許第４１１５
５３５号に記載されている。メタクリル酸および／また
はヒドロキシエヂルメタクリレートのような親水性コモ
ノマーによるアクロレインホモポリマーおよびコポリマ
ーのミクロスフイアが米国特許第４４１３０７０号に記
載されている。米国特許第４４５２７７３号は、抗体、
酵素および他の生物粒子と共有結合し得、磁場により細
胞および他の生物粒子および分子を標識および分離する
のに用いられ得る磁性鉄−デキストランミクロスフイア
を開示している。

被覆された磁化しうるミクロ粒子、その可逆性けん濁液
およびそれに関する方法が米国特許第４４５４２３４号
に記載されている。米国特許第４５２３９９６号には、
各々のイオン性ビーズが複雑に混入した強磁性物質を用
い、混合樹脂ベッドにおいてアニオン性ビーズからカヂ
オン性ビーズを分離する方法が記載されている。磁性粒
子コロイドを用いる磁気分離方法か米国特許第４５２６
６８１号に記載されている。英国特許出願ＧＢ２１５２
６ｄＡは磁気アッセイ試薬を開示している。

鉄−デキストラン粒子と抗体分子の共有結合によりつく
られた電子高密度抗体コンジュゲートがダシトン等（１
９７９年）［プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンンーズＪ（Ｐ　ｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓ　ｃｉ、）　７６　：　３
３９２−２３９６ｉこ８己載されている。イタキッンオ
ス等は、［クリニカル・ケミストリーＪ（ｃＩｉｎ。

Ｃｈｅｍ、）２３：２０７２〜２０７９（１９７７年）
でラノオアッセイにおける磁性ミクロ粒子含有蛋白質の
使用について記載している。高勾配磁性クロマトグラフ
ィーを用いる免疫特異性鉄デキストランミクロスフイア
で標識された細胞の分離は、モルディ等による（１９８
４年）「フエブスｊ（Ｆ　ＥＢＳ）１７０：２３２〜２
３８に開示されている。「ジャーナル・オブ・イミュノ
ロジカル・メソソズ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、
）５　：３５３〜３６７（１９８２年）でモルディ等は
、細胞の標識および磁性分離に用いる免疫特異性強磁性
鉄デキストラン試薬について記載している。細胞の標識
および分離における磁性ミクロスフイアの適用らまたモ
ルディ等により［ネイチュアーＪ（Ｎａｔｕｒｅ）２６
８　：’４３７〜４３８（１９７７年）に開示されてい
る。ヒトアルブミンおよび生物体液の固相フルオロイム
ノアッセイは、ナルゲラン等により（１９７８年）「ク
リ二カ・キミ力・アクタＪ（ｃ１ｉｎ、Ｃｈｉｍ、Ａｃ
ｔａ、）８９：４．５５〜４６０に記載されている。「
クリ二カ・キミカ・アクタｒＣ１ｉｎ、Ｃｈｉｍ、Ａｃ
ｔａ、）６９　：３８７〜３９６（１９７６年）でナイ
等は固相磁性粒子ラジオイムノアッセイについて開示し
ている。

［サイエンティフィック・アメリカンＪ（Ｓｃｉｅｎ、
Ａｍｅｒ、）１０：１３６−１９４（１９８３年）でロ
ーゼンバイクは磁性流体について記載している。磁性蛋
白質Ａミクロスフイアおよび細胞分離方法におけるそれ
らの用途がライラダー等により（１９７９年）［クリニ
カル・イミュノロジー・アンド・イミュノバソロジーＪ
（ｃｆｉｎ、　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、ａｎｄ　　［ｍｍｕ
ｎ。

ｐａｔｂ、）　ｌ　４　：　３９５〜４００に開示され
ている。

［発明の要約］ この発明による方法は、物質に極微小磁性粒子との結合
を起させろことにより液体媒質から物質を分離すること
を目的とする。物質が非粒子溶質として存在する場合、
普通、特異的配位子−受容体結合を通じて磁性粒子と結
合する。物質が非磁性粒子として存在する場合、結合は
特異的でもあり得ろが、通常静電気性または疎水性相互
反応のように非特異的である。次に、化学的手段を用い
ることにより磁性粒子を相互におよび普通非磁性粒子に
結合さけ、粒子のアグリゲーノヨンまたはコアグリゲー
ションをもたらす。次に、媒質に磁場勾配を与えること
により媒質から粒子を分離する。好ましくは非特異結合
は荷電相互作用により達成され、可逆性である。

この発明による方法は、有機および生化学分析質特に体
液分析における興味ある分析質のアッセイに特に適用性
を有する。特に興味深いのは、分析質が粒子表面と結合
した、または結合し得る特異的結合対（ｓｂｐ）のメン
バーである場合のアッセイである。分析質が表面成分で
あるかまたは非磁性粒子と結合している場合、この方法
は、非磁性および磁性粒子を結合し、磁性粒子の非特異
的凝集を化学的に誘発する条件下で、アッセイ媒質中で
、試料、分析質が非磁性粒子と結合するときにはこの非
磁性粒子および磁性粒子を合わせることを含む。非磁性
粒子または磁性粒子は通常ｓｂｐメンバーと結合してい
る。非磁性粒子のｓｂｐメンバーが分析質に対して相捕
的でない場合、相補ｓｂｐメンバーもまた加えられる。

次に、アッセイ媒質に磁場勾配を与えることにより媒質
から粒子を分離する。分離後、ｓｂｐメンバーの存在ま
たは量について媒質または粒子を検査するが、これは試
料中の分析質の存在により影響される。通常、ｓｂｐメ
ンバーは、試料中の分析質のｔｌに関係（比例）してシ
グナルを発するングナル発生系を用いることにより生じ
たシグナルを通じて検出される。媒質から分離された粒
子を試験前に洗浄することができる。さらに、粒子を媒
質から分離後、続いて処理することにより粒子の非特異
結合を逆行（解除）することができろ。

この発明による方法は、非磁性粒子と磁性粒子の化学的
に制御された非特異的可逆結合により媒質から非磁性粒
子を分離する方法を提供する。磁性粒子のサイズが小さ
いため、分離されるべき物質の非常に速い結合ちまたら
たらされろ。次に粒子をアグリゲートすることにより従
来の方法を用いた場合よりもかなり速くて完全な磁気分
離が達成される。

この発明は、本発明方法を行なうための、特に分析質を
含有する疑のある試料における分析質の測定アッセイを
行なうための組成物およびキットを包含する。

［実施態様の記載］ この発明は、液体媒質からけん局した粒子に結合した物
質を分離する方法に関するものである。

この方法には、磁性粒子および磁性拉千Ｈ］互の化学的
に制御された非特異結合が関与する。普通、分離される
べき物質は非磁性粒子に結合しているかまたは結合させ
られる。非磁性粒子および磁性粒子間または磁性粒子間
の非特異結合を達成するための好ましいアプローチは電
荷相互作用である。

結合した粒子は磁場勾配の使用により媒質から分離され
る。分離された粒子は洗浄され、物理的または化学的方
法により試験され得る。また粒子を処理して非特異結合
を逆行させることもできる。

非磁性粒子を用いる場合、結合逆行及遊離磁性粒子を分
離することにより磁性粒子からの非磁性粒子分離手段が
得られる。

本発明方法は、けん濁した粒子を媒質から分離する分野
、特に細胞および微生物のような生物学的物質を分離す
る分野並びにイムノアッセイおよび血液型分類の分野に
広い適用性を示す。この発明は、遠心分離、濾過および
従来の磁気分離方法より乙便利で速く、また粒子不含有
液体媒質または分離された粒子の分析を行なうことが望
まれる場合のけん温液の前処理に特に適用できる分離方
法を提供する。またこの発明は、分離段階が必要とされ
る場合の試料中の分析質アッセイに対する適用性ら打す
る。

さらに本発明の実施態様のＡ２　’ｌ’ｌ！を行なう１
１：Ｉに、若干の用語の定義を行なう。

分析質（アナライト）・・・測定されるべき化合物また
は組成物、興味ある物質。分析質は、特異的結合対（ｓ
ｂｐ）のメンバーであり得、また配位子（リガンド）で
あり得るが、これは−価または多価で、普通抗原性また
はハプテン性であり、また少なくとｔＪｌｇＩのエピト
ープまたは決定部位をノ（通にする単一化合物または複
数の化合物である。また分析質は、粒子の成分てあり得
るがまたはアッセイ中に粒子と結合し得る。粒子の成分
である分析質の例は、血液群抗原（Ａ、Ｂ、１３．Ｏｌ
Ｄ等）のような細胞表面の抗原または）Ｉ　Ｌ　Ａ抗原
である。

アッセイ中に粒子と結合する分析質の例は、相補ｓｂｐ
メンバーが、粒子、レクチンが粒子と結合している場合
糖蛋白質またはグリコリピド、プロティンＡが粒子と結
合している場合抗体などである場合のｓｂｐメンバーで
ある。分析質が粒子と結合しているときに必要な結合は
、特異的または非特異的、免疫学的または非免疫学的で
あり得る。

多価配位子分析質は普通、ポリ（アミノ酸）、すなわち
ポリペプチドおよび蛋白質、多糖類、核酸およびこれら
の組み合わせである。このような組み合わせは、細菌、
ウィルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、核、細胞
膜等の成分を含む。

分析質の幾つかの正確な性質およびその多くの例は、リ
ドマン等による米国特許第４２９９９１６号、特にカラ
ム１６〜２３に記載されている。

大抵の場合、本発明で用いられるポリエピトープ配位子
分析質は少なくとも約５０００、さらに普通は少なくと
ら約１００００の分子量を有する。

ポリ（アミノ酸）カテゴリーの場合、興味あるポリ（ア
ミノ酸）は一般に約５０００〜５００００００の分子量
、さらに侍通は約２００００〜＋００００００の分子Ｍ
を有する。興味あるホルモンの中では、分子量は普通約
５０００〜６００００分子量の範囲である。

類似した構造−ヒの特徴を有する蛋白質、特定の生物学
的機能を存する蛋白質、特異的微生物特に病気の原因と
なる微生物と関連のある蛋白質等の分類に関して広範な
種類の蛋白質が考えられ得る。

一般にモノエピトープ配位子分析質は約１００〜２００
０の分子量、さらに普通は１２５〜［０００の分子量で
ある。興味ある分析質には、薬剤、中間代謝物、農薬、
汚染物質などがある。興味深い薬剤にはアルカロイド類
が挙げられる。アルカロイド類には、モルヒネ、コディ
ン、ヘロイン、デキストロメトルファン、それらの誘導
体よ３よび中間代謝物を含むモルヒネアルカロイド類、
コカインおよびペンゾイルエクゴニン、それらの誘導体
および中間代謝物を含むコカインアルカロイド類、リセ
ルグ酸ジエチルアミドを含む麦角アルカロイド類、ステ
ロイドアルカロイド類、イミナゾイルアルカロイド類、
キナゾリンアルカロイド類、イソキノリンアルプＪロイ
ド類、キニンオ３よびキニジンを含むキノリンアルカロ
イド類、ンテルベンアルカロイド類、それらの誘導体お
よび中間代謝物がある。

次群の薬剤には、ステロイド類、例えばエストロゲン、
エストゲン、アンドロゲン、アンドレオコルチ力ルステ
ロイド、胆汁酸、強心性グリコシドおよびアグリコン、
例えばノゴキンンおよびジゴキシゲニン、サポニンおよ
びサボゲニン、それらの誘導体および中間代謝物がある
。またジエチルスチルベストロールのようなステロイド
疑似物質も含まれる。

次群の薬剤には、パルピッエート類、例えばフェノバル
ビタールおよびセコバルビタール、ジフェニルヒダント
ニン、プリミドン、エトサクノミドおよびそれらの中間
代謝物を含む、５〜６員環のラクタムがある。

次群の薬剤には、２〜３個の炭素原子を有するアルキル
を含むアミノアルキルベンゼン類、例えばアンフェタミ
ン、カテコールアミン、例えばエフェドリン、Ｌ−ドー
パ、エピネフリン、ナルセイン、パパへリンおよびそれ
らの中間代謝物がある。

次群の薬剤には、ベンズ復素環、例えばオキサゼパム、
クロルプロマジン、テグレトール、イミブラミン、それ
らの誘導体および中間代謝物があり、複素環はアゼピン
、ノアゼビンおよびフェノチアジンである。

次群の薬剤には、プリン類、例えばフオフイリノ、カフ
ェイン、それらの中間代謝物および誘導体がある。

次群の薬剤には、カンナヒノールおよびテトラヒドロカ
ンナビノールを含む、マリファナから得られたものがあ
る。

次群の薬剤には、ビタミン類、例えばＡ、Ｂ。

例えばＢ１０、Ｃ，ＤＳＥおよびに１葉酸、チアミンが
ある。

次群の薬剤には、水酸化および不飽和性の程度および部
位が異なるプロスタグランジン類がある。

次群の薬剤には、抗生物質、例えばペニシリン、クロロ
マイセチン、アンチツマイセチン、テトラサイクリン、
テラマイシン、それらの中間代謝物および誘導体がある
。

次群の薬剤には、ヌクレオシドおよびヌクレオチド、例
えば適当な糖および燐酸置換基を有するＡＴＰ、ＮＡＤ
、ＰＭＮ、アデノシン、グアノシン、チミジンおよびシ
チジンがある。

次群の薬剤には、種々雑多な個々の薬剤、例えば、メタ
トン、メブロバメート、セロトニン、メペリジン、アミ
トリブチリン、ノルトリ°ブチリン、リドカイン、ブロ
カインアミド、アセチルブロカインアミド、プロプラノ
ロール、グリセオフルビン、パルプロ酸、ブヂロフエノ
ン、抗ヒスタミン剤、抗コリンエステラーゼ剤、例えば
アトロピン、それらの中間代謝物および誘導体がある。

疾患状態と関連のある中間代謝物には、スペルミン、ガ
ラクトース、フェニルピルビン酸およびポルフィリンク
イブ１かある。

次群の薬剤には、アミノグリコンド類、例えばゲンタマ
イシン、カナマイシン、ドプラマイノンお上びアミカノ
ンがある。

興味深い農薬には、ポリハロゲン化ビフェニール類、燐
酸エステル類、チオホスフェート類、カルバメート類、
ポリハロゲン化スルフエナミド類、それらの中間代謝物
および誘導体がある。

受容体分析質の場合、分子量は一般にｔｏｏ。

Ｏ〜２ｘｌＯ’、さらに普通は１ｏｏｏｏ〜１０６の範
囲である。免疫グロブリン、ＩｇＡ、ＩｇＧ。

ＩｇＥおよびＩｇＭの場合、一般に分子量は約１６００
００〜約１０’の範囲である。酵素は通常的１００００
〜１００００００の範囲の分子量を有する。天然受容体
は広範に変化するが、一般に少なくとも約２５０００の
分子量であり、１０°またはそれ以上の分子量であり得
、例えばアビノン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、チロキンン結合グ
ロブリン、ヂロキシン結合プレアルブミン、トランスコ
ルヂン等のような物質が挙げられる。

配位子類似体または分析質類原体・・・受容体に対して
類似配位子または分析質と競合し得る修飾された配位子
らしくは配位子代用物または修飾された分析質もしくは
分析性代用物。修飾により配位子類似体または分析質類
原体を別の粒子と結合させる手段がもたらされる。普通
、配位子類似体または分析質類原体は、配位子類似体ま
たは分析質類似体をハブ（ｈｕｂ）または標識と連結す
る結合により１ｐ１以上の水素を置換する以外の点ても
配位子または分析質とは異なるが、これは必要なことで
はない。配位子代用物または分析質代用物の語は、配位
子または分析質と相捕的な受容体を非特異結合する能力
を有する化合物を意味する。すなわち、配位子代用物ま
たは分析質代用物は、配位子または分析質と同様に受容
体と結合することができる。例えば代用物は、配位子ま
たは分析質に対する抗体のイディオタイプに対する抗体
であり得る。

ポリ（配位子類似体）・・・−緒になって通常ハブ核と
兵曹結合した複数の配位子類似体。ハブ核は多官能性物
質であり、普通結合部位として複数の官能基、例えばヒ
ドロキシル、アミノ、メルカプト、エチレン基等を有す
る通常はポリマーである。ハブ咳は、水溶性または水不
溶性、好ましくは水溶性であり得、通常少なくとも約３
００００の分子量であり、ｔｏｏｏ万またはそれ以上の
分子量であり得る。ハブ核の例としては、多糖類、ポリ
ペブヂド類（蛋白質を含む）、核酸類、アニオン交換樹
脂などがある。また水に不溶性のノ＼ブ核には、容器壁
、例えばガラスまたはプラスチック、ガラスピーズ、付
加および縮合ポリマー、セファデックス（Ｓ　ｅｐｈａ
ｄｅｘ）およびアガロース（Ａ　ｇＨｒｏｓｅ）ビーズ
などがある。

特異的結合対のメンバー（Ｔｓｂｐメンバー」）・・・
表面または空洞部分に、特異的結合することにより他方
の分子の特定の空間的および極性機構と相捕的なものと
して定義される領域を有する２種の児なる分子の一方の
分子。特異的結合対の成分を配位子（リガンド）および
受容体（抗配位子、アンチリガンド）と称する。これら
は普通抗原と抗体のような免疫学的対の成分であるが、
免疫学的対ではない他の特異的結合対、例えばビデオン
とアビジン、ホルモンとホルモン受容体、核酸デュプレ
ックス、ＩｇＧとプロティンＡ、ＤＮＡとＤ　Ｎ　Ａ、
ＤＮＡとＲＮＡなどもこの発明に含まれる。

配位子（リガンド）・・・受容体が天然に存在するかま
たは製造され得る有機化合物。

受容体（「アンチリガンド」）・・・分子の特定の空間
的および極性機構、例えばエピトープまたは決定部位を
認識することができる化合物または組成物。

受容体の例には、天然受容体、例えばチロキシン結合グ
ロブリン、抗体、酵素、Ｆａｂ断片、レクチン、核酸、
プロティンＡ、補体成分Ｃ１ｑなどがある。

非磁性粒子・・普通Ｉ　Ｘ　Ｉ　Ｏ’ｅｍｕ／　Ｏｅｃ
ｍ３未満の磁化率（χ）を有する反磁性または常磁性粒
子。

一般に非磁性粒子は少なくとも約０．０２　ミクロン以
上で約１００ミクロン未満、通常少なくとも約０．０５
ミクロン以上で約２０ミクロン未満、好ましくは約０３
〜１０ミクロンの直径を有する。非磁性粒子は、有機ま
たは無機で、膨張性または非膨張性、多孔性または非多
孔性で、好ましくは水に近い密度、一般的には約０．７
〜約１．５ｇ／ｍＱであり、透明、部分的に透明または
不透明であり得る物質を成分とし得る。普通、非磁性粒
子はプラスまたはマイナスの電荷を有し、表面にｓｂｐ
成分を有し得る。通常、非磁性粒子は、細胞および微生
物のような生物学的物質、例えば赤血球、白血球、リン
パ球、ハイブリドーマ、連鎖球菌（ストレプトコッカス
）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ　ｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（エシェリ
ヒア・コリ　Ｅ、　ｃｏｌｉ）、ウィルスなどである。

また、非磁性粒子は、有機および無機ポリマー、リポソ
ーム、ラテックス粒子、リン脂質小胞、キロミクロン、
リポ蛋白質などからなる粒子でもあり得る。

通常、ポリマー（重合体）は付加また縮合ポリマーであ
る。これらに由来する非磁性粒子はアッセイ媒質に容易
に分散可能であり、また、吸着性または官能性化し得る
ものであるため直接的または間接的にｓｂｐ成分または
磁性粒子を結合できる。

非磁性粒子は、分析質であるか、分析質と結合している
か、またはアッセイ（実施）中に分析質と結合すること
が多い。最初分析質と結合していない非磁性粒子は、天
然物質、合成修飾された天然物質および合成物質から得
ることができる。特に興味深い有機ポリマーには、多糖
類、特に交叉結合した多糖類、例えばアガロース［セフ
ァロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）の名できろ市販されて
いるコ、デキストラン［セファデックス（Ｓ　ｅｐｈａ
ｄｅｘ）およびセファクリル（Ｓ　ｅｐｈａｃｒｙｌ）
として市販されているコ、セルロース、澱粉なとがある
。付加重合体には、例えばボリスヂレン、ポリビニルア
ルコール、アクリレートおよびメタクリレート誘導体の
ホモポリマーおよびコポリマー、特に遊離ヒドロキンル
官能性を存するエステルおよびアミド等がある。

アッセイで用いる非磁性粒子は普通多官能性であり、ｓ
ｂｐメンバー、例えば抗体、アヒンン、ピオチン、レク
チン、プロティンＡなどと結合してしまうかまたは特異
的非共有結合し得る。広範な種類の官能基が用いられ得
るかまたは結合され得る。官能基には、カルボン酸、ア
ルデヒド、アミノ基、ンアノ基、エチレン基、ヒドロキ
ノル基、メルカプト基などがある。広範な種類の化合物
と粒子の結合形式はよく知られており、文献に詳細に示
されている。例えばカウトレカサス、「ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリーＪ（Ｊ、１３　ｉｏ
ｌ、ｃｈｃｍ、）、２４５巻、３０５９頁（１９７０年
）参照。結合基の長さは広い範囲で変化し得、結合され
る化合物の性質、ｓｂｐメンバーおよび分析質の結合上
の結合される化合物および粒子間の距離の影響などによ
り異なる。

通常非磁性粒子はプラスまたはマイナスの電荷を有する
。粒子は、本質的に荷電し得るかまたは化学的らしくは
物理的処理により電荷を取り込み得ろ。例えば、カルボ
キシル、スルホネート、ボスフェート、アミノなどのよ
うな基は、当業界で公知の技術により粒子と化学的に結
合するかまたは粒子上に形成され得る。細胞は、通常細
胞表面にシアル酸残基が存在するため負電荷を帯びてい
る。ラテックス粒子は正または負電荷を帯び得るが、通
常、官能基の導入または荷電ポリマー例えばポリペプチ
ド、蛋白質、ポリアクリレートなどの吸収の結果負電荷
を有する。

非磁性粒子は、蛍光性または非蛍光性であり得、普通は
非蛍光性であるが、直接蛍光化されるかまたは蛍光化合
物もしくは蛍光剤を常法で粒子と結合させることにより
蛍光性となり得る。普通、蛍光剤を溶かし入れるかまた
は非磁性粒子と共有もしくは非共有結合させ、実質的に
均等に粒子に結合させることが多い。蛍光化されたラテ
ックス粒子は米国特許第３８５３９８７号に記載されて
おり、コバレント・テクノロジー社からコバスフイア（
ｃｏｖａｓｐｈｅｒθ）として市販されている。

興味深い蛍光剤は、一般に約３５０　ｎｍ、普通的４０
０ｎｍおよび好ましくは約４５０ｎｍの波長の光を放射
する。望ましくは、蛍光剤は高い虫干収率、大きなスト
ークンフトを有し、またフンシュゲートおよび使用条件
下化学的に安定している。蛍光剤の語は、電磁放射によ
る活性化または化学的活性化の際に光を放射する物質を
含むものとし、蛍光性および燐光性物質、シンデレータ
ーおよび化学光物質か含まれる。

興味ある蛍光剤は、ある種の１次官能性を有する様々な
カテゴリーに分類される。これらの１次官能性には、ｌ
−および２−アミノナフタレン、ｐ、ｐ−ジアミノスチ
ルベン類、ピレン類、第４級フェナントリジン塩類、９
−アミノアクリジン類、ｐ、ｐ’−ジアミノスチルベン
類、イミン類、アントラセン類、オキサカルボシアニン
、メロンアニン、３−アミノエキレニン、ペリレン、ビ
ス−ベンズオキサゾール、ビス−ｐ−オキサゾリルベン
ゼン、１．２−ベンゾフェナジン、レチノール、ビス−
３−アミノピリジニウム塩類、ヘレブリゲニン、テトラ
サイクリン、ステロフェノール、ヘンズイミダゾリルフ
ェニルアミン、２−オキソ−３−クロメン、インドール
、キサンチン、７−ヒトロキシクマリン、４．５−ヘン
ズイミダゾール、フェノキサジン、サリチレ−１・、ス
トロファンデシン、ポルフィリン類、トリアリールメタ
ン類、フラピン並びに希土類元素ギレート酸化物および
塩がある。蛍光剤の例は米国特許第４３１８７０７号カ
ラム７および８にりｌ挙されているが、この内容を引用
して説明の一部とする。またスクアライン染料ら蛍光剤
として有用であり、１９８５年９月６日出顎の米国特許
出願第７７３４０１号（これは、１９８５年９月６日の
優先権主張の１９８６年９月５日出願されたヨーロッパ
特許出願第８６３０６８５９．９、日本特許出願第２１
０５１６／１９８６号、オーストラリア特許出願第６２
３６５号およびカナダ特許出願に対応するもので、発明
の名称は［スクアレート染料を用いた新規配位子受容体
アソセ仁で当社の表示番号（゛よ２５２００である）に
記載されている。この関連文献は、スクアレート染料お
よび特異的結合対（ｓｂｐ）のメンバーの新規コンジュ
ゲートを開示しており、これらは特異的結合対メンバー
分析質を含む疑のある試料におけるこのような分析質の
存在または量を測定するアッセイで用いられるとしてい
る。スクアレート染料は、当技術分野で周知の技術によ
りｓｂｐメンバーにコンジュゲートさせ得る。

さらに、少なくとも直径約１０ｎｍの固体難溶性粒子で
ある光吸収性非磁性粒子を用いることができる。

多くの異なる型の粒子が使用され得る。特に興味深いも
のは、炭素粒子、例えば木炭、ランプブラック、グラフ
ァイト、コロイド状炭素などである。炭素粒子以外に金
属ゾル、特に貴金属、金、銀、および白金のゾルら使用
され得る。

を票識・ｓｂｐメンバーとコンツユゲートするシグナル
発生系のメンバー。標識は、アイソトープまたは非アイ
ソトープ、普通は非アイソト−プであり得、触媒、例え
ば酵素、色素原、例えば蛍光剤、染料または化学発光剤
、放射性物質、粒子などがある。

シグナル発生系・・・シグナル発生系は、Ｉｐｌまたは
それ以上の成分を含み得、少なくとも一成分か標識であ
る。シグナル発生系は、試料中の分析質の存在または竜
に関連するシグナルを発する。シグナル発生系は、測定
可能なシグナルを発生するのに必要な試薬をすべて含む
。標識が分析質と類似のｓｂｐメンバーにコンジュゲー
トされない場合、通常標識は分析質と類似のｓｂｐメン
バーに相捕的なｓｂｐメンバーに結合する。シグナル発
生系の他の成分には、基質、エンハンサ−１活性剤、化
学発光合物、コファクター、阻害剤、スカベンジャー、
金属イオン、シグナル発生物質の結合に必要な特異的結
合物質などが含まれ得る。シグナル発生系の他の成分は
、補酵素、酵素製品および他の酵素および触媒と反応す
る物質などであり得る。

シグナル発生系は、外的手段により、好ましくは粒子の
アグリゲーション程度の測定により、または電磁放射の
使用により、望ましくは視覚試験により検出可能なシグ
ナルを提供する。大抵の場合、シグナル発生系は、粒子
、例えば蛍光粒子または他の光吸収粒子、発色基質およ
び酵素を含むが、発色基質は、紫外線もしくは可視領域
の光を吸収する染料、燐光体、蛍光剤または化学発光剤
に酵素変換される。

シグナル発生系は、少なくとも１種の触媒、普通は酵素
および少なくとも１種の基質を含み得、また２種または
それ以上の触媒および複数の基質を含み得、また酵素の
組み合わせを含み得るが、ただしこの場合一方の酵素の
基質は他方の酵素の生成物である。ソゲナル発生系の作
用は、試料中の分析質の量に関連した検出可能なシグナ
ルを提供する生成物をもたらすことである。

シグナル発生系に有用な多数の酵素および補酵素は、米
国特許第４２７５１４９号（カラム１９〜２３）および
米国特許第４３１８９８０号（カラム１０〜１４）に示
されている。幾つかの酵素組み合わせは米国特許第４２
７５１４９号カラム２３〜２８に記載されているが、こ
れらの組み合わせは本発明でも用いられ得る。

特に興味深いものは、過酸化水素の生成および染料前駆
体を酸化して染料とするための過酸化水素の使用にとも
なう酵素である。特定の組合わせには、ザソカリドオキ
シダーゼ、例えばグルコースおよびガラクトースオキノ
ダーゼまたは複素環オキソダーゼ、例えばウリカーゼお
よびキサンチンオキノダーゼを、過酸化水素を用いて染
料＋）ｉｆ駆体を酸化する酵素、すなわちベルオキンダ
ーセ例えば西洋わさび（ホースラディツシュ）ベルオキ
ンダーセ、ラクトペルオキシダーゼまｆこはミクロペル
オキシダーゼと結合したものか含まれる。市ｊ記以外の
酵素の組合わせは、引用された内容に含まれている。単
一酵素を標識として用いろとき、池の酵素、例えばヒド
ロラーゼ、トランスフェラーゼおよびオキンドレダクタ
ーゼ、好ましくはアルカリ性ホスファターゼおよびβ−
ガラクトンダーセのようなヒドロラーゼを用いることが
できる。

別法として、ルンフェラーゼ、例えばホタルルンフエラ
ーゼおよび細菌ルンフエラーゼを用いることができる。

使用される補酵素の例には、ＮＡＤ［Ｈ］、ｌ’ＪＡＤ
ＰＩＩＨ］、燐酸ピリドキサール、ＦＡＤ［Ｔ（］、Ｆ
ＭＮ［Ｉ−１］等があり、普通、補酵素は閉環反応をと
もなうが、詳しくは米国特許第４３１８９８０号参照。

酵素反応の生成物は、普通は染料または蛍光剤である。

多数の蛍光剤の例が米国特許第４２７５１４９号（カラ
ム３０および３１）に示されている。

磁性粒子・・・本質的に磁気反応性であるか、または例
えば磁気反応性物質に付着させるかまたはこのような物
質を粒子に混入することにより磁性化された粒子。磁性
粒子は、常磁性、強磁性または超常磁性、普通は常磁性
であり得、少なくとも５Ｘ　Ｉ　０　５ｅｍｕ／　Ｏｅ
ｃｍ３、普通は少なくとら＝ｉ　Ｘ　１０　　’ｅｍｕ
／　Ｏｃｃｍ３の磁化率（ｘ）を有する。粒子の直径は
小さく、一般的には約５ｎｍ−１ミクロン、好ましくは
約ｌＯ〜２５０ｎｍ、さらに好ましくは約２０〜ｌｏｏ
ｎｍの範囲であり、最ら好ましくはコロイド状である。

本質的に磁性または磁気反応性である粒子の磁気成分の
例には、錯塩および高い磁化率を有する鉄、コバルト、
ニッケルおよび希土類元素の酸化物、ホウ化物および硫
化物、例えば赤鉄鉱、フェライトがある。他のこのよう
な粒子の磁気成分には、純金属またはこれらの元素の１
ｐＩまたはそれ以上を含む合金がある。

大抵の場合磁性粒子は、ヒドロキシル、シリケート、カ
ルボキシレート、スルフェート、アミノ、ボスフェート
等のような表面官能基をともなう磁気成分のコアを含む
。表面と共有または非共有結合した付加的表面コーティ
ングを用いることが多い。表面コーティングは、アニオ
ン性またはカチオン性の、普通はアニオン性のデターノ
エントで−　　　あり得る。またはコーティングは、蛋
白質、例えばアルブミン、免疫グロブリン、アビジン、
フェツインなどであり得る。またはコーティングは炭水
化物、例えばデキストラン、キトサン、アミロースなど
、またはこれらの組み合わせまたはこれらの物質の自然
形態または電荷および親水性を制御するために官能性化
された形態であり得る。別法として、粒子は、リボ多糖
類、オクチルグルコシド等のような他の両親媒性物質で
被覆され得る。

別法として、磁気成分は、例えば、ポリマー性マトリッ
クスに物質を含浸させるなど、粒子に混入され得る。し
かしながら、この方法は、この発明の磁性粒子より大き
な粒子をもたらすことが多い。この方法による磁性粒子
の製造のさらに詳細な記載は、ホワイトサイド等、（１
９８３年）［トレンズ・イン・バイオテクノロジーｊ（
Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎＢ　ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、
１巻（５）、１４４〜１４８頁およびそこに引用された
参考事項に見られる。

直径が１００ナノメーター未満の好ましい磁性粒子は、
多糖類または蛋白質のようなコーティングの存在または
非存在下に酸化鉄を沈殿させることにより製造され得る
。直径が数ミクロンの磁性粒子もまたボールミル方法を
行ない、興味あるサイズ範囲外の物質を除去することに
より製造され得る。一般的に、この後者の方法で生成し
た磁性粒子は、全く多分散性であるため一般に有用性の
あるものではない。これより有用な単分散性金属酸化物
けん副液は、沈殿プロセス中においてｐ　Ｉ（、温度お
よび濃度を注意深く制御することにより製造され得る。

磁性粒子を巨大分子で被覆すると、粒子のコロイド安定
剤を増すことができろ。これは、高分子量ポリマーの直
接吸着によるかまたは粒子表面を官能化し、次いで巨大
分子を官能基と結合させることにより行なわれ得る。エ
マルジョンポリマー化およびグラフト技術により磁性粒
子をポリマーで被覆する手段が得られる。

一般に、所定の課題に最善である磁性粒子は、第一に分
離されるべき粒子のサイズおよび特性により決定される
。イムノアッセイまたは細胞単離の場合、磁性粒子は好
ましくは容易にけん澗可能であり、安定した、好ましく
はコロイド状のけん濁液を形成し、高い磁化率を有して
いるへきである。ｓｂｐメンバーが表面と結合している
場合、相捕的ｓｂｐ、Ｔｈの結合能力が保有され、時間
が経過しても安定しているべきである。

小さい（＜　Ｉ　ＯＯｎｍ）磁性粒子は、イムノアッセ
イおよび細胞分離方法において有利に用いられる。

これらの粒子は、好ましくは金属、金属酸化物または他
の金属化合物の均質コアを有する。コロイド状で安定し
ているとき、小粒子は長時間けん濁し得ろ。表面対容量
の比率が大きく、拡散速度が比較的高いため、粒子は媒
質に分散している分子および粒子と急速に結合できる。

また小磁性粒子は、大きな適用磁場にさらされた後の残
余磁気モーメントのために大きな磁性粒子よりもアグリ
ゲーションしにくい。また、このような小粒子をコロイ
ド状で安定させる方法も知られている。

また、中間サイズ（１００〜ｌ　ＯＯＯｎｍ）の磁性粒
子を用いることらできる。これらは容易にけん濁し得、
これらより小さい粒子の場合よりも低い表面荷電密度で
自発的アグリゲーションを妨げ得る。このサイズ範囲の
磁性粒子は、エマルノヨンボリマー化により製造され得
、グラフティングによろうと、巨大分子と表面の共有結
合によろうと表面が容易に修飾されるという利点を有す
る。しかしながら、これらの粒子はけん濁している時間
が短く、また表面対容量の比率が低いため分離されるべ
き物質との結合速度が減少する。

磁性流体・・・磁場により容易には分離されない液体担
体中磁性粒子のコロイドけん濁液。生成した液体は、磁
性物質のバルク（ｂｕｌｋ）特性を存する。

流体は、外部磁場の存在下で自発的に磁化する。

またこの液体は、流体として作用し、容器の形をとり、
流動し、障害物のまわりを動くことができる。磁性流体
の例としては、けん蜀した粒子か強磁性粒子であるフェ
ロ（含鉄または強磁性）流体（「ｅｒｒｏｒｌｕｉｄ）
がある［例えば、ローゼンバイク、前出および米国特許
第４０１９９９４号（この内容を引用して説明の一部と
する）、およびカラフォラ等、（１９８０年）ｒＩＥＥ
Ｅ・トランザクシヨンズ・オン・マグネティックス（Ｔ
ｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ　。

ｎ　Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ）、ＭＡＧ−１６Ｊ１７８−１
８３頁参照］。

コロイド磁性粒子は、蛋白質物質等、例えば血清蛋白質
例えばアルブミン、ガンマグロブリン等で被覆され得る
。コロイド磁性粒子を蛋白質の水性緩衝液と混合するこ
とにより蛋白質被覆コロイド磁性粒子を製造することが
できる。物理的（例、吸収）または化学的結合により磁
性粒子を蛋白質で被覆することができる。

非特異（的）結合・・特異的表面構造が比較的独立した
ものである粒子間の非共有結合。普通、このような非特
異結合は、反対に荷電した粒子間または粒子と反対の電
荷を有するポリイオン性試薬を用いる場合には同に電荷
を有する粒子間における電荷または電子相互作用の結果
生じるものである。

また非特異結合は粒子間の疎水性相互作用の結果てら生
し得る。

ポリイオン性試薬　無機または有機、天然または合成で
、少なくとも２個の同じ電荷、ポリアニオンまたはポリ
カチオン、好ましくは少なくとも１０個の同じ電荷を有
する化合物、組成物または素材、例えば高分子電解質。

ポリアニオン性試薬の例としては、ポリアルキレンアミ
ン類例えばポリエチレンイミンおよびポリプロピレンイ
ミン並びにそれらの低級アルキルアンモニウム塩類例え
ばポリブレン、（−Ｎ（ｃＨ３）ｔｃ　Ｈ２ＣＨｚＮ（
ｃＩ（ｓ）ｔｃ　Ｈ２ＣＩ−１２ＣＨ２ＣＨ２−）ｎ１
金属イオン、例えばカルシウムおよびバリウムイオン、
アミノデキストラン、プロタミン、正電荷リポソーム、
ポリリジンなどがある。

ポリアニオン性試薬の例としては、ヘパリン、デキスト
ランスルフェート、負電荷燐脂質小胞、ポリカルボン酸
、例えばポリアクリレート、ポリグルタメートなどがあ
る。前記の物質およびそれらのまたは単離法は当業界で
はよく知られており、多くは市販されている。

解離剤・・・粒子間の非特異結合を逆行さける、すなわ
ち粒子を解離することができる天然また（」合成、何機
または無機の化合物、組成物または素材。

解離剤は、粒子間の非特異結合に作用する。例えば、非
特異結合が電荷相互作用によるものである場合、解離剤
は培地のｐＨ値を電荷相互作用に不適または相客れない
値に変えることができる。したがって解離剤は、無機酸
らしくは有機酸のような酸または無機塩基もしくは有機
塩基のような塩基であり得る。他方、解離剤はイオン相
互作用を防御することができるため高イオン強度溶液ま
たはデキストランのような中性ポリマー溶液であり得る
。他方、解離剤は、粒子および磁性粒子間の非特異結合
を崩壊する電荷を存し得る。この例としては、高分子電
解質塩、例えばクエン酸塩、ポリアクリレート、デキス
トランスルフェートなどがある。ポリイオンブリツノに
より粒子が結合している場合、解離剤は、反対の電荷を
有するポリイオン性剤であるかまたはポリイオン試薬を
解重合する試薬であり得る。粒子および磁性粒子が反対
の電荷を有している場合、他の正または負電荷高分子電
解質または高イオン強度液が用いられ得る。

補助物質・・様々なＮｌｉ助物質がこの発明によるアッ
セイで用いられることが多い。例えば、通常、アッセイ
成分には緩衝剤並びにアッセイ成分およびアッセイ成分
に対する安定剤が存在する。これらの添加物に加えて、
さらに蛋白質、例えばアルブミン、または界面活性剤、
特に非イオン性界面活性剤、結合促進剤等、例えばポリ
アルキレングリコール類がしばしば含まれ得る。

前述したように、この発明は液体媒質から物質を分離す
る方法を含む。この方法は、物質が磁性粒子と結合し、
磁性粒子を非特異結合およびアグリゲートさせる条件下
で（ただし化学的手段を用いてけん濁した磁性粒子を互
いに非特異結合させる）、物質を含有する液体媒質を好
ましくは磁性液体として分散した磁性粒子と合わせるこ
とからなる。分離されるべき物質は、非磁性粒子である
ことが多く、または非磁性粒子と結合している。

普通非特異結合は、好都合には電荷の相互反応の結果と
して得られるが、これはまた非磁性粒子を磁性粒子と非
特異結合させる役割を果たし得る。

例えば、非磁性粒子および磁性粒子は反対の電荷を有し
得るが、その場合非特異結合が自発的に生じる。粒子お
よび磁性粒子が同じ電荷を有する場合、反対の電荷を有
するポリイオン性試薬を媒質に加えることにより非磁性
粒子および磁性粒子間並びに磁性粒子間に非特異結合を
もたらすことができる。前記の結合か形成後培地に磁場
勾配を用いることにより粒子を培地から分離する。

この方法を実施するとき、普通は水性の液体媒質を用い
る。池の極性溶媒、例えば普通は、１〜６個さらに一般
的には１〜４個の炭素原子を有する酸素化有機溶媒、例
えばアルコール、エーテルなどら用いられ得る。通常、
これらの共溶媒は、約４０重量パーセント未満、さらに
普通は約２０重量パーセントの割合で存在する。普通、
媒質については、分離前の磁性粒子の非特異的結合およ
びアグリゲーションを促進するようなｐＨ値が選ばれる
。粒子か負に帯電している場合にｐｌを増やすと、電荷
が増加し、また非特異的疎水性およびファンデルワール
ス相互作用により起こる自発的アグリゲーションを妨げ
ることが多い。この逆のことが正に帯電した粒子に当て
はまる。反対に帯電した高分子電解質を加えることによ
りアグリゲーションさせる場合、高分子電解質の電荷を
増加させるｐ　ｔｒ値の変化は、しばしば粒子の電荷を
減少させるため、この試薬の過剰量の使用を避けるよう
な最適１）Ｈ値を選ばなければならない。一般に５〜１
０、さらに普通は６〜９のＩ）Ｈ範囲が用いられる。ア
ッセイの際、ｐＨ値に関して他に考慮するべきことは、
シグナル発生能力を最ら効果的にする一方で重要なｓｂ
ｐメンバーの結合レベルを維持することである。場合に
より、これらの条件間で妥協がなされる。様々な緩衝剤
を用いろことにより望ましいｐ［−Ｉを達成し、測定の
間そのｐｌ−Ｉを維持することができろ。緩衝剤の例に
は、ポレート、ホスフェ−１・、カーボネート、トリス
、バルビツールなどがある。この発明の場合使用される
具体的な緩衝剤は厳密ではない。しかしながら、個々の
分離または個々のアッセイにおいては他のらのよりも好
ましい可衝剤が存在し得る。非磁性粒子が含まれる場合
、分離完了後に粒子と磁性粒子の結合の逆転を促進する
試薬が加えられ得る。

この方法を行なうためには通常、温度は中位でこの方法
を行なう間普通は一定に保たれる。一般的に、分離前に
粒子の非特異結合を促進するような温度が選ばれる。特
にアッセイをともなうこの方法における温度は一般に約
０°〜５０°Ｃ１さらに普通は約１５°〜４０℃の範囲
である。また、分離完了後に粒子および磁性粒子の結合
逆転を促進する温度が選ばれ得ろ。

媒質における磁性粒子の濃度は、粒子であろうとなかろ
うと分離されるべき媒質中の物質の量、望ましい分離速
度、磁場勾配および場の強さ、磁性粒子の磁化率などに
より異なる。一般に、磁性粒子濃度の高い方が、効果的
で速い分離をもたらすが、濃度が高すぎると媒質の過剰
な同伴を生じる。通常、濃度は経験的に測定され、一般
に約０゜１〜ｔｏ００μｇ／ｍ（！、さらに普通は約０
．５〜２００μｇ／ｍ１２、多くは約１〜５０μｇ／ｍ
ｆ２の範囲で変化する。

非磁性粒子を媒質から分離するべき場合、非磁性粒子の
８度は必要に応じて広範に変化し得ろ。

例えば、血液から細胞を分離する場合、細胞容量は、血
液の総容量の５０％を示し得ろ。対照的に、水の試料か
ら１ｍ（！当たりわずか１０００９］の細菌を分離する
ことし要望され得ろ。アッセイの場合のように比較的媒
質から遊離している非磁性粒子を得ろ必要があるとき、
普通非磁性粒子の総容量は媒質の５％未満であるべきで
ある。分析質が粒子の一成分であるかまたは粒子と結合
するアッセイにおいて、一般に分析質は約ｌ０−４〜１
０−”モル、さらに普通は約１０−８〜１０−１２モル
の範囲で変化する。分析質と会合した天然粒子以外の非
磁性粒子を媒質に加える場合、濃度は、粒子サイズおよ
び表面領域、分析性濃度、分析質または相補ｓｂｐとの
望ましい反応速度など多（の要因により異なる。一般に
、加えられた非磁性濃度は、約０．０１−１００μｇ／
ｍ（！、さらに普通は約０゜１〜２０μｇ／ｍＱである
。通常、分析性濃度、非特異結合作用、望ましい反応速
度、温度、溶解度、粘度などを考慮して他のアッセイ試
薬濃度を決定する。

一般に様々な試薬の濃度は分離されるべき粒子の興味あ
る濃度範囲またはアッセイにおける分析質の濃度範囲に
より決定されるが、各々の試薬の最終濃度は通常、粒子
の分離速度および範囲並びにアッセイの場合には興味の
対象である範囲を越える感受性および特異性を最も適し
たものにするべく経験的に決定される。

粒子間の非特異結合を形成するだめの化学的手段は通常
液体媒質に含まれている。磁性粒子と反対の電荷を何す
る非磁性粒子を分離する場合を除き、この化学的手段は
音道粒子とは反対の電荷を何するポリイオン性試薬であ
る。加えられるポリイオン性試薬の（？′ｔは、実質的
に全部の粒子がアグリゲート（凝集）またはコアグリゲ
ート（非凝集）するのに充分なものであるべきである。

この濃度は経験的に決定されなければならない。一般的
に過剰の試薬は粒子の完全なアグリゲーションを防げる
ため、避けられなければならない。一般的に、ポリイオ
ン性試薬の液体媒質における濃度は、ポリマーと会合す
るイオンの数をもたらすのに充分なものであり、これは
媒質中の全粒子における反対の電荷の総数と等しい。磁
性粒子と反対の電荷を有する非磁性粒子を分離する場合
、粒子間の非特異結合を形成させる化学的手段は、低イ
オン強度緩衝液であることが多い。

アッセイにおいて、水性媒質はまた１個またはそれ以上
のシグナル発生系メンバーを含有し得ろ。

面性したように、シグナル発生系の様々なメンバーの０
度は、分析質の興味ある０度範囲および必要な測定また
はアッセイのタイプにより変化する。

一般的なポイントとして、シグナル発生系の様々なメン
バーの濃度は、分析質の興味ある濃度範囲に関連して発
生されるシグナルを最適にするように還ばれる。

非磁性粒子と磁性粒子間または磁性粒子間の結合はｐＨ
により影響される。また’ｆ６合は、他の要因、例えば
イオン強度およびイオン性および非イオン性ポリマーの
存在により影響される。一般的に、非特異結合が電荷相
互作用による場合、イオン強度はまず粒子間の結合を容
易にするように選ばれるへきである。このためにはイオ
ン強度は一般に低く、０．００１〜０．５モル、好まし
くは０゜００５〜０．１モルの範囲内である得る。分離
完了後、イオン強度を高く調節することにより粒子およ
び磁性粒子のカップリングの逆転を容易にすることがで
きる。このためには、媒質のイオン強度は通常約０．１
〜３モル、好ましくは約０．１５〜１モルである。粒子
をアグリゲートさせるかまたはけん濁状態にしておくた
めの原則はコロイド科学分野でよく知られている。

磁性粒子との特異的結合を必要とするアッセイのため液
体媒質において磁性粒子を合わせた後、結合が生じるの
に充分な時間液体媒質を放置する。

通常、これには０．５〜１２０分、より一般的には１〜
６０分を要する。続いて化学的に誘発された磁性粒子の
非特異的アグリゲーションおよび粒子の非特異結合のみ
が必要なときには粒子の非特異的コアグリゲーンヨンが
実質上即座に起こり、そして普通は混合物を６０秒、多
くの場合１５秒未ｌ、：ｉ放置すれば充分である。好ま
しくは混合後直ちに磁場を適用する。粒子および磁性粒
子間または磁性粒子間の結合程度が磁気分離の効率を左
右する。

粒子のアグリゲーション後、磁場を適用することにより
媒質から粒子を分離させる。媒質への磁場の適用は、高
い磁場勾配をもたらす常法にしたがい行なわれ得る。通
常、この方法は、非磁性材料、例えばガラスまたはプラ
スチック製の容器中で行なわれる。磁場を適用する際、
反応容器は、電磁石または永久磁石、好ましくは永久磁
石に極めて接近して置かれ得るが、これはけん温液内の
場の強さおよび勾配を最大にするジオメトリ−を有する
。磁場の強さが強く勾配が高いほど分離は速くなる。通
常、約２〜５０ｍｍ、好ましくは約３〜ｔ５ｍｍの直径
の管において、少なくとも約２００エルステツドおよび
好ましくは少なくとも約１キロエルステツドの場の強さ
に普通少なくとも約２０キロエルステツド／ａＸの磁場
勾配を実際に与える程度１個またはそれ以上の永久磁石
を管に近づけて分離を行なうのが好都合である。磁場は
、粒子を媒質から望ましい程度分離させるのに充分な時
間適用される。ジオメトリ−１場の強さ、粒子の磁化率
などにより、磁場は約２秒〜１時間、好ましくは約５秒
〜６０秒の量適用される。

粒子が容器の一部分に集められてしまえば、けん澗して
いる液体媒質を常套手段、例えば傾しゃ、ピペットなど
により粒子から分離することができる。

液体媒質から分離された粒子を処理し、結合の逆転を容
易にするための試薬を加えて液体媒質に粒子をけん濁す
ることにより粒子間の非特異結合を逆行させることがで
きる。一つのアプローチとして、粒子がイオン相互作用
により結合している場合、イオン強度および媒質のｐＨ
を調節することにより結合の逆行を容易にすることがで
きる。

一般的に、イオン強度を高めると静電気結合は逆行され
る。粒子が負に帯電している場合、ｐｉ−１を減らすと
荷電は低下し、結合の相互作用は減少する。別法として
、ポリカチオン性アグリゲート剤を用いる場合、ｐＨを
増やすと電荷を中和し、結合を逆行することができる。

すなわち、ｐ　Ｉ−ｌ値を試薬の安定性により許容され
る程度の高いまたは低い値、普通はｐｆ（４程度または
ｐＨｌ０より大きい値に変えることが望ましい。

粒子および磁性粒子間の結合の逆行は、粒子間の非特異
結合の性質に左右される。非特異結合が電荷相互作用に
起因する場合、薬剤を加えることにより非特異結合の原
因である電荷相互作用を逆転させることができる。例え
ば、解離剤が加えられ得る。結合が反対の電荷を有する
粒子のアグリゲーションに起因する場合、ポリカチオン
性またはポリアニオン性高分子電解質が用いられ得る。

粒子が同じ電荷を有し、反対に帯電した高分子電解質が
粒子を結合させる化学的手段であった場合、粒子上の電
荷と同じ電荷の高分子電解質を用いて粒子を解離するこ
とができる。高分子電解質は、例えばポリアニオン類、
例えばデキストランスルフェート、ヘパリン、ポリグル
タメート、ポリアクリレート、燐脂質小胞、カルボキシ
メチルデキストランであり得る。用いられ得るポリカチ
オンの例としては、アミノデキストラン、キトサン、ポ
リブレン、ポリエチレンイミン、およびカチオン性リポ
ソームがある。

ポリカチオンを用いて粒子および磁性粒子間または磁性
粒子間の非特異結合を起こした場合、ポリアニオンを用
いて結合を逆転することができる。

他方、ポリアニオンを用いて粒子および磁性粒子間また
は磁性粒子間の非特異結合を起こした場合、ポリカチオ
ンを用いて結合を逆転することができる。例えば、ポリ
ブレンまたはバリウムイオンのようなポリカチオンを用
いた場合、解離剤は、クエン酸イオンまたは硫酸イオン
のようなポリアニオンであり得る。デタージエントは、
リポソームに対し、また主として疎水性相互作用により
粒子が非特異的にアグリゲートしているとき解離剤とし
て作用し得る。

解離剤の濃度は、粒子間の非特異結合の実質的または完
全な逆転を乙たらずのに充分なものであるべきである。

解離剤の濃度は一般に粒子および磁性粒子間の結合の性
質並びに粒子の性質により異なる。一般的に、解離剤の
濃度は、少なくとも粒子上のイオンまたは疎水性部位の
濃度に等しく、好ましくは少なくとも１０倍高い値であ
る。

アグリゲートから解離後の粒子に対する損害を最小にす
るかまたは避けるためには、アプリゲート中の粒子の性
質に従って解離剤を選ぶことが重要である。

粒子をアグリゲートから分離してしまえば、希望により
粒子を使用することができる。例えば、アッセイにおい
て、分離された粒子により試料中の分析質の量と関連性
のある検出可能なングナルの存在について検査すること
ができる。所望にしたがい使用することができる分離さ
れた粒子は細胞であり得る。例えば、分離された粒子は
赤血球であり得る。

この発明の好ましい態様において、磁性粒子は磁性液体
、例えばフェロ流体（強磁性、含鉄流体）として提供さ
れる。分離される粒子を磁性液体と合わせる。

この方法の重要な適用例は、細胞を含有する試料からの
細胞の除去、例えば全血からの赤血球の除去である。こ
の方法の場合、限定するわけではなく一例として血液全
体を用いるが、磁性粒子と細胞を非特異結合させる条件
下で全血試料を帯電した磁性粒子と液体媒質中で合わせ
る。普通、細胞は、細胞表面上のシアル酸残基などの存
在により負電荷を有している。磁性粒子が正電荷を有ｊ
７ている場合細胞および磁性粒子間の直接的非特異結合
をもたらし得る。好ましくは、磁性粒子は負電荷を有す
る。この場合媒質中にポリカチオン試薬を含有させるこ
とにより細胞および磁性粒子間の非特異結合条件がもた
らされる。この方法における有用なポリカチオン試薬は
、例えばポリブレン、ポリアルキレンイミン、アミノデ
キストラン、キトサンおよび正に帯電したリポソームで
あり得る。全血から細胞を除去する場合に好ましいポリ
カチオン試薬はポリブレンまたはポリエチレンイミンで
ある。

次に、媒質に磁場勾配を与えることにより媒質から細胞
を分離することができる。磁場を適用すると容器の一部
分に細胞−磁性粒子アグリゲートが集まるため、例えば
傾しゃ、ピペット等により前記アグリゲートを残留細胞
不含有媒質から除去することができる。

次いで分離された細胞磁性粒子アグリゲートを前記のよ
うに処理することによりアグリゲ−１・から細胞を分離
することができる。ポリカチオン性結合剤としてポリブ
レンまたはポリエチレンイミンを用いる場合、好ましい
解離剤はシトレートまたはポリアクリレートである。

この方法は、遠心分離せずに血漿を製造する方法を提供
するためオートメーション化した血液型分類方法にとっ
て特に有益である。また免疫グロブリン含有血漿を、ま
ず試験細胞と合わせ、次に血漿からの抗体が細胞と結合
したかどうかを測定するために完全に除去しなければな
らないクームス抗グロブリンテストにおいても有用であ
る。この方法の場合、磁性粒子および非特異結合剤を血
漿および試験細胞からなる混合物に加えた後分離した細
胞を解離剤の助けにより再けん罰する。さらに、この方
法は、ｓｂｐメンバーを粒子と結合させ、そして遠心分
離せずに粒子を分離および洗浄ずろことか望ましいイム
ノアッセイにおいて用いられ得る。粒子は、磁性または
非磁性であり得る。

この発明は、分析質を含有する疑のある試料における分
析質のアッセイに適用性を有する。分析質はｓｂｐメン
バーである。アッセイの場合、試料をアッセイ媒質中で
分析質に相補的なｓｂｐメンバーと合わせるが、その際
分析質または相補的ｓｂｐメンバーの少なくとも一方は
非磁性粒子（普通、細胞ラテックス粒子）または磁性粒
子の表面と会合する。この発明の場合、磁性粒子の非特
異結合およびアグリゲーノヨン条件下で帯電した磁性粒
子を媒質と合わせる点に改善が認められる。しばしば非
特異結合の条件は、ポリイオン性試薬を合わせて磁性粒
子間の非特異結合を起こすことを含む。通常、アッセイ
は、試料中の分析質の栄と関連性のある検出可能なシグ
ナルを発するシグナル発生系を必要とする。普通、シグ
ナル発生系は標識されたｓｂｐメンバーを含む。さらに
媒質を１個またはそれ以上のシグナル発生系メンバーと
合わせ得るが、合わせないことらあり得る。媒質に磁場
勾配を与えろことにより媒質から磁性粒子を含むアグリ
ゲートを分離する。分離されたアグリゲートまたは媒質
における検出可能なシグナルの存在について検査するこ
とができる。このような測定の場合、上記で加えられな
かったシグナル発生系の残りのメンバーがあればこれを
加える必要らあり得る。上記条件にしたがい分離された
アグリゲートを処理することにより、検出可能なシグナ
ルの存在を検査する前に磁性粒子から非磁性粒子を分離
することができる。磁性粒子から非磁性粒子を分離した
後、試料中の分析質の量に関連して発生された検出可能
な粒子の存在について非磁性粒子を検査することができ
る。このため粒子を、検出可能なシグナルを発生するた
めに」二足で加えられなかったシグナル発生系の残りの
メンバーと合わせ得る。

さらにこの発明は、ｓｂｐメンバーが結合しており、し
かも（ｂ）磁性粒子と非特異的に静電気結合する（ａ）
非磁性粒子のアグリゲートを含む組成物を含む。さらに
組成物は、磁性粒子および非磁性粒子（ノコだし非磁性
粒子および磁性粒字が同じ電荷を有する場合）と反対の
電荷を有するポリイオン性試薬を含み得る。一般的に組
成物のアグリゲートは、解離剤を用いることにより組成
粒子に解離され得る。他方、この発明の組成物は、ｓｂ
ｐメンバーと結合ずろ磁性粒子および磁性粒子を互いに
非特異結合させるポリイオン性試薬を含み得る。

便宜のために、アッセイを行なうための試薬は、分析質
についてアッセイするとき用いるために予め測定された
量のパブケージを組み合わせたキットの形で提供され得
る。キットは、（ａ）分析質に相補てきなｓｂｐメンバ
ー、（ｂ）分析質も相補的ｓｂｐメンノにも荷電粒子と
結合していない場合荷電粒子に結合したｓｂｐメンバー
および（ｃ）粒子が磁性でない場合荷電磁性粒子を含み
得ろ。またキットは、試料中の分析質の債と関連したシ
グナルを発生させろ試薬を含み得る。さらに、キットは
、全粒子が同じ電荷を有するときに粒子とは反対の電荷
を有するポリイオン性試薬を含み得る。これに加えてキ
ットはさらに、粒子間の結合を逆行させる解離剤を含み
得る。

［実施例］ 以下実施例をあげてこの発明についてさらに記載する。

実施例における部およびパーセンテージは特記しない限
り容量に関するものである。温度は摂氏（°Ｃ）である
。

実施例！ 血漿の製造 永久磁石により生じた磁場に置かれた容器に凝固してい
ない全面（４８０μｇ１１６巧／ｆｆｃ）およびフェロ
（含鉄）流体（２５０μＱ、４．　、５　Ｆｇ（Ｆ　Ｏ
）／ＩＲＱ）を続けて加えた。磁場のマグニチュードは
４゜０キロガウスであった。磁極に向かって赤血球−粒
子アグリゲートが移動し、血液中に存在する赤血球の９
９％以上が除去された。澄明な血漿を傾しやにより別の
容器に移した。１７５の対象から血液に関する結果が得
られた。完全な分離に要する時間は１５〜８５秒の範囲
で変化した。フェロ流体は、スクシニル化うし血清アル
ブミンで被覆された鉄磁性粒子を成分とした。フェロ流
体は実施例４にしたがい製造された。実施例４の記載と
同様にスクシニル化うし血清アルブミンを製造した。

実施例２ 抗Ｒｈ抗体アッセイ 実施例１で製造された血漿にポリアクリル酸（ｌＯμＱ
、２ｍ９／ｙｒ（１）およびスクアレート染料で染色さ
れたＲｈ陽性試験細胞を加えた。５０μＱのスクアレー
ト染料（１０−’モル、ＤＭＦに溶解）を赤面法１ｍＱ
のけん副液に加えた。［スクアレート染料は、２−（ｐ
−ジブチル−アミノ−ｍ−ヒドロキシフェニル）−４−
（４−ジエチルイモニオシー２−ヒドロキシ−２，５−
シクロへキサジェニリデン）−３−オキソ−１−シクロ
ブチル−トであり、ｎ−ブタノール　トルエン（２：１
）中スクアリン酸を３−Ｎ、Ｎ−ンブヂルーアミノフェ
ノールと縮合し、次いで水を共沸除去ずろことにより製
造された。］混合物を３７°Ｃて８分間インキユヘート
した。次に続いて緩衝液（＋６ｙ／ρグリノン、００３
モルＮａＣ（２，Ｏ，Ｑ　Ｉ　５モルホスフェート、ｐ
ｌ−１６，７Ｘ５００μＱ）、フェロ流体おＪ：びポリ
ブレン（１０μｃ、１６　ｍｔｉ／ｍ（Ｄを加え、前記
と同じ強さの磁場の存在下に試験細胞を分離した。（こ
の発明によるアグリゲーションにより容器の端に集めら
れた）試験細胞を緩衝液［低イオン強度食塩水、ホスフ
ェート（０，００３モル）、ｐＨ６，７，０，２４モル
のグリシンおよび０．０３モルのＮａＣＱ含有］で２回
洗浄した。次にポリアクリル酸（１０μＱ、　２ｕ／ｍ
Ｑ）、次いで１％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）含有
抗ヒト免疫グロブリンを加えた。

３分間２５°Ｃでインキュベーノヨン後、反応混合物を
クエン酸（８００μＱ、０２モル）で希釈し、ブリック
ス等による「ジャーナル・オブ・イミュノロジーＪ（Ｊ
　、　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、）　８１巻、７３−８１頁（
１９８５年）および米国特許第４５６４５９８号記載の
ファイバーオプティック粒子血球計算法により分析した
。

要するに、米国特許第４５６４５９８号の場合、興味の
対象の物質の存在または量の検出に関して分散中の粒子
の存在を測定するための方法および装置が示されている
。オプティカルファイバーを用いて、蛍光が受容および
分析され得る比較的小さい容量を定めている。この容量
は、予測された揺動をらたらす単一粒子のみが存在しや
すい容量と関連性を有する。試料中の分析質の存在に関
連した蛍光揺動の変化をもたらす様々な技術を用いるこ
とにより、存在する分析質の量が測定され得る。揺動を
一定期間にわたって静止モードで、または試料において
複数の容量を試すことにより観察する。既知ｍの分析質
を宵するアッセイ溶液で得られた結果と上記観察結果を
比較することにより、分析質の量を定ｍ的に測定するこ
とができる。

上記実験から得られた結果を要約して下表に示す。

第　　１　　表 延−社　　　　　　　　　　　　　シグナルａ対照血漿
　　　　　　　　　　　３ｏ±４抗Ｒｈ抗体でスパイク された対照血漿ｂ　　　　　　　　８０±９ａ：対照血
漿からの５ＳＤ（標阜偏差）を越えるシグナルを陽性と
みなした。

ｂ：常用の抗ヒト血清を用いた市販抗体スクリーンテス
トで充分な抗Ｒｈ抗体を加えて１＋スコア（スケールｌ
＋〜４＋）をもたらした。

これらの結果は、抗Ｒｈ抗体の感受性アッセイがこの発
明にしたがい行なイっれ得ろことを示す。

実施例３ 抗トリョードチロニン（Ｔ３）で標識されたヒープの分
離 Ａ、試薬および略語 １、ＰＢ−αＴ３Ｃ２’Ｉ）＝ＥＤΔＣカップリングに
より（放射性ヨウ素化された）抗−′Ｆ３抗体で標識さ
れたカルボキン置換ポリスチレンビーズ。

２、ＭＰ−磁性粒子 ａ）ＰＧＡ−ホスフェートによりグルクロン酸で誘導体
化された磁鉄鉱（０，２〜０．８μｍ）ｂ）　ＣＭ−Ｄ
　ｅｘｔ（ｒＦｅフェロ流体」）・カルボキシメチルデ
キストラン−磁鉄鉱（０，０３０〜０．４５μｍ）、米
国特許第４４５２７７３号記載と同様の方法により製造
。

ｃ）Ｍ４１００　ＢｉｏＭａｇ−ＣＯＯＨ（０，２〜１
．０μｍ）＝アドバンスト・マグネティック社製Ｍ４１
００　ＢｉｏＭａｇ粒子、粒子の遊離アミン基がスクシ
ニル化。

３　ポリブレン−ヘキサジメトリンプロミド、ングマ・
ケミカル社製。

４、アッセイ緩衝液＝ＰＢＳ１０．１％ＢＳＡ。

５　正常なヒト血清。

Ｂ、方法 ５５μ９のビーズを含有する２５０μＱのＰＢ−αＴ　
３　（”５１　）に５０μｇのアッセイ緩衝液または正
常ヒト血清を加えた。この混合物を室温で２０分間イン
キュベート後、０　、２　ｕのＦｅを含有する１００μ
（！のＭｒ’（ＰＧＡ、ＣＭ−Ｄｅｘｍまたは１３ｉｏ
Ｍａｇ　　ＣＯＯＩ−Ｄを加えた。この反応ｌ混合物に
５０μρのポリブレン（様々な濃度で）を加えた。約３
分間振盪後、２６ギロガウスの強さを有する磁場に管を
５分間段いた。分離後、上清を傾しゃし、ベックマン（
Ｂ　ｅｃｋｍａｎ）ガン７５５００カウンターを用いて
沈殿物を数えた。

Ｃ９結果 第　　２　　表 使用した　　　ポリブレン　　反応混合物から静磁性粒
子　　　の濃度　　　　去されたボリスヂ（ｘｇ／酎）
　　　レンの量（％） 緩衝液　血清　　　緩衝液　血清 ＰＧＡ　　　　　Ｏ，１４０，５６９２７３ＣＭ−Ｄｅ
ｘｍ　　Ｏ，４０，４８７８４ＢｉｏＭａｇ− ＣＯＯＨＯ，０３５０，１４８８７７ 抗Ｔ３抗体で被覆された０、２６μｍのポリスチレンビ
ーズを、ポリブレンを用いて負に帯電した磁性粒子とコ
アグリゲートさせることにより反応混合物から除去。

第３表 使用した　　　ポリブレン　　反応混合物から静磁性粒
子　　　の濃度　　　　去されたポリスチＣ１１９／Ｒ
（１）　　　　レンの量（％）緩衝液　血清　　　緩衝
液　血清 ＰＧＡ　　　　　Ｏ，０３５０，１４＞９９　　＞９９
ＣＭ−Ｄｅｘｍ　　Ｏ，４０，４＞９９　　＞９９Ｂｉ
ｏＭａｇ− ＣＯＯＨＯ，０３５０，１４＞９９　　＞９９抗Ｔ３抗
体で被覆された０、５１〜１．２マイクロメーターのポ
リスチレンビーズを、ポリブレンを用いて負に帯電した
磁性粒子とコアグリゲートさせろことにより反応混合物
から除去。

第４表 使用した　　　ポリブレン　　反応混合物から静磁性粒
子　　　の濃度　　　　去されたボリスチ（ｆｆ！？／
ＩＩＱ）　　　　レンの量（％）緩衝液　血清　　　緩
衝液　血清 ＰＧＡ　　　　　Ｏ，０３５０，１４９２９２ＣＭ−Ｄ
ｅｘｍ　　Ｏ，４０，４９８９８バイオマグ Ｃ０ＯＨＯ，０３５０，１４９０９４ 抗Ｔ３抗体で被覆された０、２６μｍのスクンニル化ポ
リスチレンビーズを、ポリブレンを用いて負に帯電した
磁性粒子とコアグリゲートさせることにより反応混合物
から除去。

第５表 ＮａＧＱ　　　　　反応から除かれたＣＰＭａ（％）（
モル／（り　　　　　　　ＰＧＡ　　　　　ＣＭ　　Ｄ
ｅｘ３０．０５８　　　　　９３　　　　　　８００．
０８６　　　　　９０　　　　　　８８０、＋４１　　
　　　９４　　　　　　９００．２５２　　　　　８８
　　　　　　３２０．４７４　　　　　　５　　　　　
　　４ａ：ｃＰＭ＝Ｉ分当たりのカウント。

第　　６　　表 ポリブレン　反応から除去されたＣ　Ｐ　Ｍ　（％）（
７汁’ｖｔＱ）Ｐ　Ｇ　Ａ　　　　ＣＭ　−Ｄｅｘ３０
．０２５　　　　２０　　　　　　　２０．０７　　　
　　９０　　　　　　　３０．１４　　　　　９４　　
　　　　　５０．２８　　　　　９３　　　　　　５５
０．５６９０９０ １．１２　　　　　８８　　　　　　９２２．２４８５
９３ ４．４８　　　　　８７　　　　　　９１８．９６　　
　　　９０　　　　　　８２１７．８２　　　　　５６
　　　　　　１６Ｄ検討 抗Ｔ３抗体で被覆されたポリスチレンビーズは、ポリブ
レンおよび磁場を用いて負に帯電した磁性粒子と非特異
的にコアグリゲートすることにより反応混合物から効果
的に除去され得ることが示された。

第２．３および４表で示された結果から、大きなポリス
チレンビーズの方が小さいビーズよりら効率よく反応混
合物から除去され得ることがイつかろ。また、スクンニ
ル化および非スクンニル化ポリスチレンビーズ間の除去
効率の差から、微粒子表面上の電荷分布がコアグリゲー
ンヨンすなわち除去効率に寄与することか示される。

ポリスチレンビーズの分離に対するイオン強度およびポ
リスチレン濃度の影響を示す結果を第５および６表に示
す。ＮａｃＱ、ｅＩｅ度が高い場合、粒子のコアグリゲ
ーションおよびポリスチレンビーズの除去は実質的に低
下した。これは、コアグリゲーションが負および正に帯
電した基の間の相互作用に基くものであったことを示す
。第６表は、ポリブレンの最適濃度が存在し、そして濃
度か高すぎるかまたは低すぎるとアグリゲーションを起
こす能力が低下してしまうことを示す。

抗Ｔ３抗体で被覆されたポリスチレンビーズは（アグリ
ゲーション時間および磁性分離時間を含めで）１分以内
に反応混合物から効果的に除去され得ることが示された
。

この方法は、例えば、抗体または抗原で標識された微小
ビーズが用いられるヘテロノニアスイムノアッセイにお
いて結合フラクションを反応混合物から除去するための
魅力的なアプローチであり得る。

実施例４ 含鉄流体の製造 ７〜．コロイド状磁性酸化鉄（Ｆｅフェロ流体）の製造 ２０ｍＱの２モルＦｅＣＬ＋、ＩＯｍＱ、の２モルＦｅ
Ｃ０，２および２０ｍＱの１モルトＩＣ夕からなる溶液
を５分間かけて撹拌しながら２５Ｒ（！のａＮＨ，０１
（および５００Ｊ２の水からなる溶液に滴下した。沈殿
が終ると上清を傾しゃした。残留物を２分間５００ｍ０
．の２モルＨＣ（！０４と撹拌し、再び放置した。

上清を傾しゃし、残留物を水に吸収させ、１０ミリモル
のＨＣρ０４に対して透析した。生成したつロイドは８
０ａ＋ｆｆの容量で、鉄成分は２８ｍｙ／ｍ（であった
。ダイナミック光スキャッターにより測定された平均粒
子サイズは６０Ｒｍであった。参考文献・マツサートに
よる、［コント・ランデュ・ド・ラカデミー・ド・シャ
ンス・パリＪ（ｃ、Ｒ、Ａ　ｃａｄ。

Ｓ　ｃｉ、ｐａｒｉｓ）、２９ＩＣ，１（１９８０年）
。

Ｂ、蛋白質によるコロイド状磁性酸化鉄の被覆ウサギ血
清アルブミン（ＲＳ　Ａ）：　ｌ　Ｉ　ｍ９／ｍＱ、　
Ｒ３Ａの溶液（２肩Ｑ）を上記コロイド状磁性酸化鉄と
水の１・４希釈液２ｙｔｔＱに加えた。５分後、０５０
ＷＱの５５０ミリモルトリスー１−（ｃＩ２、ｐＩ（８
，０を加えた。生成したコロイドは認識できろ粒状物を
含んでいなかった。

スクシニル化ウシ血清アルブミン（ｓＢ　Ｓ　Ａ）：水
仲９．５ｍｇ／ｖｒＱの５ＢＳＡ（２５０ｘＱの０１モ
ル燐酸ナトリウム、ｐＨ８，０中５．０９の！’３ＳＡ
を０２０のコハク酸無水物で処理することにより製造）
１０５ｍｃの溶液を０．１モルＨＣＱＯ４で調節するこ
とによりｐ）Ｉ３．３８とした。１０ミリモルＨＣＱＯ
４中３５ｘ９／ｘＱ、のコロイド状磁性酸化鉄３０ｔＣ
の溶液を７５ｍＱの水で希釈し、５ＢＳＡ溶液に加えた
。次いで溶液のｐＴ−■を１モルＮ　Ｍ　ｅ　４０　Ｉ
ＩによりｐＴ（９，０６に調節した。生成したコロイド
の平均粒子サイズをダイナミック光スキャッタで測定す
ると６３ｎｍであった。

実施例５ フェロ流体およびラテックスビーズの凝集一連の試験管
に、１００μＱのＤ　Ｃ＋８Ａ　Ｓ　（１。

３−ビス［４−（ノヘキサデンルアミノ）ｌ−２，４−
ジヒドロキンノクロブテンジイリウムジヒドロキシド）
、ビス（内部塩）染色カルボキンルラテックスビーズ（
外径０．４５５μ、推定値的１．５×１０８ビーズ／靜
、実施例７、Ａ項記載の方法により製造ＸＰ　Ｂ　Ｓ緩
衝液中）、７００μＱの希フレオン処理正常ヒト血清（
２，５％、ＰＢＳ中）および１００μｇの新たに希釈さ
れた市販の、水ベース含鉄流体ＥＭＧ　８０５　（２０
０ｇＫフェロフルイディクス社製、ナンユア、ニューハ
ンプシャー、ＰＢＳ中１中火０％分の測定値〜１７ｍｇ
／Ｒσ）をピペットにより入れた。次いで０．０１１モ
ルのβ−ＣＤ（β−ツクＣｌデギストラン）を含有する
ＰＢＳ中０，５％ポリブレン１００μｇをうず上に加え
た。直ちに、２６６キロガウスの磁場の強さを有ずろコ
ーニング（ｃｏｒｎｉｎｇ）磁気分離器中に試験管を置
いた。次いで異なる分離時間で、分離された液体の５０
０μＱアリコートを試験管から採取し、等容量のＰＢＳ
緩衝液で希釈し、実施例２記載にしたがい蛍光を測定し
た。対照として、磁性粒子を用いずに全蛍光を測定する
と６０４２０ＫＨｚであった。結果の要約を第７表に示
す。

第７表 分離時間　　　　　　　　　蛍　　光 （秒）　　　　　　　　（Ｋｌ（ｚ）　　　　　　　％
６０５２６０．８７ ３０　　　　　　　７２７　　　　　１．２２０　　　
　　　　９３３　　　　　１．５ｔｏ　　　　　　　１
１９７　　　　　２．００　　　　　６０４２０　　　
１００．０結果は、この発明によるポリブレン凝集率が
１分て９９％を越えることを示す。

実施例６ フェロ流体およびラテックスビーズの凝集に対するラテ
ックスビーズ濃度の影響 実施例５と同様のプロトコルを用いた。様々な濃度のラ
テックスビーズけん濁液を調製した（約１０７〜ｌ０１
０ビーズ／Ｉ□。各ストックけん濁液１００μＱを試験
管に取った。次いで各試験管に７００μＱの希釈血清（
ＰＢＳ中２．５％）および１００μρの希釈含鉄流体を
加えた。ｏ、ｏ　ｔ　ｔモルのβ−ＣＤを含有するＰＢ
Ｓ中０．５％ポリブレン１００μＱを加えた後、混合物
を渦巻かせ（〜３秒）磁気分離器に入れる前に全部で１
０秒になるまでブレインキュベートした。ポリブレンを
加えて正確に１分後（磁気分離時間５０秒）、分離され
た液体の５００μＱアリコートを採取し、１Ｒ（ｌに希
釈し、蛍光を測定した。対照は磁性粒子を用いず、測定
前に適当な濃度に希釈した。

結果の要約を第８表に示す。

第８表 蛍　　　光 ビーズストック （ビーズ／ｍ＆）　　　　総量　　　残り　　　（％）
１．２Ｘ　１０”　　　３．４１Ｘ　１０５３３０６０
　　　（０，９７）６ＪＸ　１０’　　　　１．８６Ｘ
　１０’　　　１８５１６　　　（１，０）Ｌ、２Ｘ　
１０’　　　　５．４３ｘ　ＬＱ’　　　５２１８　　
　（０，９６）７．９Ｘ　１０８２．７１Ｘ　１０’　
　　１７１３　　　（０，６３）１．６Ｘ　ｔｏ”　　
　　５．８９ｘ　ｔｏ’　　　　７３２　　　（１，２
）７．９ＸＩＯ’　　　　３．２１Ｘ１０３５０９　　
　（１，６）１、ＱＸ　ＩＱ７４．６０Ｘ　１ｏ２３６
１　　　（Ｌ８）上記実施例は、ＩＱＩＱビーズ／１Ｗ
Ｉ２以下の濃度のラテックスビーズがこの発明によると
１分未満で効率的に除去され得ることを示す。

実施例７ Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のアッセイこのアッセ
イについて記載する前に若干の用語を定義ずろ。

ｆｌ　Ｔ−室ｌ益、 ＥＤＡ（、−１−エヂルー３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド、 ＰＢＳ−燐酸緩衝食塩水、 ＤＴＥ−ノ千オトリエトール、 ＥＤＴＡ−エチレンノアミンチトラアセテート、ナトリ
ウム塩、 ＢＳＡ−ウシ血清アルブミン、 ＩｇＭ−免疫グロブリンＭ１ ｒｇＧ−免疫グロブリンＧ、 Ｎ　ＨＳ　−Ｎ−ヒドロキシスクンンイミド、ＭＰ−磁
性粒子、 ＬＩＳＳ−グリシン１８９／リツトル、燐酸カリウム２
３０　ｒｔｒｇ／リットル、燐酸ナトリウム、スクアラ
イン染料−ＤＣ１８Ａ　Ｓ　０Ａ、スクアライン染色ラ
テックスビーズの製造−律０．７１６　ミクロン直径の
カルボキンル化ポリスチレン粒子（ビーズ）をデューク
・サイエンティフィック社（カリフォルニア９４３０４
、ｊく口・アルド）から購入した。粒子はダウ・ケミカ
ル社（コロラド８０２３９、デンノ＜−）製であり、脱
イオン水中１０重１％のけん濁固体および痕跡量の非イ
オン性界面活性剤を含む１５ｍ＆のバイアルに包装され
ている。

染色するためにビーズを、遠心分離（１５０００ｒｐｍ
、１０分間）および上清液の傾しやにより製造した。沈
殿物をエチレングリコールに再けん蜀して遠心分離前と
同じ容量にした。

スクアライン染料は、還流するｎ−ブタノール−ベンゼ
ン中水を共沸除去しなからスクアリン酸をジヘキサデシ
ルフェニルアミン（モル比２：ｌ）と縮合することによ
り製造された。

５００マイクログラムのスクアライン染料を、１４０°
に維持された油浴中に固定された小さな管またはバイア
ル（磁性撹拌枠付）中、０．５　ｍＱの熱ベンノルアル
コールに溶かした。染料溶液を１ｍσのエチレングリコ
ールでゆっくりと希釈した。

１ミリリツトルのエチレングリコールビーズけん尚液を
激しく撹拌しなから熱染料溶液に滴下した。１５分間撹
拌を続けた。次いで混合物をピペットにより７０％エタ
ノール水溶液５〜ＩＯｍＱに入れた。染色されたビーズ
を遠心分離し、７０％エタノールで２回洗浄し、次いで
遠心分離後ビーズを音波処理して分散させた。ビーズを
脱イオン水で２回洗浄し、次に脱イオン水中にｌｙ、Ｑ
当たり固体１００＋９を越えない濃度で貯蔵した。

Ｂ、アビジンビオチン相互作用によるスクアレート染色
ラテックスビーズへの抗体付着・ｌ、スフアレートラテ
ックスビーズへのアビジンの共有結合 スクアレート染色ラテックスビーズ（０，８５ＩＣ１２
，３ｘｌＯ目ビ一ズ／ｍ４．０．７１６μｍ直径）を２
ｍＱの蒸留水にけん蜀し、カルホキノル基を３〜４分間
室温でＥＤＡＣ（シグマ、１８．７５ｍ９をビーズけん
濁液に加えた）と反応させることにより活性化した。次
いで活性化ビーズをアビノンＤ溶液（ベクター、アイオ
ワ５２３０２、マリオン、３ｒｔｔＱの０１モルＮａＣ
Ｑ中１５ＸＩ＋９）に加え、ときどき音波処理しながら
反応を室温で一夜行なった。

ビーズを遠心分離により洗浄し、１％ＢＳＡ（シグマ、
ミズーリ６３１１８、セントルイス、ｒｚ　ｉＡグレー
ド）を含有する緩衝１（０、１７モルグリシン、Ｑ、１
モルＮａＣρ、ｐＨ９，２）にけん濁することによりＢ
ＳＡで被覆した。ビーズを遠心分離により洗浄し、次い
で１時間室温でインキュベーションし、ＢＳＡを含まな
い曲記緩衝液（：３ｏ２）に再けん澗した。

ビオチン結合能１４０−ビオチンを用いて測定すると６
×１０６個のビーズに対し７７ピコモルを示した。

２、ビオチニル化抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体の製
造 抗１−Ｉ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇモノクローナル抗体１ｇＧｌ
（セルチクまたはロイヤル・フリー・ポスピタル、イギ
リス、ロンドン、蛋白質Ａアフィニティー・クロマトグ
ラフィーにより精製、０．１モル燐酸緩衝液中１　、０
　ｍ９／ｍＱＳｐＨ８、２）を室温で４時間２５倍モル
過剰ビオチニル−Ｎ　Ｉ−Ｉ　Ｓ　（シグマ、ミズーリ
６３１１８、セントルイス、Ｄ　Ｍ　Ｉ＞中３．４ｍｇ
／７７ｔｌ）と反応させた。

３、アビ゛ジンスクアラインラテノクスビーズ」二にお
けるビオチニル化抗体の固定化 ビオチニル化抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体（０，４
Ｈｌｏ　１モル燐酸緩衝液、ｐＨ８，２）を室温で２時
間アビノンラテックスビーズ（１，２５Ｘ　１０１０ビ
ーズ）とインキュベートした。遠心分離によりビーズを
洗浄し、０．Ｏ１モルグリンン、０．Ｏ１モルＮａＣＱ
、　ｐＩ４８　、２．０．２％ＢＳＡ、０．０５％トウ
ィーン（Ｔ　ｗｅｅｎ）　２０に再けん濁した（最終ビ
ーズ濃度６．２５　ｘ　１０８／ｉＱ）。

Ｃ，スクンニル化磁性粒子の製造 ２００１ｇの磁性粒子（アドバンスト・マグネティック
社、マサチューセッツ０２１３８、−キャンプリッジ、
ＢｉｏＭａｇ４１００．４　ｚＱ）を磁気分離により洗
浄しく３Ｘ４ＯＮ１２０．１モル燐酸緩衝液、ｐＨ７、
０）、１５ｚｅの上記緩衝液に再けん濁した。

粒子をコハク酸無水物（ＤＭＦ中１モル、５ｚｇ）と２
時間にわたって５アリコート加えることにより（加える
たびにｐ）（を７４０に調節した）反応させた。

スクシニル化された粒子を磁気分離により洗浄しく３Ｘ
４０Ｊの０１モル燐酸緩衝液、ｐＨ７、０および２　ｘ
４０ｘＱＬ　Ｉ　Ｓ　Ｓ）、２０ｘＱのＬＩＳＳに再け
ん局し、０．０２％アンドを用いて４℃で貯蔵した。

Ｆ、アッセイプロトコル 試薬 ■、スクアレート染色ラうックスヒビー（直径０７１６
ミクロン、詳細な製法は前出）に共有結合した抗ＨＢｓ
ＡｉｕｇＧ　ｌモノクローナル抗体（セルチクまたはロ
イセル・フリー・ポスピタル、イギリス国ロンドンから
人手）（スクアラインーラテヅクスビーズー抗ＨＢｓＡ
ｇ）。

２、ＨＢｓＡｇ（アボット（Ａｂｂｏｔｔ）正制御、ア
スザイム（ＡＳＵＺＹＭＥ）ＩＩ、６ｎ９／ｉＱ）。

３、磁性粒子：　Ｓ　ｕｃｃ（スクシニル化）　−Ｂ　
ｉｏＭａｇ（１００巧／ｙ（Ｄ、前記と同様に製造。

４、ポリブレン（シグマ、ミズーリ６３１１８、セント
ルイス、平均分子１５０００）ＬｔＳＳ中【０肩ｔｉ／
ｄ。

５．０．２モルシトレート、ｐＨ８，２゜６　、１　ｇ
Ｍ抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体（セルチク）、ＺＸ
ＰＢＳ中０．５〜１．０巧／ＩＱ中。

Ｇ、アッセイ手順 １、スクアレートーラテックスビーズー抗ＨＢｓＡｇ（
５μＱ、３ＸＩＯ’個のビーズ含有）を１００μＱの試
料［Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ｓ中５０％血清、抗原含有または不含
有（１５または３　ｎｇ／　ｘ（Ｄ］に加え、ＲＴで８
分間インキュベートした。

２、ラテックスビーズと磁性粒子を、Ｉθμりのスクシ
ニル化ＢｉｏＭａｇ、次いでｌＯμρのポリブレンを加
えることにより凝集させた。

３．２．３キロガウス（１分）の磁場勾配においてラテ
ックス−ＭＰココアリゲートを磁気分離した。

結果を下記第９表に示す。

４．５０μＱのシトレート中でラテックス−ＭＰココア
リゲートの解離を行なった。

５　、１　ｇＭ抗Ｉ（ＢｓＡｇ（５μｇ）を加え、ＲＴ
で５分間インキュベーションすることにより抗原依存凝
集させた。

６、ラテックスビーズからスクシニル化Ｂ　ｉｏＭａｇ
を磁気分離した。

７．０．２モルのシトレート、ｐＩ−１８，２で希釈し
、レーザー光スキャッタリング（Ｎｉｃｏｍｐ　　ＨＮ
　５−９０）によりスクアラインラテックス凝集を測定
した。結果を下記第１０表に示す。

Ｈ、結果 １．５０％血清から抗ＨＢｓＡｇ−スクアレートラテッ
クスビーズの分離効率 磁気分離後血清中に残存する抗ＨＢｓＡｇ−スクアレー
トラテソクスビーズの量を蛍光分光光度計により測定し
た。

第　　９　　表 上清の蛍光 Ｉ−Ｉ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ含有　　　　　　　Ｔ（Ｂ　ｓ
　Ａ　ｇ不含存（血清中１　、５　ｎｇｌ順） ３．３　　　　　　　　　　　３．９ ３．０　　　　　　　　　　　３．０ ２．２　　　　　　　　　　　５．７ ５．８　　　　　　　　　　　１．９ （抗ＨＢｓＡｇ−スクアレート染色うテックスビーズア
ッセイの全蛍光単位−９８） 上記結果は、この発明により媒質から染色ラテックスビ
ーズが効率的に分離されたことを示す。

２．ＨＢｓＡｇアッセイ結果の要約を下表に示す。

第　　［０表 平均直径（ｎｍ） ＨＢｓＡｇ含有　　　　　　　ＨＢｓＡｇ不含有（血清
中１　、５　ｎ９／１（１） 上記結果は、この発明による分離法を用いてＨＢｓＡｇ
の感受性アッセイが行なわれ得ることを示す。ＨＢｓＡ
ｇが媒質に存在するとき、実質的に高いレベルの凝集が
観察された。

実施例８ 甲状腺刺激ホルモンのアッセイ Ａ略語および幾つかの材料、 Ｔ　Ｓ　ｌ−ｌ−甲状腺刺激ホルモン、ヒト（ｈ）、Ｍ
Ｐ−磁性粒子、 ＦＦ−フェロフルイディクス社製含鉄流体（ＥＭＧ８０
５．２００ｇ）、 ＬＣ−長鎖、 １１Ｃ６または９Ｄ７−ｈＴＳＨのαサブユニットに対
ずろモノクローナル抗体、 ％Ｂ−％１２Ｊ−ＴＳＩ−１結合（特異結合）、％Ｎ５
Ｂ−％非特異結合、 ＢＭＰ−アドバンスト・マグネティ・ツク社製ＢｉｏＭ
ａｇ粒子、 緩衝液Ａ−ＰＢＳ＋０．１％ｌ３ＳＡ＋０．０５％トウ
ィーン（Ｔ　ｗｅｅｎ）　２０、ｐト（７，４、ＰＢ−
ポリブレン、 ｒ、を−室温、 Ａｂ−抗体、 Ａｇ−抗原、 面清−ＴＳＨ不含有血清、イミュノーサーチ社製。

Ｂ、”’Ｉ−ＴＳＨとＦＦ−アビジンの結合１００μＱ
のＦＦアビジン（ＦＦ’上にアビジンを吸収させること
により製造）および緩衝液Ａ中ビオチン−ｔ、ｃ−ｉｃ
ｅ、１００μσ（〜１ｔＬ９抗体）および緩衝液Ａまた
は血清中”Ｊ−ＴＳＨＩ００μｇ（〜ｌｎｇ／ｘｃ）を
室温で１５分（緩衝液）または２５分（血清）インキニ
ベートした。

ＰＢＳ中ポリブレン５０μρを加えた。緩衝液の場合、
ＰＢ＝１．６ｆｆｇ／屑Ｑ、１分間。血清の場合、ＰＢ
＝２５ｘ９／ｍ（１，３分間。

コーニング磁気分離器中で３分間材料に２．１〜２．６
キロガウスの磁場を用いた。材料を０．５ｉｏ、ＰＢｓ
＋０．０５％トウィーン（Ｔ　ｗｅｅｎ）　２０で１回
洗浄し、ＭＰを数えた。結果を第１１表に要約する。

第　　１１　　　表 ＦＦ−アビジン　　　　　５１　（１）＊　　６０　（
１）＊ＦＦ−アビジン　　　　　５０　（５）＊　　６
５　（１）＊ＢＭＰ−アビノン（対照）　　Ｎ、Ｄ亨＊
　　６８　（２）＊＊括弧中の％ＮＳＢ ＊＊Ｎ、Ｄ、−測定されていない。

上記結果は、この発明によると、アビジンで被覆された
含鉄流体か、抗体に結合したビオチンと合わせ、ポリブ
レンを加えて粒子を非特異的に１疑集させることにより
分離され得ることを示す。

Ｃ、アビジンを加える”Ｊ−ＴＳＩ（とＦＦの結合 ５０μＱアビジン（２μｇ）、１００μ、２１ｓ（ＴＳ
）（（ｌ樹液ＡまたはＴ　Ｓ　Ｉ−１不含有而清中）お
よび１００μＣビオチン−ＬＣ−１１Ｃ６（緩衝液Ａ中
）をｒｔ、で１５分間インキュベートした。

５０μＱのフェロ流体（〜２００μＱのＦｅ含有）、次
いで５０μＱのポリブレンを加えた。緩衝液におけるア
ッセイの場合１．６ｍ９／ｍ、Ｑ、血清におけるアッセ
イの場合１２　、５　ｍ９／ｍＱ。

コーニング磁気分離器中で３分間材料に２．１〜２．８
キロガウスの磁場を作用させ、１回洗浄し、数えた。結
果を第１２表で要約する。

第　　１２　　表 Ｆｌ’；”　　　　　５３（ｔｏ）＊　４８（３）＊Ｆ
Ｆ−アビジン（対照＊＊）５１　（１１）＊　　４９（
２）＊ＢＭＰ−アビジン（対照＊＊）　／１．２（３５
）＊　　５２（４）＊＊括弧内の％ＮＳＢ ＊＊前記Ｂ項による。

上記結果は、この発明により含鉄流体を、抗体に結合し
たピオチンおよびアビジンと合イつせ、ポリブレンを加
えて粒子を非特異的に凝集させることにより分離するこ
とができることを示゛す。

Ｄ、ＦＦ−アビジンとの競合的ＴＳＨアッセイ血清中０
．２００ｎ９．２μ７．２０μりおよび２００ｕｑ／、
ｗＱ、の割合のＴＳＨ５０μ（２（すなわち０゜１０μ
ｇ、１１００ｎ、１μ９およびｌｏｕｇ／アッセイ）、
血清中５０ｔｔＱの＋２５ｒ　−Ｔ　Ｓ　Ｈ（２ｎｌ？
／ｍＱ、０　、１　ｎｑ／アッセイ）、緩衝液Ａ中ビオ
ヂンーＬ　Ｃ−９Ｄ７、！００μＣ（１μｇＡｂ／アッ
セイ）および前記にしたがい製造されたＦＦ−アビジン
を合わせ、室温で１５分間インキュベートした。１２゜
５、ｏ／ｉ（！の割合のポリブレン５０μρを加えた。

３分後、材料に２．１〜２．６キロガウスの磁場を作用
させ、分離し、洗浄し、カウントした（Ｆ前記と同様）
。

結果を第１３表に要約する。

第１３表 Ｔ　Ｓ　ＩＩ　（ｎｙ／ア・・ｌセイ）　　　　　　Ｊ
Ｌｏ　　　　　　　　　　　　　４９ ＋００　　　　　　　　　　　　４８ ＋０００　　　　　　　　　　　　２１１００００　　
　　　　　　　　　　　３．３」二足結果は、この発明
による分離法を用いて′ＦＳｌ＋のアッセイが行なイっ
れ得ることを示す。ＴＳＩＩが媒質に存在する場合、実
質的に低いパーセントの結合が観察された。

Ｅ、アビノンを加えたＦＦとの競合的Ｔ　Ｓ　ｔ（アッ
セイ 血清中０．２００ｎ９．２μ９．２０μ９および２゜Ｏ
μ９／Ｍρの割合）Ｔ　Ｓ　Ｉ−Ｉ　５０　μ（！（ず
なイッち、０１０μｇ、１００ｎ９．１μ９および１０
μｇ／アッセイ）、血清中５０μρの”Ｊ　−ＴＳＨ（
２ｎ９／ｚ（！、０　、　Ｉ　ｎｇ／アッセイ）、緩衝
液Ａ中１００μ（のピオチン−ＬＣ−９Ｄ７Ｃ１μｇＡ
ｂ／アッセイ）および５０μＣのアビノン（２μ９／ア
ツセ／）を１５分間室温でインキュベートした。次いで
、５０μｅのＦＦ（２００μ９のＦｅ含有）を加え、５
公役１２゜５　’７！？／１ｌＩｆ！のポリブレン５０
μＱを加えた。３公役材料に２１〜２．６キロガウスの
磁場を作用させ、分離し、洗浄し、カウントした（前記
と同様）。

結果を第１４表に要約する。

第　　１４　　表 Ｔ　Ｓ　ＨＣｎ９／アツセイ）　　　　　　　　％Ｂ＋
　００　　　　．１２ １００００　　　　２．５ 上記結果は、この発明による分離を用いてＴＳ［（のア
ッセイが行なわれ得ることを示す。Ｔ　Ｓ　Ｈが媒質に
仔注する場合、実質的に低いパーセントの結合か観察さ
れた。

前記発明について明確に理解できるようにある程度詳し
く実例および実施例により説明したが、ある種の変化ま
たは修正が特許請求の範囲内で行なわれ得ることは明ら
かであろう。

特許出願人　シンテックス（ニー・ニス・エイ）インコ
ーホレイテッド 代　理　人　弁理士　青　山　葆　ほかＩ名第１頁の続
ぎ ＠発明者　ナリス・カーノ　アメ ア・ ＠発明者　リタイ・ウエン　アメ ンΦ リカ合衆国カリフォルニア、パー口・アルド、プレコー
ト９７田昏 リカ合衆国カリフォルニア、マウンテン・ビュー、サル
イス・アベニュー１４１幡

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. （１）非磁性粒子および磁性粒子を非特異的に結合させ
   る条件下で非磁性粒子を含有する液体媒質を磁性粒子と
   合わせ、媒質に磁場勾配を用いることにより媒質から結
   合した粒子を分離することからなる、液体媒質からけん
   濁した非磁性粒子を分離する方法。
2. （２）非特異的結合が電荷相互作用の結果である、特許
   請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）非磁性粒子が磁性粒子と非特異的に結合する条件
   に、ポリブレン、ポリエチレンイミン、カルシウムイオ
   ンまたはバリウムイオンからなる群から選ばれたポリカ
   チオンであるポリイオン性試薬を媒質に加えることが含
   まれる、特許請求の範囲第２項記載の方法。
4. （４）結合した非磁性粒子を試薬で処理することにより
   磁性粒子との結合を逆行させ、好ましくは結合を逆行さ
   せる試薬がポリカチオン性またはポリアニオン性試薬か
   らなる群から選ばれたポリイオン性試薬である、特許請
   求の範囲第２項記載の方法。
5. （５）非磁性粒子が、生物粒子および合成粒子からなる
   群から選ばれ、好ましくは生物粒子が赤血球である、特
   許請求の範囲第１項記載の方法。
6. （６）非磁性粒子と合わせる前に磁性粒子がフェロ流体
   （ｆｅｒｒｏｆｌｕｉｄ）中に存在している、特許請求
   の範囲第１項記載の方法。
7. （７）分析質を含有する疑のある試料における分析質の
   測定方法であって、分析質が特異的結合対（ｓｂｐ）の
   一メンバーであり、標識されたｓｂｐメンバーを分析質
   濃度に関係してアッセイ混合物から分離する方法であり
   、さらに アッセイ媒質中で試料、磁性粒子および標識されたｓｂ
   ｐメンバーを合わせ（ただし、粒子は標識されたｓｂｐ
   メンバーに結合することができる）、化学的手段により
   磁性粒子を非特異的にアグリゲート（凝集）することに
   より標識されたｓｂｐメンバーを媒質から分離し、そし
   て 標識されたｓｂｐメンバーの存在について媒質または磁
   性粒子を検査する ことからなる特許請求の範囲第１項記載の方法。
8. （８）標識されたｓｂｐメンバーが非磁性粒子またはそ
   の成分であり、非磁性粒子および磁性粒子が非特異的に
   コアグリゲート（ｃｏａｇｇｒｅｇａｔｅ）する、特許
   請求の範囲第７項記載の方法。
9. （９）非磁性粒子が生物粒子および合成粒子からなる群
   から選ばれ、好ましくは生物粒子が赤血球である、特許
   請求の範囲第８項記載の方法。
10. （１０）液体媒質中で全血試料および荷電磁性粒子を合
    わせることからなる、全血から細胞を分離するための特
    許請求の範囲第２項記載の方法。
11. （１１）液体媒質中に分散した物質を媒質から分離する
    方法であって、物質と磁性粒子を結合させ、磁性粒子を
    アグリゲートさせ、媒質に磁場勾配を作用させることに
    よりアグリゲートした磁性粒子を媒質から分離すること
    からなり、非特異的に磁性粒子をアグリゲートさせる化
    学的手段を媒質に含ませることにより磁性粒子をアグリ
    ゲートさせる点で改良の見られる方法。
12. （１２）媒質が水性であり、磁性粒子が荷電状態であり
    、化学的手段が電荷の相互作用により磁性粒子をアグリ
    ゲートさせるものである、特許請求の範囲第１１項記載
    の方法。
13. （１３）化学的手段が低イオン強度緩衝液および電荷が
    磁性粒子とは反対のポリイオン性試薬からなる群から選
    ばれたものである、特許請求の範囲第１２項記載の方法
    。
14. （１４）リガンド（配位子）およびその相補的受容体か
    らなる特異的結合対（ｓｂｐ）の一メンバーと結合して
    おり、（ｂ）磁性粒子または互いに非特異結合した磁性
    粒子のアグリゲートと非特異的に静電気結合した（ａ）
    非磁性粒子のアグリゲートを含む組成物。
15. （１５）分析質を含有する疑のある試料中の分析質を測
    定するアッセイを行なうためのキットであって、分析質
    が配位子およびその相補的受容体からなる特異的結合対
    の一メンバーであり、そして（ａ）分析質に相補的なｓ
    ｂｐメンバー、（ｂ）分析質も相補的ｓｂｐメンバーも
    荷電粒子と結合していない場合荷電粒子と結合したｓｂ
    ｐメンバー、（ｃ）荷電粒子が磁性でない場合荷電磁性
    粒子および（ｄ）荷電粒子および荷電磁性粒子を凝集さ
    せるための非特異的化学結合剤を含むキット。