CN109444401A - 一种磁微粒化学发光产品的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磁微粒化学发光产品的制备方法，首先将磁珠原液加入到缓冲溶液中，混匀后磁铁分离，弃上清备用；用缓冲溶液配制多聚糖溶液，加入高碘酸钠进行反应；待反应结束，加入EDC溶液和NHS溶液，混合均匀后将第一步洗涤过的磁珠加入，继续反应；将反应溶液进行磁铁分离，弃上清后加入缓冲溶液对磁珠进行洗涤；在洗涤后的磁珠中加入缓冲溶液和包被活材，混匀反应；磁铁分离弃除上清后，加入封保液振荡反应；磁铁分离后，将磁珠定容到磁珠封保液中，制备工作完成，2~8℃保存。本发明方法修饰的磁珠表面的羧基密度高，活性位点较多，并且羧基活性高、偶联效率高、抗原抗体包被量多，能够有效提高磁珠分散性、灵敏度和检测范围。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂，尤其是涉及一种磁微粒化学发光产品的制备方法。
背景技术
磁微粒化学发光产品（磁性微球）是基于化学发光免疫分析技术开发的一类体外诊断试剂，具有检测超微量活性物质的功能。羧基和氨基是两种常用的修饰磁性微球的活性基团。一定条件下，通过中间体活化，可与抗体或抗原上的氨基或羧基偶联。其中，氨基修饰的磁性微球表面的氨基活性较好，很容易与抗体或抗原进行化学偶联。在使用戊二醛过程中，戊二醛作为空间臂对磁珠表面的氨基和抗体或抗原表面的氨基进行偶联，可获得很高的包被量。但该方法活化阶段常常生成不稳定的席夫碱，还需要添加还原剂如硼氢化钠或氰基硼氢化钠，这常常会引起蛋白等变形失活，同时戊二醛也会导致磁珠和抗体或抗原发生自身交联，导致磁珠、蛋白内部交联，不利于抗原抗体的包被。
目前，国内的纳米微球修饰技术也在逐步展开，也就是说在纳米微球表面包覆涂层，经过修饰、改性磁珠表面的功能和性质，然后进行偶联抗原抗体。
常见的包覆涂层有二氧化硅，但二氧化硅修饰常常引入新的问题，二氧化硅本山带有负电荷，常常会吸附带正电荷的蛋白产生非特异性吸附。多糖类修饰磁珠，可显著改善磁珠的生物相容性，改善磁珠的亲水性，其表面的羟基可做进一步的修饰，如琼脂糖、葡聚糖等等，越来越受到更多人的青睐。
目前，在磁微粒包被CA199单克隆抗体的工艺中，羧基磁珠经过EDC、NHS活化并与CA199单克隆抗体进行连接，直接使用封保液进行封闭和保存，该工艺表现为磁珠包被CA199单克隆抗体的效价较低，且磁珠分散性、灵敏度和检测范围较差。
发明内容
本发明的目的在于提供一种磁微粒化学发光产品的制备方法，该方法利用多聚糖对磁珠进行修饰，可显著改善磁微粒的抗板结能力，进而可大大提升磁微粒化学发光试剂盒的检测范围。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的磁微粒化学发光产品的制备方法包括下述具体步骤：
第一步，将磁珠原液加入到缓冲溶液中，混匀后磁铁分离，弃上清备用；
第二步，用缓冲溶液配制多聚糖溶液，加入高碘酸钠进行反应；
第三步，待第二步反应结束，加入EDC溶液和NHS溶液，混合均匀后将第一步洗涤过的磁珠加入，继续反应；
第四步，将第三步的反应溶液进行磁铁分离，弃上清后加入缓冲溶液对磁珠进行洗涤；
第五步，在第四步洗涤后的磁珠中加入缓冲溶液和包被活材，混匀反应；
第六步，磁铁分离弃除上清后，加入封保液振荡反应；
第七步，磁铁分离后，将磁珠定容到磁珠封保液中，制备工作完成，2~8℃保存。
本发明所用缓冲溶液为磷酸盐、碳酸盐、吗啉乙磺酸、DMF、DMSO、甲醇、乙醇溶液中的一种。
本发明所用多聚糖溶液的浓度为0.5~5%；其中多聚糖为葡聚糖、果糖、纤维素、透明质酸、壳聚糖中的一种。
本发明第二、第三步中所用的EDC、NHS、多聚糖、磁珠之间的质量比为5~50:10-30:3~25:15~40。
本发明第五步中包被活材的浓度为2~5mg/mL。
本发明第六步所用的封保液为含有1~10%氨基酸、1~10%表面活性剂的缓冲液；所用的氨基酸为常见的氨基酸（如甘氨酸、精氨酸、酪氨酸、组氨酸、谷氨酸等氨基酸），所用表面活性剂为SPan80、吐温~80，SDS、CTNB、TritonX-100中的一种；所用缓冲液为碳酸盐、磷酸盐、吗啉乙磺酸、DMF、DMSO、甲醇、乙醇中的一种。
本发明的优点在于：多聚糖中的羟基经过高碘酸钠氧化为羧基，进而被EDC、NHS活化，生成磁性微球中间体，再利用NHS基团与抗原抗体上的氨基进行偶联。本发明方法修饰的磁珠表面的羧基密度高，活性位点较多，并且羧基活性高、偶联效率高、抗原抗体包被量多，能够有效提高磁珠分散性、灵敏度和检测范围。
附图说明
图1是本发明制备的磁珠和常规磁珠的抗板结效果对比图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，以方便本领域技术人员的理解。如无特殊说明，本实施例中所用的试剂和检测仪器均为市售产品，方法为本行业常规方法。
实施例1 制备多聚糖磁微粒混悬液（本发明磁微粒化学发光产品）
其具体步骤如下：
1、取30μL磁珠原液加入到300μL 0.01~0.1mol/L碳酸盐缓冲溶液中，在振荡器上混匀5min，磁铁分离，弃除上清，重复5次；
2、用碳酸盐缓冲溶液配置1~10mg/mL 葡聚糖溶液，取100μL葡聚糖溶液加入反应容器中，加入100μL5~30mg/ml 高碘酸钠溶液，振荡器震荡混匀2h；
3、用碳酸盐缓冲溶液分别配置浓度为10~50mg/mL 的EDC溶液和浓度为10~50mg/mLNHS溶液，加入步骤2反应后的溶液中，振荡器震荡混匀2h；
4、活化后的磁珠在碳酸盐缓冲溶液中洗涤两次，具体操作和步骤1一致；
5、将洗涤后的磁珠加入步骤4中的反应器中继续反应2h；
6、磁铁分离，弃除上清，重复5次，加入到300μL 0.01~0.1mol/L碳酸盐缓冲溶液中洗涤2次；加入碳酸盐缓冲溶液和5~20μL CA199单克隆抗体，共计100uL，在振荡器混匀反应2h；
7、包被反应结束后，在包被体系中直接加入100μL 0.1%~10% BSA水溶液，在振荡器中反应24h；
8、磁铁分离弃上清，加入300μL封保液，振荡反应5min，重复4次；
9、磁铁分离弃上清，最后将磁珠定容到3mL的磁珠封保液中，2~8℃保存，磁微粒混悬液制备工作完成。
实施例2 制备氨基磁微粒混悬液（对照例）
其具体步骤如下：
1、取30μL磁珠原液加入到300μL 0.01~0.1mol/L 碳酸盐缓冲溶液中，在振荡器上混匀5min，磁铁分离，弃除上清，重复5次；
2、用碳酸盐缓冲溶液分别配置浓度为1~10%戊二醛溶液加入磁珠中，振荡器震荡混匀1h；
3、活化后的磁珠在碳酸盐缓冲溶液中洗涤两次，具体操作和步骤1一致；
4、磁珠洗涤后，加入碳酸盐缓冲溶液和5~20μLCA199单克隆抗体，共计100~200μL，在振荡器混匀反应2h；
5、磁铁分离弃上清，加入300μL封保液，振荡反应5min，重复4次；
6、包被反应结束后，磁珠进行磁铁分离，弃上清，最后将磁珠定容到3mL的磁珠封保液中，2~8℃保存，磁珠混悬液的制备工作完成。
实施例3 实施例1、实施例2制备的磁珠混悬液的分散性对比
将实施例1和实施例2分别制备的磁珠混悬液放在磁铁侧面静置磁吸过夜（＞12h），然后放在载机混匀器上混匀，分别观察30min 、90min、150min、210min磁微粒的分散状态，如图1所示。从图1中可以看出，磁吸过夜，载机30min，氨基磁微粒（图1左侧图片）底部明显有较多颗粒，直至混匀210min，底部依然有肉眼可见颗粒。而本发明制备的多聚糖磁微粒载机30min即可混匀（图1右侧图片）。
实施例4 实施例1、2制备的两种磁微粒混悬液进行CA199抗原定量检测
1、材料与仪器
试剂：采用市售CA199试剂盒中的试剂，激发液为H2O2和鲁米诺；
磁微粒：两种磁微粒混悬液中磁珠浓度均与市售CA199试剂盒中磁珠浓度一致；
检测仪器：全自动化学发光检测仪。
2、将试剂和待测样本准备好放入机器中，每种磁珠混悬液测试两次。
3、待测样本为五个不同浓度的样本，分别为S0(浓度0U/mL)、S1(浓度9.15U/mL)、S2(浓度50.9U/mL)、S3(浓度104.8U/mL)、S4(浓度428.22U/mL)、S5(浓度884.5U/mL)。检测结果见下表1。
表1 两种磁微粒混悬液发光值
从表1数据可以看出，在磁微粒包被CA199单克隆抗体完成以后，采用本发明方法制备的磁微粒化学发光产品（磁微粒混悬液），能够有效提高磁珠的包被效价和灵敏度，拓宽了检测范围。
Claims (6)
1.一种磁微粒化学发光产品的制备方法，其特征在于：包括下述具体步骤：
第一步，将磁珠原液加入到缓冲溶液中，混匀后磁铁分离，弃上清备用；
第二步，用缓冲溶液配制多聚糖溶液，加入高碘酸钠进行反应；
第三步，待第二步反应结束，加入EDC溶液和NHS溶液，混合均匀后将第一步洗涤过的磁珠加入，继续反应；
第四步，将第三步的反应溶液进行磁铁分离，弃上清后加入缓冲溶液对磁珠进行洗涤；
第五步，在第四步洗涤后的磁珠中加入缓冲溶液和包被活材，混匀反应；
第六步，磁铁分离弃除上清后，加入封保液振荡反应；
第七步，磁铁分离后，将磁珠定容到磁珠封保液中，制备工作完成，2~8℃保存。
2.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光产品的制备方法，其特征在于：所述缓冲溶液为磷酸盐、碳酸盐、吗啉乙磺酸、DMF、DMSO、甲醇、乙醇溶液中的一种。
3.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光产品的制备方法，其特征在于：所述多聚糖溶液的浓度为0.5~5%；其中多聚糖为葡聚糖、果糖、纤维素、透明质酸、壳聚糖中的一种。
4.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光产品的制备方法，其特征在于：所述第二、第三步中所用的EDC、NHS、多聚糖、磁珠之间的质量比为5~50:10-30:3~25:15~40。
5.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光产品的制备方法，其特征在于：所述第五步中包被活材的浓度为2~5mg/mL。
6.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光产品的制备方法，其特征在于：所述第六步所用的封保液为含有1~10%氨基酸、1~10%表面活性剂的缓冲液；所述表面活性剂为SPan80、吐温~80，SDS、CTNB、TritonX-100中的一种；所述缓冲液为碳酸盐、磷酸盐、吗啉乙磺酸、DMF、DMSO、甲醇、乙醇中的一种。
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