CN109212179A

CN109212179A - Ca199定量检测试剂盒用磁微粒化学发光产品的制备方法

Info

Publication number: CN109212179A
Application number: CN201811180973.2A
Authority: CN
Inventors: 王慧敏; 王玉堂; 李思雨; 李林; 渠海; 郑业焕; 付光宇; 吴学炜
Original assignee: Autobio Diagnostics Co Ltd
Current assignee: Autobio Diagnostics Co Ltd
Priority date: 2018-10-11
Filing date: 2018-10-11
Publication date: 2019-01-15

Abstract

本发明公开了一种CA199定量检测试剂盒用磁微粒化学发光产品的制备方法：取磁珠原液加入到缓冲溶液中，混匀后，磁铁分离，弃除上清；用缓冲液分别配置二甲基氨基丙基乙基碳酰胺溶液和N~羟基丁二酰亚胺溶液，将其加入磁珠中震荡混匀，洗涤磁珠后，加入缓冲液和CA199单克隆抗体，振荡混匀；磁铁分离弃上清，加入含有氨基酸和表面活性剂的缓冲液进行后封闭、反应，磁铁分离弃去上清，加入封保液反应；磁铁分离后，将磁珠定容，2~8℃保存，磁微粒化学发光产品制备完成。本发明制备方法简单，在原有方法的基础上，在磁珠包被CA199单克隆抗体完成以后，添加氨基酸封闭的过程，使包被等磁微粒效价更高，可以实现更宽等检测范围。提高其灵敏度和磁珠分散状态。

Description

CA199定量检测试剂盒用磁微粒化学发光产品的制备方法

技术领域

本发明涉及体外诊断技术，尤其是涉及一种CA199定量检测试剂盒用磁微粒化学发光产品的制备方法。

背景技术

糖类抗原CA199是细胞膜上的一种糖脂质，分子量为1000KD，胰腺癌血清中CA199的水平是正常均值的683倍，是目前胰腺癌的有效标志物，临床检测中通常通过检测CA199水平确定血清样本是否来源于胰腺癌患者。

目前检测CA199的方法主要包括酶联免疫分析方法和化学发光分析方法，其中，化学发光分析方法和酶联免疫分析法相比较，前者具有易于自动化、操作简便、灵敏度高、检测范围宽等优点，因而具有较大范围的应用。

CA199定量检测试剂盒包括三个组分：CA199校准品、包被CA199单克隆抗体的固相载体以及辣根过氧化物酶标记的CA199单克隆抗体。其中固相载体包括微孔板、磁性颗粒等，其中以磁微粒为固相载体在磁微粒化学发光产品中最为常见。

磁微粒化学发光产品是基于化学发光免疫分析技术开发的一类体外诊断试剂，具有检测超微量活性物质的功能，和现有的其它诊断试剂相比较，具有准确度高、灵敏性高、精密性好等优点。

磁微粒化学发光产品的技术组成包括免疫技术和化学发光技术两大部分。磁微粒首先通过自身包被抗原或者抗体，将抗原或者抗体进行固相化，制备出磁微粒混悬液，加入酶标记的抗原或抗体以及待检样本，待检样本中的抗原或抗体、磁珠表面的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体通过一定反应模式发生免疫反应，之后加入标记酶的反应底物并将其催化成为有色产物，通过检测有色产物的含量从而鉴定待检样本中抗原以及抗体的含量。

在免疫中使用的磁微粒结构主要包括两部分，具有免疫配基和载体磁性微球，根据免疫配基的不同，目前主要使用的磁珠主要有氨基磁珠、羧基磁珠、羟基磁珠、醛基磁珠等。免疫磁珠中的免疫配基和抗原或者抗体中的免疫配基发生免疫反应结合到磁性载体，在外界磁力存在的情况下，免疫磁珠在混合溶液中移动，从而将靶物质进行分离。

目前用于制备磁微粒化学发光产品所用到的羧基磁珠，其中一种包被抗原或抗体的流程为羧基磁珠首先经过二甲基氨基丙基乙基碳酰胺活化，之后可以与抗原或者抗体的氨基发生化学连接，从而将抗原或者抗体固相化到磁珠表面，用于检测反应，其反应原理见图1。其中在磁微粒包被CA199单克隆抗体的工艺中，羧基磁珠经过EDC活化并与CA199单克隆抗体进行连接，直接使用封保液进行封闭和保存，该工艺表现为磁珠包被CA199单克隆抗体的效价较低，且磁珠分散性、灵敏度和检测范围较差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种CA199定量检测试剂盒用磁微粒化学发光产品的制备方法，可有效提高磁珠的分散性、灵敏度和检测范围。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的CA199定量检测试剂盒用磁微粒化学发光产品的制备方法包括下述步骤：

第一步，取30μL磁珠原液加入到300μL缓冲溶液中，在振荡器上混匀5min，磁铁分离，弃除上清，重复5次；

第二步，用缓冲溶液分别配置浓度10~50mg/mL的二甲基氨基丙基乙基碳酰胺溶液和浓度10~50mg/mL的N~羟基丁二酰亚胺溶液；将其加入第一步处理后的磁珠中，振荡器震荡混匀1~2h；

第三步，经第二步活化后的磁珠在缓冲液中洗涤两次，操作方法同第一步；

第四步，磁珠洗涤后，加入缓冲溶液和5~20μLCA199单克隆抗体，振荡器混匀反应2~3h；

第五步，磁铁分离弃除上清，加入含有1~10%氨基酸、1~10%表面活性剂的缓冲液进行后封闭，在振荡器上反应20~24h；

第六步，磁铁分离弃去上清，加入300~600μL封保液，振荡反应5~10min，重复4次；

第七步，磁铁分离后，将磁珠定容到3~6mL的磁珠封保液中，2~8℃保存，磁微粒化学发光产品制备完成。

第一步和第二步中所述的缓冲溶液为磷酸盐、碳酸盐、吗啉乙磺酸、DMF、DMSO、甲醇、乙醇溶液中的一种。

第二步中所述二甲基氨基丙基乙基碳酰胺溶液和N~羟基丁二酰亚胺溶液的比例为10:1~1:10，其体积分别为20~100μL。

第四步中加入的所述CA199单克隆抗体的浓度为2~5mg/mL，其体积为5~20μL；所述缓冲溶液和CA199单克隆抗体的总体积为100~200μL。

第五步中所述的表面活性剂为SPAN80、吐温~80，SDS、CTNB、TritonX-100中的一种；所述缓冲液为碳酸盐、磷酸盐、吗啉乙磺酸、DMF、DMSO、甲醇、乙醇溶液中的一种。

本发明中所用的氨基酸为常见的如甘氨酸、精氨酸、酪氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等氨基酸。

本发明的优点在于制备方法简单，在原有方法的基础上，在磁珠包被CA199单克隆抗体完成以后，添加氨基酸封闭的过程，使包被等磁微粒效价更高，可以实现更宽等检测范围。提高其灵敏度和磁珠分散状态。

附图说明

图1是磁珠反应原理图。

图2a、图2b、图2c是三种不同制备方法的磁珠分散状态对比。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，以便于本领域技术人员的理解。

实施例1 传统方法制备的磁微粒化学发光产品

其步骤包括：

1）取30μL磁珠原液加入到300μL 0.01~0.1mol/L 碳酸盐缓冲溶液中，在振荡器上混匀5min，磁铁分离，弃除上清，重复5次。

2）用碳酸盐缓冲溶液分别配置浓度为10~50mg/mL 的EDC溶液和浓度10~50mg/m LNHS溶液；取体积为20~100μL的 EDC溶液和20~100μL的NHS溶液加入磁珠中，振荡器震荡混匀1h;

3)活化后的磁珠在碳酸盐缓冲溶液中洗涤两次，具体操作和步骤1一致；

4）磁珠洗涤后，加入碳酸盐缓冲溶液和5~20μLCA199单克隆抗体，共计100~200μL，在振荡器混匀反应2h；

5）磁铁分离弃上清，加入300μL封保液，振荡反应5min，重复4次；

6）包被反应结束后，磁珠进行磁铁分离，弃上清，最后将磁珠定容到3mL的磁珠封保液中，2~8℃保存，磁微粒化学发光产品（磁珠混悬液）的制备工作完成。（分散性见图2a）。

实施例2 采用BSA后封闭磁微粒化学发光产品的制备方法

其步骤包括：

1）取30μL磁珠原液加入到300μL 0.01~0.1mol/L碳酸盐缓冲溶液中，在振荡器上混匀5min，磁铁分离，弃除上清，重复5次；

2）用碳酸盐缓冲溶液分别配置浓度为10~50mg/mL 的EDC溶液和浓度为10~50mg/mLNHS溶液；取体积为20~100uL的 EDC溶液和20~100μL的NHS溶液加入磁珠中，振荡器震荡混匀1h；

3）活化后的磁珠在碳酸盐缓冲溶液中洗涤两次，具体操作和步骤1一致；

4）磁珠洗涤后，加入碳酸盐缓冲溶液和5~20μLCA199单克隆抗体，共计100uL，在振荡器混匀反应2h；

5）包被反应结束后，在包被体系中直接加入100μL 0.1%~10% BSA水溶液，在振荡器中进反应24h；

7）磁铁分离弃上清，加入300μL封保液，振荡反应5min，重复4次；

8）磁铁分离弃上清，最后将磁珠定容到3mL的磁珠封保液中，2~8℃保存，磁微粒化学发光产品（磁珠混悬液）的制备工作完成。（分散性见图2b）。

实施例3 采用甘氨酸后封闭磁微粒化学发光产品的制备方法

其步骤包括：

1）取30μL磁珠原液加入到300μL0.01~0.1mol/L 碳酸盐缓冲溶液中，在振荡器上混匀5min，磁铁分离，弃除上清，重复5次；

5）包被反应结束后，在包被体系中直接加入100μL封闭溶液，在振荡器中进行第一步反应，振荡反应2h；

6）磁铁分离弃除上清，加入0.1~10%甘氨酸封闭溶液进行后封闭，在振荡器上反应24h；

7）磁铁分离弃去上清，加入300μL封闭液，振荡反应5min，重复4次；

8）磁铁分离后，将磁珠定容到3mL的磁珠封保液中，2~8℃保存，磁微粒化学发光产品（磁珠混悬液）的制备工作完成。（分散性见图2c）。

从图2a、2b、2c可以看出，传统方法制备的磁微粒化学光产品有明显可磁珠凝集出现，采用BSA后封闭制备的磁微粒化学发光产品磁珠的分散性并未得到改善；采用甘氨酸后封闭制备的磁微粒化学发光产品磁微粒混悬液中，磁珠分散良好。

封闭溶液采用5%甘氨酸溶液（0.1%~10%Tween~20溶液溶解），甘氨酸是一种小分子物质，受到空间位阻效应的影响，磁珠表面上的某些活化后的基团无法完全与抗体进行连接，而作为一种小分子物质的甘氨酸由于受到的空间位阻效应相对较小，所以通过自身的氨基和磁珠表面活化后的基团能够发生化学连接，从而提高磁珠包被后的封闭效果，减少免疫反应过程中非特异性结合引起的干扰，增加了磁微粒化学发光产品在诊断过程中的效价和精密性。

实施例4 采用实施例1~3制备的三种磁微粒化学发光产品进行CA199抗原定量检测

1）材料与仪器

试剂：采用市售CA199试剂盒中的试剂，激发液为H₂O₂和鲁米诺；

磁微粒：三种磁微粒化学发光产品中磁珠浓度均与市售CA199试剂盒中磁珠浓度一致；

检测仪器：全自动化学发光检测仪

2）将试剂和待测样本准备好放入机器中，每种磁微粒化学发光产品测试两次。

3）待测样本为五个不同浓度的样本，分别为S0(浓度0U/mL)、S1(浓度9.15U/mL)、S2(浓度50.9U/mL)、S3(浓度104.8U/mL)、S4(浓度428.22U/mL)、S5(浓度884.5U/mL)。

5）测试结果见表1：

表1三种磁珠混悬液发光值

从表1数据可以看出，在磁微粒包被CA199单克隆抗体完成以后，采用本发明制备磁微粒化学发光产品的制备方法，能够有效提高磁珠的包被效价、灵敏度，并拓宽了检测范围。

Claims

1.一种CA199定量检测试剂盒用磁微粒化学发光产品的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：

2.根据权利要求1所述的CA199定量检测试剂盒用磁微粒化学发光产品的制备方法，其特征在于：第一步和第二步中所述的缓冲溶液为磷酸盐、碳酸盐、吗啉乙磺酸、DMF、DMSO、甲醇、乙醇溶液中的一种。

3.根据权利要求1所述的CA199定量检测试剂盒用磁微粒化学发光产品的制备方法，其特征在于：第二步中所述二甲基氨基丙基乙基碳酰胺溶液和N~羟基丁二酰亚胺溶液的比例为10:1~1:10，其体积分别为20~100μL。

4.根据权利要求1所述的CA199定量检测试剂盒用磁微粒化学发光产品的制备方法，其特征在于：第四步中加入的所述CA199单克隆抗体的浓度为2~5mg/mL，其体积为5~20μL；所述缓冲溶液和CA199单克隆抗体的总体积为100~200μL。

5.根据权利要求1所述的CA199定量检测试剂盒用磁微粒化学发光产品的制备方法，其特征在于：第五步中所述的表面活性剂为SPAN80、吐温~80，SDS、CTNB、TritonX-100中的一种；所述缓冲液为碳酸盐、磷酸盐、吗啉乙磺酸、DMF、DMSO、甲醇、乙醇溶液中的一种。