CN110865183B - 一种利用磁珠制备hrp标记抗体的方法 - Google Patents

一种利用磁珠制备hrp标记抗体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用磁珠制备HRP标记抗体的方法，解决了现有HRP标记抗体方法不适用于大规模多批次工业化制备的问题，本方法可以简化实验步骤，完善过程控制，降低操作的技术要求，减小反应的不确定性，使风险可控。本发明利用磁珠制备HRP标记抗体的方法的任意步骤都可以在步骤结束后终止将产物冻存，然后在合适的时间继续后续步骤，弥补了现有方法要求连续操作直至反应结束的不足；本方法利用磁珠将氧化后反应活性的HRP醛化酶同氧化不完全或氧化过度导致反应活性降低的HRP分离，并进一步富集了有效的反应物，使标记反应易于控制；本方法未使用有机溶剂沉淀目的蛋白，有效控制了蛋白质的变性和降解，保持了较好的生物活性。

Description

一种利用磁珠制备HRP标记抗体的方法
技术领域
本发明属于HRP标记抗体制备技术领域，具体涉及一种制备HRP标记蛋白质的通用方法，特别涉及一种利用磁珠制备HRP标记抗体的方法。
背景技术
现阶段HRP标记抗体最好的方法是改良高碘酸钠氧化法，据文献报道标记效率可达到70％左右。现有HRP标记抗体技术很大一部分基于改良高碘酸钠氧化法发展起来的。但是，基于改良高碘酸钠氧化法存在以下缺点：1.反应的步骤较多，HRP的状态难以控制，导致产物比较复杂，难以纯化和进行质量评价；2.反应的不确定性大，标记效果不稳定，风险不可控；3.受到操作者的技术水平影响较大。综上所述，现有方法比较适用于实验室规模的制备，不适用于工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种利用磁珠制备HRP标记抗体的方法，解决了现有HRP标记抗体方法不适用于大规模多批次工业化制备的问题，本方法可以简化实验步骤，完善过程控制，降低操作的技术要求，减小反应的不确定性，使风险可控。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种利用磁珠制备HRP标记抗体的方法，包括以下步骤：
A、制备HRP醛化酶：
称量HRP，溶于pH＝2～6的缓冲溶液中，加入高碘酸钠溶液，混匀，室温反应0.5-2小时，加入乙二醇终止反应，室温静置0.5-1小时，得到HRP醛化酶溶液(1)；
B、利用氨基磁珠收集HRP醛化酶：
将HRP醛化酶溶液(1)中加入氨基磁珠，用氢氧化钠调至pH＝8～11，37℃震荡1-4小时，磁珠收集HRP醛化酶得到HRP-磁珠复合物(2)，溶液可回收未反应的HRP；
C、利用席夫碱反应的可逆性将HRP醛化酶同磁珠分离：
将HRP-磁珠复合物(2)置于pH＝2～5的缓冲溶液中，37℃，震荡0.5至4小时，得到HRP醛化酶溶液(3)；
D、将纯化的HRP醛化酶和抗体通过席夫碱反应进行标记：
HRP醛化酶溶液(3)用氢氧化钠调至pH值为9.5，得到HRP醛化酶溶液(4)，将抗体溶解于弱碱性碳酸氢钠缓冲溶液(5)，HRP醛化酶溶液(4)与抗体溶液(5)混合，37℃，缓慢搅拌，2至4小时，得到溶液(6)；
E、硼氢化钠还原得到目的产物：
溶液(6)加入硼氢化钠，4℃，30min，反应结束后，溶液加入100k超滤管，超滤得到浓缩产物溶液(7)，调节滤液pH值至酸性除去多余的硼氢化钠；
F、用TBST或PBST溶液加入超滤后的浓缩产物溶液(7)，100k超滤管14000g离心10分钟；
G、重复步骤F，3-5次，收集浓缩产物(8)；
H、产物的精制，进一步纯化浓缩产物(8)。
进一步地，步骤A，所述HRP的添加量为0.2mg～1g，加入高碘酸钠溶液的量为每1mgHRP加入1～20μmol高碘酸钠溶液，加入的乙二醇为总体积的0.5％至10％。
进一步地，步骤A，所述缓冲溶液为醋酸-醋酸钠缓冲溶液、磷酸-磷酸二氢钾/钠缓冲溶液或柠檬酸盐缓冲溶液。
更进一步地，缓冲溶液为pH值为4.0的醋酸-醋酸钠溶液。
进一步地，步骤B，所述加入氨基磁珠的量为每1mg HRP加入10～200mg氨基磁珠。
进一步地，步骤C，所述缓冲溶液为醋酸-醋酸钠缓冲溶液、磷酸-磷酸二氢钾/钠缓冲溶液或柠檬酸盐缓冲溶液。
更进一步地，缓冲溶液为pH值为2.0的醋酸-醋酸钠溶液。
进一步地，步骤D，所述抗体的添加量为每1mg HRP加入0.5～5mg抗体。
进一步地，步骤D，所述碳酸氢钠缓冲溶液的pH值为9.5。
进一步地，步骤E，所述硼氢化钠的添加量为每1mg HRP加入1～10mg硼氢化钠。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明利用磁珠制备HRP标记抗体的方法的任意步骤都可以在步骤结束后终止将产物冻存，然后在合适的时间继续后续步骤，弥补了现有方法要求连续操作直至反应结束的不足；
2、现有方法无法有效去除低标记活性的HRP，标记反应不确定性大。而本方法利用磁珠将氧化后反应活性的HRP醛化酶同氧化不完全或氧化过度导致反应活性降低的HRP分离，并进一步富集了有效的反应物，使标记反应易于控制；
3、现有方法用有机溶剂沉淀蛋白，导致生物活性大幅度降低。而本方法未使用有机溶剂沉淀目的蛋白，有效控制了蛋白质的变性和降解，保持了较好的生物活性。
附图说明
图1为本发明利用磁珠制备HRP标记抗体的方法流程图；
图2为HRP抗体标记效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
A、制备HRP醛化酶。称量HRP 5mg，溶于1mL的200mmol/L的醋酸/醋酸钠(pH值＝4.0)溶液中，加入100mmol/L高碘酸钠溶液200μL。混匀，室温，反应30分钟。加入乙二醇100μL。室温，静置30min，得到HRP醛化酶溶液(1)。
B、利用氨基磁珠收集HRP醛化酶。HRP醛化酶溶液(1)中加入0.1mL氨基磁珠，用1mol/L氢氧化钠调至pH为9.5。37℃震荡1小时。磁珠收集HRP醛化酶HRP-磁珠复合物(2)，溶液可回收未反应的HRP。
C、利用席夫碱反应的可逆性将HRP醛化酶同磁珠分离。将HRP-磁珠复合物(2)置于0.5mL pH＝2的醋酸溶液中，37℃，震荡1小时，得到HRP醛化酶溶液(3)。
D、将纯化的HRP醛化酶和抗体通过席夫碱反应进行标记。HRP醛化酶溶液(3)用1mol/L氢氧化钠调至pH至9.5，得到HRP醛化酶溶液(4)。将抗体2mg溶解于1mL pH值9.5的200mmol/L的碳酸氢钠缓冲溶液(5)。HRP醛化酶溶液(4)与抗体溶液(5)混合，37℃，缓慢搅拌，2小时，得到溶液(6)。
E、硼氢化钠还原得到目的产物。溶液(6)加入20mg硼氢化钠，4℃，30min。反应结束后，溶液加入100k超滤管14000g离心10分钟，超滤得到浓缩产物溶液(7)。(注：滤液要调pH值至酸性除去多余的硼氢化钠，注意硼氢化钠的使用安全。由于硼氢化钠会产生氢气，使用量大时注意安全。)
F、用TBST或PBST溶液加入超滤后的浓缩产物溶液(7)，100k超滤管14000g离心10分钟。
G、重复步骤F，3至5次。收集浓缩产物(8)。
H、产物的精制，进一步纯化浓缩产物(8)。非必要步骤，视使用用途进行调整。
实施例2
A、制备HRP醛化酶。称量HRP 50mg，溶于2mL的100mmol/L的醋酸/醋酸钠(pH值＝3.6)溶液中，加入150mmol/L高碘酸钠溶液100μL。混匀，室温，反应15分钟。加入乙二醇200μL。室温，静置30min，得到HRP醛化酶溶液(1)。
B、利用氨基磁珠收集HRP醛化酶。HRP醛化酶溶液(1)中加入1mL氨基磁珠，用1.5mol/L氢氧化钠调至pH为9.8。37℃震荡4小时。磁珠收集HRP醛化酶HRP-磁珠复合物(2)，溶液可回收未反应的HRP。
C、利用席夫碱反应的可逆性将HRP醛化酶同磁珠分离。将HRP-磁珠复合物(2)置于10mL pH＝2的醋酸溶液中，37℃，震荡2小时，得到HRP醛化酶溶液(3)。
D、将纯化的HRP醛化酶和抗体通过席夫碱反应进行标记。HRP醛化酶溶液(3)用1mol/L氢氧化钠调至pH至9.8，得到HRP醛化酶溶液(4)。将抗体25mg溶解于10mL pH值9.8的150mmol/L的碳酸氢钠缓冲溶液(5)。HRP醛化酶溶液(4)与抗体溶液(5)混合，37℃，缓慢搅拌，4小时，得到溶液(6)。
E、硼氢化钠还原得到目的产物。溶液(6)加入150mg硼氢化钠，4℃，30min。反应结束后，溶液加入100k超滤管14000g离心10分钟，超滤得到浓缩产物溶液(7)。(注：滤液要调pH值至酸性除去多余的硼氢化钠，注意硼氢化钠的使用安全。由于硼氢化钠会产生氢气，使用量大时注意安全。)
F、用TBST或PBST溶液加入超滤后的浓缩产物溶液(7)，100k超滤管14000g离心10分钟。
G、重复步骤F，3至5次。收集浓缩产物(8)。
H、产物的精制，进一步纯化浓缩产物(8)。非必要步骤，视使用用途进行调整。
如图2所示，100ng/孔抗原包被酶标板，将HRP标记抗体按梯度稀释，进行ELISA检测。结果表明，实施例1和实施例2所得HRP标记抗体与现有常规方法所得HRP标记抗体的活性相比，有显著提升。

Claims (10)

1.一种利用磁珠制备HRP标记抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、制备HRP醛化酶：
称量HRP，溶于pH＝2～6的缓冲溶液中，加入高碘酸钠溶液，混匀，室温反应0.5-2小时，加入乙二醇终止反应，室温静置0.5-1小时，得到HRP醛化酶溶液(1)；
B、利用氨基磁珠收集HRP醛化酶：
将HRP醛化酶溶液(1)中加入氨基磁珠，用氢氧化钠调至pH＝8～11，37℃震荡1-4小时，磁珠收集HRP醛化酶得到HRP-磁珠复合物(2)，溶液可回收未反应的HRP；
C、利用席夫碱反应的可逆性将HRP醛化酶同磁珠分离：
将HRP-磁珠复合物(2)置于pH＝2～5的缓冲溶液中，37℃，震荡0.5至4小时，得到HRP醛化酶溶液(3)；
D、将纯化的HRP醛化酶和抗体通过席夫碱反应进行标记：
HRP醛化酶溶液(3)用氢氧化钠调至pH值为9.5，得到HRP醛化酶溶液(4)，将抗体溶解于弱碱性碳酸氢钠缓冲溶液(5)，HRP醛化酶溶液(4)与抗体溶液(5)混合，37℃，缓慢搅拌，2至4小时，得到溶液(6)；
E、硼氢化钠还原得到目的产物：
溶液(6)加入硼氢化钠，4℃，30min，反应结束后，溶液加入100k超滤管，超滤得到浓缩产物溶液(7)，调节滤液pH值至酸性除去多余的硼氢化钠；
F、用TBST或PBST溶液加入超滤后的浓缩产物溶液(7)，100k超滤管14000g离心10分钟；
G、重复步骤F，3-5次，收集浓缩产物(8)；
H、产物的精制，进一步纯化浓缩产物(8)。
2.根据权利要求1所述的一种利用磁珠制备HRP标记抗体的方法，其特征在于：步骤A，所述HRP的添加量为0.2mg～1g，加入高碘酸钠溶液的量为每1mgHRP加入1～20μmol高碘酸钠溶液，加入的乙二醇为总体积的0.5％至10％。
3.根据权利要求1所述的一种利用磁珠制备HRP标记抗体的方法，其特征在于：步骤A，所述缓冲溶液为醋酸-醋酸钠缓冲溶液、磷酸-磷酸二氢钾/钠缓冲溶液或柠檬酸盐缓冲溶液。
4.根据权利要求3所述的一种利用磁珠制备HRP标记抗体的方法，其特征在于：缓冲溶液为pH值为4.0的醋酸-醋酸钠溶液。
5.根据权利要求1所述的一种利用磁珠制备HRP标记抗体的方法，其特征在于：步骤B，所述加入氨基磁珠的量为每1mg HRP加入10～200mg氨基磁珠。
6.根据权利要求1所述的一种利用磁珠制备HRP标记抗体的方法，其特征在于：步骤C，所述缓冲溶液为醋酸-醋酸钠缓冲溶液、磷酸-磷酸二氢钾/钠缓冲溶液或柠檬酸盐缓冲溶液。
7.根据权利要求6所述的一种利用磁珠制备HRP标记抗体的方法，其特征在于：缓冲溶液为pH值为2.0的醋酸-醋酸钠溶液。
8.根据权利要求1所述的一种利用磁珠制备HRP标记抗体的方法，其特征在于：步骤D，所述抗体的添加量为每1mg HRP加入0.5～5mg抗体。
9.根据权利要求1所述的一种利用磁珠制备HRP标记抗体的方法，其特征在于：步骤D，所述碳酸氢钠缓冲溶液的pH值为9.5。
10.根据权利要求1所述的一种利用磁珠制备HRP标记抗体的方法，其特征在于：步骤E，所述硼氢化钠的添加量为每1mg HRP加入1～10mg硼氢化钠。
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