KR970003519B1 - 사람 인슐린 전구체를 사람 인슐린으로 형질전환시키는 방법 - Google Patents

사람 인슐린 전구체를 사람 인슐린으로 형질전환시키는 방법 Download PDF

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일라이 릴리 앤드 캄파니
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없음.

Description

사람 인슐린 전구체를 사람 인슐린으로 형질전환시키는 방법
본 발명은 사람 인슐린 전구체를 사람 인슐린으로 형질전환시키는 방법에 관한 것이다.
트립신 및 카복시펩티다제 B를 사용하여 프로인슐린을 인슐린으로 전환시킬 수 있는 능력은 수년 동안 인지되어 왔었다. [참조: Krmmler, W., Clark, j. 및 Steiner, D.F., Fed. Proc. 30(1971)1210; Kemmler, W., Peterson, J.D., 및 Steiner, D.F.,J. Biol.Chem., 246(1971)6788-6791]. 이러한 전환 방법으로 겪는 난점은 반응 혼합물 중에 제거하게 어려운 부산물이 상당한 다량으로 지속적으로 존재한다는 데에 있다. 특히, 사람 프로인슐린을 사람 인슐린으로 전환시키는데 있어서, 다량(약 4 내지 6%)의 Des-Thr(B30) 사람 인슐린[Des-Thr(B30)-hI]이 형성된다. 이러한 부산물은 단을 말단 아미노산이 없다는 점에서 사람 인슐린과 그 차이가 있으며 생성 혼합물로부터 완전히 분리가 가능할 경우에는 어렵고 성가신 방법에 의해서만 분리된다.
DNA 재조합 기술이 도래함에 따라, 처음으로 다량의 사람 프로인슐린을 제조할 수 있게 되었다. 인슐린의 생성시에 사람 프로인슐린을 중간체로서 사용하는데 있어서, 가장 우선적인 문제 해결은 Des-Thr(B30)-hI 불순물로의 제거에 있다. 본 분야의 전문자들은 Des-Thr(B30)-hI 불순물로부터 사람 인슐린을 정제할 수 있는 방법을 탐구하거나, 그의 조건이 Des-Thr(B30)-hI의 형성을 최소화하는 전환 방법을 탐색할 수 있었다. 본 발명의 목적은 Des-Thr(B30)-hI의 최소 형성과 관련하여 사람 인슐린 전구체를 사람 인슐린으로 전환시키기 위한 신규한 방법을 제공하는데 있다.
따라서, 본 발명은 하기 일반식의 사람 인슐린 전구체를, 사람 인슐린 전구체 1몰당 원자 번호 21 내지 34, 39 내지 52, 57 내지 84, 및 89 내지 92의 금속중 하나 이상의 금속 이온 약 0.1 내지 약 10몰을 함유하는 수성 매질중에서 트립신 및 카복시펩티다제 B로 처리함을 특징으로 하여, 하기 일반식의 사람 인슐린 전구체 사람 인슐린으로 전환시키는 방법에 관한 것이다;
Figure kpo00001
상기식에서,
R은 수소, 화학적으로 또는 효소적으로 분해 가능한 아미노산 잔기, 또는 2개 이상의 아미노산 잔기를 갖는 화학적으로 또는 효소적으로 분해가능한 펩타이드 잔기이고, R은 OH, Arg-Y, 또는 Lys-Y(여기에서, Y는 OH, 아미노산 잔기, 또는 2개 이상의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드 잔기이다)이며, A-1 내지 A-21의 잔기는 사람 인슐린 A-쇄이고, B-1 내지 B-30의 잔기는 사람 인슐린 B-쇄이고, X는 인슐린 A-쇄의 A-1의 아미노 그룹 및, 인슐린 B-쇄의 B-30의 카복실 그룹에 연결된 잔기이며 A-쇄 및 B-쇄가 모두 붕괴되지는 않으면 A-쇄 및 B-쇄로부터 효소적으로 분해될 수 있는 잔기이다.
언급한 바와 같이, 본 발명의 방법은 트립신 및 카복시 펩티다제 B를 사용하여 프로인슐린을 인슐린으로 전환시키는 공지된 방법을 개선시켜 준다. 본 발명의 방법은 상기 일반식의 사람 인슐린 전구체에 적용되며, 가장 바람직하게 적용될 수 있는 전구체는 사람 프로인슐린 그 자체이다.
본 명세서에서 사용되어 용어 "사람 인슐린 전구체"는 (1)사람 인슐린 A-쇄 및 사람 인슐린 B-쇄를 함유하고, (2) A-쇄 및 B-쇄에 위치에 각Cys 잔기의 황이 (a)A-6과 A-11, (b)A-7과 B-7및 (c)A-20과 B-19에서 각각이 연결되어 나타난 3개 이상의 디설파이드 결합을 가지며, (3)인슐린 A-쇄의 A-1의 아미노 그룹 및 인슐린 B-쇄의 B-30의 카복실 그룹에 연결된 제거가능한 연결 잔기를 갖는 분자를 의미한다.
그룹 R은 수소, 아미노산 잔기, 또는 2개 이상의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드 잔기이다. R이 아미노산 잔기 또는 펩타이드 잔기인 경우에, R은 잔여 인슐린 구조의 통합성을 상실하지 않고 인슐린 전구체 생성물로부터 분해될 수 있는 그룹이다. 여러 종류의 어떠한 아미노산 잔기 또는 펩타이드 잔기도 정의된 그룹 R로서 간주된다. 분해가능한 아미노산 잔기의 예로서는 아르기닌(Arg) 또는 라이신(Lys)과 같은 염기성 아미노산 뿐만 아니라 이러한 염기성 아미노산 잔기가 카복실 말단에 위치한 펩타이드 잔기를 들 수 있다. 이들은 단백질 분해 효소트립신으로 처리할 경우 쉽게 분해되는 것으로 인지된다. 분해 가능한 아미노산 잔기의 또다른 예로서는 메티오닌(Mer) 뿐만 아니라 카복시 말단에 Met를 갖는 펩타이드 잔기를 들 수 있다. 이들은 브롬화시아노겐으로 처리하여 제거할 수 있다. 또 다른 예는 트립토판(Trp) 또는 카복시 말단에 Trp을 함유하는 펩타이드 잔기가 있다. 이것은 N-브로모석신이미드로 처리하면 제거된다.
그룹 R1은 하이드록실, 아르기닌, 라이신, 또는 아미노 말단에 아르기닌 또는 라이신을 갖는 펩타이드이다. R이 아르기닌, 라이신, 또는 아미노 말단에 아르기닌 또는 라이신을 갖는 펩타이드인 경우, 상기 아미노산 또는 펩타이드는 본 발명에 따른 방법의 조건하에서, R이 하이드록실인 생성물이 형성되면서 분해될 것이다.
인슐린 전구체의 연결 잔기 X는 그 구조가 상당히 광범위할 수 있다. 바람직하게, 잔기 X는 폴리펩타이드이다. 폴리펩타이드는 일반적으로 2개 이상, 바람직하게는 약 35개, 가장 바람직하게는 약 6 내지 약 35개의 아미노산 잔기를 갖는다. 잔기 X는 A-쇄의 A-1의 아미노 그룹 및 B-쇄의 B-30의 카복실 그룹에 연결된다. 가장 바람직하게는, 연결 잔기 X가 펩타이드인 경우, 하기 서열식의 연결 펩타이드인 사람 프로인슐린의 천연 연결 펩타이드이다.
Figure kpo00002
언급한 바와 같이, 천연 연결 서열을 사용하는 것이 바람직하지만, 연결 펩타이드용으로서 훨씬 더 짧은 펩타이드 서열을 사용할 수 있다. 펩타이드 서열의 유일한 필요 조건은 (1) A쇄와 B-쇄 사이에 적당한 디설파이드 결합이 이루어질 수 있도록 할 만큼 충분한 길이를 갖추어야 하고 (2) 인슐린이 형성되면서 인슐린 전구체로부터 분해될 수 있어야 한다. 사용될 수 있는 전형적인 디펩타이드는 -Arg-Arg-이다. 또한, 일반식 -Arg-X1-Arg(여기서, X는 1개 이상의 아미노산 잔기이다)의 상기 디펩타이드의 변형체가 쉽게 사용될 수 있다. 대단히 바람직한 연결 펩타이드는 -Arg-Arg-Lys-Arg 뿐만 아니라 이보다 더 긴 일반식 -Arg-Arg-X-Lys-Arg-(여기서, X는 1개 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 2개 이상의 아미노산 잔기이다)의 펩타이드 쇄이다. 이들 후자의 펩타이드 쇄는 물론 천연 연결펩타이드를 포함한다.
본 발명의 방법은 수성 매질 중에서 수행한다. 용어 "수성 매질"은 물의 존재를 필요로 한다: 그러나, 메탄올, 에탄올, 아세톤, N,N-디메틸포름아미드 등과 같은 수-혼화성 유기 용매의 존재를 배제하는 것은 아니다. 사람 인슐린 전구체는 매질중에 약 30mM이하의 농도로 존재한다. 바람직하게는, 사람 인슐린 전구체 농도는 실질적으로 낮으며 일반적으로 약 0.1mM 내지 약 10mM, 더욱 바람직하게는 약 0.5 내지 약 5mM, 가장 바람직하게는 약 1 내지 약 3mM의 범위이다.
전환 반응은 광범위한 온도, 일반적으로 약 0℃ 내지 약 40℃에서 수행한다. 바람직하게는, 전환 반응은 약 4℃ 내지 약 25℃의 온도, 가장 바람직하게는 약 10℃ 내지 약 15℃의 온도에서 수행한다.
반응 혼합물의 pH 범위는 약 4 내지 약 12에 달할 수 있다. 그러나, pH 약 6 내지 약 9, 바람직하게는 약 7 내지 약 8의 범위에서 주의깊게 pH를 조절하면서, 정확하게 조절해야 할 경우는 약 pH7.2 내지 약 7.6의 범위에서 반응을 수행함으로써 최적의 결과가 수득된다.
pH 조절은 일반적으로 완충제를 사용함으로써 보조된다. 어떠한 종류의 다양한 전형적인 완충제도 사용할 수 있다. 적합한 완충제의 예로는 TROS[트리스(하이드록시메틸)아미노메탄], 에틸렌 디아민, 트리에탄올아민, 글라이신, HEPES(N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산) 등을 들 수 있다.
일반적으로 사용되는 트립신 및 카복시 펩티다제 B 의 양은 두효소간의 양 및 사람 인슐린 전구체의 양 둘 다와 관련이 있다. 상기 효소들은 용액으로서 반응 혼합물에 도입할 수 있거나, 공지된 기술을 사용하여 적합한 지지체 상에 고정화하여 반응 매질중에서 이용하도록 할 수 있다.
중량:중량을 기준으로 하여, 카복시펩티다제 B는 일반적으로 사람 인슐린 전구체의 양에 대해 약 1:10 내지 약 1:5000, 바람직하게는 약 1:500 내지 약 1:3500, 가장 바람직하게는 약 1:1000 내지 약1:3000으로 존재할 수 있다.
중량:중량을 기준으로하여, 트립신은 일반적으로 사람 인슐린 전구체에 대해, 약 1:20 내지 약 1:250,000, 바람직하게는 약 1:300 내지 약 1:20,000, 가장 바람직하게는 약 1:5000 내지 약 1:15,000의 양으로 존재할 수 있다.
반응 혼합물 중의 카복시 펩티다제 :트립신의 비율도 또한 중요한 변수로 나타난다. 일반적으로, 중량비를 기준으로 하여, 카복펩티다제 B:트립신의 비는 약 1:1 내지 약10:1, 바람직하게는 약 2:1 내지 약 5:1이 된다.
본 발명의 근간을 이루는 주된 발견은 광범위한 금속 이온중 일정량의 하나 이상의 금속 이온이 존재함으로써 반응 동안에 형성되는 Des-Thr(B300-hl의 양이 현저히 감소될 수 있음을 밝혀낸데 있다.
특정 금속 이온이 상당히 바람직하긴 하지만, 광봄위한 금속 이온이 유용하다는 사실이 밝혀졌다. 사용될 수 있는 금속 이온은 다음과 같다: 스캔듐(Sc), 티타늄(Ti), 비나듐(V), 크롬(Cr), 망간(Mn), 철(Fe), 코발트(Co), 닉켈(Ni), 구리(Cu), 아연(Zn), 갈륨(Ga), 게르마늄(Ge), 비소(As), 셀레늄(Se), 이트륨(Y), 지르코늄(Zr), 니오븀(Nb), 몰리브덴(Mo), 테크네튬(Tc), 루테늄(Ru), 로듐(Rh), 팔라듐(Pd), 은(Ag), 카드뮴(Cd0), 인듐(In), 주석(Sn), 안티몬(Sb), 텔루륨(Te), 란타늄(La), 세륨(Ce), 프라세오디뮴(Pr), 네오디뮴(Nd), 프로메튬(Pm), 사마륨(Sm), 유로퓸(Eu), 가돌리늄(Gd), 테르븀(Tb), 디스프로슘(Dy), 홀뮴(Ho), 에르븀(Er), 툴륨(Tm), 이테르븀(Yb), 루테슘(Lu), 하프늄(Hf), 탄탈(Ta), 텅스텐(W), 레늄(Re), 오스늄(Os), 이리듐(Ir), 백금(Pt), 금(Au), 수은(Hg), 탈륨(Tl), 납(Pb), 비스무트(Bi), 폴로늄(Po), 악티늄(Ac), 토륨(Th), 프로탁튬(Pa), 및 우라늄(U).
상기한 금속중 어떠한 이온도 본 발명의 방법에 사용할 수 있지만, 상당한 바람직한 부류는 다음과 같으며 더욱 바람직한 부류들로 좁히자면 다음과 같다:
(1) 크롬, 몰리브덴, 텅스텐, 수은, 안티몬, 비스무트, 닉켈, 철, 코발트, 아연, 카드뮴, 구리, 주석, 납, 유로퓸, 우라늄, 백금, 및 망간.
(2) 닉켈, 철, 코발트, 아연, 카드뮴, 구리, 주석, 납, 유로품, 우라늄, 백금 및 망간.
(3)닉켈, 아연, 코발트 및 카드뮴.
(4)닉켈 및 아연.
(5)닉켈.
본 발명의 방법에 따라, 상기한 금속 중 하나 이상의 이온을 사람인슐린 전구체 반응 혼합물에 가한다. 반응 혼합물에 존재하는 응집물중에서의 상기 금속으로부터의 이온량은 사람 인슐린 전구체 1몰당 약 0.1 내지 약 10몰의 범위이다. 실제 사용량은 상기의 범위에서 적은 범위량이 바람직하며 일반적으로 사람 인슐린 전구체 1몰당 약 0.1내지 약 2몰이다. 가장 바람직하게는, 사람 인슐린 전구체 1몰당 약 0.3 내지 약 1몰량이 사용되며, 이상적으로는 사람 인슐린 전구체 1몰당 약 0.33 내지 약 0.6몰량이 사용된다.
전환 반응은 통상적으로 약 2시간 내지 약 48시간, 보통은 약 8 내지 16시간 동안 수행한다. 반응은 고성능 액체 크로마토그래피로 모니터할 수 있으며 반응 시간은 사람 인슐린 생성량에 따라 조심스럽게 조정할 수 있다.
전혀 예상치 못했던 본 발명의 또다른 양태는 반응 혼합물 중에 또다른 부류의 금속중 하나 이상의 금속 이온을 도입함으로써 Des-Thr(B30hl의 생성량이 더욱 감소될 수 있음이 밝혀진데 있다. 이러한 추가의 개선된 사실은 일차 금속 이온량의 범위가 사람 인슐린 전구체 1몰당 약 0.1몰 내지 약 0.6몰일 경우에 특히 명확하게 나타난다. 베리륨(Be), 마그네슘(Mg), 칼슘(Ca), 스트론튬(Sr), 바륨(Ba), 및 라듐(Ra)으로 이루어진 그룹중에서 선택된 금속의 특정량의 금속 이온을 가하는 것이 상당히 유리하다. 바람직한 이온은 칼슘, 바륨, 스트론튬, 또는 마그네슘이며 가장 바람직한 이온은 칼슘이다.
이차 금속 이온량의 봄위는 사람 인슐린 전구체 1몰당 약 0.5 내지 약 5몰, 바람직하게는 사람 인슐린 전구체 1몰당 약 1몰 내지 약 3몰이다.
상술한 이차 금속 이온을 사용하여 나타난 가장 놀라운 사실은 이차 부류의 이온, 특히, 칼슘이 트립신을 안정화시티는 것으로 알려졌으며 일차 부류의 금속 이온의 부재하에서 사용될 경우엔 Des-Thr(B300hl의 생성량이 실제적으로 증가함이 밝혀졌다.
전형적으로, 본 발명의 방법은 사람 인슐린 전구체를 수정매질중에 용해시켜 수행한다. 최종 혼합물의 농도는 일반적으로 약 1mM내지 약 3mM이며, pH는 약 8이다. 이어서 이차 부류의 금속이온(사용될 경우)를 가한다. 전형적으로, 상술한 농도의 사람 인슐린 전구체를 사용할 경우 CaCl2를 약 5mM의 농도로 가한다. 그런 다음 일차 부류의 금속이온, 전형적으로 Ni(∥)을 사람 인슐린 전구체 1몰당 약 0.5몰의 농도로 가한다. 혼합물의 pH를 7.3 내지 7.5로 조정하고 카복시 펩티다제 B(약 1:2,500w/w 사람 인슐린 전구체) 및 트립신 (약 1:12,500w/w 사람 인슐린 전구체)를 차례로 가한다. 반응을 진행시키고 혼합물의 온도를 약 12℃로 유지한다. 반응의 진행은 고성능 액체 크로마토그래피로 주의깊게 모니터한다.
하기의 실시예는 본 발명에 따른 방법의 효율성을 입증하여 주지만, 이들 실시예로 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
트립신 및 카복시펩티다제 B 농도의 변화 효과
사람 프로인슐린(hPl)을 pH 7.0의 20mM 에틸렌 디아민(EDA) 완충액 중에 10.85g/ℓ의 농도로 용해시킨다. 혼합물을 두 분획으로 분리한다. 일차 분획에 돼지의 췌장 카복시펩티다제 B(CpB)를 최종 농도가 3.74mg/ℓ이 되도록 가한다. 이 용액을 6개의 1ℓ 분취량으로 분리하고, 토실페닐알라닐 크롤로 메틸 케톤으로 예비 처리한 소의 췌장트립신(트립신-TPCK)을 각각 1.0, 1.4, 1.8, 2.8, 3.6 및 5.4mg/ℓ로 가한다. 각각의 샘플을 23℃에서 8시간 동안 배양한다. Des-Thr(B30)-hl 수준을 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)로 측정하여 표 1에 나타내었다.
hPl 용액의 이차 분획을 5개의 1ℓ 분취량으로 분리한다. CpB를 각각 1.1, 1.4, 1.8, 2.8, 3.6 및 5.4mg/ℓ의 농도로 가한다. 이어서, 각각의 분취량에 트립신-TPCK를 2.71mg/ℓ의 농도로 가한다. 각각의 샘플을 23℃에서 8시간동안 배양한다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.
표 1 및 표 2 모두에서, Des-Thr(B30)-hl의 양은 HPLC로 측정할 때 hl의 백분율로 나타내었다. 데이타에 나타난 바와 같이, 일정량의 CpB에서, 트립신의 양을 감소시킴으로써 Des-Thr(B30)-hl가 감소되었다. 바꾸어 말하면, 일정량의 트립신에서, CpB의 양을 증가시키면 Des-Thr(B30)-hl의 양이 감소된다.
[표 1] hPI 형질전환에 대한 트립신의 농도 증가에 따른 효과
Figure kpo00003
[표 2] hPI 형질전환에 대한 CpB의 농도 증가에 따른 효과
Figure kpo00004
실시예 2
Des-Thr(B30)-hl 생산에 대한 온도 변화
hPl(60mg)을 pH 7.5 내지 8.0의 20mM 에틸렌디아민(6.0ml)에 용해시킨다. 돼지의 카복시펩티다제 B 및 소의 트립신-TPCK를 연속적으로 가하여 hPl:CpB:트립신-TPCK에 대해 5000:1:1(W/W)의 기질(hPl): 효소 비율을 제공한다. 두개의 1ml 분취량을 HPLC로 측정하였을 때 최대 hl 수율을 얻는데 필요한 시간, 즉 14, 6 및 4시간 동안 각각이 12, 24, 및 37℃에서 배양한다. 그 결과가 표 3에 나탄나 바와 같이, 온도가 낮을수록 Des-Thr(B30)-hl의 형성율은 낮아진다.
[표 3] 온도의 변화
Figure kpo00005
실시예 3
유도체 형성에 대한 금속의 효과
hPl(360mg)을 pH7.65의 20mM 글라이신 20ml에 용해시킨다. 용액을 두개의 10ml분취량으로 분리하고 5mM 칼슘 이온을 한개의 분취량에 가한다. 각각의 분취량을 3개 분획으로 더 나눈다. 이어서 칼슘 이온-함유 분취량의 분획을 다음과 같이 처리한다: 한샘플에는 아연 이온을 가하여 hPl에 대해 0.33 몰비를 조성한다. 다른 샘플에는 닉켈 이온을 가하여 hPl에 대해 0.36몰비를 조성한다. 모든 혼합물에 효소를 가하여 다음의 중량비를 조성한다: hPl:CpB:트립신-TPCK=13,500:5:1. 각 혼합물의 pH를 7.65내지 7.7로 조정하고 12℃에서 16시간 동안 배양한다. 표 4에 나타난 결과는 닉켈 및 아연에 의한 Des-Thr(B30)-hl 형성량의 감소효과를 입증해 준다. 또한, 칼슘에 의해 이 효과가 증감됨을 입증해 주고 있다.
[표 4] hPI 형질전환에 대한 금속의 효과
Figure kpo00006
분석은 검출한계 0.20%의 hl 미만이다.
실시예 4
hPl 전환 반응에서 유도체 형성에 대한 Ni(II) 농도의 변화 효과 hPl(245mg)을 pH 7.4의 50mM 글라이산 12.0ml에 용해시킨다. 1M CaCl2저장 용액으로 칼슘 이온을 가하여 5mM의 최종 Ca(II) 농도를 조성한다. 2ml 분취량에 0.11M NiCl2저장 용액으로부터의 닉켈(II)을 가하여 hPl에 대해 몰비가 각각 0, 0.24, 0.37, 0.44, 0.51 및 0.58인 샘플을 수득한다. 각 튜브에 CpB를 가하여 최종 농도 7.4μg/ml(4.87mg/ml 저장 용액)으로 조성한 다음 이어서 트립신- TPCK를 가하여 최종 농도 2.96㎍/ml(1.0mg/ml저장용액)을 수득한다. 모든 샘플의 pH를 7.40으로 조정하고, 각 샘플을 12℃에서 배양한다. 12시간 경과한 후 반응을 중지하고 Des-Thr(B30)-hl 및 hl의 양을 측정한다. 표 5에 나타난 결과로 닉켈의 양이 증가함에 따라 Des-Thr(B30)-hl의 생성량이 감소되었음을 알 수 있다.
[표 5] Ni(II) 농도의 변화 효과
Figure kpo00007
실시예 5
hPl 전환 반응에서 유도체 형성에 대한 각종 금속 양이온의 효과 hPl(936mg)을 5mM 글라이신 36ml에 용해시키고 pH를 7.8 내지 8.0으로 조정한다. 칼슘 이온을 CaCl2(1M 저장 용액)로서 5mM로 가한다. 각 3ml의 분취량을 제거하여 여러가지 금속 이온을 표 6에 나타낸 농도로 가한다. 12℃에서 평형시킨 후, 효소를 가하여 다음의 중량비를 조성한다: hPl:CpB:트립신-TPCK=13,500:5:1.
샘플을 12℃에서 13시간 동안 배양하고 hl 및 Des-Thr(B30)-hl에 대해 측정한다. 표 6에 나타낸 결과로 광범위한 어떠한 금속 이온도 Des-Thr(B30)-hl의 생성량을 감소시키는데 효좌적임을 알 수 있다.
[표 6] 각종 2가 양이온의 변화
Figure kpo00008
실시예 6
Ni(II) 및 Ca(II)을 사용한 hPl의 대규모 형질전환
hPl(48.5g)을 pH 7.4의 15mM 글라이신 완충액(33.0ℓ)에 용해시키고 냉각시킨 다음 12℃로 유지한다. 1.0M CaCl2저장 용액(0.165ℓ)을 가함으로써 칼슘(II)을 5mM로 가한다. 10분 동안 교반시킨 후, 고체 NiCl2· 6H2O(5.0g)을 가함으로써 닉켈(II)을 가하여 0.44:1의 Ni(II):hPl 몰비를 수득한다. 용액을 추가로 10분간 더 온후하게 교반시킨 다음 CpB(36.8ml, 35.9mg)을 1.0mg/ml저장 용액으로부터 가한다.
그런 다음 트립신-저장용액으로부터 가한다. 10시간 경과한 후 반응을 완결하고 hl의 최대 생성량으로 측정한다. 수거후, 혼합물내에 본 발명 화합물의 검출 방법의 검출한계인 약 0.29% Des-Thr(B30)-hl가 함유되었다.

Claims (19)

  1. 하기 일반식의 사람 인슐린 전구체를, 사람 인슐린 전구체 1몰당 원자 번호 21 내지 34, 39 내지 52, 57 내지 84, 및 89 내지 92의 금속중 하나 이상의 금속 이온 약 0.1 내지 약 10몰을 함유하는 수성 매질중에서 트립신 및 카복시펩티다제 B로 처리함을 특징으로 하여, 하기 일반식의 사람 인슐린 전구체 사람 인슐린으로 전환시키는 방법.
    Figure kpo00009
    상기식에서,
    R은 수소, 화학적으로 또는 효소적으로 분해 가능한 아미노산 잔기, 또는 2개 이상의 아미노산 잔기를 갖는 화학적으로 또는 효소적으로 분해가능한 펩타이드 잔기이고,
    R은 OH, Arg-Y, 또는 Lys-Y(여기에서, Y는 OH, 아미노산 잔기, 또는 2개 이상의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드 잔기이다)이며, A-1 내지 A-21의 잔기는 사람 인슐린 A-쇄이고,
    B-1 내지 B-30의 잔기는 사람 인슐린 B-쇄이고,
    X는 인슐린 A-쇄의 A-1의 아미노 그룹 및, 인슐린 B-쇄의 B-30의
    카복실 그룹에 연결된 잔기이며 A-쇄 및 B-쇄가 모두 붕괴되지는 않으면 A-쇄 및 B-쇄로부터 효소적으로 분해될 수 있는 잔기이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 금속 이온이 크롬, 몰리브덴, 텅스텐, 수은, 안티몬, 비수무트, 닉켈, 철 코발트, 아연, 카드뮴, 구리, 주석 납, 유로퓸, 우라늄, 백금, 및 망간으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 금속의 이온인 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 금속 이온이 닉켈, 철 코발트, 아연, 카드뮴, 구리, 주석, 납, 유로품, 우라늄, 백금 및 망간으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 금속의 이온인 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 금속 이온이 닉켈, 아연, 코발트 및 카드뮴으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 금속의 이온인 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서, 사람 인슐린 전구체가 수성 매질중에 20mM 이하의 농도로 존재하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 사람 인슐린 전구체가 수성 매질중에 1mM 내지 3mM의 농도로 존재하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서, 금속 이온이 사람 인슐린 전구체 1몰당 0.1 내지 2몰의 양으로 존재하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 금속 이온이 사람 인슐린 전구체 1몰당 0.33 내지 0.6몰의 양으로 존재하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서, 카복시펩티다제 B가, 사람 인슐린 전구체에 대한 중량을 기준으로 하여 1:10 내지 1:5000의 양으로 존재하는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서, 트립신이, 사람 인슐린 전구체에 대한 중량을 기준으로 하여 1:20 내지 1:250,000의 양으로 존재하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서, 카복시펩티다제 B:트립신의 중량비가 1:1 내지 10:1인 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서, 금속 이온이 닉켈 및 아연으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 금속의 이온인 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 금속 이온이 닉켈 이온인 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서, 베릴륨, 마크네슘, 칼슘, 스트론튬, 바륨, 및 라튬으로 이루어진 그룹중에서 선택된 금속의 이차 금속 이온을 혼합물에 가하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 이차 금속 이온이 칼슘, 바륨, 스트론튬 및 마크네슘으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 금속의 이온인 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 이차 금속 이온이 칼슘 이온인 방법.
  17. 제 14 항에 있어서, 이차 금속 이온이, 사람 인슐린 전구체 1몰당 0.5몰 내지 5몰의 양으로 존재하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 이차 금속 이온이, 사람 인슐린 전구체 1몰당 1몰 내지 3몰의 양으로 존재하는 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서, 사람 인슐린 전구체가 사람 프로인슐린인 방법.
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Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5130236A (en) * 1989-12-07 1992-07-14 Eli Lilly And Company Process for producing des(64,65)-proinsulin
CZ283234B6 (cs) 1990-09-05 1998-02-18 Hoechst Aktiengesellschaft Enymatický způsob konverse preproinsulinů na insuliny
ZA928916B (en) * 1991-11-26 1994-05-18 Lilly Co Eli Tri-arginine insulins
IL107536A0 (en) * 1992-11-13 1994-02-27 Lilly Co Eli Expression vectors for bovine trypsin and trypsinogen and host cells transformed therewith
US6001604A (en) * 1993-12-29 1999-12-14 Bio-Technology General Corp. Refolding of proinsulins without addition of reducing agents
US6068993A (en) * 1997-07-02 2000-05-30 Biobras Sa Vector for expression of heterologous protein and methods for extracting recombinant protein and for purifying isolated recombinant insulin
US6087558A (en) * 1998-07-22 2000-07-11 Prodigene, Inc. Commercial production of proteases in plants
US6395299B1 (en) 1999-02-12 2002-05-28 Biostream, Inc. Matrices for drug delivery and methods for making and using the same
US7169889B1 (en) * 1999-06-19 2007-01-30 Biocon Limited Insulin prodrugs hydrolyzable in vivo to yield peglylated insulin
US20020164712A1 (en) * 2000-12-11 2002-11-07 Tonghua Gantech Biotechnology Ltd. Chimeric protein containing an intramolecular chaperone-like sequence
WO2002051428A1 (fr) * 2000-12-25 2002-07-04 Shiseido Company, Ltd. Composition de parfum stimulant le systeme sympathique
US6867183B2 (en) 2001-02-15 2005-03-15 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US7060675B2 (en) 2001-02-15 2006-06-13 Nobex Corporation Methods of treating diabetes mellitus
US6828305B2 (en) 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of growth hormone drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6713452B2 (en) 2001-06-04 2004-03-30 Nobex Corporation Mixtures of calcitonin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US7713932B2 (en) 2001-06-04 2010-05-11 Biocon Limited Calcitonin drug-oligomer conjugates, and uses thereof
US6858580B2 (en) * 2001-06-04 2005-02-22 Nobex Corporation Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6828297B2 (en) 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6835802B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-28 Nobex Corporation Methods of synthesizing substantially monodispersed mixtures of polymers having polyethylene glycol moieties
US7166571B2 (en) 2001-09-07 2007-01-23 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US7196059B2 (en) 2001-09-07 2007-03-27 Biocon Limited Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US6913903B2 (en) 2001-09-07 2005-07-05 Nobex Corporation Methods of synthesizing insulin polypeptide-oligomer conjugates, and proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US7312192B2 (en) 2001-09-07 2007-12-25 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
CN100424179C (zh) 2001-11-19 2008-10-08 诺沃挪第克公司 制备胰岛素化合物的方法
CA2485703A1 (en) * 2002-05-24 2003-12-04 Fred W. Wagner Method for enzymatic production of glp-2(1-33) and glp-2-(1-34) peptides
CA2485698C (en) * 2002-05-24 2012-03-27 Jin Seog Seo Peptide amidation process
EP1531836B1 (en) * 2002-05-24 2010-11-10 Medtronic, Inc. Polypeptide cleavage process
US7601688B2 (en) * 2002-06-13 2009-10-13 Biocon Limited Methods of reducing hypoglycemic episodes in the treatment of diabetes mellitus
DE10235168A1 (de) 2002-08-01 2004-02-12 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Verfahren zur Reinigung von Preproinsulin
ES2380765T3 (es) * 2003-11-21 2012-05-18 Nps Pharmaceuticals, Inc. Producción del péptido 2 de tipo glucagón y análogos
ATE455849T1 (de) * 2003-12-05 2010-02-15 Hoffmann La Roche Rekombinante carboxypeptidase b und ihre aufreinigung
UA91512C2 (ru) 2004-07-19 2010-08-10 Биокон Лимитед Коньюгати олигомеров инсулина, их композиция (варианты) и применение
UA114700C2 (uk) 2007-10-16 2017-07-25 Біокон Лімітед Тверда фармацевтична форма для перорального застосування та процес її виготовлення
WO2010016069A1 (en) * 2008-08-07 2010-02-11 Biocon Limited A process for preparation of insulin compounds
WO2012104099A1 (en) * 2011-02-04 2012-08-09 Glucometrix Ag Process for the production of recombinant trypsin
WO2012115640A1 (en) 2011-02-23 2012-08-30 Elona Biotechnologies Liquid insulin- containing compositions and methods of making the same
KR20170036643A (ko) * 2015-09-24 2017-04-03 한미약품 주식회사 인슐린의 제조 방법
KR20200080747A (ko) * 2018-12-27 2020-07-07 주식회사 폴루스 인슐린 전구체의 인슐린 효소 전환용 조성물 및 이를 이용하여 인슐린 전구체를 인슐린으로 전환하는 방법
TW202409070A (zh) 2022-05-18 2024-03-01 美商普羅托莫科技公司 芳族含硼化合物及相關胰島素類似物

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5756878A (en) * 1980-09-22 1982-04-05 Sharp Corp Cleaning device
DK149824C (da) * 1982-01-22 1987-03-16 Carlsberg Biotechnology Ltd Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyrer i insuliner

Also Published As

Publication number Publication date
EP0264250A3 (en) 1990-03-21
PT85892A (en) 1987-11-01
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PT85892B (pt) 1990-07-31
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DK528487A (da) 1988-04-15
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