PT85892B

PT85892B - Processo para a transformacao de um precursor de insulina humana em insulina humana

Info

Publication number: PT85892B
Application number: PT85892A
Authority: PT
Inventors: Walter Francis Prouty; Bruce Hill Frank; Richard Eugene Heiney; Mark Robert Walden
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1986-10-14
Filing date: 1987-10-09
Publication date: 1990-07-31
Also published as: EG18520A; SG14795G; US5457066A; DK175266B1; PT85892A; AU7952887A; EP0264250A2; CA1339955C; CN1029131C; ES2065321T3; JP2634176B2; HK39495A; CY1830A; HU204572B; NZ222082A; KR880005262A; EP0264250A3; AR243608A1; ATE115962T1; MX168305B

Description

O presente invento diz respeito a um processo para converter um precursor de insulina humana em insulina humana, o qual compreende o tratamento de um tal precursor da insulina humana, de fórmula (A-l) GliX

I (A-ll) |I

S S|

I II s s| (B-l) I II

R-HN-Fen—Cis---------Cis-------------Tre (B-7) (B-19) (B-30) com tripsina e carboxipeptidase B num meio aquoso, que contém, por mole de precursor de insulina humana cerca de 0,1 a cerca de 10 moles de um ou mais iões metálicos que têm Nu meros Atómicos de 21 a 34·, de 39 a 52, de 57 a 84-, e de 89 a 92 .

ELI LILLY AND COMPANY

PROCESSO PARA A TRANSFORMAÇÃO DE UM PRECURSOR DE INSULINA

HUMANA EM INSULINA HUMANA

A capacidade para converter pro-insulina em insulina empregando tripsina e carboxipeptidase B, tem sido reconhecida durante vários anos /“veja, por exemplo , Kemmler, W., Clark, J.L., Borg, J. e Steiner, D.F., Eed. Proc. 30 (1971) 1210; Kemmler, W., Peterson, J.D., e Stei ner, D.F., J. Biol. Ghem., 246 (1971) 6766-6791,7· Uma di ) ficuldade progressiva com esta metodologia da conversão tem sido e continua a ser a existência de quantidades excessivamente grandes de subprodutos dificilmente removíveis, na mistura da reacção. Especificamente, na conversão de pro-insulina humana em insulina humana, forma-se uma grande quantidade ( cerca de 4 a 6$ ) de insulina humana Des-Tre

I (B30) /“Des-Tre (B3O)-hi)_7· Este subproduto, diferindo da insulina humana, pela ausência de um único amino ácido ter minai é, se susceptível de ser separado absolutamente da mistura do produto, separado somente por uma metodologia di. fícil e embaraçosa.

Com o advento da tecnologia de DNA recombinante, pela primeira vez grandes quantidades de pro-insulina humana tornaram-se uma realidade. Quando se utiliza pro-insulina humana, como um intermediário na produção de insulina, uma solução para o problema das impurezas de Des-Tre(B30)-hI tornou-se imperativa. Ou se podiam procurar processos para se atingir a purificação da insulina humana da contaminação da Des-Tre(B30)-hl, ou se procurava um processo de conversão, cujas condições minimizassem a formação desta última, á para um processo novo, para a conversão de um precursor de insulina humana em insulina humana, com a formação mínima de Des-Tre (B30)-hI, que o presente invento se dirige.

Deste modo, este invento é dirigido para um processo para a conversão de um precursor de insulina hu mana em insulina humana, tendo tal precursor a fórmula

-X (A-l) Gli —--------------I (A—6) Cis-S-S | | (Α-20) (Α-21) (Α-7) Cis---Cis---Cis----Asn—R_xI

I (A-ll) II

S SI ^{1 1}I s sI (B-l) I II

R-HN-Fen—Cis---------Cis-------------Tre (B-7) (B—19) (B-30) em que R é hidrogénio, um resíduo de amino-ácido clivável qui micamente ou enzimaticamente, ou uma porção de peptídeo cliva vel quimicamente ou enzimaticamente tendo, pelo menos,dois re síduos de amino-ácido;

Rj é OH, Arg-Y ou Lys-Y, em que Y é OH, um resíduo de amino-ácidos, ou uma porção de peptídeo tendo, pelo menos, dois resíduos de amino-ácido;

a porção de A-l a A-21 é a cadeia A de insulina humana; a por ção de B-l a B-30 é a cadeia B da insulina humana; e X é a porção que está ligada à cadeia A da insulina no grupo de ami no de A-l e à cadeia B da insulina no grupo de carboxilo de B -30, porção essa que pode ser clivada enzimaticamente a par tir de e sem rotura de, ambas as cadeias A e B, processo es se que compreende o tratamento de um tal precursor de insulina humana com tripsina e carboxipeptidase B, num meio aquoso contendo, por mole de precursor de insulina humana, cerca de 0,1 a cerca de 10 moles de um ou mais iões metálicos dos metais tendo Números Atómicos de 21 a 34, de 39 a 52, de 57 a 84, e de 89 a 92.

Como foi indicado, o processo deste inven to representa um aumento da conversão aceite de pro-insulina em insulina, empregando tripsina e carboxipeptidase B. 0 pr£ cesso é aplicado aos precursores de insulina humana da fórmu la precedente, dos quais o mais preferido é a própria pro-in sulina humana.

Tal como empregado nesta Memória Descri tiva, o termo “precursor de insulina humana designa uma molécula que (1) contém a cadeia A da insulina humana e a ca deia B da insulina humana, (2) tem, pelo menos, três liga ções dissulfureto representada por uma ligação dos enxofres de cada uma das porções Cis, localizadas nas cadeias A- e B -em (a) A-6 e A-ll, (b) A-7 e B-7, e (e) A-20 e B-19, res pectivamente, e (5) tem uma porção ligante removível, que es tá ligada à Cadeia A da insulina no grupo amino de A-l e à cadeia B da insulina, no grupo carboxilo de B-3O.

grupo R é hidrogénio, um resíduo de ami. no ácido , ou uma porção de peptídeo tendo, pelo menos, dois resíduos de amino-ácido. Nos casos, em que R é um resíduo de amino-ácido ou uma porção de peptídeo, R é um grupo que é clivável a partir do produto precursor da insulina, sem perda da integridade da estrutura da insulina residual· Qual quer de uma grande variedade de resíduos de amino-ácido, ou de porções de peptídeo está classificada dentro de uma definição do grupo R. Exemplos de resíduos de amino-ácido cliva veis são amino-ácidos básicos, tais como a arginina (Arg) ou a lisina (Lis), bem como as porções de peptídeo que terminam no carboxilo por tais resíduos de amino-ácido· Estes são reconhecidos como susceptíveis de clivagem, por tratamento com tripsina de enzimas proteolíticas. Um outro exemplo de um resíduo de amino-ácido clivável é a metionina (Met), bem como, uma vez mais, uma porção de peptídeo tendo Met no seu terminal carboxi· Estes podem ser removidos por tratamento com brometo de cianogénio. Um outro exemplo é o triptofâ nio (Trp) ou uma porção de peptídeo contendo Trp no seu terminal carboxi. Este pode ser removido por tratamento com N-bromossuccinimida.

grupo R^ é hidroxilo, arginina, lisina ou um peptideo tendo a arginina ou a lisina no seu terminal amino. Quando R^ é arginina, lisina, ou um peptídeo, tendo qualquer um destes resíduos no seu terminal amino, o amino-ácido ou o peptídeo será clivado sob as condições do processo deste invento, com a formação de um produto em que R^ é hidroxilo.

k porção ligante, X, do precursor da insulina pode ser qualquer de uma vasta gama de estruturas. De preferência, a porção X é um polipetídeo. 0 polipeptídeo tem , de um modo geral, pelo menos 2, e, de preferência, cer ca de 2 a cerca de 55, ©, com mais preferência, cerca de 6 a cerca de 55, resíduos de amino-ácido. A porção X está ligada à cadeia A, no grupo amino de A-l, e à cadeia B, no grupo car boxilo de B-50. Com a máxima preferência, a porção ligante X, quando ela é um peptídeo, e o peptídeo ligante natural da pro-insulina humana, tendo um tal peptídeo ligante a fórmula:

-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-GliGln-Val-Glu-Leu-Gli-Gli-Gli-Pro-Gli-AlaGli-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Deu-Glu-GliS er-Leu-Gln-Li s-Arg-.

Conquanto seja preferível empregar-se a sequência de ligação natural, como foi indicado no preceden te, sequências de peptídeos mais curtas podem ser empregadas para o peptídeo ligante. As únicas qualidades requeridas são (1) que elas tenham o comprimento suficiente para permi tir a adequada formação de ligação dissulfureto entre as ca deias A e B, e (2) que elas sejam cliváveis a partir do pre cursor de insulina, acompanhadas da formação da insulina. Um dipeptídeo típico, que pode ser usado, é -Arg-Arg-. Em complemento, as modificações do dipeptídeo precedente, com a fór mula -Arg-X’-Arg-, em que X’ representa, pelo menos, um resíduo de amino-ácido, podem ser empregadas facilmente. Os pej) tídeos ligantes, grandemente preferidos, são -Arg-Arg-Lis-Arg-, bem como os peptídeos de cadeia mais comprida, tendo a estrutu 2 2 » , ra -Arg-Arg-X -Lis-Arg-, em que X e, pelo menos, um resíduo de amino-ácido e, de preferência, pelo menos, dois resíduos de amino-ácido. Estes últimos, como é evidente, incluem o peptídeo ligante natural.

processo deste invento é levado a efeito num meio aquoso. 0 termo meio aquoso exige a presença de água; contudo, não exclui a presença de solventes orgânicos miscíveis com a água, tais como metanol, etanol, acetona, Jf,N6

-dimetilformamida, e outros idênticos. 0 precursor da insulina humana encontra-se presente no meio, a uma concentração até cerca de 20 mH. De preferência, a concentração do pre cursor de insulina humana é substancialmente inferior, oscilando, de um modo geral, entre cerca de 0,1 aM e cerca de 10 mM; com mais preferência, entre cerca de 0,5 θ cerca de 5 mM; e, com mais preferência ainda, entre cerca de 1 e cerca de 3 mM.

A conversão é levada a efeito a qualquer temperatura de uma vasta gama, de um modo geral entre cerca de 02 G e cerca de 402 0. De preferência, a reacção é condu zida a uma temperatura entre cerca de 42 C e cerca de 25^s 0, e, com mais preferência, entre cerca de 102 0 e cerca de 15^aC.

pH da mistura da reacção pode oscilar en tre cerca de 4 e cerca de 12. Contudo, os melhores resultados são obtidos pelo controlo cuidadoso do pH, de tal modo que a reacção seja conduzida a um pH compreendido entre cerca de 6 e cerca de 9, de preferência entre cerca de 7 e cerca de 8, e, quando controlada com exactidão, entre cerca de 7,2 e cerca de 7,6« controlo do pH é, de um modo geral, au xiliado pelo emprego de um agente tampão. Qualquer um de vas ta gama de tampões típicos pode ser empregado . Exemplos de tampões adequados são TRIS /“tris (hidroximetil) aminometa noj⁷, etilenodiamina, trietanolamina, glicina, HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazino-N*-2-etanossulfónico) e outros afins·

A quantidade de tripsina e de carboxipepti dase B que é, de um modo geral , empregada, está relacionada tanto com as duas enzimas, como com a quantidade de precur sor de insulina humana. As enzimas podem ser incorporadas na mistura da reacção tanto na solução, como, empregando téc nicas reconhecidas, podem ser imobilizadas num suporte adequa do, e, desse modo, tornadas disponíveis no meio da reacção.

Numa base de peso: peso, a carboxipeptidase B encontra-se presente, de um modo geral, numa quantidade em relação ao precursor da insulina humana, compreendida entre cerca de 1:10 e cerca de 1:5*000; de preferência, entre cerca de 1:500 e cerca de 1:5*500; e, com mais preferên cia, entre cerca de 1:1.000 e cerca de 1:5*000 .

Numa base de peso: peso, a tripsina encontra-se presente, de um modo geral, numa quantidade , em relação ao precursor de insulina humana, compreendida entre cerca de 1:20 e cerca de 1:250.000; de preferência entre cer ca de 1:500 e cerca de 1:20.000; e, com mais preferência ain da entre cerca de 1:5.000 e cerca de 1:15*000.

A proporção entre a carboxipeptidase B e a tripsina, na mistura da reacção, representa também um parâmetro importante. De um modo geral, numa base de peso, a proporção entre a carboxipeptidase B e a tripsina está compreendida entre cerca de 1:1 e cerca de 10:1, e, de prefe rência, entre cerca de 2:1 e cerca de 5:1.

A descoberta principal, que forma a base deste invento, reside na revelação de que a presença de uma quantidade definida de um, ou mais, de uma vasta gama de iões metálicos diminui, substancialmente, a quantidade de Des-Tre (B50)-hI formada durante a reacção.

Conquanto certos iões metálicos sejam altamente preferidos, tem-se verificado que é útil uma vasta gama de iões. Iões metálicos, que podem ser empregados, são os dos metais, que se seguem: escândio (Sc), titânio (Ti),va nádio (V), crómio (Cr), manganês (Mn), ferro (Fe), cobalto (Co), níquel (Ni), cobre (Cu), zinco (Zn), gálio (Ga), ger mânio (Ge), arsénico (As), selénio (Se), ítrio (Y), zircónio (Zr), nióbio (Nb), molibdénio (Mo), tecnécio (Tc), ruténio (Ru), ródio (Rh), paládio (Pd), prata (Ag), cádmio (Cd), índio (In), estanho (Sn), antimonio (Sb), telúrio (Te), lantâno (Ia), cério (Ge), praseodímio (Pr), neodímio (Nd), promécio (Pm), samário (Sm), európio (Eu), gadolínio (Gd), térbio (Tb), disprósio (Dy), hólmio (Ho) , érbio (Er), túlio (Tm),

itérbio (Tb), lutécio (Lu), hafnio (Hf), tântalo (ta), tungs. ténio (W), rénio (Re), ósmio (Os), irídio (Ir), platina (Pt), Ouro (Au), mercúrio (Hg), tálio (Tl), Chumbo (Pb), bismuto (Bi), polónio (Po), actínio (Ac), tório (Th), protactínio (Pa) e urânio (V).

Embora os iões de qualquer um dos metais precedentes possa ser utilizado no processo deste invento,se guem-se as subclasses de metais altamente preferidas e de âm bito mais restrito e, por isso, com mais preferência :

(1) Crómio, molibdénio, tungsténio, mercúrio, antimónio, bismuto, níquel , ferro, cobalto, zinco, cád mio, cobre, estanho, chumbo, európio, urânio, platina e manganês .

(2) níquel, ferro, cobalto, zinco, cádmio, cobre, estanho, chumbo, európio, urânio, platina e manganês.

(5) níquel, zinco, cobalto e cádmio.

(4) níquel e zinco.

(5) níquel.

De acordo com o processo deste invento,os iões de um, ou mais, dos metais precedentes são adicionados à mistura de reacção do precursor da insulina humana. A quantidade de iões dos metais precedentes, no agregado pre sente na mistura da reacção oscila entre cerca de 0,1 e cerca de 10 moles, por mole do precursor de insulina humana. A quantidade real empregada, de preferência, encontra-se na ex tremidade inferior da gama precedente, sendo, de um modo geral, cerca de 0,1 a cerca de 2 moles, por mole do precursor de insulina humana. Com mais preferência, a quantidade está compreendida entre cerca de 0,5 e cerca de 1 mole por mole do precursor de insulina humana, e no ideal entre cerca de 0,53 e cerca de 0,6 mole do precursor de insulina humana.

A reacção da conversão é conduzida, nor malmente, durante um período compreendido entre cerca de 2 horas e cerca de 48 horas, e habitualmente durante cerca de 8 horas a cerca de 16 horas. A reacção pode ser controla da pela cromatografia líquida de alta resolução, e o tempo da reacção pode ser cuidadosamente coordenado com a produção de insulina humana.

Uma outra faceta deste invento, totalmen te inesperada, é a descoberta de que a quantidade de produ ção de Des-Tre (B50)-hI pode ser diminuída ainda mais, pela incorporação, na mistura da reacção, de um, ou mais, iões de metais de uma outra classe de metais. Este outro aperfeiçoamento torna-se particularmente evidente, quando a quantidade do ião do primeiro metal se encontra na gama de cerca de 0,1 mole até 0,6 mole, por mole do precursor de insulina humana, á altamente vantajoso adicionar-se uma quantidade de um ião metálico de um metal seleccionado do grupo constituído por berílio (Be), magnésio (Mg), cálcio (Ca), estrôncio (Sr), bário (Ba) e rádio. De preferência, o ião deve ser o de cálcio, de bário, de estrôncio, ou de magnésio, e, com mais preferência deve ser o de cálcio.

A quantidade do ião do segundo metal deve estar compreendida entre cerca de 0,5 mole e cerca de 5 moles, por mole do precursor da insulina humana, e, de pre ferência, entre cerca de 1 mole e cerca de 5 moles, por mo le do precursor de insulina humana.

que tem sido mais surpreendente sobre o emprego de um ião do segundo metal, tal como o descrito no precedente, é o facto de um ião da segunda classe, espje cificamente o do cálcio, se conhecido comoestabilizador da tripsina, e, quando empregado na ausência de um ião de um metal da primeira classe, verifica-se que a produção de Des -Tre (B50)-hI é, na verdade, maior.

Tipicamente, o processo deste invento é levado a efeito dissolvendo-se o precursor de insulina humana num meio aquoso. A mistura final tem, de um modo geral, a concentração de cerca de 1 nM até cerca de 5mM, e tem um pH de cerca de 8. Um ião de um metal da segunda classe (se for empregado) é, então, adiccionado. Tipica mente, o cloreto de cálcio é adicionado, até uma concentra

ção de cerca de 5ΜΊ, quando se emprega a concentração prece dente do precursor de insulina humana. Um ião de um metal da primeira classe, tipicamente Ni (II),é, em seguida,adi cionado até uma concentração de cerca de 0,5 moles, por mole do precursor de insulina humana. 0 pH da mistura é ajujs tado a 7,5-7,5, e a carboxipeptidase B (cerca de 1:2.500,em peso, do precursor de insulina humana)é adicionada, seguida pela tripsina (cerca de 1:12.500,em peso, do precursor de insulina humana). Deixa-se prosseguir a reacção, sendo a mistura mantida a cerca de 1220. o desenvolvimento da reac ção é cuidadosamente controlado pela cromatografia líquida de alta resolução.

Os exemplos, que se seguem,são proporciona dos para demonstrar a eficácia do processo deste invento. Não são concebidos para limitar o seu vasto âmbito.

Exemplo 1. Efeito da variação das concentrações de tripsina e de carboxipeptidase B.

A pro-insulina humana (hpi) foi dissolvida em 20 mM de tampão etilenodiamina (EDA),pH 7,0, até uma con centração de 10,85 gramas por litro.

A mistura foi dividida em duas porções. À primeira porção, adicionou-se a carboxipeptidase B (CpB)pan créática porcina,até uma concentração final de 5,74 por litro. Esta solução foi dividida em seis partes alíquotas de um mililitro,e a tripsina pancreática bovina,tratada pre viamente com tosilfenilaianil-clorometil-cetona,(tripsina TPCK) foi adicionada até 1,0,1,4,1,8,2,8,5,6 e 5,4 mg por litro,respectivamente. Cada uma das amostras foi incubada, durante 8 horas, a 25^a C. Os níveis de Des-Tre (B50)-hI fb ram determinados pela Cromatografia Líquida de Alta Resolução (HBLC) e estão apresentados na Tabela 1.

A segunda porção da solução de hPI foi divi dida em cinco partes alíquotas de um mililitro. Adicionou-se CpB até uma concentração de 1,1, 1,5, 2,2, 5,7 θ 5,4 mg por litro, respectivamente. Adicionou-se, em seguida, a trip sina-TPCK a cada tuna das partes alíquotas, até uma concentra ção de 2,71 mg por litro. Cada um dos protótipos foi incuba do, durante 8 horas, a 23² C. Os resultados estão apresenta dos na Tabela 2.

Em ambas as Tabelas 1 e 2, a quantidade de Des-Tre (B3o)-hl está expressa como uma percentagem de hl,co mo foi determinado pela Cromatografia Líquida de Alta Resolu ção. Como os dados revelam, a níveis fixos de CpB, a Des-Tre (B3O)-hI reduz-se diminuindo as quantidades de tripsina. ite ciprocamente, a níveis fixos de tripsina, as quantidades enes centes de CpB conduzem a quantidades decrescentes de Des-Tre (B3O)-hI.

Tabela 1.

Efeito dos níveis	1 crescentes de Tripsina, sobre a transforma
ção do hPI. CpB, mg litro	Tripsina, mg litro	% de Des-Tre(B30)-hI, como % de hl.
3,7	1,0	2,4
3,7	1,4	2,6
3,7	1,8	2,7
3,7	2,8	3,3
3,7	3,6	3,9
3,7	5,4	5,2
Efeito dos níveis	Tabela 2. crescentes de CpB,	sobre a transformação
do hPI		% de Des-Tre(B30)-hI,
CpB, mg litro	Tripsina, mg litro	como % de hl.
1,1	2,71	4,8
1,5	2,71	4,0
2,2	2,71	4,1
3,7	2,71	3,4
5,*	2,71	2,6

Exemplo 2. Efeito da temperatura, sobre a produção de Des-Tre (B3O)-hI.

Dissolveu-se hPI (60 mg) em etilenodiamina 20 mM (6,0 ml), pH 7,5 a 8,0. Adicionaram-se, subsequentemente, a carbosipeptidase B porcina e a tripsina TPCK bovina, para se estabelecer uma proporção de substrato (hPI) í enzima de 5000:1:1, em peso, para hPI:CpB:tripsina-TPuK. Partes alíquotas de dois mililitros foram incu badas a 12, 24 e 37^a 0, durante os períodos de tempo necejs sários para se atingir o rendimento de hl máximo, como foi determinado por cromatografia Líquida de Alta Resolução , isto é, 14, 6 e 4 horas, respectivamente. Gomo está expojs to nos resultados da Tabela 5, as temperaturas mais baixas favoreceram a formação mais baixa de Des-Tre(B30)-hI.

Tabela 5«

Efeito da Temperatura

Temperatura da % de Des-Tre(B50)-hI,

Incubação, Q 0. _____como % de hl.

124,4

24>7

37>9

Exemplo 3. Efeito dos metais, na formação de derivados.

Dissolveu-se hPI (360 mg) em 20 ml de glicina 20 mM , pH 7,65- A solução foi dividida em duas partes de 10,0 ml cada, e adicionou-se o ião de cálcio até 5 mM a uma parte alíquota. Cada uma das partes alíquotas foi subdividida em três porções. Uma porção contendo o ião de cálcio e uma das partes alíquotas livres do ião de cálcio foram, então, tratadas como se segue: A um conjunto , adicionou-se o ião de zinco, para se obter uma proporção molar de 0,33 em relação à hPI. A um outro conjunto, adi cionou-se o ião de níquel, para se obter uma proporção mo lar de 0,56 em relação à hPI. Adicionaram-se as enzimas a todas as misturas, para se estabelecerem as proporções em peso seguintes: hPI:CpB: Tripsina-TPCK:í13*500:5:1· 0 pH de cada uma das misturas foi ajustado a 7,65 a 7,7 e elas foram incubadas a 122 q, durante 16 horas. Os resultados, expostos na Tabela 4, revelam o efeito do níquel e do zinco, na redução do nível da formação de Des-Tre (B30) - hl. Eles revelam ainda o aumento deste efeito, pelo cálcio.

Tabela 4.

Efeito de metais, na transformação de hPI

Ião metálico	Des-Tre (B50)-hl, como % hl
Nenhum	4,0
Ca	7,6
Zn Ni	1,6 1,7
Zn+Ca Ni+Ca	0,7 < 0,2¹

^Χ0 ensaio revelou um valor inferior ao do limite detectável que era 0,20 % de hl.

Exemplo 4. Efeito da variação da concentração de Ni(II), na formação de derivados na reacção de conversão de hPI.

Dissolveu-se hPI (245mg) em 12,0 ml de glicina 50 mH, pH 7,4. Adicionou-se o ião de cálcio de uma solução de estoque de CaCl£ 1M, para se obter uma concentra ção final 5nM de Ca(II). Adicionou-se o níquel (II) de uma solução de estoque de NiClg 0,11 M, a partes alíquotas de 2 ml, para se obter amostras cada uma com proporção molar relativamente à hPI de 0, 0,24, 0,57, 0,44, 0,51 e 0,5θ·

Adicionou-se CpB a cada um dos tubos, para se obter 7,4 mg/ /ml (lote de 4,8? mg/ml), seguido pela adição de tripsina TPCK, para se obter uma concentração final de 2,96 mg/ml (so lução do lote de 1,0 mg/ml). 0 pH de todas as amostras foi

ajustado a 7,40 e cada um deles foi incubado a 122c. As reacções foram interrompidas depois de 12 horas, e medi ram-se os níveis de Des-Tre(B50)-hI e de hl. Os resultados, expostos na Tabela 5, indicam que os níveis crescentes de níquel resultaram na produção reduzida de Des-Tre (B50)-hl.

Tabela 5«

Efeito da variação da concentração de Ni(II).

Proporção fíolar % Des-Tre (B50)-hI,

Ni(II)/hPI como % hl______

0	7,6
0,24	1.9
0,57	0,61
0,44	0,72
0,51	0,55
0,58	0,28

Exemplo 5. Efeito de diversos catiões de metais, na formação de derivados, na reação da conversão de hPI.

Dissolveu-se a hPI (956 mg) em 56 ml de glicina 5 mM, e o pH foi ajustado a 7,8 a 8,0. 0 ião de cálcio foi adicionado como CaClg (estoque 1 M) até 5 MM. Partes alíquotas de 5 ml cada foram retiradas, e adicionaram-se diversos iões de metais, nas concentrações indica das na Tabela 6. Após o equilíbrio a 122 o, adicionaram se as enzimas para se proporcionarem relações, em peso, co mo as que se seguem: hPI:CpB:tripsina-TFCK::15*500:5:1.

As amostras foram incubadas a 122 c, durante 15 horas, e foram medidos os valores de hl e de DesTre(B50)-hI. Os resultados, expostos na Tabela 6 , indicam que qualquer um de uma grande gama de iões de metais são eficientes na redução da produção de Des-Tre(B50)-hl ·

Tabela 6.

Efeito de diversos catiões divalentes.

ião de metal	Proporção molar,	% de Des-Tre(B50)
divalente	K(II)/hPI.	como % de hl.
Zn	0,5	1,02
Zn	0,5	0,78
Ni	0,22	2,29
Ni	0,57	0,72
Co	0,26	2,55
Co	0,45	0,89
Cd	0,19	1,65
Cd	0,51	0,88
Cu	0,14	5,25
Cu	0,25	1,54

Exemplo 6. Transformação em grande escala de hPI, empregando-se Ni (II) e Ça(II).

A hPI (448,5 grafias), dissolvida em tam pão de glicina 15 nM, pH 7,4- (53,0 L), foi arrefecida e man tida a 122 c, o cálcio (II) foi adicionado até 5 nM, pela adição de uma solução de estoque de CaCl₂ l>0 Μ (0,165 I>).

Depois de se agitar durante 10 minutos, adicionou-se níquel (II), para se obter uma proporção mo lar de Ni(II):hPI de 0,44:1, pela adição de NiCl₂.6H₂0 sélido (5,0 g). A solução foi agitada suavemente, durante outros 10 minutos, e adicionou-se OpB (56,8 ml, 179,4 mg ) de uma solução de estoque de 4,87 mg/ml. Adicionou-se em seguida, a tripsina-TPCK (55,9 ml, 55,9 mg), de uma solução de estoque de 1,0 mg/ml. A reacção atingiu o seu término em 10 horas, conforme foi medido pela produção máxima de hl. Na altura da colheita, a mistura continha cerca de 0,29 % de Des-Tre(B50)-hI, o que se aproxima do limite de detecção do método de detecção deste composto.

Claims

ía. - Processo para converter um pre cursor de insulina humana em insulina humana, tendo tal pre cursor a fórmula (A-l) GliX

II (A-6) Cis-S-S|

I | (A-20) (A-21)| (A-7) Cis---Cis---Cis----Asn—R_x|

I (A-ll) ||

S S|

I II

S SI (B-l) | ||

R-HN-Fen—cis---------cis-------------Tre (B-7) (B-19) (B-30) em que R é hidrogénio, um resíduo de amino-ácido clivável quimicamente ou enzimaticamente, ou uma porção de peptídeo clivável quimicamente ou enzimaticamente, tendo, pelo me nos, dois resíduos de amino-ácido;

R^ é OH, Arg-Y ou Lis-Y, em que Y é OH, um resíduo de amino-ácido, ou uma porção de peptídeo, tendo, pelo menos, dois resíduos de amino ácidos;

a porção de A-l a A-21 é a cadeia A da insulina humana; a porção de B-l a B-30 é a cadeia B da insulina humana; e X é a porção que é ligada à cadeia A da insulina no grupo de ami no de A-l β à cadeia B da insulina, no grupo de carboxilo de B-30, porção essa que pode ser clivada enzimaticamente a par tir de, e sem rotura de, ambas as cadeia A e B, caracterizado por compreender o tratamento de tal precursor de insulina humana, com tripsina e carboxipeptidase B, num meio aquoso contendo, por mole de precursor de insulina huma na, cerca de 0,1 a cerca de 10 moles de um ou mais iões metá lico dos metais que têm Números Atómicos de 21 a 54, de 39 a 52, de 57 a 84, e de 89 a 92.
2a. - Processo, de acordo com a rei vindicação 1, caracterizado por o ião metálico ser o de um metal seleccionado do grupo constituído por crómio, molibdénio, tungsténio, mercúrio, antimónio, bismuto, níquel , ferro, cobalto, zinco, cádmio, cobre, estanho, chumbo, európio, urânio, platina e maganês.
3a. - Processo, de acordo com a rei vindicação 2, caracterizado por o ião metálico ser o de um metal seleccionado do grupo constituído por níquel, ferro, cobalto, zinco, cádmio, cobre, estanho, chumbo, európio , urânio, platina e manganês.
4a. - Processo, de acordo com a rei. vindicação 5, caracterizado por o ião metálico ser o de um metal seleccionado do grupo constituído por níquel, zinco, cobalto e cádmio.
5&. - Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o pre cursor de insulina humana se encontrar presente, no meio aquoso, numa concentração até cerca de 20 mM.
6a. - Processo, de acordo com a rei. vindicação 5, caracterizado por o precursor de insulina hu mana se encontrar presente, no meio aquoso, numa concentra ção de cerca de 1 itíM a cerca de 3 mM.

- Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por o ião metálico se encontrar presente numa quantidade de cerca de 0,1 a cerca de 2 moles, por mole de precursor da insulina humana.
8â. - Processo, de acordo com a rei. vindicação 7» caracterizado por o ião de metal se encon trar presente numa quantidade cerca de 0,53 a cerca de 0,6 moles, por mole de precursor de insulina humana.
9§. - Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por a car boxipeptidase se encontrar presente numa quantidade, numa base ponderai, em relação ao precursor de insulina humana, de cerca de 1:10 a cerca de 1:5.000.
10&. - Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por a trig sina se encontrar presente numa quantidade, numa base pon deral, em relação precursor de insulina humana, a cerca de l;20 a cerca de 1:250.000.
11&. - Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por a pr£ porção em peso do carboxipeptidase B para tripsina ser de cerca de 1:1 a cerca de 10:1.
12a. - Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por o ião metálico ser o de um metal seleccionado do grupo constituído por níquel e zinco.
13^. - Processo, de acordo com a rei. vindicação 12, caracterizado por o ião metálico ser o ião níquel.
14a. - processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por se adicionar à mistura um segundo ião metálico, de um metal se leccionado do grupo constituído por berilio, magnésio, cálcio, estroncio, bário e rádio.
15a. - processo, de acordo com a rei. vindicação 14, caracterizado por 0 segundo ião metálico ser 0 de um metal seleccionado do grupo constituído por cálcio, bário, estroncio e magnésio.
16&. - Processo, de acordo com a rei, vindicação 15, caracterizado por o segundo ião metálico ser o ião cálcio.
17&. - Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado por o se gundo ião metálico se encontrar presente numa quantidade de cerca de 0,5 moles a cerca de 5 moles, por mole de precur sor da insulina humana.

- 19
18^. - Processo, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o segundo ião metálico se encontrar presente numa quantidade de cerca de 1 mole a cer ca de 3 moles, por mole de precursor da insulina humana.
19-¾. - processo, de acordo com qual quer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado por 0 pre cursor de insulina humana ser a pro-insulina humana.