DE3750897T2

DE3750897T2 - Verfahren für Umwandlung von menschlichem Insulin-Vorläufer in menschliches Insulin.

Info

Publication number: DE3750897T2
Application number: DE3750897T
Authority: DE
Inventors: Bruce Hill Frank; Richard Eugene Heiney; Walter Francis Prouty; Mark Robert Walden
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1986-10-14
Filing date: 1987-10-13
Publication date: 1995-05-18
Anticipated expiration: 2007-10-14
Also published as: CN1029131C; IE872743L; JPS63105695A; SG14795G; KR880005262A; JP2634176B2; DE3750897D1; ZA877505B; HU204572B; AU595934B2; PT85892B; DK175266B1; PT85892A; RU1829939C; MX168305B; AR243608A1; GR3015143T3; AU7952887A; PH26471A; CA1339955C

Description

Die Möglichkeit zur Umwandlung von Proinsulin in Insulin mittels Trypsin und Carboxypeptidase B ist seit mehreren Jahren bekannt [siehe beispielsweise W. Kemmler, J.L. Clark, J. Borg und Steiner, Fed. Proc. 30 (1971) 1210, W. Kemmler, J.D. Peterson D.F. Steiner, J. Biol. Chem., 246 (1971) 6786-6791]. Eine bestehende Schwierigkeit bei diesem Umwandlungsverfahren war und bleibt das Vorkommen einer ziemlich großen Menge an schwer entfernbaren Nebenprodukten im Reaktionsgemisch. Genauer gesagt wird bei der Umwandlung von humanem Proinsulin in Humaninsulin eine große Menge (etwa 4-6%) Des-Thr(B30) Humaninsulin [Des-Thr(B30)hI] gebildet. Dieses Nebenprodukt, das sich vom Humaninsulin durch die Abwesenheit einer einzelnen terminalen Aminosäure unterscheidet, ist, wenn es überhaupt vom Produktgemisch abgetrennt werden kann, nur durch schwierige und aufwendige Verfahren abzutrennen.
Mit dem Aufkommen der rekombinanten DNA Technologie wurden das erste Mal große Mengen an humanem Proinsulin Realität. Als man das humane Proinsulin als Zwischenprodukt zur Herstellung von Insulin verwendete, wurde eine Lösung des Des-Thr(B30)hI Verunreinigungsproblems obligatorisch. Entweder konnte man Wege suchen, um die Reinigung des Humaninsulins vom kontaminierenden Ds-Thr(B30)-hI zu erreichen oder ein Umwandlungsverfahren suchen, dessen Bedingungen die Bildung des letzteren minimieren. Beispielsweise wird die Verwendung von Zink bei der Umwandlung von Proinsulin in Insulin in BBRC 38 (1970) 284-289 erwähnt.
Es ist ein neues Verfahren zur Umwandlung eines Humaninsulinvorläufers in Humaninsulin mit minimaler Bildung von Des- Thr(B30)-hI, das diese Erfindung betrifft.
Daher betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur Umwandlung eines Humaninsulinvorläufers in Humaninsulin, wobei dieser Vorläufer folgende Formel hat
worin R für Wasserstoff, einen chemisch oder enzymatisch spaltbaren Aminosäurerest oder einen chemisch oder enzymatisch spaltbaren Peptidrest mit zumindest zwei Aminosäureresten steht,
R&sub1; für OH, Arg-Y oder Lys-Y steht, worin Y für OH, einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest mit mindestens zwei Aminosäureresten steht,
der Rest von A-1 bis A-21 die A-Kette von Humaninsulin ist, der Rest von B-1 bis B-30 die B-Kette von Humaninsulin ist, und X ein Rest ist, der an die A-Kette von Insulin an die Aminogruppe von A-1 und an die B-Kette von Insulin an die Carboxylgruppe von B-30 gebunden ist, wobei dieser Rest ohne Zerstörung sowohl der A-Kette als auch der B-Kette enzymatisch abgespalten werden kann, gekennzeichnet durch eine Behandlung eines solchen Humaninsulinvorläufers mit Trypsin und Carboxypeptidase B in einem wäßrigen Medium, das pro Mol Humaninsulinvorläufer etwa 0,1 bis etwa 10 Mol eines oder mehrerer Metallionen der Metalle mit den Atomzahlen 21 bis 34, 39 bis 52, 57 bis 84 und 89 bis 92 enthält.
Wie erwähnt stellt das erfindungsgemäße Verfahren eine Verbesserung der bekannten Umwandlung von Proinsulin in Insulin mittels Trypsin und Carboxypeptidase B dar. Das Verfahren wird auf Humaninsulinvorläufer der vorherigen Formel angewendet, wobei der bevorzugteste humanes Proinsulin selbst ist.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Humaninsulinvorläufer" auf ein Molekül, das (1) die A-Kette von Humaninsulin und die B-Kette von Humaninsulin enthält, (2) zumindest drei Disulfidbrücken aufweist, die durch eine Verbindung der Schwefelatome der jeweiligen Cys Reste zustandekommen, welche jeweils in den A- und B-Ketten an (a) A-6 und A-11 (b) A-7 und B-7 und (c) A-20 und B-19 lokalisiert sind, und (3) einen entfernbaren Verbindungsrest aufweist, der an die Insulin-A-Kette an die Aminogruppe von A-1 und an die Insulin-B-Kette an die Carboxygruppe von B-30 gebunden ist.
Die Gruppe R steht für Wasserstoff, einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest, der zumindest zwei Aminosäurereste aufweist. In den Fällen, bei denen R für einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest steht, ist R eine Gruppe, die vom Insulinvorläuferprodukt ohne Verlust der Integrität der verbleibenden Insulinstruktur abspaltbar ist. Eine Vielzahl von Aminosäureresten oder Peptidresten fällt unter die Definition der Gruppe R. Beispiele für spaltbare Aminosäurereste sind basische Aminosäuren, wie Arginin (Arg) oder Lysin (Lys), wie auch Peptidreste, die am Carboxyl von solchen Aminosäureresten enden. Von diesen ist bekannt, daß sie für eine Spaltung nach einer Behandlung mit dem proteolytischen Enzym Trypsin zugänglich sind. Ein weiteres Beispiel für einen spaltbaren Aminosäurerest ist Methion (Met), und wiederum ein Peptidrest, der Met am Carboxyterminus aufweist. Diese können durch die Behandlung mit Cyanogenbromid entfernt werden. Ein weiteres Beispiel ist Tryptophan (Trp) oder ein Peptidrest, der Trp an seinem Carboxyterminus enthält. Dies wird durch die Behandlung mit N-Bromsuccinimid entfernt.
Die Gruppe R&sub1; steht für Hydroxyl, Arginin, Lysin oder ein Peptid, das Arginin oder Lysin am Aminoterminus aufweist. Wenn R&sub1; für Arginin, Lysin oder ein Peptid steht, das einen dieser Reste an seinem Aminoterminus aufweist, wird die Aminosäure oder das Peptid unter den erfindungsgemaßen Verfahrensbedingungen unter Bildung eines Produkts gespalten, worin R&sub1; für Hydroxyl steht.
Der Verbindungsrest X des Insulinvorläufers kann jede eines großen Sortiments an Strukturen sein. Vorzugsweise ist der Rest X ein Polypeptid. Das Polypeptid hat im allgemeinen zumindest 2 und vorzugsweise etwa 2 bis etwa 35 und vor allem etwa 6 bis etwa 35 Aminosäurereste. Der Rest X ist an die A-Kette an die Aminogruppe von A-1 und an die B-Kette an die Carboxylgruppe von B-30 gebunden. Vor allem ist der Verbindungsrest X, wenn dieser ein Peptid ist, das natürliche Verbindungspeptid von humanem Proinsulin, wie das Verbindungspeptid mit der Formel
Obwohl es bevorzugt ist, die natürliche Verbindungssequenz zu verwenden, wie sie oben angegeben ist, können viel kürzere Peptidsequenzen für das Verbindungspeptid verwendet werden. Die einzigen Anforderungen sind (1) daß sie genügend lang sind, um die richtige Disulfidbindungsbildung zwischen den A- und B-Ketten zu erlauben, und (2) daß sie vom Insulinvorläufer unter gleichzeitiger Insulinbildung abspaltbar sind. Ein typisches Dipeptid, das verwendet werden kann, ist -Arg-Arg-. Zusätzlich können auch einfach Modifizierungen des vorherigen Dipeptids mit der Formel -Arg- X'-Arg- verwendet werden, worin X' für mindestens einen Aminosäurerest steht. Äußerst bevorzugte Verbindungspeptide sind -Arg-Arg- Lys-Arg-, wie auch längerkettige Peptide mit der Struktur -Arg- Arg-X²-Lys-Arg-, worin X² zumindest für einen Aminosäurerest und vorzugsweise für mindestens zwei Aminosäurereste steht. Die letzteren beinhalten selbstverständlich das natürliche Verbindungspeptid.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird in einem wäßrigen Medium durchgeführt. Der Ausdruck "wäßriges Medium" erfordert die Gegenwart von Wasser, er schließt jedoch das Vorkommen von wassermischbaren organischen Lösemitteln, wie Methanol, Ethanol, Aceton, N,N-Dimethylformamid und dergleichen nicht aus. Der Humaninsulin vorläufer kommt im Medium in einer Konzentration bis etwa 20 mM vor. Vorzugsweise ist die Konzentration des Humaninsulinvorläufers wesentlich geringer und reicht im allgemeinen von etwa 0,1 mM bis etwa 10 mM, insbesondere von etwa 0,5 bis etwa 5 mM und vor allem von etwa 1 bis etwa 3 mM.
Die Umwandlung wird bei jeder Temperatur eines weiten Temperaturbereichs ausgeführt, im allgemeinen von etwa 0ºC bis etwa 40ºC. Vorzugsweise wird die Reaktion bei einer Temperatur von etwa 4ºC bis etwa 25ºC und vor allem von etwa 10ºC bis etwa 15ºC durchgeführt.
Der pH des Reaktionsgemisches kann irgendwo von etwa 4 bis etwa 12 liegen. Jedoch werden die besten Ergebnisse mit sorgfältiger pH Kontrolle erhalten, wie durch Ausführung der Reaktion bei einem pH im Bereich von etwa 6 bis etwa 9, vorzugsweise von etwa 7 bis etwa 8, und bei genauer Kontrolle von etwa 7,2 bis etwa 7,6.
Die pH Kontrolle wird im allgemeinen durch die Verwendung eines puffernden Mittels unterstützt. Jeder einer großen Vielzahl von typischen Puffern kann verwendet werden. Beispiele für geeignete Puffer sind TRIS [Tris(hydroxymethyl)aminoethan], Ethylendiamin, Triethanolamin, Glycin, HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin- N¹-2-ethansulfonsäure) und dergleichen.
Die Menge an Trypsin und Carboxypeptidase B, die im allgemeinen verwendet wird, hängt sowohl von den beiden Enzymen als auch von der Menge an Humaninsulinvorläufer ab. Die Enzyme können in das Reaktionsgemisch entweder in Lösung oder mittels bekannter Techniken auf einem geeigneten Träger immobilisiert eingearbeitet werden und dadurch im Reaktionsmedium verfügbar sein.
Auf der Grundlage von Gewicht:Gewicht ist die Carboxypeptidase B relativ zum Humaninsulinvorläufer im allgemeinen in einer Menge von etwa 1 : 10 bis etwa 1 : 5 000, vorzugsweise von etwa 1 : 500 bis etwa 1 : 3 500 und vor allem von etwa 1 : 1 000 bis etwa 1 : 3 000 vorhanden.
Auf der Grundlage von Gewicht:Gewicht ist Trypsin relativ zum Humaninsulinvorläufer im allgemeinen in einer Menge von etwa 1:20 bis etwa 1 : 250 000, vorzugsweise von etwa 1 : 300 bis etwa 1 : 20 000 und vor allem von etwa 1 : 5 000 bis etwa 1 : 15 000 vorhanden.
Das Verhältnis von Carboxypeptidase B zu Trypsin im Reaktionsgemisch stellt ebenfalls einen wichtigen Parameter dar. Im allgemeinen beträgt das Verhältnis Carboxypeptidase B zu Trypsin auf Gewichtsbasis etwa 1 : 1 bis etwa 10 : 1 und vorzugsweise etwa 2 : 1 bis etwa 5 : 1.
Die wichtigste Feststellung, die die Grundlage dieser Erfindung bildet, beruht auf der Beobachtung, daß das Vorkommen einer definierten Menge eines oder mehrerer Metallionen eines großen Sortiments wesentlich die gebildete Menge des in der Reaktion gebildeten Des-Thr(B30)-hI vermindert.
Obwohl bestimmte Metallionen äußerst bevorzugt sind, wurde festgestellt, daß ein großes Sortiment solcher Ionen brauchbar ist. Es können Metallionen der folgenden Metalle verwendet werden: Scandium (Sc), Titan (Ti), Vanadium (V), Chrom (Cr), Mangan (Mn), Eisen (Fe), Cobalt (Co), Nickel (Ni), Kupfer (Cu), Zink (Zn), Gallium (Ga), Germanium (Ge), Arsen (As), Selen (Se), Yttrium (Y), Zirkonium (Zr), Niob (Nb), Molybdän (Mo), Technetium (Tc) Ruthenium (Ru), Rhodium (Rh), Palladium (Pa), Silber (Ag), Cadmium (Cd), Indium (In), Zinn (Sn), Antimon (Sb), Tellur (Te), Lanthan (La), Cer (Ce), Praseodym (Pr), Neodym (Nd), Promethium (Pm), Samarium (Sm), Europium (Eu), Gadolinium (Gd), Terbium (Tb), Dysprosium (Dy), Holmium (Ho), Erbium (Er), Thulium (Tm), Ytterbium (Yb), Lutecium (Lu), Hafnium (Hf), Tantal (Ta), Wolfram (W), Rhenium (Re), Osmium (Os), Iridium (Ir), Platin (Pt), Gold (Au), Quecksilber (Hg), Thallium (Tl), Blei (Pb), Wismuth (Bi), Polonium (Po), Actinium (Ac), Thorium (Th), Protactinium (Pa) und Uran (U).
Obwohl Ionen jedes der vorhergehenden Metalle im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind äußerst bevorzugte Unterklassen mit enger werdendem Umfang und steigender Bevorzugung folgende:
(1) Chrom, Molybdän, Wolfram, Quecksilber, Antimon, Wismuth, Nickel, Eisen, Cobalt, Zink, Cadmium, Kupfer, Zinn, Blei, Europium, Uran, Platin und Mangan.
(2) Nickel, Eisen, Cobalt, Zink, Cadmium, Kupfer, Zinn, Blei, Europium, Uran, Platin und Mangan.
(3) Nickel, Zink, Cobalt und Cadmium.
(4) Nickel und Zink.
(5) Nickel.
Gemäß dem Verfahren dieser Erfindung werden Ionen eines oder mehrerer der vorangehenden Metalle zu dem Reaktionsgemisch des Humaninsulinvorläufers gegeben. Die Menge des Ions der vorangehenden Metalle im Aggregat, das im Reaktionsgemisch vorhanden ist, reicht von etwa 0,1 bis etwa 10 Mol pro Mol Humaninsulinvorläufer. Die tatsächlich bevorzugt verwendete Menge liegt am unteren Ende des vorangehenden Bereichs und beträgt im allgemeinen etwa 0,1 bis etwa 2 Mol pro Mol Humaninsulinvorläufer. Vor allem beträgt die Menge etwa 0,3 bis etwa 1 Mol pro Mol Humaninsulinvorläufer und idealerweise etwa 0,33 bis etwa 0,6 Mol pro Mol Humaninsulinvorläufer.
Die Umwandlungsreaktion wird normalerweise während einer Zeitspanne von etwa 2 Stunden bis etwa 48 Stunden, gewöhnlich von etwa 8 Stunden bis etwa 16 Stunden ausgeführt. Die Reaktion kann durch Hochleistungsflüssigchromatographie verfolgt werden und die Reaktionszeit sorgfältig zur Humaninsulinproduktion koordiniert werden.
Ein weiterer Gesichtspunkt dieser Erfindung ist die völlig unerwartete Feststellung, daß die Menge der Des-Thr(B30)-hI Bildung weiter verringert werden kann durch die Einbeziehung von einem oder mehreren Metallionen von anderen Metallklassen in das Reaktionsgemisch. Diese weitere Verbesserung ist insbesondere sichtbar, wenn die Menge des ersten Metallions im Bereich von etwa 0,1 Mol bis etwa 0,6 Mol pro Mol Humaninsulinvorläufer liegt. Es ist äußerst vorteilhaft, eine Menge eines Metallions eines Metalls aus der Gruppe zuzugeben, die aus Beryllium (Be), Magnesium (Mg), Calcium (Ca), Strontium (Sr), Barium (Ba) und Radium (Ra) besteht. Vorzugsweise ist es das Ion von Calcium, Barium, Strontium oder Magnesium und vor allem ist es das von Calcium.
Die Menge des zweiten Metallions reicht von etwa 0,5 Mol bis etwa 5 Mol pro Mol Humaninsulinvorläufer und vorzugsweise von etwa 1 Mol bis etwa 3 Mol pro Mol Humaninsulinvorläufer.
Was am überraschendsten bei der Verwendung eines zweiten Metallions war, wie dies vorher beschrieben wurde, ist die Tatsache, daß ein Ion der zweiten Klasse, besonders Calcium, bekanntermaßen Trypsin stabilisiert, und wenn es in Abwesenheit eines Metallions der ersten Klasse verwendet wird, wurde festgestellt, daß die Bildung von Des-Thr(B30)-hI tatsächlich erhöht wird.
Typischerweise wird das erfindungsgemäße Verfahren durch Lösen des Humaninsulinvorläufers in einem wäßrigen Medium ausgeführt. Das schließliche Gemisch hat im allgemeinen eine Konzentration von etwa 1 mM bis etwa 3 mM und einen pH von etwa 8. Dann werden Ionen eines Metalls der zweiten Klasse (falls verwendet) zugegeben. Typischerweise wird CaCl&sub2; in einer Konzentration von etwa 5 mM zugegeben, wenn die vorherige Konzentration des Humaninsulinvorläufers verwendet wird. Ein Metallion der ersten Klasse, typischerweise Ni(II), wird dann in einer Konzentration von etwa 0,5 Mol pro Mol Humaninsulinvorläufer zugegeben. Der pH des Gemisches wird auf 7,3-7,5 eingestellt und Carboxypeptidase B (etwa 1 : 2 500 Gew/Gew Humaninsulinvorläufer) wird gefolgt von Trypsin (etwa 1 : 12 500 Gew/Gew Humaninsulinvorläufer) zugegeben. Die Reaktion läßt man laufen und hält das Gemisch auf etwa 12ºC. Der Fortschritt der Reaktion wird sorgfältig durch Hochleistungsflüssigchromatographie verfolgt.
Die folgenden Beispiele zeigen die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens. Sie sollen auf den breiten Umfang hiervon nicht beschränkend wirken.

Beispiel 1 - Einfluß variierender Trypsin- und Carboxypeptidase B- Konzentrationen

Humanes Proinsulin (hPI) wird in 20 mM Ethylendiaminpuffer (EDA), pH 7,0 in einer Konzentration von 10,85 g/Liter gelöst. Das Gemisch wird in zwei Teile aufgeteilt. Zum ersten Teil wird Pankreascarboxypeptidase B aus dem Schwein (CpB) in einer Endkonzentration von 3,74 mg/Liter gegeben. Diese Lösung wird in sechs 1 ml Aliquots aufgeteilt und Pankreastrypsin aus dem Rind, das vorher mit Tosylphenylalanylchlormethylketon (Trypsin-TPCK) behandelt wurde, wird jeweils in 1,0, 1,4, 1,8, 2,8, 3,6 und 5,4 mg/Liter zugegeben. Jede der Proben wird für 8 Stunden bei 23ºC inkubiert. Die Des-Thr(B30)-hI Mengen werden durch Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) bestimmt und sind in Tabelle 1 gezeigt.
Der zweite Teil der hPI Lösung wird in fünf 1 ml Aliquots aufgeteilt. CpB wird jeweils in einer Konzentration von 1,1, 1,5, 2,2, 3,7 und 5,4 mg/Liter zugegeben. Dann wird Trypsin-TPCK zu jedem Aliquot in einer Konzentration von 2,71 mg/Liter gegeben. Jede der Proben wird für 8 Stunden bei 23ºC inkubiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
In den beiden Tabellen 1 und 2 ist die Menge an Des- Thr(B30)-hI als Prozent hI ausgedrückt, wie es durch HPLC bestimmt wird. Wie die Daten zeigen, wird Des-Thr(B30)-hI durch abnehmende Mengen Trypsin bei konstanten Mengen an CpB verringert. Umgekehrt dazu führen bei fixierten Trypsinmengen steigende Mengen an CpB zu verringerten Mengen an Des-Thr(B30)-hI. Tabelle 1 Einfluß steigender Trypsinmengen auf die hPI Umwandlung CpB, mg/Liter Trypsin Tabelle 2 Einfluß steigender CpB Mengen auf die hPI Umwandlung CpB, mg/Liter Trypsin

Beispiel 2 - Einfluß der Temperatur auf die Des-Thr(B30)-hI Bildung

hPI (60 mg) wird in 20 mM Ethylendiamin (6,0 ml) pH 7,5-8,0 gelöst. Schweine-Carboxypeptidase B und Rinder-Trypsin-TPCK werden nacheinander zugegeben, um ein Produkt (hI) zu liefern: Enzymverhältnis von 5 000:1 : 1 Gew/Gew für hPI:CpB:Trypsin-TPCK. Zweimilliliteraliquots werden bei 12, 24 und 37ºC für Zeitspannen inkubiert, die zum Erreichen einer mittels HPLC gemessenen maximalen hI Ausbeute notwendig sind, das heißt jeweils 14, 6 und 4 Stunden. Wie die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen, fördern niedrigere Temperaturen eine niedrigere Des-Thr(B30)-hI Bildung.

Tabelle 3

Temperatureinfluß

Inkubation Temperatur ºC % Des-Thr(B30)-hI als % hI
12 4,4
24 > 7
37 > 9

Beispiel 3 - Einfluß von Metallen auf die Derivatbildung

hPI (360 mg) wird in 20 ml 20 mM Glycin pH 7,65 gelöst. Die Lösung wird in 10,0 ml Aliquots aufgeteilt und Calciumionen werden 5 mM zu einem Aliquot zugegeben. Jedes Aliquot wird weiter in drei Teile geteilt. Ein Teil von den Calciumion-enthaltenden und einer von den Calciumion-freien Aliquots werden folgendermaßen behandelt: Für einen Satz werden Zinkionen unter Bildung eines Molverhältnisses relativ zu hPI von 0,33 gegeben. Zu einem weiteren Satz werden Nickelionen unter Bildung eines Molverhältnisses relativ zu hPI von 0,36 gegeben. Zu allen Gemischen werden Enyzme unter Bereitstellung der folgenden Gewichtsverhältnisse gegeben: hPI:CpB:Trypsin-TPCK 13 500 : 5:1. Der pH jedes Gemisches wird auf 7,65-7,7 eingestellt und bei 12ºC für 16 Stunden inkubiert. Die in Tabelle 4 gezeigten Ergebnisse zeigen den Einfluß von Nickel und Zink in der Verringerung der gebildeten Des-Thr(B30)-hI Menge. Sie zeigt ferner die Steigerung dieses Einflusses durch Calcium.

Tabelle 4

Einfluß von Metallen auf die hPI Umwandlung

Metallion Des-Thr(B30)-hI als % hI
Keines 4,0
Ca 7,6
Zn 1,6
Ni 1,7
Zn+Ca 0,7
Ni+Ca > 0,2¹
¹ Der Test lag unter der Detektionsgrenze, die 0,20% hI betrug.

Beispiel 4 - Einfluß variierender Ni(II)-Konzentrationen auf die Derivatbildung bei der hPI Umwandlungsreaktion

hPI (245 mg) wird in 12,0 ml 50 mM Glycin pH 7,4 gelöst. Calciumionen werden aus einer 1 M CaCl&sub2; Stammlösung unter Bildung einer Ca(II)-Endkonzentration von 5 mM zugegeben. Nickel(II) wird aus einer 0,11 M NiCl&sub2; Stammlösung zu 2 ml Aliquots unter Bildung einer Probe eines Molverhältnisses von hPI von 0, 0,24, 0,37, 0,44, 0,51 und 0,58 gegeben. CpB wird zu jedem Röhrchen unter Bildung von 7,4 ug/ml (4,87 mg/ml Stammlösung) gefolgt von der Zugabe von Trypsin-TPCK unter Bildung einer Endkonzentration von 2,96 ug/ml (1,0 mg/ml Stammlösung) gegeben. Der pH von allen Proben wird auf 7,40 eingestellt und jede wird bei 12ºC inkubiert. Die Reaktionen werden nach 12 Stunden gestoppt und die Mengen an Des-Thr(B30)-hI und hI gemessen. Die in Tabelle 5 gezeigten Ergebnisse zeigen, daß erhöhte Mengen an Nickel zu einer verringerten Bildung von Des-Thr(B30)-hI führen.

Tabelle 5

Einfluß der variierenden Ni(II) Konzentration

Molverhältnis Ni (II)/hPI % Des-Thr(B30)-hI als % hI
0 7,6
0,24 1,9
0,37 0,61
0,44 0,72
0,51 0,33
0,58 0,28

Beispiel 5 - Einfluß verschiedener Metallkationen auf die Derivatbildung bei der hPI Umwandlungsreaktion

hPI (936 mg) wird in 36 ml 5 mM Glycin gelöst und der pH wird auf 7,8-8,0 eingestellt. Calciumionen werden als CaCl&sub2; (1 M Stammlösung) 5 mM zugegeben. Aliquots mit 3 ml werden jeweils entnommen und verschiedene Metallionen werden in den in Tabelle 6 gezeigten Konzentrationen zugegeben. Nach der Äquilibrierung bei 12ºC werden die Enzyme unter Bereitstellung folgender Gewichtsverhältnisse zugegeben: hPI : CpB : Trypsin-TPCK 13 500 : 5:1.
Die Proben werden bei 12ºC für 13 Stunden inkubiert und hI und Des-Thr(B30)-hI werden gemessen. Die in Tabelle 6 gezeigten Ergebnisse zeigen, daß jedes Metallion eines großen Sortiments bei der Verringerung der Des-Thr(B30)-hI Bildung wirksam ist. Tabelle 6 Einfluß verschiedener divalenter Kationen Divalentes Metallion Molverhältnis

Beispiel 6 - Umwandlung von hPI im großen Maßstab mittels Ni(II) und Ca(II)

hPI (448,5 g), gelöst in 15 mM Glycinpuffer pH 7,4 (33,0 l) wird gekühlt und auf 12ºC gehalten. Calcium (II) wird 5 mM durch die Zugabe einer 1,0 M CaCl&sub2; Stammlösung (0,165 l) zugegeben. Nach zehnminütigem Rühren wird Nickel (II) unter Bildung eines Molverhältnisses von Ni(II):hPI von 0,44 : 1 durch die Zugabe von festem NiCl&sub2;·6 H&sub2;O (5,0 g) zugegeben. Die Lösung wird für weitere 10 Minuten mäßig gerührt und CpB (36,8 ml, 179,4 mg) wird aus einer 4,87 mg/ml Stammlösung zugegeben. Trypsin-TPCK (35,9 ml, 35,9 mg) wird dann aus einer 1,0 mg/ml Stammlösung zugegeben. Die Reaktion ist nach 10 Stunden beendet, wie dies durch die maximale hI Bildung bestimmt wird. Am Ende enthält das Gemisch etwa 0,29% Des- Thr(B30)-hI, was nahe an der Detektionsgrenze des Detektionsverfahrens dieser Verbindung liegt.

Claims

1. Verfahren zur Umwandlung eines Humaninsulinvorläufers in Humaninsulin, wobei dieser Vorläufer die folgende Formel hat

worin R für Wasserstoff, einen chemisch oder enzymatisch spaltbaren Aminosäurerest oder einen chemisch oder enzymatisch spaltbaren Peptidrest mit zumindest zwei Aminosäureresten steht,

R&sub1; für OH, Arg-Y oder Lys-Y steht, worin Y für OH, einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest mit mindestens zwei Aminosäureresten steht,

der Rest von A-1 bis A-21 die A-Kette von Humaninsulin ist, der Rest von B-l bis B-30 die B-Kette von Humaninsulin ist, und X ein Rest ist, der an die A-Kette von Insulin an die Aminogruppe von A-1 und an die B-Kette von Insulin an die Carboxylgruppe von B-30 gebunden ist, wobei dieser Rest ohne Zerstörung sowohl der A-Kette als auch der B-Kette enzymatisch abgespalten werden kann, gekennzeichnet durch eine Behandlung eines solchen Humaninsulinvorläufers mit Trypsin und Carboxypeptidase B in einem wäßrigen Medium, das pro Mol Humaninsulinvorläufer etwa 0,1 bis etwa 10 Mol eines ersten Metallions von Metallen mit den Atomzahlen 21 bis 34, 39 bis 52, 57 bis 84 und 89 bis 92, und ein zweites Metallion eines Metalls enthält, ausgewählt aus der aus Beryllium, Magnesium, Calcium, Strontium, Barium und Radium bestehenden Gruppe.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das erste Metallion von einem Metall stammt, ausgewählt aus der aus Chrom, Molybdän, Wolfram, Quecksilber, Antimon, Wismuth, Nickel, Eisen, Cobalt, Zink, Cadmium, Kupfer, Zinn, Blei, Europium, Uran, Platin und Mangan bestehenden Gruppe.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin das erste Metallion von einem Metall stammt, ausgewählt aus der aus Nickel, Eisen, Cobalt, Zink, Cadmium, Kupfer, Zinn, Blei, Europium, Uran, Platin und Mangan bestehenden Gruppe.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin das erste Metallion von einem Metall stammt, ausgewählt aus der aus Nickel, Zink, Cobalt und Cadmium bestehenden Gruppe.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin der Humaninsulinvorläufer im wäßrigen Medium in einer Konzentration bis zu etwa 20 mM vorhanden ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin der Humaninsulinvorläufer im wäßrigen Medium in einer Konzentration von etwa 1 mM bis etwa 3 mM vorhanden ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das erste Metallion in einer Menge von etwa 0,1 bis etwa 2 Mol pro Mol Humaninsulinvorläufer vorhanden ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das erste Metallion in einer Menge von etwa 0,33 bis etwa 0,6 Mol pro Mol Humaninsulinvorläufer vorhanden ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin Carboxypeptidase B auf Gewichtsbasis in einer Menge relativ zum Humaninsulinvorläufer von etwa 1 : 10 bis etwa 1 : 5 000 vorhanden ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin Trypsin auf Gewichtsbasis in einer Menge relativ zum Humaninsulinvorläufer von etwa 1 : 20 bis etwa 1 : 250 000 vorhanden ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin das Gewichtsverhältnis von Carboxypeptidase B zu Trypsin etwa 1 : 1 bis etwa 10 : 1 beträgt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, worin das erste Metallion das eines Metalls ist, ausgewählt aus der aus Nickel und Zink bestehenden Gruppe.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin das erste Metallion das Nickelion ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin das zweite Metallion von einem Metall stammt, ausgewählt aus der aus Calcium, Barium, Strontium und Magnesium bestehenden Gruppe.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin das zweite Metallion das Calciumion ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 oder 15, worin das zweite Metallion in einer Menge von etwa 0,5 Mol bis etwa 5 Mol, pro Mol Humaninsulinvorläufer vorhanden ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin das zweite Metallion in einer Menge von etwa 1 Mol bis etwa 3 Mol pro Mol Humaninsulinvorläufer vorhanden ist.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, worin der Humaninsulinvorläufer humanes Proinsulin ist.