JP2634176B2 - インシュリン前駆体のインシュリンへの変換法 - Google Patents
インシュリン前駆体のインシュリンへの変換法Info
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- JP2634176B2 JP2634176B2 JP62258166A JP25816687A JP2634176B2 JP 2634176 B2 JP2634176 B2 JP 2634176B2 JP 62258166 A JP62258166 A JP 62258166A JP 25816687 A JP25816687 A JP 25816687A JP 2634176 B2 JP2634176 B2 JP 2634176B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はインシユリン前駆体のインシユリンへの変換
方法、更に詳しくはヒトインシユリン前駆体のヒトイン
シユリンへの変換方法ならびに該方法により製造された
ヒトインシユリンに関する。
方法、更に詳しくはヒトインシユリン前駆体のヒトイン
シユリンへの変換方法ならびに該方法により製造された
ヒトインシユリンに関する。
従来技術と解決すべき問題点 トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢを用いて
プロインシユリンをインシユリンに変換できることは、
ここ数年間認められていることである〔たとえばケムラ
ー（Kemmler,W.）、クラーク（Clark,J.L.）、ボルグ
（Borg,J.）およびステイナー（Steiner,D.F.）著、フ
エデレイシヨン・プロシーデイングス（Fed.Proc.）第3
0巻（1971年）1210頁；ケムラー（Kemmler,W.）、ペタ
ーソン（Peterson,J.D.）およびステイナー（Steiner,
D.F.）著、ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（J.Biol.Chem.）第246巻（1971年）6786〜6791
頁参照〕。この変換の方法論に伴う持続的困難は、この
反応混合物中の実質的に多量の分離困難な副生物が存在
したことであり、かつ存在が継続していることである。
特にヒトプロインシユリンのヒトインシユリンへの変換
において、多量の（約４〜６％）のDes−Thr（B30）ヒ
トインシユリン〔Des−Thr（Ｂ−30）−hI〕が生成す
る。この副生物は、１個の末端アミノ酸を欠く点でヒト
インシユリンと異なり、もし生成物の混合物から強いて
分離しようとするなら、分離されるが、ただ方法論的に
困難かつ煩雑である。
プロインシユリンをインシユリンに変換できることは、
ここ数年間認められていることである〔たとえばケムラ
ー（Kemmler,W.）、クラーク（Clark,J.L.）、ボルグ
（Borg,J.）およびステイナー（Steiner,D.F.）著、フ
エデレイシヨン・プロシーデイングス（Fed.Proc.）第3
0巻（1971年）1210頁；ケムラー（Kemmler,W.）、ペタ
ーソン（Peterson,J.D.）およびステイナー（Steiner,
D.F.）著、ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（J.Biol.Chem.）第246巻（1971年）6786〜6791
頁参照〕。この変換の方法論に伴う持続的困難は、この
反応混合物中の実質的に多量の分離困難な副生物が存在
したことであり、かつ存在が継続していることである。
特にヒトプロインシユリンのヒトインシユリンへの変換
において、多量の（約４〜６％）のDes−Thr（B30）ヒ
トインシユリン〔Des−Thr（Ｂ−30）−hI〕が生成す
る。この副生物は、１個の末端アミノ酸を欠く点でヒト
インシユリンと異なり、もし生成物の混合物から強いて
分離しようとするなら、分離されるが、ただ方法論的に
困難かつ煩雑である。
組換えDNA技術の出現に伴い、最初、多量のヒトプロ
インシユリンが現実となつた。インシユリン生産におけ
る中間体としてヒトプロインシユリンを用いる場合に、
Des−Thr（B30）−hI不純物の問題の解決が必須事項と
なつた。不純なDes−Thr（B30）−hIからヒトインシユ
リンの精製を達成する方法を探求するか、または変換方
法とその不純物の生成を最少限にする条件を探求するこ
とが望ましい。本発明の新規方法は、上記問題点を解決
するものであつて、Des−Thr（B30）−hIの生成を最少
限に保持してヒトインシユリン前駆体をヒトインシユリ
ンに変換することに指向される方法である。
インシユリンが現実となつた。インシユリン生産におけ
る中間体としてヒトプロインシユリンを用いる場合に、
Des−Thr（B30）−hI不純物の問題の解決が必須事項と
なつた。不純なDes−Thr（B30）−hIからヒトインシユ
リンの精製を達成する方法を探求するか、または変換方
法とその不純物の生成を最少限にする条件を探求するこ
とが望ましい。本発明の新規方法は、上記問題点を解決
するものであつて、Des−Thr（B30）−hIの生成を最少
限に保持してヒトインシユリン前駆体をヒトインシユリ
ンに変換することに指向される方法である。
発明の構成と効果 本発明は式： 〔式中、Ｒは水素、化学的もしくは酵素的に開裂しうる
アミノ酸残基または少なくとも２個のアミノ酸残基を有
し化学的もしくは酵素的に開裂しうるペプチド部分； R1はOH、Arg−ＹまたはLys−Ｙ（基中のＹはOH、アミ
ノ酸残基または少なくとも２個のアミノ酸残基を有する
ペプチド部分）； （Ａ−１）〜（Ａ−21）部分はヒトインシユリンＡ−
鎖； （Ｂ−１）〜（Ｂ−30）部分はヒトインシユリンＢ−
鎖； Ｘは該インシユリンＡ−鎖にＡ−１のアミノ基で結合
し、かつ該インシユリンＢ−鎖にＢ−30のカルボキシル
基で結合した部分であつて、Ａ−鎖およびＢ−鎖の双方
を崩壊することなくその双方から酵素的に開裂させるこ
とができる部分を表わす〕 で示されるヒトインシユリン前駆体を、このヒトインシ
ユリン前駆体当り、原子番号21〜34、39〜52、57〜84お
よび89〜92の金属のうちの１種ないしそれ以上の金属イ
オン約0.1〜10モル含有の水性溶媒中、トリプシンおよ
びカルボキシペプチダーゼＢで処理することから成るヒ
トインシユリン前駆体をヒトインシユリンに変換する方
法に指向されるものである。
アミノ酸残基または少なくとも２個のアミノ酸残基を有
し化学的もしくは酵素的に開裂しうるペプチド部分； R1はOH、Arg−ＹまたはLys−Ｙ（基中のＹはOH、アミ
ノ酸残基または少なくとも２個のアミノ酸残基を有する
ペプチド部分）； （Ａ−１）〜（Ａ−21）部分はヒトインシユリンＡ−
鎖； （Ｂ−１）〜（Ｂ−30）部分はヒトインシユリンＢ−
鎖； Ｘは該インシユリンＡ−鎖にＡ−１のアミノ基で結合
し、かつ該インシユリンＢ−鎖にＢ−30のカルボキシル
基で結合した部分であつて、Ａ−鎖およびＢ−鎖の双方
を崩壊することなくその双方から酵素的に開裂させるこ
とができる部分を表わす〕 で示されるヒトインシユリン前駆体を、このヒトインシ
ユリン前駆体当り、原子番号21〜34、39〜52、57〜84お
よび89〜92の金属のうちの１種ないしそれ以上の金属イ
オン約0.1〜10モル含有の水性溶媒中、トリプシンおよ
びカルボキシペプチダーゼＢで処理することから成るヒ
トインシユリン前駆体をヒトインシユリンに変換する方
法に指向されるものである。
前記のように本発明の方法は、トリプシンおよびカル
ボキシペプチダーゼＢを用いてプロインシユリンをイン
シユリンに変換する公認方法の効果を増強する方法を開
示するものである。この方法は、前記式で示されるヒト
インシユリン前駆体、最も好ましくはヒトプロインシユ
リン自体に適用される。
ボキシペプチダーゼＢを用いてプロインシユリンをイン
シユリンに変換する公認方法の効果を増強する方法を開
示するものである。この方法は、前記式で示されるヒト
インシユリン前駆体、最も好ましくはヒトプロインシユ
リン自体に適用される。
本明細書で使用するヒトインシユリン前駆体という語
句は、（１）ヒトインシユリンＡ−鎖とヒトインシユリ
ンＢ−鎖を含み、（２）Ａ−鎖とＢ−鎖中のそれぞれ
（ａ）Ａ−６とＡ−11、（ｂ）Ａ−７とＢ−７および
（ｃ）A20とＢ−19に位置した各Cys部分の硫黄結合によ
り表わされる少なくとも３個のジスルフイド結合を有
し、（３）インシユリンＡ−鎖のＡ−１のアミノ基、お
よびインシユリンＢ−鎖のＢ−30のカルボキシル基に結
合した脱離させうる結合部分を有する分子を呼称する。
句は、（１）ヒトインシユリンＡ−鎖とヒトインシユリ
ンＢ−鎖を含み、（２）Ａ−鎖とＢ−鎖中のそれぞれ
（ａ）Ａ−６とＡ−11、（ｂ）Ａ−７とＢ−７および
（ｃ）A20とＢ−19に位置した各Cys部分の硫黄結合によ
り表わされる少なくとも３個のジスルフイド結合を有
し、（３）インシユリンＡ−鎖のＡ−１のアミノ基、お
よびインシユリンＢ−鎖のＢ−30のカルボキシル基に結
合した脱離させうる結合部分を有する分子を呼称する。
Ｒ基は、水素、アミノ酸残基、少なくとも２個のアミ
ノ酸残基を有するペプチド部分である。この定義のうち
上記の例におけるＲは、アミノ酸残基またはペプチド部
分であつてこのＲは残余インシユリン構造の完全性を喪
失することなくインシユリン前駆体生成物から開裂しう
る基である。広範囲に渡るいずれのアミノ酸残基または
ペプチド部分も、Ｒの定義の範囲に入るものと認められ
る。開裂しうるアミノ酸残基の例は、アルギニン（Ar
g）またはリシン（Lys）のような塩基性アミノ酸ならび
にこのようなアミノ酸残基であつてその末端にカルボキ
シル基を有するペプチド部分である。これらは、蛋白質
分解酵素トリプシンで処理後、開裂に感受性であると認
められるものである。開裂しうるアミノ酸残基の他の例
は、メチオニン（Met）ならびに前記同様末端にMetのカ
ルボキシ基を有するペプチド部分である。これらは臭化
シアンで処理することにより脱離することができる。更
に開裂しうるアミノ酸残基の例として、トリプトフアン
（Trp）または末端にTrpのカルボキシ基を含むペプチド
部分があげられる。これはＮ−ブロモスクシンイミドで
処理後、脱離される。
ノ酸残基を有するペプチド部分である。この定義のうち
上記の例におけるＲは、アミノ酸残基またはペプチド部
分であつてこのＲは残余インシユリン構造の完全性を喪
失することなくインシユリン前駆体生成物から開裂しう
る基である。広範囲に渡るいずれのアミノ酸残基または
ペプチド部分も、Ｒの定義の範囲に入るものと認められ
る。開裂しうるアミノ酸残基の例は、アルギニン（Ar
g）またはリシン（Lys）のような塩基性アミノ酸ならび
にこのようなアミノ酸残基であつてその末端にカルボキ
シル基を有するペプチド部分である。これらは、蛋白質
分解酵素トリプシンで処理後、開裂に感受性であると認
められるものである。開裂しうるアミノ酸残基の他の例
は、メチオニン（Met）ならびに前記同様末端にMetのカ
ルボキシ基を有するペプチド部分である。これらは臭化
シアンで処理することにより脱離することができる。更
に開裂しうるアミノ酸残基の例として、トリプトフアン
（Trp）または末端にTrpのカルボキシ基を含むペプチド
部分があげられる。これはＮ−ブロモスクシンイミドで
処理後、脱離される。
R1基は、ヒドロキシル、アルギニン、リシン、または
アルギニンもしくはリシンのアミノ末端基を有するペプ
チドである。R1がアルギニン、リシンまたはこれらの酸
残基のいずれかのアミノ末端基を有するペプチドである
とき、これらのアミノ酸またはペプチドは、R1がヒドロ
キシルである生成物を形成させる本発明方法の条件下に
開裂させることができる。
アルギニンもしくはリシンのアミノ末端基を有するペプ
チドである。R1がアルギニン、リシンまたはこれらの酸
残基のいずれかのアミノ末端基を有するペプチドである
とき、これらのアミノ酸またはペプチドは、R1がヒドロ
キシルである生成物を形成させる本発明方法の条件下に
開裂させることができる。
インシユリン前駆体の結合部分Ｘは、広範囲に渡るい
ずれの構造であつてもよい。部分Ｘは、好ましくはポリ
ペプチドである。このポリペプチドは一般に、少なくと
も２個、好ましくは約２〜35個、最も好ましくは約６〜
35個のアミノ酸残基を有する。部分Ｘは、Ａ−鎖のＡ−
１アミノ基、およびＢ−鎖のＢ−30カルボキシル基に結
合する。結合部分Ｘがペプチドであるとき、最も好まし
くはこれは、ヒトプロインシユリンの自然結合ペプチ
ド、たとえば次式を有する結合部分である： −Arg−Arg−Glu−Ala−Glu−Asp−Leu−Gln−Val−G
ly−Gln−Val−Glu−Leu−Gly−Gly−Gly−Pro−Gly−A
la−Gly−Ser−Leu−Gln−Pro−Leu−Ala−Leu−Glu−G
ly−Ser−Leu−Gln−Lys−Arg。
ずれの構造であつてもよい。部分Ｘは、好ましくはポリ
ペプチドである。このポリペプチドは一般に、少なくと
も２個、好ましくは約２〜35個、最も好ましくは約６〜
35個のアミノ酸残基を有する。部分Ｘは、Ａ−鎖のＡ−
１アミノ基、およびＢ−鎖のＢ−30カルボキシル基に結
合する。結合部分Ｘがペプチドであるとき、最も好まし
くはこれは、ヒトプロインシユリンの自然結合ペプチ
ド、たとえば次式を有する結合部分である： −Arg−Arg−Glu−Ala−Glu−Asp−Leu−Gln−Val−G
ly−Gln−Val−Glu−Leu−Gly−Gly−Gly−Pro−Gly−A
la−Gly−Ser−Leu−Gln−Pro−Leu−Ala−Leu−Glu−G
ly−Ser−Leu−Gln−Lys−Arg。
上記のような自然的結合鎖状物を処理するのが好まし
いが、結合ペプチドとして、非常に短かいペプチドを結
合ペプチドとして処理することができる。特定の要件
は、Ｘが（１）Ａ−鎖およびＢ−鎖の間の本来のジスル
フイド結合を許容するのに充分な長さであること、およ
び（２）インシユリン前駆体からインシユリンを形成さ
せるのに伴い、該前駆体から脱離させることができるこ
とである。処理することができる典型的ジペプチドは、
−Arg−Arg−である。加うるに式：−Arg−Ｘ′−Arg−
（Ｘ′は少なくとも１個のアミノ酸残基を表わす）を有
する上記ジペプチドの改良型も処理することができる。
特に好ましい結合ペプチドは、−Arg−Arg−Lys−Argお
よび−Arg−Arg−X2−Lys−Argの構造（X2は少なくとも
１個のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも２個のアミ
ノ酸残基である）を有するより長い鎖状のペプチドであ
る。後者は、もちろん自然的結合ペプチドを包含する。
いが、結合ペプチドとして、非常に短かいペプチドを結
合ペプチドとして処理することができる。特定の要件
は、Ｘが（１）Ａ−鎖およびＢ−鎖の間の本来のジスル
フイド結合を許容するのに充分な長さであること、およ
び（２）インシユリン前駆体からインシユリンを形成さ
せるのに伴い、該前駆体から脱離させることができるこ
とである。処理することができる典型的ジペプチドは、
−Arg−Arg−である。加うるに式：−Arg−Ｘ′−Arg−
（Ｘ′は少なくとも１個のアミノ酸残基を表わす）を有
する上記ジペプチドの改良型も処理することができる。
特に好ましい結合ペプチドは、−Arg−Arg−Lys−Argお
よび−Arg−Arg−X2−Lys−Argの構造（X2は少なくとも
１個のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも２個のアミ
ノ酸残基である）を有するより長い鎖状のペプチドであ
る。後者は、もちろん自然的結合ペプチドを包含する。
本発明の方法は、水性媒体中で行なわれる。水性媒体
という語句は、水の存在が必要であるが、メタノール、
エタノール、アセトン、N,N−ジメチルホルムアミドそ
の他のような水に混和しうる有機溶媒の存在は排除され
ない。ヒトインシユリン前駆体は媒体中に約20mMを越え
ない濃度で存在する。ヒトインシユリン前駆体の濃度
は、好ましくは一般に約0.1〜10mM、より好ましくは約
0.5〜5mM、最も好ましくは約１〜3mMの範囲で実質的に
低い。
という語句は、水の存在が必要であるが、メタノール、
エタノール、アセトン、N,N−ジメチルホルムアミドそ
の他のような水に混和しうる有機溶媒の存在は排除され
ない。ヒトインシユリン前駆体は媒体中に約20mMを越え
ない濃度で存在する。ヒトインシユリン前駆体の濃度
は、好ましくは一般に約0.1〜10mM、より好ましくは約
0.5〜5mM、最も好ましくは約１〜3mMの範囲で実質的に
低い。
変換反応は、一般に約０〜40℃の広範囲の温度で行な
うことができる。この反応は、好ましくは約４〜25℃、
最も好ましくは約10〜15℃の温度で行なわれる。
うことができる。この反応は、好ましくは約４〜25℃、
最も好ましくは約10〜15℃の温度で行なわれる。
反応混合物のpHは、約４〜12の範囲内のいずれかであ
ることができる。しかし反応が、pH約６〜９、好ましく
は約７〜８、正確に調節するときpH約7.2〜7.6の範囲で
進行するように注意してpHを調節することにより、最良
の結果が得られる。
ることができる。しかし反応が、pH約６〜９、好ましく
は約７〜８、正確に調節するときpH約7.2〜7.6の範囲で
進行するように注意してpHを調節することにより、最良
の結果が得られる。
一般に緩衝剤を使用することにより、pHの調節が助け
られる。広範囲に渡るいずれかの典型的緩衝剤を使用す
ることができる。適切な緩衝剤の例は、トリス（TRIS）
〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〕、エチレ
ンジアミン、トリエタノールアミン、グリシン、HEPES
〔Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−N1−２−エタ
ンスルホン酸〕その他である。
られる。広範囲に渡るいずれかの典型的緩衝剤を使用す
ることができる。適切な緩衝剤の例は、トリス（TRIS）
〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〕、エチレ
ンジアミン、トリエタノールアミン、グリシン、HEPES
〔Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−N1−２−エタ
ンスルホン酸〕その他である。
トリプシンとカルボキシペプチダーゼＢの使用量は一
般に、この２種の酵素の間の関係およびヒトインシユリ
ン前駆体の量に関連する。これらの酵素を、反応混合物
中に溶液とするかまたは適当な支持体上に固定して反応
媒体中で作用させることができる公知技術を応用するか
いずれかにより反応混合物に配合することができる。
般に、この２種の酵素の間の関係およびヒトインシユリ
ン前駆体の量に関連する。これらの酵素を、反応混合物
中に溶液とするかまたは適当な支持体上に固定して反応
媒体中で作用させることができる公知技術を応用するか
いずれかにより反応混合物に配合することができる。
重量：重量比に基づき、カルボキシペプチダーゼＢ
を、一般にヒトインシユリン前駆体に対する比約（1:1
0）〜（1:5,000）、好ましくは約（1:500）〜（1:3,50
0）、最も好ましくは約（1:1,000）〜（1:3,000）の量
で存在させる。
を、一般にヒトインシユリン前駆体に対する比約（1:1
0）〜（1:5,000）、好ましくは約（1:500）〜（1:3,50
0）、最も好ましくは約（1:1,000）〜（1:3,000）の量
で存在させる。
重量：重量比に基づき、トリプシンを、一般にヒトイ
ンシユリン前駆体に対する比約（1:20）〜（1:250,00
0）、好ましくは約（1:300）〜（1:20,000）、最も好ま
しくは約（1:5,000）〜（1:15,000）の量で存在させ
る。
ンシユリン前駆体に対する比約（1:20）〜（1:250,00
0）、好ましくは約（1:300）〜（1:20,000）、最も好ま
しくは約（1:5,000）〜（1:15,000）の量で存在させ
る。
また反応混合物中のカルボキシペプチダーゼＢのトリ
プシンに対する比は、重要なパラメーターである。カル
ボキシペプチダーゼＢのトリプシンに対する重量比は、
一般に約（1:1）〜（10:1）、好ましくは約（2:1）〜
（5:1）である。
プシンに対する比は、重要なパラメーターである。カル
ボキシペプチダーゼＢのトリプシンに対する重量比は、
一般に約（1:1）〜（10:1）、好ましくは約（2:1）〜
（5:1）である。
本発明の基本を構成する要点となる発見は、１種ない
しそれ以上広範囲に渡る金属イオンの特定量を存在させ
ることにより、反応中に生成するDes−Thr（B30）−hI
の量を実質的に減少させることを見いだしたことにあ
る。
しそれ以上広範囲に渡る金属イオンの特定量を存在させ
ることにより、反応中に生成するDes−Thr（B30）−hI
の量を実質的に減少させることを見いだしたことにあ
る。
ある種の金属イオンが非常に好ましいが、広範囲の金
属イオンが有用であることを見いだした。使用すること
ができる金属イオンは、次のような金属のイオンであ
る：スカンジウム（Sc）、チタン（Ti）、バナジウム
（Ｖ）、クロム（Cr）、マンガン（Mn）、鉄（Fe）、コ
バルト（Co）、ニツケル（Ni）、銅（Cu）、亜鉛（Z
n）、ガリウム（Ga）、ゲルマニウム（Ge）、ヒ素（A
s）、セレン（Se）、イツトリウム（Ｙ）、ジルコニウ
ム（Zr）、ニオブ（Nb）、モリブデン（Mo）、テクネチ
ウム（Tc）、ルテニウム（Ru）、ロジウム（Rh）、パラ
ジウム（Pd）、銀（Ag）、カドミウム（Cd）、インジウ
ム（In）、スズ（Sn）、アンチモン（Sb）、テルル（T
e）、ランタン（La）、セリウム（Ce）、プラセオジム
（Pr）、ネオジム（Nd）、プロメチウム（Pm）、サマリ
ウム（Sm）、ユーロピウム（Eu）、ガドリニウム（G
d）、テルビウム（Tb）、ジスプロシウム（Dy）、ホル
ミウム（Ho）、エルビウム（Er）、ツリウム（Tm）、イ
ツテルビウム（Yb）、ルテチウム（Lu）、ハフニウム
（Hf）、タンタル（Ta）、タングステン（Ｗ）、レニウ
ム（Re）、オスミウム（Os）、イリジウム（Ir）、白金
（Pt）、金（Au）、水銀（Hg）、タリウム（Tl）、鉛
（Pb）、ビスマス（Bi）、ポロニウム（Po）、アクチニ
ウム（Ac）、トリウム（Th）、プロトアクチニウム（P
a）およびウラン（Ｕ）。
属イオンが有用であることを見いだした。使用すること
ができる金属イオンは、次のような金属のイオンであ
る：スカンジウム（Sc）、チタン（Ti）、バナジウム
（Ｖ）、クロム（Cr）、マンガン（Mn）、鉄（Fe）、コ
バルト（Co）、ニツケル（Ni）、銅（Cu）、亜鉛（Z
n）、ガリウム（Ga）、ゲルマニウム（Ge）、ヒ素（A
s）、セレン（Se）、イツトリウム（Ｙ）、ジルコニウ
ム（Zr）、ニオブ（Nb）、モリブデン（Mo）、テクネチ
ウム（Tc）、ルテニウム（Ru）、ロジウム（Rh）、パラ
ジウム（Pd）、銀（Ag）、カドミウム（Cd）、インジウ
ム（In）、スズ（Sn）、アンチモン（Sb）、テルル（T
e）、ランタン（La）、セリウム（Ce）、プラセオジム
（Pr）、ネオジム（Nd）、プロメチウム（Pm）、サマリ
ウム（Sm）、ユーロピウム（Eu）、ガドリニウム（G
d）、テルビウム（Tb）、ジスプロシウム（Dy）、ホル
ミウム（Ho）、エルビウム（Er）、ツリウム（Tm）、イ
ツテルビウム（Yb）、ルテチウム（Lu）、ハフニウム
（Hf）、タンタル（Ta）、タングステン（Ｗ）、レニウ
ム（Re）、オスミウム（Os）、イリジウム（Ir）、白金
（Pt）、金（Au）、水銀（Hg）、タリウム（Tl）、鉛
（Pb）、ビスマス（Bi）、ポロニウム（Po）、アクチニ
ウム（Ac）、トリウム（Th）、プロトアクチニウム（P
a）およびウラン（Ｕ）。
上記金属のいずれかのイオンを本発明方法で使用する
ことができるが、下位種類に属するより狭い範囲の非常
に好ましく、それ故優先性の高い金属イオンは、次に示
す金属のイオンである： （１）クロム、モリブデン、タングステン、水銀、アン
チモン、ビスマス、ニツケル、鉄、コバルト、亜鉛、カ
ドミウム、銅、スズ、鉛、ユーロピウム、ウラン、白金
およびマンガン、 （２）ニツケル、鉄、コバルト、亜鉛、カドミウム、ス
ズ、鉛、ユーロピウム、ウラン、白金およびマンガン、 （３）ニツケル、亜鉛、コバルトおよびカドミウム、 （４）ニツケルおよび亜鉛、 （５）ニツケル。
ことができるが、下位種類に属するより狭い範囲の非常
に好ましく、それ故優先性の高い金属イオンは、次に示
す金属のイオンである： （１）クロム、モリブデン、タングステン、水銀、アン
チモン、ビスマス、ニツケル、鉄、コバルト、亜鉛、カ
ドミウム、銅、スズ、鉛、ユーロピウム、ウラン、白金
およびマンガン、 （２）ニツケル、鉄、コバルト、亜鉛、カドミウム、ス
ズ、鉛、ユーロピウム、ウラン、白金およびマンガン、 （３）ニツケル、亜鉛、コバルトおよびカドミウム、 （４）ニツケルおよび亜鉛、 （５）ニツケル。
本発明方法に従つて上記金属１種ないしそれ以上のイ
オンを、ヒトインシユリン前駆体反応混合物に加える。
反応混合物中に存在させる前記金属のイオン総量は、ヒ
トインシユリン前駆体モル当り約0.1〜10モルの範囲に
渡る。実際の使用量は、好ましくはこの範囲内の低い
量、一般的にはヒトインシユリン前駆体モル当り約0.1
〜２モルである。最も好ましくはこの量は、ヒトインシ
ユリン前駆体モル当り約0.3〜１モル、理想的にヒトイ
ンシユリン前駆体モル当り約0.33〜0.6モルである。
オンを、ヒトインシユリン前駆体反応混合物に加える。
反応混合物中に存在させる前記金属のイオン総量は、ヒ
トインシユリン前駆体モル当り約0.1〜10モルの範囲に
渡る。実際の使用量は、好ましくはこの範囲内の低い
量、一般的にはヒトインシユリン前駆体モル当り約0.1
〜２モルである。最も好ましくはこの量は、ヒトインシ
ユリン前駆体モル当り約0.3〜１モル、理想的にヒトイ
ンシユリン前駆体モル当り約0.33〜0.6モルである。
変換反応は、標準的に約２〜48時間、通常約８〜16時
間行なわれる。高性能液体クロマトグラフイーで反応を
監視し、ヒトインシユリンの生成に伴つて反応時間を注
意して調節することができる。
間行なわれる。高性能液体クロマトグラフイーで反応を
監視し、ヒトインシユリンの生成に伴つて反応時間を注
意して調節することができる。
本発明のもう一つの側面は、反応混合物に更に別の種
類の金属イオン１種ないしそれ以上を配合することによ
り、Des−Thr（B30）−hIの生成量を更に減少させ得る
ことを見いだしたことにあり、これは全く予期していな
かつた効果である。このような更に改良された方法は、
第１の金属イオンの量が、ヒトインシユリン前駆体モル
当り約0.1〜0.6モルであるとき特に明らかである。ベリ
リウム（Be）、マグネシウム（Mg）、カルシウム（C
a）、ストロンチウム（Sr）、バリウム（Ba）およびラ
ジウム（Ra）から成る群から選ばれる金属のイオンの量
を加えるのが非常に有利である。好ましいイオンは、カ
ルシウム、バリウム、ストロンチウムまたはマグネシウ
ムのイオン、最も好ましくはカルシウムイオンである。
類の金属イオン１種ないしそれ以上を配合することによ
り、Des−Thr（B30）−hIの生成量を更に減少させ得る
ことを見いだしたことにあり、これは全く予期していな
かつた効果である。このような更に改良された方法は、
第１の金属イオンの量が、ヒトインシユリン前駆体モル
当り約0.1〜0.6モルであるとき特に明らかである。ベリ
リウム（Be）、マグネシウム（Mg）、カルシウム（C
a）、ストロンチウム（Sr）、バリウム（Ba）およびラ
ジウム（Ra）から成る群から選ばれる金属のイオンの量
を加えるのが非常に有利である。好ましいイオンは、カ
ルシウム、バリウム、ストロンチウムまたはマグネシウ
ムのイオン、最も好ましくはカルシウムイオンである。
第２種の金属のイオン量は、ヒトインシユリン前駆体
モル当り約0.5〜５モル、好ましくはヒトインシユリン
前駆体モル当り約１〜３モルである。
モル当り約0.5〜５モル、好ましくはヒトインシユリン
前駆体モル当り約１〜３モルである。
上記のように第２の金属イオンの使用について最も驚
くべきことは、第２種の金属イオン特にカルシウムイオ
ンがトリプシンを安定にすることがわかつたこと、およ
び第１の金属イオンを存在させることなく第２の金属イ
オンを使用したとき、Des−Thr（B30）−hIの生成が実
際的に増大することが認められたことである。
くべきことは、第２種の金属イオン特にカルシウムイオ
ンがトリプシンを安定にすることがわかつたこと、およ
び第１の金属イオンを存在させることなく第２の金属イ
オンを使用したとき、Des−Thr（B30）−hIの生成が実
際的に増大することが認められたことである。
標準的に本発明方法は、ヒトインシユリン前駆体を水
性媒体に溶解することにより行なわれる。最終的混合物
は一般に約１〜3mMの濃度、pH約８となる。次いで第２
種の金属イオン（使用する場合）を加える。標準的に前
記濃度のヒトインシユリン前駆体を使用したとき、塩化
カルシウムを約5mMの濃度になるように加える。次いで
第１種の金属イオン、典型的にはニツケル（II）イオン
を、ヒトインシユリン前駆体モル当り約0.5モルの濃度
になるように加える。混合物のpHを7.3〜7.5に調節し、
カルボキシペプチドＢ（約1:2,500w/wヒトインシユリン
前駆体）、次いでトリプシン（約1:12,500w/wヒトイン
シユリン前駆体）を加える。混合物を約12℃に保持して
反応を進行させる。高性能液体クロマトグラフイーによ
り反応の進行を注意して監視する。
性媒体に溶解することにより行なわれる。最終的混合物
は一般に約１〜3mMの濃度、pH約８となる。次いで第２
種の金属イオン（使用する場合）を加える。標準的に前
記濃度のヒトインシユリン前駆体を使用したとき、塩化
カルシウムを約5mMの濃度になるように加える。次いで
第１種の金属イオン、典型的にはニツケル（II）イオン
を、ヒトインシユリン前駆体モル当り約0.5モルの濃度
になるように加える。混合物のpHを7.3〜7.5に調節し、
カルボキシペプチドＢ（約1:2,500w/wヒトインシユリン
前駆体）、次いでトリプシン（約1:12,500w/wヒトイン
シユリン前駆体）を加える。混合物を約12℃に保持して
反応を進行させる。高性能液体クロマトグラフイーによ
り反応の進行を注意して監視する。
以下に記載の実施例は本発明方法の有効性を証明する
ものである。実施例は本発明の広い範囲に制限を加える
ことを意図するものではない。
ものである。実施例は本発明の広い範囲に制限を加える
ことを意図するものではない。
実施例１−トリプシンとカルボキシペプチダーゼＢの濃
度を変える効果 ヒトプロインシユリン（hPI）を、20mMエチレンジア
ミン（EDA）緩衝液（pH7.0）に、10.85g/の濃度で溶
解する。この混合物を２部分に分ける。第１部分に、豚
膵臓のカルボキシペプチダーゼＢ（CpB）を、最終濃度
3.74mg/の濃度になるように加える。この溶液を６個
の分画（１分画は1ml容）に分け、あらかじめトシルフ
エニルアラニルクロロメチルケトンで処理した牛膵臓の
トリプシン（トリプシン−TPCK）を、それぞれ1.0、1.
4、1.8、2.8、3.6および5.4mg/の濃度で添加する。各
試料を23℃で８時間熟成する。高圧液体クロマトグラフ
イー（HPLC）でDes−Thr（B30）−hI濃度を測定し、結
果を表１に示す。
度を変える効果 ヒトプロインシユリン（hPI）を、20mMエチレンジア
ミン（EDA）緩衝液（pH7.0）に、10.85g/の濃度で溶
解する。この混合物を２部分に分ける。第１部分に、豚
膵臓のカルボキシペプチダーゼＢ（CpB）を、最終濃度
3.74mg/の濃度になるように加える。この溶液を６個
の分画（１分画は1ml容）に分け、あらかじめトシルフ
エニルアラニルクロロメチルケトンで処理した牛膵臓の
トリプシン（トリプシン−TPCK）を、それぞれ1.0、1.
4、1.8、2.8、3.6および5.4mg/の濃度で添加する。各
試料を23℃で８時間熟成する。高圧液体クロマトグラフ
イー（HPLC）でDes−Thr（B30）−hI濃度を測定し、結
果を表１に示す。
第２部分のhPI溶液を５個の分画（１分画は1ml容）に
分ける。CpBを、それぞれ1.1、1.5、2.2、3.7および5.4
mg/の濃度になるように加える。次いで各分画にトリ
プシン−TPCKを2.71mg/の濃度になるように添加す
る。各試料を23℃で８時間熟成する。結果を表２に示
す。
分ける。CpBを、それぞれ1.1、1.5、2.2、3.7および5.4
mg/の濃度になるように加える。次いで各分画にトリ
プシン−TPCKを2.71mg/の濃度になるように添加す
る。各試料を23℃で８時間熟成する。結果を表２に示
す。
表１および２の双方において、Des−Thr（B30）−hI
を、HPLCにより測定したhIの％として表わす。データに
より証明されるようにCpBの一定濃度において、トリプ
シン濃度の減少によりDes−Thr（B30）−hIが減少す
る。これとは逆にトリプシンの一定濃度においてCpB濃
度の増加によりDes−Thr（B30）−hIの濃度は減少す
る。
を、HPLCにより測定したhIの％として表わす。データに
より証明されるようにCpBの一定濃度において、トリプ
シン濃度の減少によりDes−Thr（B30）−hIが減少す
る。これとは逆にトリプシンの一定濃度においてCpB濃
度の増加によりDes−Thr（B30）−hIの濃度は減少す
る。
実施例２−Des−Thr（B30）−hI生成に及ぼす温度の効
果 hPI60mgを20mMエチレンジアミン6.0ml（pH7.5〜8.0）
に溶解する。基質（hPI）と酵素の比、即ちhPI:CpB:ト
リプシン−TPCKの比が5000:1:1（w/w）となるように豚
カルボキシペプチダーゼＢと牛トリプシン−TPCKを順次
添加する。この混合物の2ml部分を、HPLCで測定して最
高hI収量を得るのに必要な時間即ち14、６および４時
間、それぞれ12、24および37℃で熟成する。表３の結果
で示されるように温度が低いことは、Des−Thr（B30）
−hIの生成を低くするのに好都合である。
果 hPI60mgを20mMエチレンジアミン6.0ml（pH7.5〜8.0）
に溶解する。基質（hPI）と酵素の比、即ちhPI:CpB:ト
リプシン−TPCKの比が5000:1:1（w/w）となるように豚
カルボキシペプチダーゼＢと牛トリプシン−TPCKを順次
添加する。この混合物の2ml部分を、HPLCで測定して最
高hI収量を得るのに必要な時間即ち14、６および４時
間、それぞれ12、24および37℃で熟成する。表３の結果
で示されるように温度が低いことは、Des−Thr（B30）
−hIの生成を低くするのに好都合である。
実施例３−派生物生成に及ぼす金属の効果 hPI360mgを20mMグリシン20mlに溶解する（pH7.65）。
溶液を２個の部分（各部分10.0ml）に分け、１部分にカ
ルシウムイオン（5mM）を加える。各部分を更に３分画
に分ける。カルシウムイオンを含む部分とカルシウムイ
オンを含まない部分を次のように処理する:1セツトに亜
鉛イオンを、hPIに対するモル比0.33となるように加
え、他の１セツトにニツケルイオンを、hPIに対するモ
ル比0.36となるように加える。すべての混合物に酵素
を、hPI:CpB:トリプシン−TPCKの重量比が13,500:5:1と
なるように加える。各混合物のpHを7.65〜7.7に調節
し、12℃で16時間熟成する。表４に示す結果は、ニツケ
ルおよび亜鉛がDes−Thr（B30）−hIの生成濃度を減少
させる効果を説明する。更に表４の結果は、この効果は
カルシウムにより増強されることを説明するものであ
る。
溶液を２個の部分（各部分10.0ml）に分け、１部分にカ
ルシウムイオン（5mM）を加える。各部分を更に３分画
に分ける。カルシウムイオンを含む部分とカルシウムイ
オンを含まない部分を次のように処理する:1セツトに亜
鉛イオンを、hPIに対するモル比0.33となるように加
え、他の１セツトにニツケルイオンを、hPIに対するモ
ル比0.36となるように加える。すべての混合物に酵素
を、hPI:CpB:トリプシン−TPCKの重量比が13,500:5:1と
なるように加える。各混合物のpHを7.65〜7.7に調節
し、12℃で16時間熟成する。表４に示す結果は、ニツケ
ルおよび亜鉛がDes−Thr（B30）−hIの生成濃度を減少
させる効果を説明する。更に表４の結果は、この効果は
カルシウムにより増強されることを説明するものであ
る。
実施例４−hPI変換反応における派生物生成に及ぼすNi
（II）濃度変化の効果 hPI245mgを50mMグリシン12.0mlに加える（pH7.4）。
これに1M塩化カルシウム貯蔵溶液からのカルシウムイオ
ンを、最終的にカルシウム（II）濃度が5mMとなるよう
に加える。0.11M二塩化ニツケルの貯蔵溶液からのニツ
ケル（II）を2ml分画の各１試料に、hPIに対するモル比
がそれぞれ０、0.24、0.37、0.44、0.51および0.58とな
るように加える。各試験管にCpBを、7.4μg/ml（4.87mg
/ml貯蔵溶液）になるように加え、次いでトリプシン−T
PCKを、最終濃度が2.96μg/ml（1.0mg/ml貯蔵溶液）と
なるように添加する。すべての試料のpHを7.40に調節
し、それぞれを12℃で熟成する。12時間後反応を停止さ
せ、Des−Thr（B30）−hIおよびhIの濃度を分析する。
表５の結果は、ニツケル濃度が増大すればDes−Thr（B3
0）−hIの生成が減少することを示している。
（II）濃度変化の効果 hPI245mgを50mMグリシン12.0mlに加える（pH7.4）。
これに1M塩化カルシウム貯蔵溶液からのカルシウムイオ
ンを、最終的にカルシウム（II）濃度が5mMとなるよう
に加える。0.11M二塩化ニツケルの貯蔵溶液からのニツ
ケル（II）を2ml分画の各１試料に、hPIに対するモル比
がそれぞれ０、0.24、0.37、0.44、0.51および0.58とな
るように加える。各試験管にCpBを、7.4μg/ml（4.87mg
/ml貯蔵溶液）になるように加え、次いでトリプシン−T
PCKを、最終濃度が2.96μg/ml（1.0mg/ml貯蔵溶液）と
なるように添加する。すべての試料のpHを7.40に調節
し、それぞれを12℃で熟成する。12時間後反応を停止さ
せ、Des−Thr（B30）−hIおよびhIの濃度を分析する。
表５の結果は、ニツケル濃度が増大すればDes−Thr（B3
0）−hIの生成が減少することを示している。
実施例５−hPI変換反応における派生物生成に及ぼす種
々の金属カチオンの効果 hPI（936mg）を5mMグリシン36mlに溶解し、pHを7.8〜
8.0に調節する。塩化カルシウム（1M貯蔵溶液）として
カルシウムイオンを、5mMとなるように加える。各3mlの
分画を取り、それぞれに表６に示す濃度で種々の金属イ
オンを加える。12℃で平衡処理後、hPI:CpB:トリプシン
−TPCKの重量比が13,500:5:1となるように酵素を加え
る。
々の金属カチオンの効果 hPI（936mg）を5mMグリシン36mlに溶解し、pHを7.8〜
8.0に調節する。塩化カルシウム（1M貯蔵溶液）として
カルシウムイオンを、5mMとなるように加える。各3mlの
分画を取り、それぞれに表６に示す濃度で種々の金属イ
オンを加える。12℃で平衡処理後、hPI:CpB:トリプシン
−TPCKの重量比が13,500:5:1となるように酵素を加え
る。
各試料を12℃で13時間熟成し、hIおよびDes−Thr（B3
0）−hIを測定する。表６の結果は、広範囲の金属イオ
ンがDes−Thr（B30）−hIの生成を減少させるのに有効
であることを示す。
0）−hIを測定する。表６の結果は、広範囲の金属イオ
ンがDes−Thr（B30）−hIの生成を減少させるのに有効
であることを示す。
実施例６−Ni（II）とCa（II）を用いるhPIの大規模変
換 hPI（448.5g）を15mMグリシン緩衝液（pH7.4、33.0
）に溶解し、溶液を冷やして12℃に保持する。1.0M塩
化カルシウム貯蔵溶液0.165を加えてカルシウム（I
I）濃度を5mMにする。10分間攪拌後、Ni（II）:hPIのモ
ル比が0.44:1となるようにニツケル（II）を固体二塩化
ニツケル・六水化物5.0gとして添加する。この溶液を更
に10分間おだやかに攪拌し、CpB4.87mg/ml貯蔵溶液から
CpB（36.8ml、179.4mg）を加える。次いで1.0mg/ml貯蔵
溶液からトリプシン−TPCK（35.9ml、35.9mg）を加え
る。hIの分析に従うhIの最高生成量により、10時間で反
応は完結に達する。生成時点で得られた混合物は約0.29
％Des−Thr（B30）−hIを含み、これはこの化合物の検
出方法における検出限界に近接する値である。
換 hPI（448.5g）を15mMグリシン緩衝液（pH7.4、33.0
）に溶解し、溶液を冷やして12℃に保持する。1.0M塩
化カルシウム貯蔵溶液0.165を加えてカルシウム（I
I）濃度を5mMにする。10分間攪拌後、Ni（II）:hPIのモ
ル比が0.44:1となるようにニツケル（II）を固体二塩化
ニツケル・六水化物5.0gとして添加する。この溶液を更
に10分間おだやかに攪拌し、CpB4.87mg/ml貯蔵溶液から
CpB（36.8ml、179.4mg）を加える。次いで1.0mg/ml貯蔵
溶液からトリプシン−TPCK（35.9ml、35.9mg）を加え
る。hIの分析に従うhIの最高生成量により、10時間で反
応は完結に達する。生成時点で得られた混合物は約0.29
％Des−Thr（B30）−hIを含み、これはこの化合物の検
出方法における検出限界に近接する値である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウォルター・フランシス・プラウティ アメリカ合衆国インディアナ46250、イ ンディアナポリス、イースト・セブンテ ィナインス・ストリート5520番 (72)発明者 マーク・ロバート・ウォールデン アメリカ合衆国インディアナ46227、イ ンディアナポリス、サンバースト・サー クル8920番
Claims (17)
- 【請求項１】式： ［式中、Ｒは水素、化学的もしくは酵素的に開裂しうる
アミノ酸残基、または少なくとも２個のアミノ酸残基を
有し化学的もしくは酵素的に開裂しうるペプチド部分を
表わし； R1はOH、Arg−ＹまたはLys−Ｙであり、ここにＹはOH、
アミノ酸残基または少なくとも２個のアミノ酸残基を有
するペプチド部分を表わし； （Ａ−１）〜（Ａ−21）部分はヒトインシュリンＡ−鎖
であり； （Ｂ−１）〜（Ｂ−30）部分はヒトインシュリンＢ−鎖
であり； Ｘは該インシュリンＡ−鎖に、Ａ−１のアミノ基で結合
し、かつ、該インシュリンＢ−鎖に、Ｂ−30のカルボキ
シル基で結合している部分であって、Ａ−鎖およびＢ−
鎖の双方を崩壊することなくその双方から酵素的に開裂
しうる部分を表わす］ で示されるヒトインシュリン前駆体を、ニッケル、コバ
ルト、亜鉛、カドミウムおよび銅から選ばれる１種ない
しそれ以上の金属イオンをヒトインシュリン前駆体１モ
ル当り約0.1〜10モル含有する水性溶媒中、トリプシン
およびカルボキシペプチダーゼＢで処理することから成
る、ヒトイシュリン前駆体のヒトインシュリンへの変換
方法。 - 【請求項２】金属イオンがニッケル、亜鉛、コバルトお
よびカドミウムから成る群から選ばれる金属イオンであ
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】ヒトインシュリン前駆体を、水性溶媒中、
約20mMを越えない濃度で存在せしめる特許請求の範囲第
１および２項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項４】ヒトインシュリン前駆体を、水性溶媒中、
約１〜3mMの濃度で存在せしめる特許請求の範囲第３項
記載の方法。 - 【請求項５】金属イオンを、ヒトインシュリン前駆体モ
ル当り約0.1〜２モルの量で存在せしめる特許請求の範
囲第１〜４項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項６】金属イオンを、ヒトインシュリン前駆体モ
ル当り約0.33〜0.6モルの量で存在せしめる特許請求の
範囲第５項記載の方法。 - 【請求項７】カルボキシペプチダーゼＢを、ヒトインシ
ュリン前駆体に対する重量比約（1:10）〜（1:5,000）
で存在せしめる特許請求の範囲第１〜６項のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項８】トリプシンを、ヒトインシュリン前駆体に
対する重量比約（1:20）〜（1:250,000）で存在せしめ
る特許請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項９】カルボキシペプチダーゼＢのトリプシンに
対する重量比が約（1:1）〜（10:1）である特許請求の
範囲第１〜８項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１０】金属イオンがニッケルおよび亜鉛から成
る群から選ばれる金属イオンである特許請求の範囲第１
〜９項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１１】金属イオンがニッケルイオンである特許
請求の範囲第10項記載の方法。 - 【請求項１２】ベリリウム、マグネシウム、カルシウ
ム、ストロンチウム、バリウムおよびラジウムから成る
群から選ばれる第２の金属の金属イオンを、混合物に添
加する特許請求の範囲第１〜11項のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項１３】第２の金属イオンがカルシウム、バリウ
ム、ストロンチウムおよびマグネシウムから成る群から
選ばれる金属イオンである特許請求の範囲第12項記載の
方法。 - 【請求項１４】第２の金属イオンがカルシウムイオンで
ある特許請求の範囲第13項記載の方法。 - 【請求項１５】第２の金属イオンを、ヒトインシュリン
前駆体モル当り約0.5〜５モルの量で存在せしめる特許
請求の範囲第12〜14項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１６】第２の金属イオンを、ヒトインシュリン
前駆体１モル当り約１〜３モルの量で存在せしめる特許
請求の範囲第15項記載の方法。 - 【請求項１７】ヒトインシュリン前駆体がヒトプロイン
シュリンである特許請求の範囲第１〜16項のいずれかに
記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US91793986A | 1986-10-14 | 1986-10-14 | |
| US917939 | 1986-10-14 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63105695A JPS63105695A (ja) | 1988-05-10 |
| JP2634176B2 true JP2634176B2 (ja) | 1997-07-23 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62258166A Expired - Fee Related JP2634176B2 (ja) | 1986-10-14 | 1987-10-13 | インシュリン前駆体のインシュリンへの変換法 |
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|---|---|
| US (1) | US5457066A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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