CN114196505B - 一种稀有细胞捕获装置及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种稀有细胞捕获装置及其制备方法。该制备方法，包括如下步骤：A、提供巯基化试剂；B、将所述巯基化试剂和含有马来酰亚胺基团的高分子化合物或含有双键基团的高分子化合物混合均匀形成涂层组合物，所述含有马来酰亚胺基团的高分子化合物或所述含有双键基团的高分子化合物与所述巯基化试剂中的巯基化物的重量比为1:2至6:1；C、将基材浸没于所述涂层组合物中，取出，待溶液成胶，晾干凝胶，形成涂层；D、将捕获物连接到所述涂层上，所述捕获物能够特异性地和目标细胞结合。本发明能够降低背景细胞、蛋白的非特异性吸附，提高所捕获的靶细胞的纯度。
Description
本申请是于2021年8月11日提交的申请号为2021109160631，名称为《一种适于捕获稀有细胞的涂层组合物、装置及方法》的申请的分案申请。
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种稀有细胞捕获装置及其制备方法。
背景技术
稀有细胞是指生物样本中存在的数量稀少却具有重要生物学功能或临床检测意义的细胞。稀有细胞的传统捕获方法有CellSearch类的免疫捕获富集、物理富集等。在稀有细胞的富集过程中，背景/杂细胞干扰稀有细胞的捕获及判断，同时影响到捕获到稀有细胞的纯度。目前，一些捕获筛等捕获装置上添加有物理涂层和化学涂层来提高细胞的捕获效率，其中，物理涂层的结合强度低；而化学涂层不可逆，捕获的稀有细胞释放困难；另一方面，在捕获靶细胞的同时，背景细胞也会吸附到捕获筛上，所捕获的稀有细胞的纯度较低；此外，捕获装置会对稀有细胞有不同程度的损伤；这些因素都会影响捕获细胞的活性及下游应用。
上海邦先医疗科技有限公司于2020年提出了一种捕获筛，参见CN111175503A，该捕获筛包括筛网骨架和设置于所述筛网骨架上的捕获物，所述捕获物能够与目标细胞或生物分子特异性结合，所述筛网骨架具有金属原子，所述的筛网骨架和所述捕获物之间通过巯基化物质连接，其中巯基化物质与所述筛网骨架通过反应形成金属-硫键而结合，巯基化物质与所述捕获物通过反应形成酰胺键而结合；所述巯基化物质为巯基化海藻酸钠和巯基化透明质酸中的一种或两种的组合。该捕获筛能够方便地将捕获的细胞洗脱，但是用于富集稀有细胞时，背景细胞也会吸附到捕获筛上，捕获的目标稀有细胞的纯度较低。
发明内容
针对上述技术问题中的至少一个，本发明的目的是提供一种稀有细胞捕获装置及其制备方法，能够降低背景细胞、蛋白的非特异性吸附，提高所捕获的靶细胞的纯度。
根据本发明的第一个方面，一种稀有细胞捕获装置的制备方法，包括如下步骤：
A、提供巯基化试剂；
B、将所述巯基化试剂和含有马来酰亚胺基团的高分子化合物或含有双键基团的高分子化合物混合均匀形成涂层组合物，所述含有马来酰亚胺基团的高分子化合物或所述含有双键基团的高分子化合物与所述巯基化试剂中的巯基化物的重量比为1:2至6:1；
C、将基材浸没于所述涂层组合物中，取出，待溶液成胶，晾干凝胶，形成涂层；
D、将捕获物连接到所述涂层上，所述捕获物能够特异性地和目标细胞结合。
优选地，所述基材为筛网、板或微流控芯片；和/或，所述捕获物包括蛋白、核酸中的至少一种。
优选地，所述基材为金属筛网或塑料筛网；和/或，所述捕获物包括抗体。
优选地，所述巯基化物包括巯基化透明质酸钠或巯基化海藻酸钠。
更优选地，所述巯基化物的巯基化率为5-45％，所述巯基化物的分子量为5-200kDa；和/或，步骤A中，将透明质酸钠和/或海藻酸钠溶于缓冲溶液中，加入含氨基的二硫代化合物和羧基活化剂搅拌反应，然后加入二硫键还原剂，制得所述巯基化试剂；和/或，所述巯基化试剂的固含量为1-20％。
优选地，所述含有马来酰亚胺基团的高分子化合物包括选自双马来酰亚胺基-聚乙二醇和四臂聚乙二醇-马来酰亚胺中的一种或两种。
优选地，所述含有双键基团的高分子化合物包括甲基丙烯酰化明胶、甲基丙烯酰化透明质酸、甲基丙烯酰化海藻酸钠和甲基丙烯酰化葡聚糖中的一种或多种的组合。
优选地，步骤B中，将所述含有马来酰亚胺基团的高分子化合物或所述含有双键基团的高分子化合物配制为水溶液，和所述巯基化试剂混合均匀形成涂层组合物。
优选地，所述制备方法具体实施如下：制备巯基化透明质酸钠或所述巯基化海藻酸钠；将巯基化透明质酸钠或所述巯基化海藻酸钠的溶液和四臂聚乙二醇-马来酰亚胺或双键化明胶的水溶液混合均匀形成涂层组合物；将不锈钢筛网或塑料筛网浸没于所述涂层组合物中，所述筛网的孔径为10μm-50μm，取出，待溶液成胶，晾干凝胶，形成覆于筛网上的涂层；将能够和免疫细胞特异性结合的抗体覆于至涂层上。
根据本发明的第二个方面，一种由上述制备方法制得的稀有细胞捕获装置。
优选地，所述含有马来酰亚胺的高分子化合物或双键基团的高分子化合物和所述巯基化物的重量比为1：1至6：1之间，进一步为1：1至5：1之间，更进一步为1：1至4：4之间。将含有马来酰亚胺或双键基团的高分子化合物和巯基化物的重量比控制为1:2至6:1之间，能够有效降低背景细胞的吸附，且不会对目标稀有细胞造成损伤。
优选地，所述含有马来酰亚胺基团的高分子化合物包括选自双马来酰亚胺基-聚乙二醇和四臂聚乙二醇-马来酰亚胺中的一种或两种。
优选地，所述含有双键基团的高分子化合物包括甲基丙烯酰化明胶、甲基丙烯酰化透明质酸、甲基丙烯酰化海藻酸钠和甲基丙烯酰化葡聚糖中的一种或多种的组合。
优选地，所述巯基化物包括巯基化透明质酸钠或巯基化海藻酸钠。该涂层可被裂解，从而便于将捕获到的细胞从基材上洗脱下来，且不会损伤到细胞，具有较高的洗脱效率。
优选地，所述巯基化物的巯基化率为5-45％，所述巯基化物的分子量为5-200kDa。
更优选地，所述巯基化物的巯基化率为15-25％，所述巯基化物的分子量为9-39kDa。
可选地，所述基材包括筛网、板或微流控芯片。所述基材的材质不受限制，只要能够提供供涂层组合物涂覆的表面即可，包括但不限于金属、塑料、玻璃、陶瓷等。
在一具体且优选的实施例中，所述基材为筛网。更优选地，所述筛网的孔径为10μm-50μm。进一步地，所述筛网的孔径为10μm-20μm，适于免疫细胞的捕获。
在一更优选的实施例中，所述筛网为不锈钢筛网。
在另一更优选的实施例中，所述筛网为由塑料形成的塑料筛网，包括但不限于尼龙筛网、聚对苯二甲酸乙二醇酯筛网等。
优选地，所述捕获物包括蛋白、核酸中的至少一种。更优选地，所述蛋白包括抗体。进一步地，所述抗体包括EPCAM抗体、CD3抗体中的至少一种。稀有细胞等被捕获物能够与抗体特异性结合而被抗体等捕获物捕获到装置中，然后通过对涂层裂解，将捕获到的稀有细胞从基材上洗脱下来，用于后续分析、下游应用等。
优选地，所述涂层组合物包括含有马来酰亚胺或双键基团的高分子化合物溶液和含有所述巯基化物的巯基化试剂，所述含有马来酰亚胺或双键基团的高分子化合物溶液的固含量为1-80％，所述巯基化试剂的固含量为1-20％。
更优选地，所述含有马来酰亚胺或双键基团的高分子化合物溶液的固含量为10-65％，进一步为20-50％，更进一步为25-35％。通过调整含有马来酰亚胺或双键基团的高分子化合物溶液的固含量能够调整涂层的厚度。
更优选地，所述巯基化试剂的固含量为5％-20％，进一步为8-15％，更进一步为10-15％。调整巯基化试剂的固含量能够调整涂层的厚度。
优选地，所述巯基化试剂由如下步骤制得：将透明质酸钠和/或海藻酸钠溶于缓冲溶液中，加入含氨基的二硫代化合物和羧基活化剂搅拌反应，然后加入二硫键还原剂，制得所述巯基化试剂。更优选地，将透明质酸钠和/或海藻酸钠溶于2-吗啉乙磺酸溶液中，加入3,3'-二硫代二(丙酸肼)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，搅拌至完全溶解并搅拌反应，反应结束后，加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐。
优选地，所述捕获物由如下步骤连接至所述涂层上：将覆有所述涂层的基材冻干，洗涤；将N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶于2-吗啉乙磺酸溶液中得第一溶液，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于2-吗啉乙磺酸溶液中得第二溶液，将所述第一溶液和所述第二溶液混合得共混活化剂溶液；使所述共混活化剂溶液和所述基材接触，静置孵育；制备含有捕获物的孵育液并进行孵育，将所述捕获物孵育至所述涂层上。
优选地，所述稀有细胞为免疫细胞。
在一具体且优选的实施例中，所述基材为不锈钢或塑料筛网，所述筛网的孔径为10μm-50μm；所述涂层含有四臂聚乙二醇-马来酰亚胺和巯基化透明质酸钠、或四臂聚乙二醇-马来酰亚胺和巯基化海藻酸钠，所述四臂聚乙二醇-马来酰亚胺和所述巯基化透明质酸钠或所述巯基化海藻酸钠的重量比为1:2至6:1之间；所述捕获物为能够和免疫细胞特异性结合的抗体。
本文中，稀有细胞是指在血液和组织中的含量很少但却很重要的细胞，例如PBMC中的各类免疫细胞、T细胞、CAR-T细胞、循环胎儿细胞、有核红细胞、干细胞、循环肿瘤细胞等。
本文中，所述装置包括但不限于捕获筛、捕获芯片。
本发明采用以上方案，相比现有技术具有如下优点：
本发明的装置及方法，适于捕获稀有细胞(特别是免疫细胞)，其涂层中引入了含有马来酰亚胺或双键基团的高分子化合物，使得涂层的生物及电荷性能可以降低背景细胞、蛋白的非特异性吸附，间接地提高捕获到稀有细胞的纯度；对该涂层表面的功能基团活化后偶联捕获物(如抗体)，与靶细胞上的抗原特异性反应而特异性捕获稀有细胞，从目标细胞群体里直接富集出稀有细胞；直接、间接的两种作用机制提高了捕获的稀有细胞的纯度。此外，涂层对基材的材质没有特殊要求，金属、塑料等基材均可以使用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出了涂覆涂层的筛网。
图2a示出了未涂覆涂层的筛网；图2b示出了覆有涂层的筛网。
图3a示出了在捕获后的筛网上观察到的目标细胞；图3b示出了图3a的筛网在涂层裂解后的荧光照片。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域的技术人员理解。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。
如本说明书和权利要求书中所示，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其他的步骤或元素。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的组合。本文所使用的的术语“A至B之间”涵盖A、B及大于A且小于B的值。
下述实施例提供一种适于捕获稀有细胞的装置及方法，该装置具体为捕获筛。
实施例1：细胞捕获筛的制备
(1)巯基化试剂溶液(HA-SH溶液)的制备：
用量筒量取40mL的2-吗啉乙磺酸溶液(pH＝4.75,0.1M)，天平称取200mg透明质酸钠(3.9W，以下简称HA)，加入单口烧瓶内。400rpm磁力搅拌，待HA溶解后，称取60mg3,3'-二硫代二(丙酸肼)、120mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入烧瓶中，搅拌至完全溶解，搅拌反应5h。反应结束后，加入0.15g三(2-羰基乙基)磷盐酸盐至烧瓶中，继续搅拌反应过夜，制得巯基化试剂。
(2)涂层组合物的制备：
配置20mg/mL HA-SH和100mg/mL的四臂聚乙二醇-马来酰亚胺的水溶液。具体为：在A(1mL)离心管中加入100μL 100mg/mL的四臂聚乙二醇-马来酰亚胺溶液，在B(1mL)离心管中加入200μL 20mg/mL HA-SH溶液，调节pH＝8.0，将A加入B中，迅速用涡旋振荡器混匀，制得涂层组合物。
(3)筛网涂覆：
将准备好的筛网用镊子夹住边缘竖直浸没于涂层组合物中，然后缓慢竖直取出，待原溶液成胶后放置筛网于塑料培养皿中(如图1所示)，晾干凝胶，制得高分子筛网。其中，图2a示出了上述准备好的筛网，其包括不锈钢筛网骨架。图2b示出了涂覆且晾干形成涂层的筛网，即金属层上覆设有涂层。
(4)筛网抗体孵育：
将晾干凝胶后的筛网放在冻干机上冻干过夜，次日磷酸盐缓冲溶液泡洗10min，氮气吹干后，离心管保存起来。一张高分子筛网的活化需取0.348mg的Sulfo-NHS(中文名：N-羟基硫代琥珀酰亚胺)溶解于20μL 2-吗啉乙磺酸溶液中(0.05M、pH＝6)，再将0.609mg的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶于35μL的2-吗啉乙磺酸缓冲液，充分溶解后将两者共混得55μL共混活化剂溶液。然后，取共混活化剂溶液，滴加在筛网表面，静置遮光室温孵育30min。用500μL磷酸盐缓冲溶液2次置换洗涤，清洗活化好的芯片。随后吸去洗涤置换后筛网表面液体，并放置在新的24孔板中。取5μLEpCAM抗体与50μL 2-吗啉乙磺酸溶液(0.05M、pH＝6)共混后制备成抗体孵育液。向芯片所在孔板中加入上述制备的抗体孵育液共55μL，在37℃下孵育1.5h，即得捕获筛。
实施例2：细胞捕获筛的制备
(1)巯基化试剂溶液(HA-SH溶液)的制备：
用量筒量取40mL的2-吗啉乙磺酸溶液(pH＝4.75,0.1M)，天平称取200mg透明质酸钠(3.9W)，加入单口烧瓶内。400rpm磁力搅拌，待HA溶解后，称取60mg 3,3'-二硫代二(丙酸肼)、120mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入烧瓶中，搅拌至完全溶解，搅拌反应5h。反应结束后，加入0.15g三(2-羰基乙基)磷盐酸盐至烧瓶中，继续搅拌反应过夜，制得巯基化试剂。
(2)涂层组合物的制备：
配置20mg/mL HA-SH和50mg/mL的双键化明胶的水溶液。具体为：在A(1mL)离心管中加入100μL 50mg/mL的双键化明胶溶液，在B(1mL)离心管中加入200μL 20mg/mL HA-SH溶液，调节pH＝8.0，将A加入B中，迅速用涡旋振荡器混匀，制得涂层组合物。
(3)筛网涂覆：
将准备好的筛网用镊子夹住边缘竖直浸没于涂层组合物中，然后缓慢竖直取出，待原溶液成胶后放置筛网于塑料培养皿中，晾干凝胶，制得高分子涂覆筛网。
(4)筛网抗体孵育：
将晾干凝胶后的筛网放在冻干机上冻干过夜，次日磷酸盐缓冲溶液泡洗10min，氮气吹干后，离心管保存起来。一张高分子筛网的活化需取0.348mg的Sulfo-NHS(中文名：N-羟基硫代琥珀酰亚胺)溶解于20μL 2-吗啉乙磺酸溶液中(0.05M、pH＝6)，再将0.609mg的EDC(中文名：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶于35μL的2-吗啉乙磺酸缓冲液，充分溶解后将两者共混得55μL共混活化剂溶液。然后，取共混活化剂溶液，滴加在筛网表面，静置遮光室温孵育30min。用500μL磷酸盐缓冲溶液2次置换洗涤，清洗活化好的芯片。随后吸去洗涤置换后筛网表面液体，并放置在新的24孔板中。取5μL EpCAM抗体与50μL 2-吗啉乙磺酸溶液(0.05M、pH＝6)共混后制备成抗体孵育液。向芯片所在孔板中加入上述制备的抗体孵育液共55μL，在37℃下孵育1.5h，即得捕获筛。
实施例3：细胞捕获筛制备
本实施例基本同实施例1，区别仅在于筛网抗体孵育，筛网抗体孵育步骤具体如下：
将晾干凝胶后的筛网放在冻干机上冻干过夜，然后用磷酸盐缓冲溶液泡洗10min，氮气吹干后用离心管保存起来取0.348mg的Sulfo-NHS溶解于20μL 2-吗啉乙磺酸溶液中(0.05M、pH＝6)，再将0.609mg的EDC溶于35μL的2-吗啉乙磺酸缓冲液，充分溶解后将两者共混得55μL溶液。然后，取共混活化剂溶液，滴加在筛网表面，静置遮光室温孵育30min。用500μL磷酸盐缓冲溶液2次置换洗涤，清洗活化好的筛网。随后吸去洗涤置换后筛网表面液体，并放置在新的24孔板中。2μL CD3抗体与50μL 2-吗啉乙磺酸溶液(0.05M、pH＝6)共混后制备成抗体孵育液。向筛网所在孔板中加入上述制备的抗体孵育液共52μL，在37℃下孵育1.5h，即得捕获筛。
实施例4：细胞捕获筛制备
本实施例基本同实施例1，区别仅在于涂层组合物的制备，涂层组合物的制备步骤具体如下：
在A(1mL)离心管中加入40μL 100mg/mL的四臂聚乙二醇-马来酰亚胺溶液，在B(1mL)离心管中加入200μL 20mg/mL HA-SH溶液，调节pH＝8.0，将A加入B中，迅速用涡旋振荡器混匀，制得涂层组合物。
实施例5：细胞捕获筛制备
本实施例基本同实施例1，区别仅在于涂层组合物的制备，涂层组合物的制备步骤具体如下：
在A(1mL)离心管中加入160μL 100mg/mL的四臂聚乙二醇-马来酰亚胺溶液，在B(1mL)离心管中加入200μL 20mg/mL HA-SH溶液，调节pH＝8.0，将A加入B中，迅速用涡旋振荡器混匀，制得涂层组合物。
实施例6：细胞捕获筛制备
本实施例基本同实施例1，区别仅在于高分子筛网涂覆制备，高分子筛网涂覆制备步骤具体如下：
将准备好的尼龙筛网用镊子夹住边缘竖直浸没于涂层组合物中，然后缓慢竖直取出，待原溶液成胶后放置筛网于培养皿中，晾干凝胶，制得高分子涂覆筛网。
实施例7：MCF7细胞捕获
(1)提供背景细胞
将Jurkat细胞(Ca.2000W/mL)筛网过滤，将细胞滤液收集起来并重新计数，备用。
(2)提供目标稀有细胞
将MCF7(Ca.10W/1mL)细胞用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE、1μL/10mM)37℃孵育染色10min，孵育结束后加入5mL冷的培养基(DMEM)，室温静置5min中和染色剂，400g离心5min，丢弃上清。用5mL新的培养基重悬，400g离心5min，并重复一次。最后，用1mL新的培养基重悬，备用。
(3)捕获筛处理
先600μL磷酸盐缓冲溶液泡洗1min冻干保存实施例1制备的捕获筛，用镊子夹取捕获筛，将捕获筛放在捕获夹具上，夹紧固定，连接装配工装管路。
(4)捕获
取5μL稀释好(1:20倍稀释)的MCF7显微镜下477nm通道观察计数，用100μL磷酸盐缓冲溶液将计数好的MCF7细胞液冲入离心管中，加入200W/200μL的Jurkat细胞，共约305μL混合细胞液，加入工装中，以50μL/min速度抽滤捕获。
捕获完成后，取下捕获筛，转移至荧光倒置显微镜下，先用477nm通道观察计数捕获的MCF7细胞，结果参见图3a。计数完成后。用60μL的4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI、1μg/mL)室温避光原位染色捕获筛10min，将DAPI染色好的捕获筛重新移至荧光倒置显微镜下，用385nm通道观察背景细胞吸附情况，拍照计数。
(5)裂解
将计数好的捕获筛，放在48孔板中，用200μL透明酯酸酶(15mg/mL)室温裂解2h，反应结束后，加入200μL磷酸盐缓冲溶液充分冲洗捕获筛，将冲洗好的捕获筛重新移至显微镜下观察，477nm、385nm通道观察目标细胞和背景细胞的情况，拍照计数，结果参见图3b。
可知，本发明的捕获筛涂层能够裂解，能够实现富集细胞的无损洗脱。
实施例8：Jurkat细胞捕获
离心收集Jurkat细胞和K562细胞，PBS洗一次。血球计数板计数Jurkat细胞：830W，活率99.4％；K562细胞：260W，活率96.4％。计数完成后，按照实验设计加入对应的细胞数量，并调整上样体积，调整完成后以50μL/min流速流过实施例3制备的捕获筛，富集细胞。富集后，将捕获筛取下放至48孔板中，加入200uL HA裂解酶裂解2小时，裂解完成后，加入200μL PBS冲洗芯片，将孔板内的液体转移至Ep管。上清液300g离心5min，PBS洗一次，去上清，加入100μL CD3-APC和100μL CD19-PE抗体，室温避光孵育20min。孵育结束后，300g离心5min，去上清，加入250μL PBS，流式检测，流式结果见表1。
对比例
用量筒量取40mL的2-吗啉乙磺酸溶液(pH＝4.75,0.1M)，天平称取200mg透明质酸钠(3.9W，以下简称HA)，加入单口烧瓶内。400rpm磁力搅拌，待HA溶解后，称取60mg3,3'-二硫代二(丙酸肼)、120mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入烧瓶中，搅拌至完全溶解，搅拌反应5h。反应结束后，加入0.15g三(2-羰基乙基)磷盐酸盐至烧瓶中，继续搅拌反应过夜。
将准备好的筛网用镊子夹住边缘竖直浸没于溶液中，然后缓慢竖直取出，晾干，制得高分子筛网。其中，上述准备好的筛网包括不锈钢筛网骨架，筛网骨架的表面上覆设有金属层，如金。
将晾干后的筛网放在冻干机上冻干过夜，然后用磷酸盐缓冲溶液泡洗10min，氮气吹干后用离心管保存起来取0.348mg的Sulfo-NHS溶解于20μL 2-吗啉乙磺酸溶液中(0.05M、pH＝6)，再将0.609mg的EDC溶于35μL的2-吗啉乙磺酸缓冲液，充分溶解后将两者共混得55μL溶液。然后，取共混活化剂溶液，滴加在筛网表面，静置遮光室温孵育30min。用500μL磷酸盐缓冲溶液2次置换洗涤，清洗活化好的筛网。随后吸去洗涤置换后筛网表面液体，并放置在新的24孔板中。2μL CD3抗体与50μL 2-吗啉乙磺酸溶液(0.05M、pH＝6)共混后制备成抗体孵育液。向筛网所在孔板中加入上述制备的抗体孵育液共52μL，在37℃下孵育1.5h，即得捕获筛。
离心收集Jurkat细胞和K562细胞，PBS洗一次。血球计数板计数Jurkat细胞：830W，活率99.4％；K562细胞：260W，活率96.4％。计数完成后，按照实验设计加入对应的细胞数量，并调整上样体积，调整完成后以50μL/min流速流过该对比例制备的捕获筛，富集细胞。富集后，将捕获筛取下放至48孔板中，加入200uL HA裂解酶裂解2小时，裂解完成后，加入200μL PBS冲洗芯片，将孔板内的液体转移至Ep管。上清液300g离心5min，PBS洗一次，去上清，加入100μL CD3-APC和100μL CD19-PE抗体，室温避光孵育20min。孵育结束后，300g离心5min，去上清，加入250μL PBS，流式检测，流式结果见表1。
表1
由表1可知，在目标细胞的数量远多于背景细胞的情况下，对比例的Jurkat细胞的捕获率仍然较低，且对K562细胞的非特异性吸附较多，导致富集的Jurkat细胞的纯度也较低。实施例8的目标细胞(Jurkat细胞)的捕获效率较高，且对背景细胞的非特异性吸附较少，富集后的目标细胞的纯度较高。尤其是在目标细胞远少于背景细胞的情况下(30万：70万)，富集的Jurkat细胞的纯度仍能达到85％以上，说明本发明的捕获筛适宜用于稀有细胞的捕获，且捕获后的稀有细胞纯度较高。
此外，还对实施例7的以尼龙筛网为基材的捕获筛的性能进行了测试，其对目标细胞的捕获率及目标细胞的纯度与实施例3近似，说明本发明的捕获筛对基材的材质没有特殊要求。对比例的基材的表层必须是贵金属保护层，否则抗体无法孵育至基材上。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，是一种优选的实施例，其目的在于熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限定本发明的保护范围。凡根据本发明的原理所作的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种稀有细胞捕获装置的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、提供巯基化试剂；
B、将所述巯基化试剂和含有马来酰亚胺基团的高分子化合物或含有双键基团的高分子化合物混合均匀形成涂层组合物，所述含有马来酰亚胺基团的高分子化合物或所述含有双键基团的高分子化合物与所述巯基化试剂中的巯基化物的重量比为1:2至6:1；
C、将筛网浸没于所述涂层组合物中，取出，待溶液成胶，晾干凝胶，形成涂层；所述筛网的孔径为10 µm-50 µm；
D、将捕获物连接到所述涂层上，所述捕获物能够特异性地和目标细胞结合；
其中，所述捕获物由如下步骤连接至所述涂层上：将覆有所述涂层的筛网冻干，洗涤；将N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶于2-吗啉乙磺酸溶液中得第一溶液，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于2-吗啉乙磺酸溶液中得第二溶液，将所述第一溶液和所述第二溶液混合得共混活化剂溶液；使所述共混活化剂溶液和所述筛网接触，静置孵育；制备含有捕获物的孵育液并进行孵育，将所述捕获物孵育至所述涂层上；
所述巯基化物包括巯基化透明质酸钠或巯基化海藻酸钠；
所述含有马来酰亚胺基团的高分子化合物包括选自双马来酰亚胺基-聚乙二醇和四臂聚乙二醇-马来酰亚胺中的一种或两种；
所述含有双键基团的高分子化合物包括甲基丙烯酰化明胶、甲基丙烯酰化透明质酸、甲基丙烯酰化海藻酸钠和甲基丙烯酰化葡聚糖中的一种或多种的组合。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述捕获物包括蛋白、核酸中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述筛网为金属筛网或塑料筛网；和/或，所述捕获物包括抗体。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述巯基化物的巯基化率为5-45%，所述巯基化物的分子量为5-200kDa；和/或，步骤A中，将透明质酸钠和/或海藻酸钠溶于缓冲溶液中，加入含氨基的二硫代化合物和羧基活化剂搅拌反应，然后加入二硫键还原剂，制得所述巯基化试剂；和/或，所述巯基化试剂的固含量为1-20%。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤B中，将所述含有马来酰亚胺基团的高分子化合物或所述含有双键基团的高分子化合物配制为水溶液，和所述巯基化试剂混合均匀形成涂层组合物。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体实施如下：制备巯基化透明质酸钠或所述巯基化海藻酸钠；将巯基化透明质酸钠或所述巯基化海藻酸钠的溶液和四臂聚乙二醇-马来酰亚胺或双键化明胶的水溶液混合均匀形成涂层组合物；将不锈钢筛网或塑料筛网浸没于所述涂层组合物中，所述筛网的孔径为10 µm-50 µm，取出，待溶液成胶，晾干凝胶，形成覆于筛网上的涂层；将能够和免疫细胞特异性结合的抗体覆于至涂层上。
7.一种如权利要求1至6任一项所述的制备方法制得的稀有细胞捕获装置。
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