CN104730233A - 一种elisa检测中的血清稀释液 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种ELISA检测中的血清稀释液，即ELISA抗体检测试验中的一抗稀释液，主要应用于ELISA试验中一抗的稀释，能阻止ELISA试验中非特异性反应，降低阴性本底的OD值，提高ELISA试验的灵敏性。本发明的血清稀释液，是通过大肠埃希氏杆菌的发酵菌液制备的。本发明的稀释液解决了在ELISA试验过程中阴性本底高，灵敏性低的问题。本发明的工艺操作简单，对设备要求低，并且能大量生产。

Description

一种ELISA检测中的血清稀释液
技术领域
本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种ELISA检测中的血清稀释液。
背景技术
在常规的ELISA试验中，大多使用PBST、含1％BSA的PBS等作为血清稀释液。对于载体表达的蛋白做为包被用抗原的ELISA试验中，虽然抗原经纯化，纯度较高，但是还是经常会出现本底颜色较深，OD值较高的情况，直接影响ELISA试验的结果判定。因此，有必要提供一种效果更好的血清稀释液。
发明内容
本发明的目的是提供一种ELISA检测中的血清稀释液，即ELISA抗体检测试验中的一抗(猪血清或是鸡血清)稀释液，主要应用于ELISA试验中一抗(猪血清或是鸡血清)的稀释，能阻止ELISA试验中非特异性反应，降低阴性本底的OD值，提高ELISA试验的灵敏性。
本发明的血清稀释液，是通过大肠埃希氏杆菌的发酵菌液制备的。
作为实施例的优选，本发明的血清稀释液的制备方法如下：收集大肠杆菌发酵液菌体，将菌体溶于PBS缓冲液中，置于－20℃冻存；将冻存菌液解冻后进行超声波裂解，裂解液离心收集上清；然后将上清用0.01M的pH7.2的PBS稀释至总蛋白含量为1.2mg/ml完成制备。
上述的血清稀释液作为ELISA抗体检测试验中的一抗稀释液来使用；
其中的一抗为猪血清或是鸡血清。
本发明是制备了一种可以降低在ELISA试验中阴性本底的一抗稀释液，解决了在ELISA试验过程中阴性本底高，灵敏性低的问题。本发明的工艺操作简单，对设备要求低，并且能大量生产。
具体实施方式
申请人发现用包被抗原包被于包被板后很容易与加入的一抗(猪或是鸡的血清)结合形行抗原抗体结物，这种特异性反应在洗涤的过程中很难被洗掉，这是造成了本底颜色较深的主要原因。在上述研究的基础上从而促成了本发明。
下面结合具体实施例来对本发明进行详细的描述。
实施例1：
1、稀释液的制备
1.1大肠埃希氏杆菌BL21(E.coli BL21)菌液的制备：
从LB培养平板上挑取大肠埃希氏杆菌BL21(E.coli BL21)单菌落,转接于含LB培养液的试管中，37℃培养过夜，制备饱和菌液。将饱和菌液转接到250ml的LB培养基中，接种量约5％，培养8小时。6000转/分离心15分钟。将菌体溶于15mlPBS中置于－20℃冻存。
1.2大肠埃希氏杆菌BL21(E.coli BL21)可溶蛋白的提取将冻存菌液解冻，超声波裂解。置6000转/分，离心15分钟，收集上清。用BCA蛋白含量检测试剂盒测定蛋白含量。然后将破菌液用0.01M pH7.2PBS稀释至总蛋白含量为1.2mg/ml。
其中BCA法检测蛋白含量的具体步骤如下：
一、稀释BSA标准品用PBS稀释BSA标准品。
表1：标准品的配制
管号 PBS用量(μl) BSA标准品用量(μl) BSA最终浓度(μg/ml)
A 0 300μl原液 2000
B 125 375μl原液 1500
C 325 325μl原液 1000
D 175 175μl B瓶稀释液 750
E 325 325μl C瓶稀释液 500
F 325 325μl E瓶稀释液 250
G 325 325μl F瓶稀释液 125
I 400 100μl G瓶稀释液 25
H 400 0 0＝空白
使用下列公式来确定所需的工作液的总体积：
(标准品的个数待测+待测蛋白样品的个数)×(实验重复次数)×(用于每个样品的工作液的体积)＝所需的工作液总体积
以12个蛋白质检测样品为例说明：
(9个标准品+12个蛋白质检测样品)×(2次实验重复)×(2ml)＝84ml工作液
将90ml BCA试剂A与1.8ml BCA试剂B混合(试剂A与试剂B的比例＝50:1)，制备工作液。取各个稀释浓度的蛋白标准品和待测蛋白样品各0.1ml，加入到做好标记的试管中。在每个试管中加入2.0ml工作液，充分混合。将试管密封，37℃孵育30分钟。将所有试管冷却至室温。将分光光度计设定在检测波长为562nm，使用一只仅装有水的比色皿将仪器调 零。然后，在10分钟内依次检测所有样品的吸光值。将各个标准品和待检蛋白质样品在562nm波长下的吸光值减去空白标准品在562nm波长下的平均吸光值。将BSA标准品在562nm波长下经过空白校正的吸光值对其浓度(μg/ml)作图，以浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得出一元二次方程。每个待检蛋白质样品的吸光值代入方程，计算蛋白质浓度。
1.3除菌及防腐用0.22μm滤膜过滤除菌，加入1％的硫柳汞至终浓度为0.01％，充分混合。
1.4分装无菌定量分装，20ml/瓶，贴签。 
2成品检验
2.1性状淡黄色透明液体。
2.2无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
3效果验证
3.1在鸡传染性法氏囊ELISA抗体检测试验中的使用效果
3.1.1试验条件
3.1.1.1包被蛋白及包被浓度以大肠杆菌为载体表达的VP2蛋白，包被浓度为25ug/ml。
3.1.1.2一抗稀释液 
3.1.1.2.1稀释液1(0.05％PBST)0.01M pH7.2的PBS，加入0.05％吐温-20。
3.1.1.2.2稀释液2(1％BSA PBS)0.01M pH7.2的PBS，加入1％的BSA。
3.1.1.2.3稀释液3大肠杆菌破碎上清液，蛋白浓度为1.2mg/ml。
3.1.2试验步骤
3.1.2.1加一抗及温育将鸡传染性法氏囊阴、阳性血清分别用3.1.1.2中3种稀释液作1:400倍稀释，分别加入的对应的包被板孔中，每个样品重复2孔，置37℃反应10分钟。
3.1.2.2洗涤向微孔中加入洗涤液100ul，用蒸馏水反复洗涤5次，在吸水纸上拍干。
3.1.2.3加二抗及温育向微孔中加入羊抗鸡HRP酶标二抗液100ul，37℃放置10分钟。
3.1.2.4洗涤向微孔中加入洗涤液100ul，用蒸馏水反复洗涤5次，在吸水纸上拍干。
3.1.2.5显色加入显色底物液A 100ul，显色底物液B 100ul，轻轻 摇匀，置37℃反应10分钟。
3.1.2.6终止每孔加100μl终止液终止反应。
3.1.2.7读数将酶标板置于酶标仪上，读取A450nm波长下的光吸收值，记录试验结果。
3.1.3结果通过表2结果可以看出，稀释液3可以明显的降低阴性本底的OD值，S/P值也远远大于其他2种稀释液，降低了阴性本底的同时也提高了ELISA试验的灵敏性。
表2：不同稀释液的ELISA试验结果
注：P/N值表示阳性血清样品的平均值/阴性血清样品平均值
3.2在猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试验中的使用效果
3.2.1试验条件
3.2.1.1包被蛋白及包被浓度以大肠杆菌为载体表达的Cap蛋白，包被浓度为2.5ug/ml。
3.2.1.2一抗(鸡血清)稀释液
3.2.1.2.1稀释液1(0.05％PBST)0.01M pH7.2的PBS，加入0.05％吐温-20。
3.2.1.2.2稀释液2(1％BSA PBS)0.01M pH7.2的PBS，加入1％的BSA。
3.2.1.2.3稀释液3大肠杆菌破碎上清液，蛋白浓度为1.2mg/ml。
3.2.2试验步骤
3.2.2.1加一抗及温育将猪圆环病毒2型阴、阳性血清分别用3.1.1.2中3种稀释液作1:800倍稀释，分别加入的对应的包被板孔中，每个样品重复2孔，37℃放置30分钟。
3.2.2.2洗涤向微孔中加入洗涤液100ul，用蒸馏水反复洗涤5次， 在吸水纸上拍干。
3.2.2.3加二抗及温育向微孔中加入羊抗鸡HRP酶标二抗液100ul，37℃放置30分钟。
3.2.2.4洗涤向微孔中加入洗涤液100ul，用蒸馏水反复洗涤5次，在吸水纸上拍干。
3.2.2.5显色加入显色底物液A 100ul，显色底物液B 100ul，轻轻摇匀，37℃反应10分钟。
3.2.2.6终止每孔加100μl终止液终止反应。
3.2.2.7读数将酶标板置于酶标仪上，读取A450nm波长下的光吸收值，记录试验结果。
3.2.3结果通过表3结果可以看出，稀释液3可以明显的降低阴性本底的OD值，S/P值也远远大于其他2种稀释液，降低了阴性本底的同时也提高了ELISA试验的灵敏性。
表3：不同稀释液的ELISA试验结果
注：P/N值表示阳性血清样品的平均值/阴性血清样品平均值。

Claims (6)

1.一种血清稀释液，其特征在于，所述的血清稀释液是通过大肠埃希氏杆菌的发酵菌液制备的。
2.权利要求1所述的血清稀释液，其特征在于，所述的血清稀释液的制备方法如下：收集大肠杆菌发酵液菌体，将菌体溶于PBS缓冲液中，置于－20℃冻存；将冻存菌液解冻后进行超声波裂解，裂解液离心收集上清；然后将上清用PBS缓冲液稀释完成制备。
3.权利要求1所述的血清稀释液，其特征在于，所述的PBS缓冲液浓度为0.01M，其pH值为7.2。
4.权利要求1所述的血清稀释液，其特征在于，所述的血清稀释液中总蛋白含量为1.2mg/ml。
5.权利要求1所述的血清稀释液作为ELISA抗体检测试验中的一抗稀释液的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的一抗为猪血清或是鸡血清。
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