BG60508B2

BG60508B2 - Днк последователности кодиращи еритропоетин

Info

Publication number: BG60508B2
Application number: BG096060A
Authority: BG
Inventors: Fu-Kuen Lin
Original assignee: Kirin-Amgen Inc.
Priority date: 1984-11-30
Filing date: 1992-03-13
Publication date: 1995-06-30
Also published as: RU2261276C2

Abstract

Еритропоетинът се прилага при диагностика и лечение на различни форми на анемия и хипоксия, тъй като повишава продуцирането на червени кръвни телца. За получаването му се използват рекомбинантни днк методи. По тях се получават днк последователности, кодиращи част или цялата последователност на човешки или маймунски еритропоетин. С получените от тях плазмиди или експресионни вектори се трансформират или трансфектират прокариотни или еукариотни клетки гостоприемници. При експресията се продуцират полипептиди, проявяващи биологичните свойства на природния еритропоетин. 31 претенции

Description

Област на приложение

Изобретението се отнася общо до манипулиране на генетични материали и, по-специално, до рекомбинантни методи, правещи възможно получаването на полипептити, имащи част или всичките първични структурни конформации и/или едно или повече от биологичните свойства на естествените еритропоетини.

Предшестващо състояние на техниката

А. Манипулиране на генетични материали

Генетичните материали могат да бъдат широко дефинирани като химически вещества, които програмират за и ръководят получаването на елементи на клетки и вируси и насочват реакциите на клетки и вируси. Една дълговерижна полимерна субстанция, известна като дезоксирибонуклеинова киселина (ДНК), съставлява генетичния материал на всички живи клетки и вируси, с изключение на някои от последните, които са програмирани чрез рибонуклеинови киселини (РНК). Повтарящите се единици в ДНК полимерите са четири различни нуклеотиди, всеки от които се състои от пурин (аденин или гуанин) или от пиримидин (тимин или цитозин), свързани с дезоксирибоза, към която е прикрепена една фосфатна група. Свързването на нуклеотидите в линейна полимерна форма става чрез прикрепване на 5‘-фосфата на единия нуклеотид към 3‘-хидроксилната група на друг. Функционалната ДНК се явява във форма на стабилни двойноверижни асоциации от единични нуклеотидни вериги (известни като дезоксирибонуклеотиди), които асоциации се получават посредством водородно свързване между пуриновата и пири мидиновата база, т. е. „допълнителни“ асоциации, съществуващи между аденин (А) и тимин (Т) или гуанин (G) и цитозин (С). За удобство, нуклеотидите се означават с имената на техните съставни пуринови или пиримидинови бази, а допълнителните асоциации от нуклеотиди в двойноверижна ДНК (т.е. А-Т и G-С) се наричат базови двойки. Рибонуклеиновата киселина е полинуклеотид, съдържащ аденин, гуанин, цитозин и урацил, а не тимин, свързани с рибоза и една фосфатна група.

Казано по-накратко, програмиращата функция на ДНК се проявява чрез един процес, при който специфични ДНК нуклеотидни секвенции (гени) са транскрибирани в сравнително нестабилни информационни РНК (иРНК) полимери. От своя страна иРНК служи като матрица при образуването на структурни, регулаторни и каталитични протеини от аминокиселините. Този иРНК транслационен процес включва малки РНК вериги (тРНК), които транспортират и подреждат отделни аминокиселини по протежение на веригата на иРНК за образуване на полипептиди с правилна аминокиселинна секвенция. Информацията на иРНК, произхождаща от ДНК и осигуряваща основата на тРНК и ориентирането на всяка една от двадесетте аминокиселини за експресия на полипептиди е във формата на тройка кодони - триплет, образуващ групировки от последователности от три нуклеотидни бази. В известен смисъл, образуването на протеин е последната форма на експресия на програмираната генетична информация, осигурена от нуклеотидната секвенция на един ген.

Промотерна ДНК секвенция обикновено предхожда един ген в ДНК полимера и осигурява място за иници2 иране на транскрипцията в иРНК. Регулаторна ДНК секвенция, също обикновено предхождаща един ген в даден ДНК полимер, свързва протеини, които определят честотата (или скоростта) на започване на транскрипцията. Колективно означавани като промотер/регулаторна или контролна ДНК секвенция, тези секвенции, които предхождат определени гени (или серии от гени) в един функционален ДНК полимер съдействат за определяне дали транскрипцията (или евентуално експресията) на един ген ще се осъществи. ДНК последователности, които следват един ген в даден ДНК полимер и подават сигнал за завършване на транскрипцията в иРНК се наричат транскрипционни „терминаторни“ последователности.

Фокус на микробиологичните разработки през последното десетилетие са опитите за производство на индустриално и фармацевтично значими вещества чрез използване на микроорганизми, които или нямат по начало генетично кодирана информация, включена в тяхната ДНК, относно желания продукт, или (в случая с култура от клетки на бозайници) обикновено не „изразяват“ хромозомен ген на подходящо равнище. Казано просто, ген, определящ структурата на желания полипептиден продукт, е или изолиран от „донорен“ организъм, или химически синтезиран и след това инжекционно въведен в друг микроорганизъм, който е за предпочитане саморепликиращ се едноклетъчен микроорганизъм като например бактерии, дрожди или клетки от бозайници в култура. След като това е направено веднъж, съществуващият механизъм за генна експресия в трансформирана или трансфектирана микробна клетка гостоприемник, действа за изграждане иа желания продукт, използвайки екзогенна ДНК като матрица за транскрипция на иРНК, която тогава се превежда в непрекъсната секвенция от аминокиселинни остатъци.

Тази област е богата на патентни и литературни публикации, отнасящи се до рекомбинантни ДНК методологии да изолиране, синтез, пречистване и омекотяване на генетичен материал за използването му при трансформиране на избрани организми гостоприемници. Например US 4,237,224 на Cohen и сътр. се отнася до трансформиране на едноклетъчни организми гостоприемници с хибридна вирусна или кръгова плазмидна ДНК, която включва подбрани екзогенни ДНК секвенции. Процесите в този патент включват първо получаване на един трансформационен вектор чрез ензимно разцепване на вирусна или кръгова ДНК за образуване на линейни ДНК вериги. Под чужди екзогенни или хетерогенни ДНК вериги, обикновено включващи секвенции, кодиращи за желания продукт, се получават в линейна форма чрез използване на сходни ензими. Линейната вирусна или плазмидна ДНК се инкубира с чужда ДНК в присъствието на лигиращи ензими, пригодни за създаване на възстановителен процес се оформят хибридни вектори, които включват избрания екзогенен ДНК сегмент „вплетен“ във вирусния или кръгов ДНК плазмид.

Трансформирането на подходящи едноклетъчни организми гостоприемници с хибридния вектор приключва с образуването на многобройни копия на екзогенната ДНК в популацията на клетката гостоприемник. В някои случаи очакваният резултат е просто увеличаване на чуждата ДНК и събираният „продукт“ е ДНК. По-често целта на трансформирането е експресия чрез клетките гостоприемници на екзогенната ДНК под форма на едромащабна синтеза на изолируеми количества от търговски значим протеин или полипептидни фрагменти, кодирани чрез чуждата ДНК. Виж също например US 4,264,731, 4,273,875, 4,293,652 и ЕР 093,619, публикувана ноември 9, 1983 година.

Разработването на специфични ДНК последователности за образуване на ДНК вектори се извършва по различни методики в зависимост в голяма степен от това, доколко е „чужд“ донорът на приетия гостоприемник и от големината на полипептида, който трябва да бъде изразен в гостоприемника. При риск за преопростяване може да се каже, че могат да бъдат използвани три алтернативни принципни метода: (1) изолиране на двойноверижна ДНК секвенция от геномната ДНК на донора; (2) химическо получаване на ДНК секвенция, осигуряваща код за представляващия интерес полипептид; и (3) синтеза ин витро на двойно верижна ДНК секвенция чрез ензимно обратно транскрибиране на и РНК, изолирана от донорни клетки. Последните споменати методи, които включват образуването на един ДНК комплемент на иРНК се съобщават обикновено като сДНК методи.

Получаването на ДНК секвенции е често въпрос на избор, когато е известна цялата последователност от аминокиселинни остатъци на желания полипептиден продукт. Процесите за получаване на ДНК по съвместната патентна заявка US 483,451 (подадена на април 15, 1983 и отговаряща на РСТ /US83/00605, публикувана ноември 24, 1984 като W083/04053), предлагат много добро средство за получаване на такива много желани резултати като: осигуряване наличност на други кодони, обикновено установявани в генГй, които са силно изразени в гостоприемниковите клетки, избрани за експресия (например създаване на дрождеви или Е. coli предпочитани кодони); избягване на непреведени интронни секвенции обикновено съдържащи се в бозайникови геномни ДНК секвенции и РНК транскрипции на същите), които не са напълно обработени от прокариотни гостоприемникови клетки; избягване на експресията на нежелани „водещи“ полипептидни секвенции, обикновено кодирани от геномна ДНК и сДНК секвенции, но често не напълно делени он интересуващия ни полипептид от бактериални или дрождеви гостоприемникови клетки; осигуряване на точно включване на ДНК в обикновени експресионни вектори във връзка с желани промотер/регулаторни и терминаторни секвенции; и създавайки условия за правилно конструиране на гени, кодиращи за полипептидни фрагменти и аналози на желаните полипептиди.

Когато цялата последователност от аминокиселинни остатъци на желания полипептид не е известна, директното получаване на ДНК секвенции не е възможно и се избира изолирането на ДНК последователности, кодиращи за полипептида, по сДНК метода, независимо от възможните недостатъци по отношение лекота на създаване на експресионни вектори, осигуряващи високо ниво на микробиална експресия. Между стандартните методи за изолиране на интересуващи ни сДНК последователности е получаването на породени от плазмиди сДНК банки, получени при обратна транскрипция на иРНК в донорни клетки, селекционирани така, че да осигуряват високо равнище на експресия на гени (например банки от сДНК, извлечени от хипо4 физни клетки, които се използват за експресия на голямо количество хормонални растежни продукти). Когато е известна значителна част от аминокиселинната последователност на полипептида, маркирани едноверижни пробни ДНК последователности, дублиращи секвенция, предполагаемо налична в сДНК матрица, могат да се използват при ДНК/ДНК хибридизационни методи, провеждани върху клонирани копия на сДНК, които са били денатурирани до едноверижна форма. Този въпрос е бил обсъден и направените изводи са посочени в US 4394443, Weissman, et al., а последните съобщения са за използването на дълги олигонуклеотидни хибридизационни сонди са в Wallace, et al., Nuc. Acids Rev., 6, pp. 3543-3557, (1979), Reyes, etal., p. N. A. S. (USA), 79, pp. 3270-3274 (1982) и Jeye, et al., Nuc. Acids Res., 11, pp. 2325-2335 (1983). До ДНК/ ДНК хибридизационни методи, използвани при диагностика, се отнася US 4358535 на Falkow, et al., а до емитиращи светлина маркери върху едноверижни полинуклеодитни сонди публикувани ЕР 0070658 и 0070687, Davis, et., „А Manual for Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics“, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1980), p.55-58 и 176-174, се отнасят до колония и метод за хибридизиране на плаки; и брошурата New England Nuclear Boston, Mass) за „Gene Screen“ материали за мембрани за хибридизационен трансфер, предлагаща наръчник за трансфер и хибридизация на ДНК и РНК, каталог N NEF-973.

Между по-значимите скорошни успехи в методите за хибридизация за скриниране на рекомбинантни клонове е използването на белязани смесени синтетични олигонуклеотидни сонди, всяка от които е потенциално цялостен комплемент на специфична

ДНК последователност в хибридизационната проба, включваща хетеро5 генна смес от едноверижни ДНК и

РНК. Тези методи са признати като особено полезни пир откриване на сДНК клонове, получени от източници, които осигуряват извънредно малко количество иРНК последовател10 ности за интересуващите ни полипептиди. Накратко, използването на строги условия на хибридизиране, насочени към избягване на неспецифично свързване, може да позволи например 15 авторадиографиране на специфичен сДНК клон при хибридизиране на мишенна ДНК до тази единична сонда в сместа, която е нейния цялостен комплемент. Виж Wallace et al., Nuc, 20 Acids Res. 9, стр. 879-897 (1981);

Suggs et al. P.N.A.S. САЩ, 78, стр. 6613-6617 (1981); Choo et al., Nature 299, стр. 178-180 (1982); Kurachi et al., P.N.A.S. (САЩ), 79, стр. 646125 6464 (1982); Ohkubo et al., P.N.A.S.

(САЩ) 80, стр. 2196-2200 (1983); и Kornblihtt et al., P.N.A.S. (САЩ) 80, стр. 3218-3222 (1983). Общо взето, методът със смесена сонда по Wallace 30 et al., (1981) (виж по-горе) се разпростира от различни изследователи и до получаване на надеждни резултати при изолиране на сДНК клон като се използва 32-членен смесен пул от 35 16 бази дълги (16-мерни) олигонуклеотидни проби от еднообразни, вариращи ДНК последователности заедно с една 11-мерна за създаване двустранна позитивна конформация за на40 личност на интересуваща ни сДНК.

Виж Singer-Sam et al., P.N.A.S (САЩ) 80, стр. 802-806 (1983).

Използването на геномни ДНК изолати се среща най-малко от трите 45 споменати метода за развиване на специфични ДНК последователности за използване в рекомбинантни методи.

Това се отнася особено до областта от рекомбинантни методи, насочени към осигуряване на микробиална експресия на бозайникови полипептиди, и се дължи по принцип на сложността на бозайниковата геномна ДНК. Въпреки че съществуват надеждни методи за развиване на получени от фаги банки от геномна ДНК с човешки и от други бозайници произход (виж например Down et al., Cell, 15, стр. 11571 174 (1978), отнасящи се до методи за създаване на човешки геномни банки, които обикновено се наричат „Maniatis Library; Karn et al., P.N.A.S. (САЩ) 77, стр. 5172-5176 (1980), отнасяща се до човешка геномна банка, основаваща се на алтернативен метод за рестрикционно ендонуклеозно фрагментиране; и Blattner et al., Science, 196, стр. 161-169, (1977), описващ получаването на говежда геномна банка) има сравнително малко успешни опити за използване на хибридизационни методи за изолиране на геномна ДНК при липса на обширни предварителни познания за аминокиселинните последователности на ДНК. Като пример, Fiddes et al., J. Mol. and App. Genetics, 1, стр. 3-18 (1981) описват успешното изолиране на ген, кодиращ за алфаподединица на глюкопротеин от човешки хипофизни хормони при използване на проба с пълна дължина, включваща фрагмент от 621 двойки бази от предварително изолирана сДНКпоследователност на алфаподединица. Като друг пример Das et al., P.N.A.S (САЩ), 80, стр. 1531-1535 (1983) съобщават за изолиране на човешки геномни клонове човешки HLADR при използване на синтетичен олигонуклеотид от 175 двойки бази. Anderson et al., P.N.A.S. (САЩ), 80, стр. 6838-6842 (1983) съобщава за изолиране на геномен клон за инхибитор на говежди панкреасов трипси нов инхйбитор (ВРТ1) при използване на единична проба с дължина 86 двойки бази и конструиран съгласно известната аминокиселинна последователност на BPTI. Авторите отбелязват определено слабата възможност за изолиране на иРНК, подходяща за синтез на сДНК банка поради явно ниското съдържание на иРНК в определените паротидна жлеза и източници на белодробна тъкан и затова насочват изгледите за успех към сондиране на геномна банка при използване на смес от белязани сонди, посочвайки: „По-общо, олигодезоксинуклеотидни сонди със смесени последователности за изолиране на гени на протеин с неизвестна последователност от сДНК банки. Такива сонди са обикновено смеси от 8-32 олигонуклеотида, с дължина 14-17 нуклеотида, предоставящи всички възможни комбинации от кодони за малки участъци (5-6 остатъка) на аминокиселинна последователност. При строги условия на хибридизиране, които ограничават проби с неправилни двойки бази, тези смеси са в състояние да локализират специфични генни последователности с ниска до умерена сложност в банка клонове. Независимо от това, поради тяхната малка дължина и хетерогенност, при смесените сонди често липсва специфичността, изисквана за сондиране на последователности толкова сложни като бозайниковия геном. Това прави такъв метод неизползваем при изолирането на гени на бозайникови протеини, когато липсва съответната иРНК.

Така че продължава да съществува нужда в тази област от подобрени методи за бързо и ефективно изолиране на сДНК клонове в случаи, когато е известно малко за аминокиселинната последователност на полипептида, за който се кодира и където „обогатени“ тъканни източници на и РНК не са лесно достъпни за използване при конструиране на банки сДНК. Такива подобрени методи могат да бъдат използвани специално, ако се прилагат за изолиране на геномни клонове при бозайници, където има оскъдна информация относно аминокиселинните последователности на полипептида, за който даденият ген кодира.

В. Еритропоетинът като представляващ интерес полипептид

Еритропоезата, продуцирането на червени кръвни клетки, се извършва непрекъснато през целия живот на човека до настъпване разрушаване на клетката. Еритропоезата е твърде точно контролиран физиологически процес, осигуряващ наличието на достатъчен брой червени кръвни клетки в кръвта за правилно снабдяване на тъканите с кислород, но не толкова много, че клетките да пречат на циркулацията. Образуването на червените кръвни клетки става в костния мозък и се извършва под контрола на хормона еритропоетин.

Еритропоетинът, един кисел гликопротеин с молекулно тегло приблизително 34 000 далтона, може да съществува в три форми: α, β и asialo. Алфа- и бетаформите се различават слабо по въглехидратни компоненти, но имат еднакво действие, биологична активност и молекулно тегло. Азиалоформата представлява алфа- или бетаформа с отстранен краен въглехидрат (сиалова киселина). Еритропоетинът се съдържа в много ниски концентрации в плазмата, когато тялото е здраво, тъй като тъканите получават достатъчно количество кислород от наличните еритроцити. Тази нормална ниска концентрация е достатъчна да стимулира подмяната на червените кръвни клетки, които са загубени нор мално поради стареене.

Количеството еритропоетин в кръвообръщението се повишава при условия на хипоксия, когато транспортирането на кислород от кръвните клетки в кръвообращението е понижено. Хипоксия може да се причини от загуба на големи количества кръв при кръвоизлив, разрушаване на червени кръвни клетки при продължително излагане на радиация, намаляване на поемания кислород при големи височини, продължително безсъние или при различни форми на анемия. Като реакция на тъканите, подложени на хипоксичен стрес, еритропоетинът ще повиши продукцията на червени кръвни клетки чрез стимулиране превръщането на примитивните преходни клетки в костния мозък в проеритробласти, които впоследствие узряват, синтезират хемоглобин и се освобождават в кръвообращението като червени кръвни клетки. Когато броят на червените кръвни клетки в кръвообращението е по-голям, отколкото е необходимо за задоволяване нормалните нужди на тъканите от кислород, еритропоетинът в циркулацията намалява.

Виж общо Testa et al., Exp. Hematol. 8, (Supp 8), 144-152 (1980); Tong et al., J. Biol. Chemo. 256 (24), 12666-12672 (1981); Goldwasser, J. Cell. Physiolin 110 (Supp. 1), 133-135 (1982); Finch, Blood, 60(6), 1241-1246 (1982); Sytdowski et al., Expt. Hematol. 8 (Supp., 8), 52-64 (1980); Naughton, Ann.Clin.Lab.Sci. 13 (5), 432-438 (1983); Weiss et al., Am. J. Vet. Res. 44 (10), 1839-1835 (1983); Lappin et al.. Exp. Hematol. 1 1 (7), 661-666 (1983); Baciu et al., Ann. Ν. Y. Acad Sci. 414, 66-72 (1983); Murphy et al., Acta Haematdologica Japanica 46 (7), 1380-1396 (1983); Desspyris et al., Brit. J. Haematol. 56, 295-306 (1984);

Emmannouel et al.. Am. J. Physiol. 247 (Pt 2). F 168-76 (1984).

Тъй като еритропоетинът е съществен в процеса на образуване на червени кръвни клетки, хормонът има потенциално полезно приложение както при диагностиката, така и при лечението на кръвни смущения, характеризиращи се със слабо или нарушено продуциране на червени кръвни клетки. Виж например Renna thur-Das et al., Blood, 63 (5), 1168-71 (1984) и Haddy, Am. Jour. Ped. Hematol/Oncol. 4, 191-196 (1982), отнасящи се до еритропоетин при терапия на сърповидноклетъчна анемия и Eschbach и сътр. J. Clin. Invest. 74 (2), стр. 434441 (1984), които описват терапевтичните режими при уремични овце въз основа на ин виво реакция на инфузия на богата на еритропоетин плазма и предлагат дозировка от 10 единици ЕРО/кг на ден в продължение на 15 до 40 дни като средство при анемия от типа, свързан с хронична бъбречна недостатъчност. Виж също Krane, Henry Ford. Hosp. Med. J. 31 (3), 177-181 (1983).

Напоследък е установено, че наличността на еритропоетин в количество би позволило лечението всяка година на анемия на 1 600 000 души само в Съединените щати. Виж например Morrison, „Bioprocessing in Space - an Overview стр. 557-571 в The World Biotech Report 1984, том 3, САЩ (Online Publication, Ν. Y. 1984). Последните проучвания положиха основа за разширяване областта на лечението с еритропоетин при множество болестни състояния, нарушения и хематологични смущения. Vedorato et al., Acta Haematol. 71, 211-213, 1984 (бетаталасемия); Vichinsky et al., J. Pediatr. 104 (1), 15-21 (1984) (цистозна фиброза), Cotes et al., Brit. J. Obstet Gunecol. 90 (4), 304-311 (1983) (бременност, менструални смущения); Haga et al., Acta Pediatr. Scand. 72. 827-831 (1983) (ранна анемия при преждевременно раждане); ClausWalker et al., Arch. Phys. Med. Rehabil, 65, 370-374 (1984) (увреждания на гръбначния мозък); Dunn et al., Eur. J. Appl. Physiol. 52, 187-182 (1984) (космически полети); Miller et al., Brit. J. Haematol. 52, 545-590 (1982) (силен кръвоизлив); Udupa et al., J. Lab. Clin. Med. 103 (4). 574-580 (1984); Lipschitz et al., Blood. 63 (3), 502-509 (1983) (стареене); Dainiak et al., Cancer 51 (6), 1 101-1106 (1983) и Schwarts et al., Otolaryngol. 109, 269272 (1983) (различни неопластични болестни състояния, придружени с ненормална еритропоеза).

Предишните опити за получаване на еритропоетин в добри количества от плазма или урина са се оказали сравнително неуспешни. Необходими са комплицирани и усложнени лабораторни методики и те обикновено дават като резултат събирането на твърде малки количества от непречистени и нестабилни екстракти, съдържащи еритропоетин.

Патент US 3,033,753 описва един метод за частично пречистване на еритропоетин от овча кръвна плазма, който дава малък добив на суров твърд екстракт, съдържащ еритропоетин.

Началните опити за изолиране на еритропоетин от урина даваха нестабилни, биологически неактивни препарати на хормона. Патент US 3 865 801 описва метод за стабилизиране на биологичната активност на сурова субстанция, съдържаща еритропоетин, получен от урина. Полученият суров препарат, съдържащ еритропоетин, има 90% от активността на еритропоетина и е стабилен.

Друг метод за пречистване на човешки еритропоетин от урина на па циенти с апластична анемия е описан от Miyake et al., J. Biol. Chem.. том 252, N 15, август 10, 1975,стр. 5558-5564. Този седеметапен метод включва йоннообменна хроматография, преципитиране с етанол, гелна филтрация и адсорбционна хроматография и дава чист еритропоетинов препарат със 70,400 единици/мг протеин при 21% добиви.

Патент US 4 397 840 на Takezawa et al., описва методи за получаване на „един еритропоетинов продукт“ от урина на здрави хора със слаби основни йонообменни смоли и предполага, че нискомолекулните продукти нямат инхибиращ ефект спрямо еритропоетина.

Заявка за патент GB 2,085,887 от Sugimoto et al., публикувана през май 1982 г., описва метод за получаване на хибридни човешки лимфобластоидни клетки с добиви от 3 до 420 единици еритропоетин на мл клетъчна суспензия (културата, след размножаване на бозайникови гостоприемници съдържа до 10⁷ клетки на милилитър). При най-високите добиви, които е възможно да бъдат постигнати, нормата на продукция на еритропоетин може да бъде 40 до около 4 000 единици/10⁶клетки/48 часа в култура ин витро, последвано от пренасяне на клетки от система за размножаване ин виво. (Виж също еквивалентния US 4,377,513) Правени са голям брой предложения за изолиране на еритропоетин от тъканни източници, включително неопластични клетки, обаче добивите са доста ниски. Виж например Jelkman et al., Expl. hematol. 11 (7), 581-588 (1983); Tambourin et al., P.N.A.S. (USA), 8, 6269-6273 (1983); Katsuoka et al., Gann. 74, 534-541 (1983); Hagiwara et al., Blood, 63 (4), 828-835 (1984); Choppin et al., Blood, 64 (2), 341-347 (1984).

Други методики за изолиране, използвани за получаване на пречистен еритропоетин, включват имунологични процедури. Едно поликлонално, получено от серум антитяло, реактивно спрямо еритропоетин, е получено при инжектиране на животно, за предпочитане плъх или заек, с човешки еритропоетин. Инжектираният човешки еритропоетин се разпознава като чужда антигенна субстанция от имунната система на животното и инициира образуването на антитела на антигена. Различни клетки в отговор на стимулацията от антигенната субстанция продуцират и освобождават в кръвообращението антитела, слабо различаващи се от продуцираните от други реагиращи клетки. Антитялоактивността се запазва в серума на животното, когато неговата кръв се екстрахира. Въпреки че непречистеният серум или от антитела препарат, пречистен като фракция на серумен имуноглобулин G, може да бъде изпалзван при изследвания за откриване и комплексообразуване с човешки еритропоетин, тези материали имат един голям недостатък. Серумното антитяло, съставено от всички различни антитела, продуцирани от отделните клетки, е поликлонално по характер и образува комплекси със съставки на суровия екстракт, различни от еритропоетина.

От интерес за нивото на техниката на настоящето изобретение са последните успехи в областта на развитие на постоянни култури от клетки, способни да продуцират определен вид антитяло, което да е специфично имунологично реактивно с единичен антигенен детерминант на избран антиген. Виж общо Cisholm, High Technology, том 3, Ν 1, 57-63 (1983). Правени са опити да се използват методи за сливане на клетки и хибри дизиране за получаване на моноклонални антитела срещу еритропоетин и да се използват тези антитела за изолиране и количествено определяне на човешки еритропоетин. Съобщение за успешно разработване на миши-миши хибридомни клетъчни линии, секретиращи моноклонални антитела срещу човешки еритропоетин, се появи в реферативна форма в Lee-Huang, Abstract N 1463 на Fed. Proc. 41, 520 (1982). Друг пример е едно подробно описание за получаване и използване на моноклонално антиеритропоетиново антитяло от Weis et al., P.N.A.S. (САЩ) 79, 5465-5469 (1982). Виж също Sasaki, Biomed. Biochim. Acta, 42 (1 1/12), 202-206 (1983); Yanagawa et al., Blood, 64 (2), 357-364 (1984); Yahagawa et al., J. Biol. Chem. 259 (5), 2707-2710 (1984); US N 4,465,624.

Също включени в нивото на техниката на настоящето изобретение са съобщенията за имунологичната активност на синтетични пептиди, които по същество дублират аминокиселинната последователност на съществуващи в природата протеини, гликопротеини и нуклеопротеини. Поспециално, установено е, че полипептиди със сравнително ниско молекулно тегло проявяват имунни реакции, които са еднакви по времетраене и обхват с имунните реакции на физиологично значими протеини като например вирусни антигени, полипептидни хормони и други подобни. Присъщо на имунните реакции на такива полипептиди е провокиране образуването на специфични антитела при имунологично активни животни. Виж например Lerner et al., Nature 294, 654-656 (1981); Walter et al., P.N.A.S. (USA) 77, 5197-5200 (1980); Lerner et al., P.N.A.S. (USA) 78,3403-3407; Walter et al., P.N.A.S. (USA)78, 4882-4886 (1981); Wong et al., P.N.A.S. (USA) 78,

7412-7416 (1981); Green et al., Cell. 28. 477-487 (1982); Nigg et al.. P.N.A.S. (USA) 79. 5322-5326 (1982); Baron et al., Cell, 28, 395-404 (1982); Dreemsn et al., Nature 295, 158-160 (1982); Lerner, Scientific American 248, N 2, 66-74 (1983); виж също Kaiser et al., Science, p. 249-255 (1984) отнасящо се до биологични и имунологични активности на синтетични пептиди. които имат приблизително вторичните структури на пептидните хормони, но може да нямат такива първични структурни конформации.. Горните проучвания се отнасят разбира се до аминокиселинни последователности на протеини, различни от еритропоетин. едно вещество, за чиято аминокиселинна последователност не е публикувана съществена информация. В заявка за патент US 463 724, подадена на 4.02.83 от J. Egrie, публикувана на 22.08.83, като ЕР 0116446, е описана една миша-миша хибридомна клетъчна линия (АТСС N НВ 8209), която продуцира високо специфично моноклонално антиеритропоетиново антитяло, което е също специфично имунореактивно с полипептид, имащ следната последователност от аминокиселини:

N Н₂- Ala-Pro-Pro- Arg-Leu-Ile-Cys-AspSer-ArgVal-Leu-Glu-Arg-Tyr-Leu-Leu-Glu-AlaLys-COOH

Полипептидната последователност е същата като тази от първите двадесет аминокиселинни остатъка на зрелия човешки еритропоетин, изолиран по метода на Miyake et al., J.Biol. Chem. 252, 5558-5564 (1977), аминокиселините на който са анализирани на газово фазен секвенатор (Applied Biosystems, Inc.) съгласно метода на Hewick, М. et al., J. Biol. Chem. 256, 7990-7997 (1981). Виж също Sue et al.. Proc. Natl. Acad. Sci. (САЩ) 80, стр.

3651-3655 (1983), отнасящо се до разработване на поликлонални антитела срещу синтетичен 26-мер, основаващ се на различаваща се аминокиселинна последователност и Sytowski et al., J. Immunol. Methods 69, стр. 181-186 (1984).

Въпреки че поликлоналните и моноклоналните антитела, както са описани по-горе, създават много полезни продукти за прилагане на имунни анализи за откриване и количествено определяне на еритропоетин и могат да се прилагат при афинитетното пречистване на еритропоетин, не е вероятно тези материали да могат да се използват за изолиране от бозайникови източници на големи количества еритропоетин, достатъчни за други анализи, клинични изпитвания и потенциално широкообхватно терапевтично прилагане на субстанцията при лечението например на хронични бъбречни заболявания, при които увредените тъкани не могат да поддържат продуцирането на еритропоетин. Затова разработките в тази област, насочени към получаване на висококачествен еритропоетин от бозайници и осигуряване на големи количества от него за диагностично и клинично приложение, включват успешното прилагане на рекомбинантните методи за осъществяване на едромащабен микробен синтез на съединението.

Въпреки значителните усилия за насочено изолиране на ДНК-последователности, кодиращи за човешки и за други типове еритропоетин на бозайници, никой от опитите не се оказва успешен. Това се дължи по принцип на оскъдността на тъканни източници, специално на човешки тъканни източници, обогатени на иРНК, такива, които биха позволили създаването на сДНК банка, от която да може да се изолира ДНК-последо вателност, кодираща за еритропоетин по обикновените методи. Освен това е известно малко за непрекъсната последователност от аминокиселинни остатъци на еритропоетина. така че не е възможно да се създадат, например дълги полинуклеотидни сонди, надеждни и с възможност за използване при ДНК/ДНК хибридизационен скрининг на сДНК и по-специално на геномна ДНК банка. Последователността от двадесет аминокиселини, използвана за получаване на посоченото по-горе моноклонално антитяло, продуцирано от АТТС N НВ 8209, не позволява създаването на необходимата олигонуклеотидна сонда, съставена от 60 бази по метода, описан от Andersen et al. (виж по-горе). Установено е, че човешкият ген за еритропоетин може да се явява като ген с единично копие в човешкия геном, а в някои случаи генетичният материал, кодиращ за човешки еритропоетин, може да съставлява по-малко от 0,00005 % от общата човешка геномна ДНК, налична в геномната банка.

Най-успешните от известните опити с рекомбинантни методи за получаване на ДНК-последователности, подходящи за използване при микробна експресия на изолируеми количества еритропоетин от бозайници не постигат поставената цел. Като пример, Farber et al., Exp. Hematol. 11, Supp. 14, Abstract 101 (1983) съобщават за екстрахиране на иРНК от бъбречна тъкан от третирани с фенилхидразин павиани и инжектирането на тази иРНК в осцити на Xenopus laevis с доста преходен резултат, състоящ се в ин витро продуциране на смес от транслационни продукти, които включват и някои, проявяващи биологичните свойства на еритропоетина. Напоследък, Farber et al., Blood, 62, Ν 5, прит. Ν 1, реферат 392 на стр. 122а (1983) съобщава за транслация ин витро на човешка бъбречна иРНК от осцити на жаба. Полученият транслационен продукт е установено, че включва в реда от 220 mU един транслационен продукт, проявяващ активност на еритропоетин за микрограм от инжектираната иРНК. Въпреки че такова съдържание при ин витро транслация на екзогенна иРНК, кодираща за еритропоетин, се приема като доста ниско (в сравнение дори с по-рано установеното съдържание при транслация на павианска иРНК в търсения продукт) се приема, че резултатът утвърждава човешкия бъбрек като сайт за експресия на еритропоетин, позволяващ получаването от човешки бъбрек на обогатена сДНК банка, от която може да бъде изолиран търсеният ген (виж също Farber, Clin. Res. 31 (4), 769А, 1983).

След подаването на заявки за патент US N 561 024 и 582 185, се появява едно единствено съобщение за клониране и експресия на това, което се приема, че е сДНК на човешки еритропоетин в Е. coli. Казано накратко, известен брой сДНК клонове са включени в Е. coli плазмиди, и за продуктите, получени при беталактамазна фузия е установено, че са имунореактивни с моноклонално антитяло към един теопределен „епитоп“ на човешки еритропоетин. Виж LeeHuang, Proc., Nat. Acad. Sci. (САЩ) 81, стр. 2708-2712 (1984).

Техническа същност на изобретението

Настоящото изобретение се отнася до нови пречистени и изолирани полипептидни продукти, които имат част или цялата първична структурна конформация (т.е. непрекъсната последователност на аминокиселинни остатъци) и едно или повече от биологичните свойства (например иму нологичните свойства и ин виво и ин витро биологическата активност на природните еритропоетини, включително алелни варианти на същите. Тези полипептиди са също еднозначно характеризирани с това, че са продукт на експресия в прокариотен или еукариотен гостоприемник (например бактерии, дрожди и клетки от бозайници в култура) на екзогенна ДНК последователност, получена чрез геномно или сДНК клониране или чрез синтеза на ген. Продуктите от микробната експресия в клетки на гръбначни (например бозайници и птици) може освен това да се характеризират и с това, че не се асоциират с човешки протеини или с други онечиствания, които понякога са свързани с еритропоетина в неговата естествена среда в клетки на бозайници или в извънклетъчни течности като плазма или урина. Продуктите на типични дрождеви (например Saccharomyces cerevisiae) или прокариотни (например Е. coli) клетки гостоприемници не се свързват с никакви бозайникови протеини. В зависимост от използвания гостоприемник полипептидите съгласно изобретението може да бъдат гликолизирани с въглехидрати, получени от бозайници или други еукариотни клетки, или може да не бъдат гликозилирани. Полипептидите съгласно изобретението може да включват също и един начален метионинов аминокиселинен остатък (в позиция -1).

Новите гликопротеинови продукти съгласно изобретението включват такива, които имат първична структурна конформация, достатъчно подобна на тази на природния (например човешки) еритропоетин, за да осигурява проявяването на един или повече от неговите биологични свойства и имащи средно съдържание на въглехидрати, различно от това на природния (например човешки) еритропоетин.

Клетките от гръбначни (например COS-Ι и СНО), включени в настоящето изобретение, представляват първите достъпни клетки, които могат да се размножават ин витро непрекъснато и които при култивиране са в състояние да продуцират в хранителната среда в излишък от 100 единици (за предпочитане в излишък от 500 единици и най-вече в излишък от 1000 до 5000 единици) еритропоетин на 10⁶ клетки за 48 часа, както е определено чрез радиоимунно изследване.

Настоящето изобретение се отнася и до синтетични полипептиди, напълно или частично повтарящи непрекъснатите последователности от аминокиселинни остатъци на еритропоетина, които се описват тук за първи път. Тези последователности, фактически имащи първичните, вторичните или третичните структурни и конформационни характеристики на природния еритропоетин, може да проявяват биологична активност и/ или имунологични свойства общи с природния продукт, така че да могат да бъдат използвани като биологично активни или имунологични заместители на еритропоетина в терапевтични и имунологични методи. Съответно, осигуряват се моноклонални и поликлонални антитела, получени по известни методи, които са имунореактивни с такива полипептиди и, за предпочитане, са също имунореактивни с природния еритропоетин.

Обекти на настоящото изобретение са клонирани ДНК последователности от маймунски и човешки произход и полипептидни последователности съответно изведени от тях, които представляват първичната структурна конформация на еритропоетини от май мунски и човешки произход.

Настоящото изобретение предлага и нови биологично функционални вирусни и кръгови плазмидни ДНК вектори, включващи ДНК последователности съгласно изобретението и микробни (например бактериални, дрождеви или клетки от бозайници) микроорганизми гостоприемници, устойчиво трансформирани или трансфектирани с такива вектори. Съответно с това изобретението се отнася до нови методи за получаване на полезни полипептиди, състоящи се в култивиране на такива трансформирани или трансфектирани микробни гостоприемници при условия, улесняващи едро мащабна експресия на екзогенни, породени от вектор ДНК последователности, и изолиране на желаните полипептиди от хранителната среда, клетъчни лизати или фракции от клетъчни мембрани.

Изолирането и пречистването на получените чрез микробна експресия полипептиди съгласно изобретението може да стане с обикновените средства, например подготвително хроматографско сепариране и имунологично сепариране, включващо получаването на моноклонално и/или поликлонално антитяло.

Изяснявайки по този начин последователността от аминокиселинни остатъци на еритропоетин, настоящото изобретение осигурява цялостно или частично получаване на ДНК последователности, кодиращи за еритропоетин, както и включване на кодони, предпочитани за експресия от избрани гостоприемници, непроизхождащи от бозайници, места за разцепване с рестрикционни ендонуклеазни ензими и допълнителни начални, крайни или междинни ДНК последователности, които улесняват конструирането на лесни за експресия вектори. В съот ветствие с това настоящото изобретение се отнася до получаването (и развитието чрез специфична по място мутагенеза на сДНК и геномна ДНК) на ДНК последователности, кодиращи за микробна експресия на полипептидни аналози или производни на еритропоетина, които се различават от природните му форми по вида или разположението на един или повече аминокиселинни остатъка (например аналози, получени чрез делеция, съдържащи не всички остатъци, типични за ЕРО, и/или аналози, получени чрез заместване, при което един или повече от характерните за ЕРО остатъци се заместват с други, и/или аналози, получени чрез разширяване, при което един или повече аминокиселинни остатъци се добавят към крайната или средната част на веригата на полипептида); като всеки от аналозите проявява едно или всички свойства на природния еритроетин.

Новите ДНК последователности съгласно изобретението включват всички последователности, които могат да осигурят експресия в прокариотни или еукариотни клетки гостоприемници на полипептидни продукти, имащи поне част от първичната структурна конформация и едно или повече от биологичните свойства на еритропоетина, което може да се види при (а) ДНК последователностите, показани в таблици V и VI тук или техните комплементарни вериги; (в) ДНК последователности, които хибридизират (при хибридизационни условия, каквито са описани тук или по-строги от тях) до ДНК последователности, описани в (а) или техни фрагменти; и (с) ДНК последователности, които поради дегенериране на генетичния код хибридизират до ДНК последователностите, описани в (а) и (в) погоре. Част от описаните в (в) са ге номни ДНК последователности, кодиращи алелни вариантни форми на маймунски или човешки еритропоетин и/или кодиращи други видове еритропоетин от бозайници. Част от (с) са получени ДНК последователности, кодиращи за ЕРО, ЕРО-фрагменти и ЕРО-аналози, които може да включват кодони, улесняващи транслирането на информационна РНК в безгръбначни гостоприемници.

Настоящото изобретение включва и клас полипептиди, за които кодират части от ДНК комплементарни към горната верига на човешката геномна ДНК последователност от таблица VI, т. е. комплементарно инвертиран протеин, както е описан от Tramontano et al., Nucleic Acids Research, 12, стр. 5049-5059 (1984).

Също включени в обхвата на изобретението са фармацевтични състави, съдържащи ефективни количества от полипептидните продукти съгласно изобретението заедно с подходящи разредители, добавки и/или носители, които се използват при терапия с еритропоетин, особено при лечение на анемии и по-специално такива анемии, които водят до хронична бъбречна недостатъчност.

Полипептидните продукти съгласно изобретението могат да бъдат „белязани“ чрез ковалентно свързване със специфични лесно откриваеми вещества - маркери (например изотопно маркиране със ¹²⁵1) за осигуряване на реактиви, използвани при откриване и количествено определяне на еритропоетин в твърда тъкан и в течни проби, като например кръв и урина. ДНК продуктите съгласно изобретението може също да бъдат белязани с откриваеми маркери (изотопни и неизотопни маркери например биотин) и използвани при ДНК хибридизационни методи за определяне на пози цията на гена за еритропоетин и/или позицията на всяка сходна фамилия гени в човешка, маймунска и на други видове бозайници хромозомна карта.

Те може също да бъдат използвани за откриване на дефекти в гена за еритропоетин на равнище ДНК и като генни маркери за идентифициране на съседни гени и техни дефекти.

Както е описано по-нататък в подробности, настоящото изобретение също предлага значителни подобрения в методите за откриване на специфични едноверижни полинуклеотиди с неизвестна последователност в хетерогенна клетъчна или вирусна проба, включващо свързани едноверижни полинуклеотиди, където:

(а) се приготвя смес от маркирани едноверижни полинуклеотидни сонди с еднообразно вариращи последователности от бази, като всяка от споменатите сонди е потенциално специфично комплементарна към една последователност от бази, характерна за полинуклеотидите, които трябва да бъдат открити;

(в) пробният образец се фиксира към твърд субстрат;

(c) субстратът, към който е фиксиран пробният образец се обработва, за да се намали възможността за друго свързване на полинуклеотиди към него освен чрез хибридизация към полинуклеотиди в споменатия пробен образец;

(d) обработеният субстрат с фиксирания върху него пробен образец се довежда временно в контакт със спомената смес от маркирани проби при условия, улесняващи хибридизирането само между изцяло комплементарни полинуклеотиди, и (e) специфичният полинуклеотид се открива чрез следене за проява на хибридизационна реакция между него и една изцяло комплементарна сонда в спомената смес от маркирани сонди, което се показва от по-високата плътност на белязания материал върху субстрата на мястото на специфичния полинуклеотид в сравнение с фоновата плътност на белязания материал, която е резултат от неспецифичното свързване на маркираните сонди със субстрата.

Методът е особено ефективен в случаи, изискващи използването на 64, 128, 256, 512 и 1024 или повече смесени полинуклеотидни сонди с дължина от 17 до 20 бази пир ДНК/ ДНК, РНК/РНК или ДНК/РНК хибридизации.

Както е описано тук, споменатите по-горе методи се използват при идентифицирането на сДНК клонове, кодиращи за еритропоетини с произход от маймуни от една банка, получена от иРНК от бъбречни клетки на анемични маймуни. По-специално, една смес от 128 еднообразно вариращи 20мерни сонди, основаващи се на информация за аминокиселинната последователност, получена при секвениране на фракции на човешки еритропоетин, се използва при хибридизация на колонии за откриване на седем положителни сДНК клона на еритропоетин между 200 000 колонии. Дори използването на подобрени методи съгласно изобретението е довело до бързо изолиране на три положителни клона при скрининг на 1 500 000 фагови плаки, съставляващи човешка геномна банка. Процесът завършва с използване на описаната смес от 128 20мерни сонди заедно с един втори комплект от 128 17-мерни сонди, основан на аминокиселинен анализ на различни непрекъснати последователности на човешки еритропоетин.

Описаните методи представляват първия известен случай на използва15 не на свързани смесени олигонуклеотидни сонди при ДНК/ДНК хибридизационни методи за изолиране на геномни клонове на бозайници и първия известен случай на използване на смес от повече от 32 олигонуклеотидни сонди при изолирането на сДНК клонове.

Голям брой аспекти и предимства на изобретението ще станат явни на специалистите в тази област след разглеждането на следващото подробно описание, което илюстрира предпочитаните в настоящия момент приложения на изобретението.

Съгласно настоящото изобретение се изолират и охарактеризират ДНК последователности кодиращи за част или за цялата полипептидна последователност на човешки и маймунски еритропоетин (отбелязван по-нататък като ЕРО). По-нататък ДНК от маймунски и човешки произход са субект на еукариотна и прокариотна експресия, осигуряваща изолируеми количества полипептиди, проявяващи биологичните (например имунологични) свойства на природния ЕРО, както и ин виво и ин витро биологични активности на ЕРО.

ДНК от маймунски произход е изолирана от сДНК банка, конструирана с иРНК, получена от бъбречна тъкан на маймуна с химически причинена анемия и за чийто серум е установено имунологично, че има високо съдържание на ЕРО в сравнение с нормален серум от маймуна. Изолирането на желаните сДНК клонове, съдържащи ДНК, кодираща за ЕРО, се придружава от ДНК/ДНК хибридизация на колонии при използване на пул от 128 смесени, изотопно маркирани, 20мерни олигонуклеотидни сонди и включва бърз скрининг на 200 000 колонии. Получаването на олигонуклеотидните сонди е основано на информация за аминосикелинната последователност, получена чрез ензимно фрагментиране и секвениране на малка проба от човешки ЕРО.

ДНК от човешки произход се изолира от човешка геномна ДНК банка. Изолирането на клонове, съдържащи кодираща за ЕРО ДНК се извършва чрез ДНК/ДНК хибридизация на плаки при използване на посочения погоре пул от 128 смесени изотопно белязани 17-мерни сонди, чиито последователности са базирани на информация за аминокиселинната последователност, получена от различен ензимен фрагмент на човешки ЕРО.

Позитивните колонии и плаки се проверяват последством дидезокси секвениране на клонална ДНК при използване на един подкомплект от 16 последователности от пула от 20-мерни сонди и избрани клонове се подлагат на анализ на нуклеотидната последователност, в резултат на който се определя първичната структурна конформация на ЕРО полипептидите, кодирани от тях. Определените полипептидни последователности проявяват висока степен на хомоложност помежду си и към една частична последователност, получена чрез аминокиселинен анализ на фрагменти на човешки ЕРО.

Един избран положителен маймунски сДНК клон и един избран положителен човешки геномен клон се включват в един ДНК вектор, който се умножава в Е. coli и се използва за трансфекция на култура от клетки на бозайници. Култивирането на трансфектирани клетки гостоприемници води до съдържание на ЕРО в настоящата течност на хранителната среда до 3000 mU на милилитър културална течност.

Описание на приложените фигури Фигура 1 е графично представяне на радиоимунен анализ на продукти16 те съгласно изобретението;

Фигури 2 до 4 показват конструкция на вектори съгласно изобретението и

Фигури 5 до 21са ДНК и полипептидни последователности съгласно изобретението.

Следващите примери са представени за илюстриране на изобретението и се отнасят специално до процесите, предхождащи идентифицирането на кодиращи за ЕРО маймунски сДНК клонове и човешки геномни клонове, процесите, водещи до такова идентифициране и до секвенирането, развитието на експресионни системи и имунологичното потвърждаване на експресията на ЕРО в тези системи.

По-специално, пример 1 се отнася до аминокиселинно секвениране на човешки ЕРО фрагменти и получаване на смеси от „изотопно“ маркирани сонди въз основа на резултатите от това секвениране. Пример 2 се отнася общо до методи за идентифициране на положителни маймунски сДНК клонове и така осигурява информация, отнасяща се до лечение на животни и предварително радиоимунно изследване (RIA) за анализ на животински серуми. Пример 3 е свързан с получаването на сДНК банка, хибридизационен скрининг на колонии и проверка на позитивните клонове, секвениране на позитивни сДНК клонове и осигуряване на информация за първичната структурна конформация (аминокиселинната последователност) на маймунски ЕРО. Пример 4 се отнася до процеси, включени при идентифицирането на положителни човешки геномни клонове и осигуряващи по този начин информация за източника на геномната банка, методи за хибридизация на плаки и проверка на положителните кло-нове. Пример 5 се отнася до ДНК секвениране на поло жителен геномен клон и получаване на информация за полипептидната аминокиселинна последователност на човешки ЕРО, включително сравняване на същата с информацията за последователността на маймунски ЕРО. Пример 6 е свързан с методи за конструиране на вектор, включващ ДНК, кодираща за ЕРО, получена от позитивен маймунски сДНК клон, използването на вектора за трансфектиране на COS-1 клетки и култивирането на трансфектираните клетки. Пример 7 се отнася до методи за конструиране на вектор, включващ ЕРО-кодиращи ДНК, получени от позитивен човешки геномен клон, използването на вектора за трансфектиране на COS-1 клетки и култивирането на трансфектираните клетки. Пример 8 описва имунен анализ на настоящите течности на хранителните среди, използвани за култивиране на трансфектираните съгласно примери 6 и 7 клетки. Пример 9 описва биологичната активност ин виво и ин витро на ЕРО, получени чрез микробна експресия съгласно примери 6 и 7.

Пример 10 се отнася до създаването на експресионни системи от гостоприемници от бозайници за сДНК на маймунски ЕРО и човешка геномна ДНК, включващи клетки от яйчници на Китайски хамстер („СМО“) и до имунологичните и биологичните активности на тези експресионни системи, както и охарактеризирането на такива продукти. Пример 11 се отнася до получаването на гени, кодиращи човешки ЕРО и аналози на ЕРО, които гени включват известен брой предпочитани колони за експресия в Е. coli и дрождеви клетки гостоприемници и до експресионни системи, основаващи се на тях. Пример 12 се отнася до профили на имунологичната и биологична активност на експ17 ресионни продукти на системата по пример 11.

Пример 1

А. Аминокиселинно секвениране на 5 фрагмент на човешки ЕРО

Човешки ЕРО се изолира от урина и се подлага на тройно смилане, водещо до получаване и изолиране на 17 отделни фрагмента в количества приблизително 100-150 пмола.

Таблица 1

Фрагмент N	Резултат от анализа на последователността
Т4а Т4Ь T9 Т13 Т16 Т18 Т21 Т25 Т26а Т26Ь Т27 ТЗО Т31 ТЗЗ Т35 Т38	A-P-P-R G-K-L-K A-L-G-A-Q-K V-L-E-R A-V-S-G-L-R L-F-R K-L-F-R Y-L-L-E-A-K L-I-C-D-S-R L-Y-T-G-E-A-C-R E-A-I-S-P-P-O-A-A-M-A-A-P-L-R E-A-E-X-I-T-T-G-X-A-E-H-X-S-L-N-E-X-I-T-V-P V-Y-S-N-F-L-R S-L-T-T-L-L-R V-N-F-Y-A-W-K G-Q-A-L-L-V-X-S-S-Q-P-W-E-P-L-Q-L-H-V-D-E

Фрагментите са номерирани произволно и аминокиселинните им последователности са анализирани чрез микросеквениращ анализ при използване на газово-фазов секвенатор (Applied Biosystems) за получаване на посочената на Таблица 1 информация за последователностите, при което са използвани еднобуквени кодове, a X означава остатък, който не е еднозначно определен.

В. Съставяне и получаване на смеси от олигонуклеотидни сонди аминокиселинните последователности, посочени в таблица I, се разглеждат в контекста на дегенерация на генетичния код за установяване дали методите, използващи смесени сонди, да се прилагат при ДНК/ДНК хибридизационни процеси върху сДНК и/или ге30 номна ДНК банка. Този анализ показва, че във фрагмент Ν Т35 същестувва серия от 7 аминокиселинни остатъка (Vai Asn-Phe-Tyr-AlaTrp-Lys), която може да бъде ед35 нозначно определена като кодираща за една от 128-те възможни ДНК последователности, обхващащи 20 базови двойки. Поради това един пръв комплект от 128 20-мер40 ни олигонуклеотида е синтезиран по стандартните фосфоамидитни методи (Виж Beaucage et al., Tetrahedron Letters, 22, стр. 1859-1862 (1981)) върху твърда подложка съг45 ласно последователността, посочена в таблица 2 по-долу.

Таблица 2

Остатък	Vai	Asn	Phe	Tyr	Ala	Trp	Lys
3'	CAA	TTG	AAG	ATG	CGA	ACC	TT	5'
	Τ	A	A	A	T
	G				G
	C				C

Последващият анализ показва, че 10 ято може да се приготви пул от 128 във фрагмент Ν Т38 има серия от 6 смесени 17-мерни олигонуклеотидни аминокиселинни остатъка (Gin-Pro- сонди, посочени в таблица 3 по-долу. Trp-Glu-Pro-Leu), на основата на коТаблица 3

Остатък	Gin	Pro	Trp	Glu	Pro	Leu
3'	GTT	GGA	ACC	CTT	GGA	GA	5'
	C	T		C	T	A
		G			G
		C			C

Олигонуклеотидните сонди се маркират в 5' края с гама - ³²Р-АТР, 75008000 ci/mmol (ICN) при използване на Т₄ полинуклеотидна киназа (NEN).

Пример 2

A. Методи за третиране на маймуна Женски Cynomolgus маймуни

Macaca fascicularias (2, 5 - 3 кг, на възраст от 1,5 до 2 години) се третират подкожно с разтвор на фенилхидразин хидрохлорид с pH 7,0 в дози от

12,5 мг/кг на 1-я, 3-я и 5-я ден. Следи се хематокритната стойност преди всяко инжектиране. На седмия ден или когато хематокритната стойност е спаднала под 25% от изходното равнище, се взима серум и бъбреци след прилагане на кетамин хидрохлорид в дози 25 мг/кг. Събраните материали се замразяват незабавно в течен азот и се съхраняват при -70°С.

B. RIA за ЕРО (радиоимунно изследване - RIA)

Извършват се радиоимунни анализи за количествено определяне на ЕРО в проби по следния начин:

Стандартен еритропоетин или неизвестна проба се инкубира заедно с 30 антисерум в продължение на 2 ч при 37°С. След двучасово инкубиране епруветките се охлаждат върху лед, добавя се ¹²⁵1-маркиран еритропоетин и епруветките се инкубират при 0°С най-малко още 15 ч. Всяка епруветка съдържа 500 μΐ инкубационна смес, състояща се от 50 μΐ разреден имунен серум, 10 000 срт ^|251-еритропоетин, 5 μΐ тразилол и 0-250 μΐ от стандартния ЕРО или неизвестната проба в PBS (буфериран с фосфат физиологически разтвор), съдържащ 0,1% BSA, за допълване на останалия обем. Използваният антисерум е от втория кръвен тест на заек, имунизиран с 1 % чист препарат еритропоетин от човешка урина. Крайното разреждане на ан19 тисерума за изследването се наглася така, че количеството на свързания с антитяло ^|251-ЕРО да не надхвърля 1020 °_о от общото. Всъщност това отговаря на крайно разреждане на антисерума от 1:50 000 до 1:100 000.

Свързаният с антитяло ¹²⁵1-еритропоетин се прециптира чрез добавянето на 150 μΐ Staph А. След 40 мин инкубиране пробите се центрофугират и утайката се промива два пъти с 0,75 ml 10 mM Трис-солна киселина с pH

8,2. съдържаща 0,15М натриев хлорид, 2 mM ЕДТА и 0,05% Triton X100. Промитата утайка се изследва с гама брояч за определяне на процента на свързания ¹²⁵1 еритропоетин. Пробите, свързани от предимунните серуми, се изваждат от крайната стойност за да се коригира броят с неспецифично преципитираните. Съдържанието на еритропоетин в непознатите проби се определя чрез сравняване със стандартната крива.

Описаният по-горе метод се прилага за изследване на маймунски серум, получен както е описано в част А по-горе, както и на нетретиран маймунски серум. Установено е, че нормалните серумни проби съдържат приблизително 36 mU/мл, докато третираният маймунски серум съдържа от 1000 до 1700 mU/мл.

Пример 3

А. Получаване на банка от маймунски сДНК

Информационна РНК се изолира от бъбреци на нормална и анемична маймуна по метода с гванидин тиоцианат по Chirgwin et al., Biochemistry, 18, стр. 5294 (1979) и поли (А)⁺ иРНК се пречиства с две преминавания чрез колонна хроматография с олиго (dT) целулоза, както е описано на стр. 197198 от Maniatis et al., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual“,N.Y., (1982). Банката сДНК се конструира съглас но една модификация на общия метод на Okayama et al., Mol. and Cell Bid 2. стр. 161-170 (1982). Ключовите белези на сега предпочитаните методи са следните: (1) pUC8 се използва като единичен вектор, срязан с PstI и тогава снаден с олиго - dT с дължина 60-80 бази; (2) Смилане с Hindi се използва за отстраняване на олиго dT опашната част от единия край на вектора; (3) Синтезът на първата верига и олиго dG краят се извършва съгласно описания метод; (4) За отстраняване на олиго dG от края на вектора се използва смилане BamHI, (5) Заместването на РНК верига с ДНК се извършва в присъствието на два линкера (GATCTAAAGACCGTCCCCCCCCC и ACGGTCTTTA) при трикратен моларен излишък на олиго dG крайния вектор.

В. Методи за хибридизиране на колонии за скрининг на банка от маймунски сДНК.

Трансформирани Е. coli се разстилат при гъстота от 9000 колонии за 10x10 см блюдо върху твърда хранителна среда, съдържаща 50 pg/ml ампицилин. Използват се Gene Screen филтри (New England Nuclear Catalog N EF-972) предварително обмокрени върху BHI-CAM плочки (както мозъчно-сърдечна инфузия 37 g/Ι, казаминови киселини 2 g/Ι и агар 15 g/Ι, съдържаща 500 pg/ml хлорамфеникол) и се използват за отделяне на колониите от средата. Колониите се култивират в същата среда в продължение на 12 часа или по-дълго за умножаване на броя на плазмидните копия. Умножените колонии се обработват чрез поставяне на серии филтри върху 2 парчета филтърна хартия Whatman 3 ММ, наситени с един от следните разтвори:

(1) 50 тМ глюкоза - 25 тМ триссолна киселина (pH 8)-10 тМ ЕДТА (pH 8,0) за 5 мин;

(2) 0,5 М натриев хидроксид за 10 мин; и (3) 1,0 М трис-солна киселина (pH 7.5) за 3 мин.

След това филтрите се изсушават въздушно във вакуум при 80°С за 2 ч.

Изсушените филтри се подлагат на смилане с протеиназа К чрез обработка с разтвор, съдържащ 50 pg/ml от протеазния ензим в буфер К (0,1 М трис-солна киселина (pH 8,0) - 0,15 М натриев хлорид - 10 шМ ЕДТА (pH 8,2) - 0,2% SDS). По-специално към всеки филтър се добавят 5 мл от разтвора и смилането се извършва при 55°С за 30 мин, след което разтворът се отстранява.

След това филтрите се обработват с 4 ml прихибридизационен буфер (5xSSPE - 0,5% SDS - 100 pg/ml SS E. coli ДНК - 5xBFP). Прехибридизационната обработка се извършва при 55°С, обикновено за 4 ч или подълго, след което прехибридизационният буфер се отстранява.

Хибридизацията се извършва по следния начин. Към всеки филтър се добавят 3 ml от хибридизационния буфер (5xSSPE - 0,5% SDS - 100pg/ml дрождева ТРНК), съдържащ 0,025 пмола от всяка от 128-те пробни последователности от таблица 2 (общата смес се означава като EPV смес) и филтрите се държат при 48°С за 20 ч. Тази температура е 2°С по-ниска от най-ниската от изчислените температури на дисоциация (Td), която е определена за всяка от пробите.

След хибридизацията филтрите се промиват три пъти за по 10 мин върху клатачка с 6xSSC -0,1% SDS при стайна температура и се промиват два до три пъти с 6xSS С-1% SDS при температурата на хибридизиране (48°С).

Автографията на филтрите откри ва седем положителни клона измежду скринираните 200 000 колонии.

Изходният анализ на последователността на един от предполагаемите положителни маймунски сДНК клонове (означен клон 83) се извършва с цел потвърждаване на резултатите чрез модификация на метода на Wallace et al., Gene, стр. 21-26 (1981). Накратко, плазмидна ДНК от маймунския сДНК клон 83 се линеаризира чрез смилане с EcoRi и се денатурира чрез загряване в кипяща водна баня. Нуклеотидната последователност се определя чрез дидезокси метода на Sanger et al., P.N.A.S. (САЩ) 74, стр. 5463-5467 (1977). Един вторичен комплект от EPV сместа от проби, състоящ се от 16 последователности се използва като праймер за секвениращите реакции.

С. Секвениране на сДНК на маймунски ЕРО

Анализът на нуклеотидната последователност на клон 83 се извършва по метода на Messing, Methods in Enzymology, 101, стр. 20-78 (1983). Ha таблица 4 е показан предварителен анализ на рестрикционните карти на EcoRI/Hindlll, клониран фрагмент на клон 83, състоящ се от приблизително 1600 базови двойки. Приблизителните разположения на сайтовете за рестрикционния ендонуклеазен ензим са означени като базите се броят от 3' края до EcoRi сайта при 5' края на фрагмента. Нуклеотидното секвениране се извършва чрез секвениране на отделни рестрикционни фрагменти със свързване на припокриващи се фрагменти. Например информация за припокриване на последователности е получена чрез анализ на нуклеотидите в рестрикционен фрагмент, означен СНЗ (Sau3A при ~ 111/SmaI при ~324) и при секвениране в обратен ред на един фрагмент, означен С73 (Alul при ~424/BstEII при =203).

Таблица 4

Рестрикционен ензим сайт на разпознаване	Приблизително разположение
EcoRl	1
Sau3A	111
Smal	180
BstEIl	203
Smal	324
Kpnl	371
Rsal	372
Alul	424
PstI	426
Alul	430
Hpal	466
Alul	546
PstI	601
PvuII	604
Alul	605
Alul	782
Alul	788
Rsal	792
PstI	807
Alul	841
Alul	927
Ncol	946
Sau3A	1014
Alul	1072
Alul	1115
Alul	1223
PstI	1301
Rsal	1343
Alul	1384
Hindlll	1449
Alul	1450
Hindlll	1585

Секвенирането на 1342 базови двойки (в участък, обхващащ от Sau ЗА сайта при 3' до EcoRl сайта и Hindlll сайта) и анализът на всички възможни четящи рамки осигуряват информацията за ДНК и аминокиселинната последователност, отразена на фиг. 5. На фигурата предполагаемият изходен аминокиселинен отста45 тък от аминокрая на веригата на зрелия ЕРО (което е потвърден чрез корелация на споменатия по-рано ана лиз на последователностите на двадесет аминокрайни остатъка) е означен като +1. Натискът от определящия метионин ATG кодон (означен -27) „нагоре“ от изходния аминокраен аланинов остатък като определения за първи остатък от аминокиселинната последователност на зрелия протеин е показателен за вероятността за експресия на ЕРО първоначално в цитоплазмата в предхождаща форма, включваща един водещ участък от 27 аминокиселини, който е изрязан преди навлизане на зрелия ЕРО в кръвообращението. Потенциалните сайтове за гликолизиране в полипептида са означени със звездичка. Определеното молекулно тегло на транслираната зона е 21 117 далтона, а молекулното тегло на полипептида от 165 остатъка, съставляващи зрелия маймунски ЕРО е определен на 18 236 далтона.

Полипептидната последователност от фиг. 5 може лесно да бъде подложена на анализ за наличност на силно хидрофилни участъци и/или вторични конформационни характеристики, показателни за потенциални високо имуногенни участъци чрез, например, методите на Hopp et al., P.N.A.S. (САЩ) 78, стр. 3824-3828 (1981) и Kyte et al., J. Mol. Biol. 157, стр. 105132 (1982) и/или Chou et al., Biochem. 13, стр. 222-245 (1974) и Adrances in Enzymology, 47, стр. 45-47 (1978). Компютърният анализ по метода на Hoop et al., се осъществява с помощта на програма, означена PEP Reference Section 6.7, осигурена от Intelligenetics, Inc. 124 University Avenue Polo Alto, California.

Пример 4

А. Човешка геномна банка

Една Ch4A фагова геномна банка от човешки ембрионален дроб, приготвена съгласно метода на Lawn et al., Cell (виж по-горе) е получена и поддържана за целите на анализа на хибридизационни плаки.

В. Методи за хибридизация на плаки, използвани за скрининг на човешка геномна банка

Фагови частици се лизират и ДНК се фиксират върху филтри (50 000 плаки на филтър) съгласно метода на Woo, Methods in Enzymology, 68, стр. 389-395 (1979) освен при използване на Gene Screen Plus филтрите (New England Nuclear Catalog N NEF-972) и NZYAM плочки (NaCI, 5 g; MgCI₂. 6H₂O, 2 g; NZ-амин A, 10 g; дрождев екстракт 3 г; казаминови киселини 2g; малтоза 2 g; и arap 15 g/л).

Изсушените на въздух филтри се изпичат за 1 ч при 80°С и след това се смилат с Протеаза К, както е описано в пример 3, част В. Предхибридизиране се извършва с 1 мол натриев хлорид - 1 % SDS буфер при 55°С за 4 ч или повече, след което буферът се отстранява. Хибридизационното и следхибридизационното промиване се извършва както е описано в пример 3. част В. Използват се смеси едната от 128 20-мерни проби, означени като EPV, и другата от 128 17мерни проби от таблица 3 (означени EPQ смеси). Хибридизацията се извършва при 48°С при използване на EPV сместа. Хибридизацията на EPQ сместа се осъществява при 46°С - 4° по-долу от изчисленото Td за съставките на сместа. Отстраняването на хибридизиралата проба за рехибридизация се извършва чрез кипване с 1 х SSC -0,1% SDS за 2 мин. Авторадиографията на филтрите показва три положителни клона (реактивни и с двете смеси от проби) измежду 1 500 000 скринирани фагови плаки. Потвърждаването на позитивните клонове като ЕРО-кодиращи се извършва чрез ДНК секвениране и електронна микрография на образува23 ните хетеродуплексни с маймунска сДНК от пример 3. Тази процедура също разкрива многобройни интрони в геномната ДНК последователност.

Пример 5

Извършен е анализ на нуклеотидната последователност на един от положителните клонове (означен λλ ΗΕΙ) и получените резултати са отразени на фиг. 6.

На фиг. 6 изходната непрекъсната ДНК последователност представлява една горна верига от 620 бази от една нетранслирана последователност, непосредствено предхождаща един транслиран участък на гена на човешкия ЕРО. По-специално, последователността изглежда че съставлява 5' края на гена, който води до транслиран участък от ДНК, кодиращ за първите четири аминокиселинни (-27 до -24) на една водеща последователност (пресеквенция). Четирите двойки бази в последователността, предхождаща тази кодираща началото на водещата не са още еднозначно определение и поради това са отбелязани с „X“. Следва един интрон от около 639 двойки бази (439 базови двойки от тях са секвенирани, а останалите 200 базови свойки са означени с „I.S.“), а непосредствено предхождащ един кодон за глутамин, който е означен като остатък -23 на транслирания полипептид. Установено е, че непосредствено следващата екзонна последователност кодира за аминокиселинните остатъци от един аланинов остатък (означен като+1 остатък от аминокиселинната последователност на зрелия човешки ЕРО), до кодона за треонин в позиция +26, след което следва втори интрон, състоящ се от 256 бази, както е специално посочено. След този интрон има една екзонна последователност за аминокиселинни остатъци 27 до 55 и след това трети интрон, съдържащ 612 базови двойки. Последващият екзон кодира за остатъци 56 до 115 на човешкия ЕРО и след него започва четвърти интрон със 134 бази както е описано. След четвъртия интрон има един екзон. кодиращ за остатъци NN 116 до 166 и един стоп кодон (TGA). Най-накрая, таблица 6 разкрива една последователност от 568 двойки бази, в която се предполага, че има нетранслиран 3' участък на гена на човешкия ЕРО, две базови двойки, на който („X“) още не са еднозначно секвенирани.

Така на фиг. 6 е идентифицирана първичната структурна конформация (аминокиселинната последователност) на зрял човешки ЕРО, включващ 166 определени аминокиселинни остатъка (установено молекулно тегло=18 399). На фигурата е показана и ДНК последователността, кодираща за една водеща последователност от 27 остатъка заедно с 5' и 3' ДНК последователностите, която има значение за промотер/операторните функции на оперона на човешкия ген. Местата за потенциално гликолизиране на полипептида на зрелия човешки ЕРО са означени на фигурата със звездички. Заслужава да се отбележи, че специфичната аминокиселинна последователност от фиг. 6 вероятно е тази на една природна алелна форма на човешкия еритропоетин. В потвърждение на това са резултатите от продължителните опити за секвениране на получени от урина изолати на човешки еритропоетин, и откриват, че значителен брой еритропоетинови молекули имат метионин при остатък 126, а не серин, както е показано на фигурата.

Фигура 9 показва степента на хомоложност между полипептидните последователности на човешки и маймунски ЕРО. В горния непрекъс24 нат ред на фигурата, с означения от единични букви е представена изведените транслирани полипептидни последователности на човешки ЕРО, започващи с остатък -27, а долният непрекъснат ред показва изведената полипептидна последователност на маймунски ЕРО, започващ от означения остатък номер -27. Звездичките са използвани за означаване на хомоложност на последователностите. Трябва да се отбележи, че изведените последователности на човешки и маймунски ЕРО разкриват един „допълнителен“ лизинов (К) остатък в позиция 116 на човешкия ЕРО. Забележките към фиг. 6 посочват, че този остатък е на границата на предполагаемо свързване на иРНК в геномната последователност. Наличието на лизинов остатък в човешката полипептидна последователност се потвърждава след това чрез секвениране на сДНК клон на човешката последователност, получен от иРНК, изолирана от COS-1 клетки, трансформирани с човешката геномна ДНК от пример 7, по-долу.

Пример 6

Избраната система за експресия при началните опити за микробиален синтез на изолируеми количества ЕРО полипептиден материал кодиран от маймунска сДНК, получена по метода от пример 3, е такава, включваща клетки гостоприемници от бозайници (например COS-1 клетки, АТСС N CRL-1650). Клетките се трансфектират с един вектор, годен на автономна репликация в Е. coli-гостоприемник благодарение на ДНК, получена от pBR322 и в бозайниковите гостоприемници (посредством наличността на SV40, произхождаща от вирус ДНК).

По-специално се конструира един експресионен вектор по следния начин: Плазмидният клон 83, получен в пример 3, се умножава в Е. coli и приблизително 1,4 кв маймунска ДНК кодираща ЕРО се изолира чрез EcoRI и Hindlll смилане. Отделно се изолира приблизително 40 кв Hindlll/Sall фрагмент от pBR322. Един приблизително 30 вр EcoRI/Sall линкер фрагмент се получава от M13mpl0 RF ДНК (Р и L лаборатории). Този линкер включва, в серии, EcoRI леплив край, последван от SstI, Smal, BamHMI и Xbal, разпознаващи сайтове и Sall леплив край. Горните три фрагмента се лигират за получаване на приблизително 5,4 кв междинен плазмид („pERS“), където ДНК на ЕРО е прикачена от едната страна чрез една „банка“ от полезни рестрикционни ендонуклеазни разпознаващи сайтове. След това pERS се смила с Hindlll и Sall за получаване ЕРО ДНК и EcoRI до Sall (M13mpl0) линкер. Фрагментът 1,4 кв се лигира с приблизително 4,0 кв BamHl/Sall на pBR322 и друг M13mpl0 Hindlll/BamHl RF линкер фрагмент също от приблизително 30 вр. М13 линкер фрагментът се характеризира с Hindlll леплив край, последван от PstI, Sall, Xbal разпознавателни сайтове и BamHI леплив край. Продуктът от лигирането отново полезен междинен плазмид („pBRЕРО“), включващ ЕРО ДНК, прикачена от двете страни чрез банки на рестрикционен сайт.

Избраният вектор за експресия на ЕРО ДНК в COS-1 клетки („pDSVLl“) е конструиран така, че да позволява селекция и автономна репликация в Е. coli. Тези характеристики се осигуряват от източника на репликация и резистен на ампицилин ген сДНК последователности в участъка, разпространяваща се от нуклеотиди 2448 до 4362 на pBR322. Тази последователност се модифицира структурно чрез добавяне на един линкер, оси25 гуряващ свързване на Hindlll непосредствено съседно на нуклеотид 2448 преди инкорпориране във вектора. Между избраните други полезни свойства на вектора е способността му за автономна репликация в COS-1 клетки и наличността на вирусна промотерна последователност, действаща в клетки на бозайници. Тези свойства се осигуряват от произхода на репликационната ДНК последователност и „ген“ вирусна промотерна/ДНК последователност „късен ген“, присъстваща в една 342 вр последователност, обхващаща нуклеотиди номера 5171 до 270 на SV40 генома. Във вектора има един уникален рестрикционен сайт (BamHI) непосредствено до него вирусна промотерна последователност, осигурени чрез използване на търговски достъпна линкерна последователност (Collaborative Research). Във вектора е също инкорпорирана една последователност от 237 базови двойки (получена от нуклеотидни номера 2553 до 2770 от SV40), съдържащ вирусния иРНК полиаденилационен сигнал на „късния ген“ (обикновено назоваван транскрипционен терминатор). Този фрагмент е разположен във вектора в правилната посока точно срещу „късния ген“ вирусен промотер през единствения BamHI сайт. Във вектора има също и друг бозайников ген в позиция, недостъпна за потенциална транскрипция на ген, включен на единствения BamHI сайт, между вирусният промотер и терминаторната последователност. /Бозайниковият ген представлява миши дихидрофолатен редуктазон (DMFR) мини-ген от приблизително 2 500 вр, изолиран от плазмид pMG-1 както при Gasser et al., P.N.A.S. (САЩ) 79, стр. 6522-6526 (1982). Отново главните операционни компоненти на плазмид pDSVLI обхващат нуклеотиди 2448 до 4362 на pBR322 заедно с неклуотиди 5171 до

270 (342 вф) и 2553 до 2770 (237 вр) на SV40 ДНК.

Следвайки метода, описан от Maniatis et al., виж по-горе, кодиращата ЕРО ДНК се изолира от плазмид pBR-EPO като BamHI фрагмент и се лигира в плазмид pDSVLI, срязан с BamHI. Използва се рестрикционен ензимен анализ за потвърждаване на инсерцията на ЕРО гена в правилна посока в два от получените клонирани вектори (двойката вектори Н и L). Виж фиг. 2, показваща плазмид pDSVLI-MkE. Вектори с ЕРО гени в неправилна посока (вектори F, X и G) се запазват за използване като негативни контроли при трансфекционни опити за определяне на степента на експресия на ЕРО в гостоприемници, трансформирани с вектори, съдържащи ЕРО ДНК в правилна посока.

Векторите Н, L, F, X и G се комбинират с носител ДНК (ДНК от черен дроб и далак) и се използват за трансфектиране на двойки 60 mm плочки по метода на микропреципитация с калциев фосфат. Двойките плочки по 60 мм са също трансфектирани с носеща ДНК като отрицателна контрола с „фалшива“ трансформация. След пет дни всичките хранителни среди се тестуват за наличност на полипептиди, имащи имунологичните свойства на природния ЕРО.

Пример 7

А. Изходна ЕРО експресионна система, включваща COS-1 клетки Системата, избрана за начални опити за микробиална синтеза на изолируеми количества човешки ЕРО полипептиден материал, кодиран чрез човешки геномен ДНК ЕРО клон, включва също експресия в клетки гостоприемници от бозайници (например COS-1 клетки, А.Т.Т.С. N CRL-1650). Човешкият ЕРО ген се клонира пър26 во в „совалков вектор, който е способен на автономна репликация както в Е. coli гостоприемници ((благодарение на присъствието на ДНК, получена от pBR322) така и в бозайникова клетъчна линия COS-1 (благодарение наличността на SV40, произхождаща от вирус ДНК). След това совалковият вектор, съдържащ ЕРО гена, се трансфектира в COS-1 клетки. ЕРО полипептидният материал се продуцира в трансфектираните клетки и се секретира в хранителните среди.

По-подробно, експресионният вектор се конструира по следния начин: ДНК, изолирана от ламбда клон XhEl, съдържащ човешки геномен ЕРО ген, се смила с BamHl и Hindlll рестрикционни ендонуклеази и се изолира един 5,6 кв ДНК фрагмент, за който е известно, че съдържа целия ЕРО ген. Този фрагмент се смесва и лигира с бактериалния плазмид pUC8 (Bethesda Research Laboratories, Inc.), който се смила по подобен начин, създавайки междинния плазмид ,,pUC8-HuE“, осигуряващ удобен източник на този рестрикционен фрагмент.

Векторът, избран за експресия на ЕРО ДНК в COS-1 клетки (pSV4SEt) е конструиран по-рано. Плазмидът pSV4SEt съдържа ДНК последователности, позволяващи селекция и автономна репликация в Е. coli. Тези характеристики се осигуряват от източника на репликация и ДНК последователности на резистентен на ампицилин ген, намиращ се в участъка, разпростиращ се от нуклеотид 2448 до 4362 бактериалния плазмид pBR322. Тази последователност се модифицира структурно чрез добавянето на линкер, осигуряващ HindiII разпознаващ сайт непосредствено до нуклеотида 2448. Плазмидът pSV4SEtV също е годен за автономна репликация в COS-1 клетки. Това свойство се дъл жи на 342 вр фрагмент, съдържащ вирусния източник на репликация SV40 (нуклеотиди номера 5171 до 270). Тази фрагмент се модифицира чрез добавяне на линкер, осигуряващ едно EcoRl, разпознаващ сайт, съседен на нуклеотида 270, и линкер, осигуряващ Sall разпознаващ сайт, съседен на нуклеотид 5171. В този вектор има също един 1061 вр фрагмент от SV40 (нуклеотидни номера 1711 до 2772 плюс един линкер, създаващ Sall сайт за разпознаване близо до нуклеотид номер 2772). В този фрагмент има една уникална BamHl разпознавателна последователност. Общо, плазмидът pSV4SEt съдържа уникални BamHl и Hindlll сайтове за разпознаване, позволяващи инсерцията на човешки ЕРО ген, последователности позволяващи репликация и селекция в Е. coli. и последователности позволяващи репликация в COS-1 клетки.

С оглед да се включи ЕРО генът в pSV4SEt, плазмидът pUC8-HuE се смила с рестрикционните ендонуклеази BamHl и Hindlll и се изолира 5,6 кв ЕРО кодираща ДНК. pSV4SEt също се смила с BamHl и Hindlll и главният фрагмент от 2513 вр се изолира (запазвайки всичките необходими функции). Тези фрагменти се смесват и лигират, създавайки крайния вектор „pSVg НиЕРО“. (виж фиг. 3). Този вектор се размножава в Е. coli и се изолира ДНК вектор. Използва се анализ с рестрикционни ензими за потвърждаване на инсерцията на ЕРО гена.

ДНК на плазмида pSVgHuEPO се използва за експресия на човешки ЕРО полипептиден материал в COS1 клетки. Всъщност pSVgHuEPO ДНК се комбинира с носеща ДНК и се трансфектира в тройка 60 мм блюда с COS-1 клетки. Като контролна, носеща ДНК самостоятелно, също се трансфектира в COS-1 клетки. Взимат се проби от клетъчната културна среда пет и седем дни по-късно и се тестват за наличност на полипептиди, имащи имунологични свойства като тези на природния ЕРО.

В. Втора ЕРО експресионна система, включваща COS-1 клетки

За осигуряване на подобрена продукция на човешки ЕРО полипептиден материал, кодиран от човешки геномен ДНК ЕРО клон в COS-1 клетки (А.Т.Т.С. N CRL-1650) се използва друга система.

В предхождащата система, експресията на ЕРО в COS-1 клетки се осъществява при използване на собствения му промотер, който е в 5,6 кв BamHl до Hindlll рестрикционния фрагмент. В следващата конструкция, ЕРО генът е променен така, че експресията му се осъществява с SV40 късен промотер.

Клонирания 5,6 кв BamHl до Hindlll геномен човешки ЕРО рестрикционен фрагмент се модифицира по следния начин: Плазмидът pUC8HuE, както е описано по-горе, се разцепва с рестрикционните ендонуклеази BamHl и BstEII. BstEII разцепва 5,6 кв ЕРО гена в позиция, която е на 44 базови двойки 5’ от началния ATG код за полипептида и на приблизително 680 базови двойки 3' от Hindlll рестрикционния сайт. Фрагментът от приблизително 4900 базови двойки се изолира. Синтезира се и се пречиства един синтетичен линкерен ДНК фрагмент, имащ Sall и BstEII лепливи краища и един вътрешен BamHl сайт за разпознаване. Двата фрагмента се смесват и лигират с плазмид pBR322, който е отрязан със Sall и BamHl за получаване на междинен плазмид pBRgHE. Геномният човешки ЕРО ген може да бъде изолиран следователно като един BamHl смлян фрагмент от 4900 двойки бази, носещ целия струк турен ген с един-единствен ATG, намиращ се на 44 базови двойки 3' от BamHl сайта, съседен на аминокрайния кодиращ участък. Този фрагмент се изолира и се включва като BamHl фрагмент в разцепения с BamHl експресионен векторен плазмид pDSVLI (описан в пример 6). Резултатният плазмид, pSVLgHu ЕРО, както е показано на фиг. 4, се използва за експресия на ЕРО полипептиден материал от COS1 клетки, както е описано в примери 6 и 7А.

Пример 8

Хранителната среда от шестте трансфектирани COS-1 култури от пример 6, се анализират чрез радиоимунно изследване съгласно метода, описан по-напред в пример 2, част В. Всяка проба се анализира при аликвотни нива 250, 125, 50 и 25 μΐ. Настоящите течности, получени при култивиране на лъжливо трансфектирани или трансфектирани с вектори в неправилната посока на ЕРО гена клетки, са определено негативни по отношение на ЕРО имунореактивност. За всяка проба от двете надстоящи течности, получени от култивиране на COS-1 клетки, трансфектирани с вектори (Н и L) с ЕРО ДНК в правилна посока, процентното инхибиране на свързването на ¹²⁵1-ЕРО към антитяло е от 72 до 88%, което поставя всички получени стойности в горния край на стандартната крива. Точната концентрация на ЕРО в културалната надстояща течност не може да бъде определена. Установена е една доста постоянна стойност от 300 mU/мл, определена от стойности на изчислените на най-голямата аликвотна част (250 μΙ).

Една представителна проба от културалната течност съгласно пример 6 и културални течности от петия и седмия ден съгласно пример 7А са тествани чрез RIA за сравняване актив28 ността на рекомбинантни маймунски и човешки ЕРО продукти с тази на природния човешки ЕРО, приет за стандарт, и резултатите са изложени в графична форма на фиг. 1. Накратко, резултатите както се очаква показват, че рекомбинантният маймунски ЕРО забележително блокира антитяло срещу човешкия ЕРО антитяло, въпреки че той не е в състояние да инхибира изцяло свързването при опитните условия. Максималният процент на инхибиране за рекомбинантния човешки ЕРО е обаче близък до стойностите за стандартния човешки ЕРО. Паралелността на кривите отговор към доза показва имунологичната идентичност на последователностите (епитопите). Предишните резултати от анализ на маймунски ЕРО в културални течности се отчитат отново при по-високо разреждане и стойностите са в обхвата от 2,91 до 3,12 U/ml. Установените нива на продуциране на човешки ЕРО са съответно 392 mU/мл за пробата от петдневната култура и 567 mU/мл за пробата от седемдневно култивиране. Изчислените нива на продуциране на маймунска ЕРО с описаната експресионна система от пример 7В са от същия порядък или по-високи.

Пример 9

Културални течности, получени съгласно пример 6 и 7, се подлагат на изследване ин витро за ЕРО активност по метода на Goldwasser et al., Endocrinology 97, 2, стр. 315-323 (1975). Определените стойности за маймунски ЕРО в тестваните културални течности са в границите от 3,2 до 4,3 U/ ml. Културална течност с човешки ЕРО показва също при изследване ин витро ЕРО активност, която би могла да бъде неутрализирана от антитяло срещу ЕРО. Културални течности от рекомбинантен маймунски ЕРО съглас но пример 6 са също подложени на изследване за биологическа активност ин виво съгласно общите методи на Cotes et al., Nature, 191, стр. 1065-1067 (1961) и Hammond et al., Anna!. N.Y. Acad. Sci., 149, стр. 516-527 (1968) и установените равнища на активност са в границите от 0,94 до 1,24 U/ml.

Пример 10

В предходните примери, рекомбинантен материал от маймунски или човешки ЕРО се продуцира от вектори, използвани за трансфектиране COS-1 клетки. Тези вектори се реплицират в COS-1 клетки благодарение на присъствието на SV40 Т антиген в клетките и един SV40 източник на репликация върху векторите. Въпреки че тези вектори продуцират използваеми количества ЕРО в COS-1 клетките, експресията е само преходна (7 до 14 дни) поради евентуалната загуба на вектора. Допълнително, само малък процент от COS-1 клетките биват продуктивно трансфектирани с векторите. Настоящият пример описва експресионна система, използваща яйчници на китайски хамстери (СМО) DHFR-клетки и избираем маркер, DHFR. (За примери за сходни експресионни системи виж US 4 399 216 и ЕР NN 117 058, 117 059 и 117 060, всички публикувани на 29.08.84.)

СНО DHFR клетки (DuX-Bll) СНО К1 клетки, Urlaub et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (САЩ) том 77, 4461 (1980) не съдържат ензима дихидрофолатредуктаза (DHFR) поради мутации в структурните гени и поради това са им необходими хранителни среди, в които има глицин, хипоксантин и тимидин. Плазмидите pDSVL-МкЕ (пример 6) или pDSVL-gHuEPO (пример 7В) се трансфектират заедно с носеща ДНК в СНО DHFR клетки, култивирани в среди, съдържащи хипоксантин, тимидин и глицин в 60 мм блюда. Плазмид pSVgHuEPO (пример 7А) се смесва с плазмид pMG2, съдържащ миши дихидрофолатредуктазен ген, клониран в бактериален плазмиден вектор pBR322 (съгласно Gasser виж по-горе). Сместа от плазмид и носещата ДНК се трансфектират в СНО DHFR клетки. (Клетки, които придобиват един плазмид, обикновено придобиват и втори плазмид). След три дни клетките се разпределят чрез обработка с трипсин в няколко блюда от 100 мм в среда, в която липсват хипоксантин и тимидин. Само тези клетки, които са стабилно трансформирани с DHFR ген и следователно с ЕРО ген, могат да преживеят в тези среди. След 7 до 21 дни колониите на преживелите клетки стават видими. Тези трансформантни колонии след диспергиране чрез трипсинизиране могат да бъдат непрекъснато размножавани в среди, в които липсват хипоксантин и триптидин, като създават нови клетъчни щамове (например СНО pDSVL-MkEPO, CHO-pSVgHuEPO, CHO-pDSVL-gHuEPO). Културалните течности от горните клетъчни щамове се тестуват в RIA за наличност на рекомбинантен маймунски или човешки ЕРО. Средата за щама CHO-pDSVLMkEPO съдържат ЕРО с имунологични свойства, подобни на тези, получавани при COS-1 клетки, трансфектирани с плазмид pDSVL-MkEPO. Една представителна 65-часова културална течност съдържа маймунски ЕРО с 0,6U/ ml. Културални течности от СНО pSVgHuEPO и СНО pDSVL-gHuEPO съдържат рекомбинантен човешки ЕРО с имунологични свойства, подобни на тези, отчитани при COS-1 клетки, трансфектирани с pSVgHuEPO или pDSVL-gHuEPO. Една представителна 3-дневна културална течност от СНО pSVgHuEPO съдържа 2,99 U/ml човешки ЕРО, а на проба от 5-дневна култура от СНО pDSVL-gHuEPO съдържа 18,2 U/ml човешки ЕРО измерени по R1A.

Продуцираното от описаните клетъчни щамове количество ЕРО може да бъде повишено чрез генно умножаване, даващо нови клетъчни щамове с по-голяма продуктивност. Ензимът дехидрофолат редуктаза (DHFR), продукт, за който кодира DHFR гена, може да бъде инхибиран от лекарството метотрексат (МТХ). По-специално, клетки, размножавани в среди, в които липсват хипоксантин и тимидин, се инхибират или убиват от МТХ. При подходящи условия (например минимална концентрация на МТХ) може да бъдат получавани клетки, резистентни на МТХ и пригодни да растат в присъствие на МТХ. Установено е, че тези клетки са резистентни на МТХ поради увеличаване на брой на техните DHFR гени, което се отразява в повишена продукция на DHFR ензима. Преживелите клетки могат след това да бъдат обработвани с повишаващи се концентрации на МТХ, като в резултат се получават клетъчни щамове, съдържащи по-голям брой DHFR гени. „Пасажерни гени“ (например ЕРО), попаднали на експресионния вектор заедно с DHFR гена или трансформирани с DHFR гена също са увеличили броя на гениите си копия, както е установено.

Като пример за приложение на тази умножаваща система, клетъчен щам СМО pDSVL-MkE се подлага на увеличаващи се концентрации на МТХ (0 nmol, 30 nmol и 100 nmol). Представителни проби от 65-часова хранителна среда от всеки етап на умножаване са изследвани чрез RIA и е определено, че съдържат съответно 0,60; 2,45 и

6,10 U/ml ЕРО. Клетъчен шам СНО pDSVL-gHuEPO се подлага на серия обработки с повишаващи се МТХ кон30 центрации от съответно 30 nmol, 50 nmol, 100 nmol, 200 nmol, lgmol и 5 gmol MTX. Представителна проба от хранителна среда на 3-дневна култу- ; ра от етапа със 100 nmol МТХ съдържа човешки ЕРО 3098 ± 129 V/ml, както е преценено чрез RIA. Представителни проби от 48-часова хранителна среда от етапите 100 nmol и 1 gmol МТХ съдържат съответно човешки 1 ЕРО от 466 и 1352 U/ml, както е преценено чрез R1A (резултатът е усреднения от трикратно изследване). При тези процеси 1 х 10⁶ клетки се разстилат в 5 мл от средата в 60 мм блюда. 1 24 ч по-късно средите се отстраняват и се заместват с 5 ml свободна от серум среда (високоглюкозна DMEM, допълнена с 0,1 mmol неесенциални аминокиселини и L-глутамин). Изчак- 2 ва се акумулирането на ЕРО в продължение на 48 ч в среда без серум. Средите се събират за изследване RIA и клетките се трипсинизират и изброяват. Средните R1A стойности от 467 2 U/ml и от 1352 U/ml за клетки, култивирани при 100 nmol и lgmol МТХ съответно, осигуряват действителни добиви от 2335 u/блюдо и 6750 и/ блюдо. Средният брой клетки на блю- 3 до съответно е 1,94 х 10⁶ и 3,12 х 10⁶. Ефективните норми на продукция при тези условия за култура са съответно 1264 и 2167 и/10⁶кл/48 ч.

Клетките в описаните култури са 3 генетично хетерогенни популации. За изолиране на генетично хетерогенни клонове с най-висок продукционен капацитет се използват стандартни методи на скрининг. Това е описано в 4 глава А, част 2, „Основни моменти в характеристиките на клетъчни линии, използвани за биологични продукти“ (1984), Бюро за биологични изследвания, Център за лекарства и биологич- 4 ни средства, US, Администрация за храни и лекарства.

Продуктивността на СНО клетъчни линии, продуциращи ЕРО, описана по-горе, може да бъде подобрена чрез подходящи методи с клетъчни култури. Размножаването на клетки от бозайници в култура изисква обикновено присъствието на серум в хранителните среди. Един метод за продуциране на еритропоетин от СНО клет0 ки в среди, които не съдържат серум, улеснява силно пречистването на еритропоетина от културалната среда. Методът, описан по-долу, се отнася до икономично продуциране на големи 5 количества еритропоетин достатъчен за производство в среди, които не съдържат серум.

Щам СНО pDSVL-gHK ЕРО клетки, култивирани при стандартни0 те условия за клетъчни култури се използват за размножаване в облодънни колби за развитие на клетъчни култури. Клетките се размножават като суспендирани клетъчни линии в облодън5 ни колби в среди, съдържащи смес от високоглюкозен DMEM и F12 на Ham, съдържащ 5% серум от телешки ембриот в съотношение 50:50 L-глутамин, пеницилин и стрептомицин, 0,05 mmol 0 неесенциални аминокиселини и подходяща концентрация на метотрексат. Суспензионната клетъчна култура позволява СНО-клетките, продуциращи ЕРО, да бъдат увеличени до големи 5 обеми. СНО-клетки, култивирани в суспензия, се използват за посявки в облодънни колби при изходна плътност на посяване от 1,5 х 10⁷ жизнеспособни клетки за облодънна колба от 850 0 ml в 200 ml среда. Клетките се култивират до сливане като полепена клетъчна линия в тридневен период. Използваните в тази фаза на култивиране следи са същите като използ5 ваните за култивиране в суспензия. В края на тридневния период на култивиране съдържащите серум среди се отстраняват и се заместват със 100 ml свободни от серум среди; допълнени със смес от високоглюкозна DMEM и F12 на Ham в съотношение 50:50, допълнени с 0,05 mmol неесенциални аминокиселини и L-глутамин. Облодънните колби се връщат в инкубатора за период от 1 до 3 ч, след което средата отново се отстранява и се замества със 100 ml прясна свободна от серум среда. Инкубирането в продължение на 1 до 3 ч на свободните от серум среди понижава концентрацията на онечистващите серумни протеини. Облодънните колби се връщат в инкубатора за седем дни, през които в свободните от серум среди се натрупва еритропоетин. В края на седемдневната фаза на продуциране кондиционираната среда се отстранява и се подменя с прясна свободна от серум среда за втори продукционен цикъл. Пример за ефекта на тази продукционна система е представителна проба от седемдневна среда без серум, съдържа човешки еритропоетин в количество 3892+409 U/ml, преценено чрез RIA. Въз основа на определена кретъчна гъстота от 0,9 до 1,8 х 10⁵клетки/см³ и това, че всяка колба от 850 см³ съдържа от 0,75 до 1,5 х 10⁸клетки, скоростта на продукция на ЕРО в 7 дневна 100 мл култура е 750 до 1450 U/10⁶ клетки/48 часа.

Културални течности от клетъчен щам СМО pDSVL-MkEPO, получени в 10 nmol МТХ се подлагат на RIA ин витро и ин виво анализи за ЕРО активност. Кондиционираните проби от средите съдържат 41,2 ± 1,4 U/ml МкЕРО, определено чрез RIA; 41,2 ± 0,064 U/ml, измерено чрез ин витро анализ за биологическа активност и

42,5 ± 5 U/ml, измерено чрез биологическа активност ин виво. Аминокиселинното секвениране на полипептидни продукти показва наличност на

ЕРО продукти, обикновено то вида, имащ три остатъка на водещата последователност. съседни на предполагаемия аминокраен аланин. Дали това е резултат от неправилно мембранно отделяне на полипептида в СНО клетки или отразява разлика в структурата на аминокрая на маймунски ЕРО, сравнен с човешки ЕРО е за сега неизвестно.

Културални течности от клетъчен щам СНО pDSVL-gHuEPO са подложени на трите описани изследвания. Проба от 5,5-дневна течност съдържа рекомбинантен човешки ЕРО в средата в количество от 18,2 U/ ml съгласно RIA анализа, 15,8 ± 4,6 U/ml съгласно изследване ин витро и 16,8 ± 3,0 U/ml, установени при изследването ин виво.

Културална течност от СНО pDSVL-gHuEPO клетки, умножени в описаната фаза с прибавяне на 100 nmol МТХ, е подложена на същите три анализа. Тридневна проба от нея съдържа рекомбинантен човешки ЕРО в количество 3089 ± 129 U/ml съгласно RIA, 2589 ± 71,5U/ml установено при изследване ин витро и 2040 ± 160 U/ ml при изследване ин виво. Аминокиселинното секвениране на получените продукти показва един аминокрай, отговарящ на посочения на фиг. 6.

Кондиционирани хранителни среди от СНО клетки, трансфектирани с плазмид pDSVL-MkEPO в 10 nmol МТХ, се събират на едно място и МТХ се диализира в течение на няколко дни, в резултат на което се получават среди с ЕРО активност от 221 ±5,0 U/ml (ЕРО-ССМ). За определяне на ин виво ефекта на ЕРО-ССМ върху хематокретните нива на нормални Bam/С мишки, се провежда следният екперимент. Кондиционирани клетъчни среди от нетрансфектирани СНО клетки (ССМ) и ЕРО-ССМ се калиб32 рират с PBS (буфериран с фосфат физиологичен разтвор). ССМ са използвани при контролната група (3 мишки), а две дозировки на ЕРО-ССМ - 4 единици на инжекция и 44 единици на инжекция - при екперименталните групи (2 мишки/група). В течение на 5 седмици седемте мишки се инжектират интраперитонеално 3 пъти в седмицата. След осмото инжектиране се определят средните хематокритни стойности, които за контролната група са 50,4%, за групата на 4U 55,1% и за групата на 44 Ό - 67,9%.

Експресионни продукти от клетки на бозайници могат лесно да бъдат възобновени в по същество чиста форма от хранителните среди чрез HPLC(C₄) с етанолов градиент за предпочитане при pH 7.

Прави се предварителен опит за характеризиране на рекомбинантните глюкопротеинови продукти от кондиционирана среда от експресия на човешки ЕРО ген в COS-1 и СНО клетки, като се сравнява с ЕРО изолат от човешка урина, чрез Western blot анализ и SDS-PAGE. Тези проучвания показват, че продуцираният от СНО ЕРО материал има малко повисоко молекулно тегло от COS-1 експресионният продукт, който на свой ред е малко по-голям от използвания за сравнение сборен екстракт от човешка урина. Всички продукти са донякъде хетерогенни. Третирането с невроамидазен ензим за отстраняване на сиалова киселина води до получаването на COS-1 и СНО рекомбинантни продукти с приблизително еднакво молекулно тегло, които са и двата по-големи от резултатния асиално човешки уринен екстракт. Ензимът ендоглюкозидаза F (ЕС 3.2.1) се използва за третиране на рекомбинантен СНО продукт и на екстракта от урина (до цялостно отстраняване на въглехидратите от двата), в резултат на което се получават по същество хомогенни продукти, които са на практика с идентично молекулно тегло.

Пречистен човешки уринен ЕРО и рекомбинантен, продуциран от СНО клетки, ЕРО съгласно изобретението се подлагат на въглехидратен анализ по метода на Ledeen et al., Methods in Enzymology, 83 (част Д), 139-191 (1982), който е модифициран чрез използването на метода за хидролиза на Nesser et al., Anal. Biochem., 142, 5867 (1984). Експериментално определените количества въглехидрати в състава (изразени като моларни количества въглехидрати в продукта) за изолат от урина са както следва: хексози 1,73, М-ацетилглюкозамин-1, N-ацетилневраминова киселина - 0,93, фукоза -0 и N-ацетилгалактозамин-О. Съответните стойности за рекомбинантния продукт (получен от СНО pDSVL-gHuEPO от 3-дневна културална среда, съдържаща МТХ) са както следва: хексоза - 15,09, N-ацетилглюкозамин-1, N-ацетилневраминова киселина-0, фукоза-0 и N-ацетилгалактозамин-О. Тези резултати отговарят на тези, получени с Western blot и SDSPAGE анализите, описани по-горе.

Глюкопротеините, получени съгласно настоящото изобретение, са продукти с първична структурна конформация, достатъчно съответстваща на тази на природния еритропоетин, за да се позволи проявяването на едно или повече от биологичните свойства на същия и среден въглехидратен състав, който се различава от този на естествения еритропоетин.

Пример 11

Настоящият пример се отнася до общото получаване чрез съединяване на нуклеотидни бази на два структурни гена, кодиращи за човешката ЕРО последователност от фиг. 6 и включващи съответно „предпочитани“ кодони за експресия в Е. coli и дрождеви (S.cerevisiae) клетки. Описано е също получаването на гени, кодиращи за аналози на човешки ЕРО. Казано накратко, използваният метод е същият като описаният в по-рано посоченото изложение на Alton et al., (WO83/ 04053). Гените са предназначени за начално съединяване на олигонуклеотиди в съставни дуплекси, които от своя страна се съединяват в три отделни части. Тези части са предназначени за умножаване и при отстраняване от системата за умножаване могат да се съединят последователно или чрез многократно лигиране на фрагменти в подходящ експресионен вектор.

Фигури 10 до 15 и 7 показват строежа и свързването на получения ген, кодиращ за човешки ЕРО транслационен продукт, който не съдържа каквато и да е водеща секвенция, но включва един начален метионинов остатък в позиция -1. Освен това, генът включва съществена част от Е. coli предпочитани кодони и затова конструкцията му се означава като „ЕСЕРО“ ген.

По-специално, фиг. 10 показва олигонуклеотиди, използвани за получаване на Секция 1 на ЕСЕРО гена, кодираща аминокрайни остатъци на човешки полипептиди. Олигонуклеотидите са свързани в дуплекси (1 и 2, 3 и 4 и т. н.), които след това се лигират за получаване ЕСЕРО секция 1, показана на фиг. 11. Трябва да се отбележи, че получената секция включва съответните EcoRI и BamHI лепливи краища, като под EcoRI лепливия край има един разпознавателен сайт за Xbal рестрикционен ензим, а над BamHI лепливия край има ΚρηΙ разпознавателен сайт. Секция 1 би могла лесно да бъде умножена, прилагайки М13 фаговия вектор, използ ван за потвърждаване на последователността на секцията. Отчитат се известни трудности при изолирането на секцията като Xbal/Kpnl фрагмент от RFAHK, образувана в E.coli, поради метилиране на базите, образуващи ΚρηΙ сайта в гостоприемника. Поради това се изолира едноверижна фагова ДНК и се превръща в двуверижна форма ин витро чрез праймерна екстензия, като след това желаният двуверижен фрагмент се изолира лесно.

Секции 2 и 3 на ЕСЕРО ген (фиг. 13 и 15) се конструират по подобен начин от олигонуклеотидите, показани съответно на фиг. 12 и 14. Всяка секция се уголемява в М13 вектора, използван за потвърждаване на последователността и се изолира от фагова ДНК. Както се вижда от фиг. 13, ЕСЕРО Секция 2 се получава с EcoRI и BamHI лепливи краища и може да бъде изолирана като KpnI/Bglll фрагмент. Подобно на нея, ЕСЕРО Секция 3 се получава с BamHI и Sall лепливи краища и може да бъде изолирана от фаговата RFДHK като Bglll/Sall фрагмент. Така получените три секции могат лесно да бъдат съединени в непрекъсната ДНК последователност (фиг.

7), кодираща целия полипептид на човешкия ЕРО с един аминокраен метионинов кодон (ATG) за иницииране на Е. coli транслация. Трябва също да се отбележи, че над началния ATG има една серия от базови двойки по същество повтаряща последователността на рибозомния свързващ сайт на високо експресионния OMPf ген на Е. coli.

Всеки подходящ експресионен вектор може да бъде използван да носи ЕСЕРО. Конкретният вектор, избран за експресия на ЕСЕРО гена е „температурно чувствителният“ плазмид pCFM536 - производен на плазмид pCFM414 (АТСС 40076), описан във включената тук заявка за патент US

636 727, подаден на 6.08.84 (публикувана ЕР заявка 136 480) от Charles F. Morris.

По-точно, pCFM536 се смила с Xbal и Hindlll; големият фрагмент се изолира и използва при двуетапно лигиране с ЕСЕРО гена. Секции 1 (Xbal/ Kpnl), 2 (Kpnl/BglH) и 3 (Bglll/Sall) са съединени предварително в правилен порядък в MI3 и ЕРО генът се изолира от тях като единичен Xbal/ Hindlll фрагмент. Този фрагмент включва една част от полилинкера от М13тр9 фаг, обхващащ Sall до Hindlll сайтове. Контролът на експресията в резултантния експресионен плазмид, р536, се осъществява посредством един XP_L промотер, който самият да бъде под контрола на C_lg37 репресорният ген (такъв какъвто е в Е. coli щам К 1 2AHtrp).

Полученият ЕСЕРО ген може да 5 бъде различно модифициран, за да кодира аналози на еритропоетина като [Asn², des-Pro² до lie⁶] hEPO и [His7]hEPO, както е описано по-долу.

A [Asn², des-Pro² до lie⁶] hEPO

Плазмид 536, носещ получения 10 ЕСЕРО ген от фиг. 7 като Xbal до Hindlll включване, се смила с Hindlll и Xhol. Последната ендонуклеаза срязва ЕСЕРО гена при единствения разпознаващ сайт от 6 двойки бази, 15 простиращ се от последната база на кодона, кодиращ Asp⁸ до втората база на Arg¹⁰ кодона. Получава се една Xbal/Xhol линкер секвенция със следната последователност:

Xbal	+ 1	2	7	8	9
	Met	Ala	Asn	Cys	Asp	Xhol
5-CTAG	ATG	GCT	AAT	TGC	GAC-3'
3'	-TAC	CGA	TTA	ACG	CTG	AGCT-5'

Линкерът Xbal/Xhol и последователността на Xhol/Hindlll фрагмента на ЕСЕРО гена се включват в големия фрагмент, получен от Xbal и Hindlll смилане на плазмид pCFM526, производен на плазмид pCFM414 (АТСС 40076), получен съгласно метода на Charles F. Morris вече описан за получаване на породена от плаз мид ДНК последователност, кодираща Е. coli експресията на Met’¹ формата на желания аналог.

В. [His⁷]hEPO

Плазмид 536 се смила с Hindlll и Xhol както в част А по-горе. Получава се линкер Xbal/Xhol със следната последователност:

Xbal +1 23 4567 8 9 Xhol

	Met	Ala	Pro	Pro	Arg	Leu	lie	His	Asp
5’-CTAG	ATG	GCT	CCG	CCA	CGT	CTG	ATC	CAT	GAC-3'
3'	-TAC	CGA	GGC	GGT	GCA	GAC	TAG	GTA	CTG AGCT-5'

Линкерът и Xhol/Hindlll фрагмен- включват в pCFM526 за получаване та от ЕСЕРО последователността се на породена от плазмид ДНК последователност, кодираща Е. coli експресията на Met'¹ формата на желания аналог.

Конструкцията на получения ген („SCEPO“), включващ кодони, предпочитащи дрожди, е както е описана в следващите фиг. 16 до 21 и 8. Както и в случая с ЕСЕРО гена, цялостната конструкция включва образуването на три групи олигонуклеотиди (фиг. 16, и 20), които са свързани в дуплекси и са съединени в секции (фиг. 17, и 21). Трябва да се отбележи, че синтезата се улеснява отчасти чрез използването на същите подоптимални кодони както в SCEPO, така и в ЕСЕРО конструкциите, например олигонуклеотиди 7-12 от секция 1 на двата гена са идентични, както са и олигонуклеотидите 1-6 от секция 2 във всеки ген.

Съединените SCEPO секции се секвенират в М13 и секции 1, 2 и 3 се изолират от фага като фрагменти Hindlll/Kpnl, KpnI/BgLII и BglH/Sall.

Сега предпочитаната експресионна система за SCEPO гении продукти е една секреционна система на база на секретирания от S. cerevisiae осфактор, както е описано в US 487 753, подадена на 22.08.83 от Grant A. Bitter, публикувана на 11.10.84 като заявка за ЕР 0 123 294. Казано накратко, системата включва конструкции, при които ДНК, кодираща водещата последователност на дрождевия а-фактор ген е разположен непосредствено 5’ до кодиращия участък на екзогенния ген, който трябва да бъде изразен. Като резултат, транслираният генен продукт включва една водеща или сигнална последователност, която е „обработена“ чрез един ендогенен дрождев ензим в хода на секретирането на остатъка от продукта. Тъй като конструкцията използва кодона за иницииране транслирането на α-фактора (ATG), то няма нужда да се осигурява такъв кодон на позиция -I на SCEPO гена. Както може да се забележи от фиг. 8, кодиращата аланин (+1) последователност се предхожда от линкерна последователност, позволяваща директна инсерция в един плазмид, включващ ДНК за първите 80 остатъка от водещия фактор след а-фактор промотер. Предпочитаната конструкция за експресия на SCEPO гена включва четирикратно лигиране. включваща описаните по-горе SCEPO секционни фрагменти и големия фрагмент от Hindlll/Sall смилането на плазмид раСЗ. От получения плазмид раСЗ/SCEPO а-факторните промотер и водеща последователност и SCEPO ген се изолират чрез смилане с BamHI и лигират в смления с BamHI плазмид рУЕ за образуване на експресионния плазмид рУЕ/SCEPO.

Пример 12

Настоящият пример се отнася до експресия на рекомбинантни продукти на получените ЕСЕРО и SCEPO гени в експресионната система от пример 11.

При използването на експресионна система, изискваща Е. coli клетки гостоприемници, плазмидът р536 от пример 11 се трансформира в АМ7 Е. coli клетки, предварително трансформирани с подходящ плазмид, pMWl, носещ C_lgJ7 ген. Клетъчни култури в LB бульон (ампицилин 50 pg/ml и канамицин 5 pg/ml, за предпочитане с 10 mmol магнезиев сулфат), се култивират при 28°С и при растеж на клетки в културата до оптическа плътност O.D._60n=0,l, се индуцира ЕРО експресия чрез повишаване на температурата до 42°С. Клетките, култивирани до около 40 O.D. осигуряват продукция на ЕРО (както е определено с гел) от около 5 мг/OD литър.

Клетките се събират, лизират, раз рушават с French Press (10 000 psi=naунда на квадратен инч) и се обработват с лизозим и NP-40 детергент. Утайката, получена при центрофугиране при 24 000 xg се разтваря в гванидинова солна киселина и се подлага на следващо пречистване едноетапно посредством С₄ (vydac) обратнофазова HPLC (EtOH) 0-80%, 50 mmol NH₄Ac, pH 4,5). Секвенирането на протеина показва, че продуктът е повече от 95% чист и получените продукти имат два различни аминокрая, A-P-P-R... и P-P-R... в относително количествено съотношение от около 3:1. Това последно наблюдение на hEPO и [des Ala'JhEPO продукти показва, че „обработката“ на аминокрая в клетките гостоприемници служи за отстраняване на крайния метионин и в някои случаи на началния аланин. Установената при радиоимунно изследване активност на изолатите е от 150 000 до 160 000 U/mg; при ин витро изследване активността е от 30 000 до 62 000 U/mg; а при ин виво изследване активността е в границите от около 120 до 720 U/mg. (За сравнение при всяко изследване служи стандартната активност на изолат от човешка урина - 70 000 U/mg.) Кривата за реакция на доза за рекомбинантния продукт при изследване ин виво се различава забележимо от тази на стандартния ЕРО от човешка урина.

Плазмиди на ЕРО аналози, получени в части А и В на пример 11 се трансформират в pMWl - трансформирани АМ7 Е. coli клетки и клетките се култивират както е описано. Пречистените изолати се изпитват, както чрез RIA, така и чрез изследване ин витро. Получените при R1A и ин витро изследвания стойности за [Asn², des Pro² до lie⁶] hEPO експресионни продукти са съответно приблизително 11 000 U/mg и 6 000 U/mg протеин, докато получените стойности при изследване на [His⁷] hEPO са съответно около 41 000 U /mg и 14 000 U/mg протеин, което показва, че аналозите имат активност от една четвърт до една десета от тази на родителския експресионен продукт.

Еспресионната система, предназначена за използване в S. cerevisiae клетки гостоприемници, плазмидът рУЕ/ SCEPO се трансформира в два различни щама. YSDP4 (генотип арер4-3 trpl) и RK81 (генотип aapep4-3trpl). Трансформирани YSDP4 гостоприемници се култивират в SD среда (Methods in Yeast Genetics Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., стр. 62 (1983), съдържаща казаминокиселини 0,5% с pH 6,5 при 30°С. Среди, събрани когато клетките са култивирани до 36 O.D. съдържат ЕРО продукти в количества от около 244 U/ml (97 gg/ODI по RIA). Трансформирани RK81 клетки, култивирани до 6,5 O.D. или 60 O.D., дават среди с ЕРО концентрации от около 80-90 U/ml (34pg/ODl по RIA). Предварителните анализи показват значителна хетерогенност на продукти, продуцирани чрез експресионната система, което вероятно се дължи на вариации в гликозирането на експресионните протеини и сравнително високото съдържание на маноза в свързания въглехидрат.

Плазмиди РаСЗ и рУЕ в НВ101 Е. coli клетки са депозирани на 27.09.84, в Американската колекция от типове култури, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md, под номера съответно АТСС 39881 и АТСС 39882. Плазмидите pCFM526 в АМ7 клетки, pCFM 536 в JM103 клетки и pMWl в JM103 клетки са също депозирани на 21.11.84, под номера АТСС съответно 33932, 33934 и 33933. Щамове Saccharomyces cerevisiae YSPD4 и RK81 са депо37 зирани на 21.11.84 под номера съответно АТСС 20734 и 20733.

Както става ясно при разглеждане на описаните примери, настоящото изобретение осигурява голям брой извънредно ценни продукти и процеси, които намират приложения в много различни направления.

Полипептидите съгласно изобретението са очевидно полезни материали, независимо дали са получени чрез микробна експресия или са синтетични продукти, като първичната, вторичната и третичната им структурна конформация е изяснена за пръв път в настоящото изобретение.

Както е посочено, получените рекомбинантни и синтетични продукти съгласно изобретението проявяват в различна степен биологичната активност ин витро на ЕРО изолати от естествени източници и следователно могат да бъдат използвани като заместители на ЕРО изолати в хранителни среди, използвани за култивиране на еритропоетинови клетки. По същия начин, като се има предвид степента, до която полипептидните продукти съгласно изобретението споделят ин виво активността на естествените ЕРО изолати, те очевидно са подходящи за използване при терапия с еритропоетин на бозайници, включително и хора, тъй като проявяват някои или всички ефекти, характерни ин виво за ЕРО, например стимулиране на отговор с ретикулоцити, развиване на ферокинетични ефекти (като ефекти на оборот на желязото и ефекти за време на преминаване през костния мозък), промени в масата на еритроцитите, стимулиране на синтеза на хемоглобин С (виж Eschbach et al. по-горе) и както се посочва в пример 10, повишаване на равнището на хематокритната стойност при бозайниците. Включени в групата на хората, които могат да бъдат лекувани с продуктите съгласно изобретението, са общо пациенти, нуждаещи се ότ кръвна трансфузия, включително пациенти с травми,такива, подложени на хирургически интервенции, бъбречно болни, включително и такива на диализа, и пациенти с различни заболявания, влияещи върху състава на кръвта, като хемофилия, сърповидноклетъчна анемия, физиологична анемия и други подобни. Свеждането до минимум на необходимостта от трансфузия чрез прилагане на терапия с ЕРО може да се очаква да води и до понижено пренасяне на инфекциозни агенти. Продуктите съгласно изобретението, благодарение на това, че са получени чрез рекомбинантни методи, се очаква да бъдат свободни от пирогени, естествени инхибиращи вещества и други подобни и поради това да проявяват повишена обща ефикасност при използването им в терапевтични методи в сравнение с естествено получаваните продукти. Еритропоетинова терапия с продукти, получени съгласно настоящото изобретение, се очаква също да води до повишаване капацитета за пренасяне на кислород при индивиди с установени хипоксични състояния, дължащи се на специфични условия на околната среда и може би до проява на благоприятни сърдечно съдови ефекти.

Един предпочитан метод за прилагане на полипептидните продукти съгласно изобретението е парентерално (например интравенозно, интрамускулно, подкожно или интраперитонеално) като прилаганите състави обикновено включват терапевтично ефективни количества от продукта в комбинация с приемливи разредители, носители и/или добавки. Предварителни фармакокинетични проучвания показват по-дълъг период на полуживот ин виво на маймунски ЕРО про дукти при интрамускулно, отколкото при интравенозно приложение. Очаква се ефикасните дози да варират значително в зависимост от лекуваните заболявания, но терапевтичните дози са определени, като се очаква за сега активното вещество да бъде от 0,1 (около 7U) до 100 (около 7000 U) μg/ kg телесно тегло. За фармацевтични съставки съгласно изобретението се използват стандартни разредители като човешки серум олбумин, както и стандартни носители като физиологичен разтвор.

Помощните материали, подходящи за използване в съставите съгласно изобретението включват съединения, за които е известно, че проявяват стимулиращ ефект върху еритропоезата като тестостерони, стимулатори на прогениторни клетки, подобни на инсулина растежни фактори, простагландини, серотонин, циклична ЯМР, пролактин и трийодотизонин, както и средства, обикновено използвани при лечение на апластични анемии, като метенолен, станозолол и нандролон (виж например Resegotti et al., Panminerva Medica, 23, 243-248 (1981); McGonigle etal., Kidney Int., 25(2), 437444 (1984); Pavlovic-Kantera etal., Expt. Hematol., 8 Supp, 8), 283-291 (1980) и Kurtz, FEBS Letters, 14a (1), 105-108 (1982). Също подходящи добавки са веществата, известни като повишаващи ефекта или синергисти на еритропоетина или асиало-ЕРО, като адренергични агонисти, тироиден хормон, андрогени и ВРА [виж Dunn „Gurrent Concepts in Erythropoiesis“, John Wiley and Sons (Chichester, England, 1983); Weiland et al., Blut, 44(3), 173-175 (1982); Kalmanti, Kidney Int., 22, 383391 (1982); Shahidi, New. Eng. J. Med., 289, 72-80 (1973); Fisher et al., Steroids, 30 (6), 833-845 (1977); Urabe et al., J. Exp. Med. 149, 1314-1325 (1979) и Billat et al., Expt. Hematol., 10 (1), 133-140 (1982)], както и групата съединения, означавани като „чернодробни еритропоетични фактори“ виж Naughton et al., Acta Haemat., 69, 171179 (1983)] и „еритротропини“ [както са описани от Congote et al., в реферат 364, Proceedings 7th Internat. Congres of Endocrinology (Quebec, 1984); Cingote, Biochem. Biophys. Res. Comm, 115 (2), 447-483 (1983) и Congote, Anal. Biochem., 140, 428-433 (1984)] и еритрогенин [както са описани от Rothman et al., J. Surg. Oncol. 20, 105108 (1982)]. При скрининиг за определяне на еритропоетиновите реакции на ексхипоксични полицитемични мишки, предварително третирани с 5α-дихидротестостерон или нандролон и след това с еритропоетин съгласно изобретението се получават еднакви резул-тати.

Полипептидите съгласно изобретението намират широко приложение в диагностиката, което включва използването им като маркирани и немаркирани форми в различни имуноизследователски методи, включително RIA, ELISA и други подобни, както и различни изследвания за активност ин витро и ин виво. Виж например Dunn et al., Expt. Hematol., 11(7), 590-600 (1983); Gibson et al., Pathology 16, 155156 (1984); Krystal, Expt. Hematol. 11(7), 649-660 (1983); Saito et al., Jap. J. Med. 23 (1) 16-21 (1984); Nathan et al., New Engl. J. Med., 308(9), 520-522 (1983) и различни източници, отнасящи се до изследвания в тази област.

Полипептидите съгласно изобретението, включително синтетичните пептиди, представляващи последователности от остатъци на ЕРО, за първи път описани тук, представляват също много полезни чисти материали за получаване на поликлонални антитела и банки от моноклонални антитела, специфични за различни непрекъснати и прекъснати епитопи на ЕРО. Като пример може да се посочи, че при предварителен анализ на аминокиселинните последователности от фиг. 6 при хидропатия според Норе et al., P.N.A.S. (US) 78, стр. 3824-3828 (1981) и на вторични структури според Chou et al., Ann. Rev. Biochem. 47, стр. 251. (1979) е установено, че синтетичните пептиди с непрекъснати последователности, обхващащи остатъци от позиции от 41 до 57, включително от 116 до 128 и от 144 до 166, провокират силни антигенни реакции и продуцират полезни моноклонални и поликлонални антитела, проявяващи имунни реакции както със синтетичните полипептиди, така и с целия протеин. Очаква се такива антитела да са полезни за откриване и афинитетно пречистване на ЕРО и на свързани с него продукти.

Получени са следните три синтетични пептида:

(1) hEPO 41-57, V-P-D-T-K-V-N-FY-A-W-K-R-M-E-V-G;

(2) hEPO 116-128, K-E-A-I-S-P-P-DA-A-S-A-A;

(3) hEPO 144-166, V-Y-S-N-F-L-R-GK-L-K-L-Y-T-G-E-A-C-R-T-G-D-R.

Подготвителните изследвания за имунизации с описаните полипептиди показват сравнително слаба положителна реакция към hEPO 41-57, незначителна реакция към hEPO 116128 и силно положителна реакция към hEPO 144-166, отчитани според способността на зайчи серумни антитела да имунорециптират ^|251-белязани човешки ЕРО изолати от урина. Предварителните проучвания ин виво не показват значителна активност на трите пептида, както самостоятелно, така и в комбинация.

Въпреки че определените последователности от аминокиселинни оста тъци на ЕРО бозайници, получен в примерите, са по същество еднакви с първичната структурна конформация на зрелия ЕРО, все пак трябва да се отбележи, че последователността от 165 аминокиселинни остатъка на маймунски ЕРО от таблица V и от 166 остатъка на човешки ЕРО от фиг. 6, не изчерпват групата на полезните полипептиди, получавани съгласно изобретението. Включени в обхвата на изобретението са и всички различни природни алелни форми на ЕРО, за които предишни изследвания за биологично активни животински полипептиди, като човешки γ-интерферон, са установили, че е вероятно да съществуват. За сравнение могат да се посочат човешки имунни интерферони, които имат аргининов остатък в позиция 140 съгласно ЕР 0 077 670 и тези видове, които имат глутамин в позиции 140 според Gray et al., Nature 295, стр. 503508 (1982). И двата вида са характеризирани като имащи последователности на зрял човешки γ-интерферон. Алелните форми на зрелите ЕРО полипептиди може да се различават един от друг, както и от последователностите, показани на фиг. 5 и 6, по отношение на дължина на последователността и/или по направените делеции, замествания, инсерции или прибавяния на аминокиселини в последователността, с последващи потенциални различия в способността за гликолизиране. Както е посочено по-рано, една предполагаема алелна форма на човешки ЕРО включва един метионинов остатък в позиция 126. Приема се. че съществуват и природни алелни форми, кодиращи ЕРО геномни ДНК и сДНК последователности, които кодират за споменатите типове алелни полипептиди или просто използват различни кодони за означаване на същите полипептиди.

Допълнително освен природните алелни форми на зрелия ЕРО, настоящото изобретение включва и други ЕРО продукти като например полипептидни аналози на ЕРО и фрагменти от зрял ЕРО. Съгласно метода по описаната заявка на Alton et al., (WO 83/04053) могат лесно да бъдат проектирани и получени гени, кодиращи за микробиалната експресия на полипептиди с първична конформация, която се различава от тази, описана на зрял ЕРО по отношение на идентичност или разположение на един или повече остатъка поради замествания, крайни и междинни допълвания и делеции. Обратно на тях промените в сДНК и геномни ЕРО гени могат лесно да бъдат идвършвани чрез известните методи на насочена към сайт мутагенеза и да бъдат използвани за създаване на аналози и производни на ЕРО. Такива ЕРО продукти проявяват поне едно от биологичните свойства на ЕРО, като другите може да се различават. Като пример за това, получените съгласно изобретението ЕРО продукти включват такива, които са предварително скъсени чрез делеции например [8 Asn², des -Pro² до lie⁶] hEPO, [des -Thr¹⁶³ до Arg¹⁶⁶]hEPO и „Δ27-55Ι1ΕΡΟ“, като последният има остатъци, кодиращият за които изцяло е отстранен кодон, или такива, които са по-стабилни на хидролиза (и поради това може да имат по-изразени или по-дълготрайни ефекти, отколкото природните ЕРО); или такива, които са променени за делеция на едно или повече потенциални места за гликолизиране (което може да има като резултат по-висока активност при продуцирани от дрожди продукти); или такива, които в един или повече цистеинови остатъци са отстранени или заместени например с хистидинови или серинови остатъци (като напри мер аналогът [His⁷]hEPO) и са потенциално по-лесни за изолиране в активна форма от микробиални системи; или такива, в които един или повече тирозинови остатъка са заместени с фенилаланин (като аналозите [Phe¹⁵] hEPO, [Phe⁴⁹]hEPO и [Phe^l45]hEPO и могат да се свързват повече или помалко лесно към ЕРО рецептори върху клетки мишени. Също включени са полипептидни фрагменти, повтарящи само една част от непрекъснатата аминокиселинна последователност или вторичните конформации в зрелия ЕРО, които фрагменти може да проявяват един аспект от активността на ЕРО (например рецепторно свързване), а другите - не (например еритропоетинова активност). Особено важни в това отношение са тези потенциални фрагменти на ЕРО, които са включени в човешката геномна ДНК последователност от таблица VI, т. е. „фрагменти“ от цялата непрекъсната ЕРО последователност, които са кодирани от интронни последователности и които може да съставляват определени домени на биологичната активност. Заслужава да се отбележи, че липсата на ин виво активност при един или повече от ЕРО продуктите съгласно изобретението не изключва напълно терапевтичното им приложение (виж Weiland et al., по-горе) или използването им в други области като например при ЕРО-анализи или ЕРО антагонизъм. Антагонистите на еритропоетина може да са доста полезни при лечението на полицистемии или на случаи на свръхпродукция на ЕРО [виж например Adamson, Hosp. Practice, 18(12), 49-57 (1983) и Hellmann et al., Clin. Lab. Haemat., 5, 335-342 (1983).

Според една друга страна на настоящото изобретение, клонираните ДНК последователности, описани тук, които кодират човешки и маймунски ЕРО полипептиди са много ценни заради информацията за аминокиселинната последователност на животински еритропоетин, която осигуряват, тъй като тя досега липсваше независимо от множеството аналитични изследвания на изолати от природни продукти. ДНК последователностите са също ценни като продукти и могат да се използват при осъществяването на едромащабна микробиална синтеза на еритропоетин по различни рекомбинантни методи. Казано по друг начин, ДНК последователностите съгласно изобретението се използват за получаване на нови и полезни вирусни и кръгови плазмидни ДНК вектори, нови и полезни трансформирани и трансфектирани микробни прокариотни и еукариотни клетки гостоприемници (включително бактерийни и дрождеви клетки и бозайникови клетки, отгледани в култура) и нови и полезни методи за култивиране на такива микробни клетки гостоприемници с възможност за експресия на ЕРО и ЕРО продукти. ДНК последователностите съгласно изобретението са подходящи за използване като маркирани индикатори при изолирането на сДНК, кодиращи ЕРО и сродни протеини и геномна ДНК последователност на други видове бозайници, различни от човек и маймуна, специално описани тук. Доколко ДНК последователностите съгласно изобретението могат да се използват при различни други методи за синтез на протеин (например клетки от насекоми) или при генетична терапия на хора и други бозайници, още не може да бъде преценено. ДНК последователностите съгласно изобретението могат да бъдат използвани при разработването на трансгенетични видове бозайници, които да служат като еукариотни гостоприемници при получаването на еритропоетин и еритропоетинови продукти в достатъчно количество. Виж общо Palmiter et al., Science 222 (4625),

809-814 (1983).

Поради това, конкретните приложения съгласно примерните изпълнения не ограничават обхвата на настоящото изобретение и специалистите в тази област могат да намерят многобройни варианти на приложение. Като един пример докато ДНК последователностите, описани в примерните изпълнения, включват сДНК и геномна ДНК последователности, защото заявката осигурява необходимата за получаване на ДНК последователност информация за аминокиселинната последователност изобретението включва също и ДНК последователности, които може да бъдат конструирани въз основа на познаването на аминокиселинните последователности на ДНК. Те може да кодират за ЕРО (както в пример 12) и за ЕРО фрагменти, както и за полипептидни ЕРО аналози (наречени „ЕРО продукти“), които може да проявяват едно или повече от биологичните свойства на природния еритропоетин, без да имат други (или да ги проявяват в различна степен).

ДНК последователностите съгласно настоящото изобретение следователно включват всички ДНК последователности, осигуряващи експресия в прокариотна или еукариотна клетка гостоприемник на полипептиден продукт, имащ поне част от първичната структурна конформация и едно или повече от биологичните свойства на еритропоетина, т. е.: (а) ДНК последователности, показани на фиг. 5 и 6; (в) ДНК последователности, които хибридизират до ДНК последователностите, посочени в (а) или фрагменти от тях; и (с) ДНК последователности, които поради дегенериране на генетичния код хибридизират до ДНК последователностите, определени в (а) и (в). Трябва да се отбележи в този смисъл, че например съществуващите последователности на алелни маймунски и човешки ЕРО гени, както и последователности на гени на други видове бозайници се очаква да хибридизират до последователностите от фиг. 5 и 6 или до фрагменти на същите. Освен тези с дегенерирали генетични кодове, SCEPO и ЕСЕРО гените и получените или мутагенирали сДНК или геномни ДНК последователности, кодиращи за различни ЕРО фрагменти и аналози, също хибридизират до посочената ДНК последователност. Такива хибридизации могат да се осъществяват при хибридизационните условия, описани с оглед началното изолиране на ДНК, кодираща маймунски и човешки ЕРО или при по-строги условия, ако се желае намаляване на странични хибридизации.

По същия начин, въпреки че горните примери илюстрират изобретението по отношение на микробна експресия на ЕРО продукти в контекста на експресия в животински клетки на ДНК, включена в един хибриден вектор от бактериален плазмид и вирусни геномни източници, в обхвата на изобретението се включва голямо разнообразие от експресионни сестеми. Към тях се отнасят експресионни системи, включващи вектори от хомогенен произход, прилагани към култури от бактериални, дрождеви и бозайникови клетки, както и експресионни системи, които не включват вектори (като трансфектиране на клетки с калциев фосфат). В това отношение трябва да бъде разбрано, че експресията на например маймунска ДНК в култура от маймунски клетки и в култура от човешки клетки гостоприемници, фактически представляват слу чаи на експресия на екзогенна ДНК. тъй като за ДНК на ЕРО, за която се търси високо равнище на експресия, няма източници в генома на клетката гостоприемник. Експресионните системи съгласно изобретението по-нататък са свързани с методи, резултиращи в цитоплазматично образуване на ЕРО продукти и натрупване на гликозилирани и негликозилирани ЕРО продукти в цитоплазмата на клетките гостоприемници или в мембраните им (например акумулиране в периплазматичното пространство) или в надстоящата течност на хранителната среда, както е описано, или други необичайни системи като Р. aeruginosa експресионна система (описано от Gray et al., Biotechnology, 2, стр. 161-165 (1984).

Подобрените методи за хибридизиране съгласно изобретението, въпреки че е описано само приложението при ДНК/ДНК хибридизационен скрининг, са еднакво приложими и при РНК/РНК или РНК/ДНК скрининг. Методите със смесени индикатори като описаните обикновено представляват подобрения в методите на хибридизация, позволяващи по-бързо и по-надеждно изолиране на полинуклеотиди. Тези много отделни подобрения включват подобрен трансфер на колонии и методи за поддържане; използването на филтри на основа найлон като „GeneScreen“ и „GeneScreen Plus“, които позволяват повторни проби със същите филтри и повторно използване на филтъра, прилагане на нови третирания с протеази (сравнени например с Taub et al., Annal. Biochem., 125, стр. 222-230 (1982)]; използване на много ниски индивидуални концентрации (от порядъка на 0,025 pmol) на голям брой смесени индикатори (например повече от 32 на брой) и осъществяване на хибридизационни и следхибридизаци43 опни етапи при строг температерун режим със стойности, доближаващи се до най-ниските (например различаващи се с 4°С и за предпочитане с 2°С) 5 изчислени дисоциационни температури за някои от използваните смесени индикатори. Тези подобрения се комбинират, при което са получават резултати, които не биха могли да се очакват. Това е ясно илюстрирано от 10 факта, че методи, използващи смесени индикатори, включващи четири пъти повече индикатори от описаните досега успешно използвани при сДНК скрининг на информационни РНК в 15 сравнително малко количество, са успешно приложени за изолиране на ген с уникална последователност при скрининг на 1 500 000 фагови плаки в геномна банка. Този факт опровергава 20 публикуваното становище на Anderson et al., виж по-горе, че методите за скрининг със смесени индикатори са ...„неприложими при изолиране на гени на протеини от бозайници, когато съот- 25 ветните РНК не са достъпни“.

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Пречистена и изолирана ДНК последователност, кодираща еритропоетин, избрана от групата, състояща 30 се от:

(а) ДНК последователности, описани на фиг. 5 и 6 или техните комплементарни вериги;

(в) ДНК последователности, които 35 при строги условия хибридизират до ДНК последователностите, определени в (а).
2. Пречистена и изолирана ДНК последователност, съдържаща главно 40 ДНК последователност, кодираща човешки еритропоетин.
3. Пречистена и изолирана ДНК последователност, състояща се основно от ДНК последователност, кодира- 45 ща маймунски еритропоетин.
4. Прокариотна или еукариотна клетка гостоприемник, трансформирана или Трансфектирана с ДНК последователност съгласно претенции 1. 2 и 3 за експресия на еритропоетин в клетката гостоприемник.
5. Биологично активен кръгов плазмид или вектор на вирусна ДНК, включващ ДНК последователност съгласно претенции 1, 2 или 3.
6. Прокариотна или еукариотна клетка гостоприемник, стабилно трансформирана или трансфектирана с ДНК вектор съгласно претенция 6.
7. Пречистена и изолирана ДНК последователност, състояща се по същество от ДНК последователност, кодираща полипептид с аминокиселинна последователност, достатъчно близка до тази на еритропоетина, че да осигурява проявата на биологичното свойство клетките на костния мозък да засилват продукцията на ретикулоцити и на червени кръвни клетки и да повишават синтезата на хемоглобин и поемането на желязо.
8. сДНК последователност съгласно претенция 7.
9. ДНК последователност съгласно претенция 8, кодираща маймунски еритропоетин.
10. ДНК последователност съгласно претенция 9. включваща участък, кодиращ протеина, посочен на фиг. 5.
11. Геномна ДНК последователност съгласно претенция 7.
12. ДНК последователност съгласно претенция 11, кодираща за човешки еритропоетин.
13. ДНК последователност съгласно претенция 12, включваща участък, кодиращ протеин, показан на фиг. 6.
14. ДНК последователност съгласно претенция 7, включваща един или повече кодони, предпочитани за експресия в Е. coli клетки.
15. ДНК последователност съгласно претенция 14, кодираща за експ ресия на човешки еритропоетин.
16. ДНК последователност съгласно претенция 15, включваща участък, кодиращ протеин от фиг. 7.
17. ДНК последователност съгласно претенция 7, включваща един или повече кодони, предпочитани за експресия в дрождеви клетки.
18. ДНК последователност съгласно претенция 17, кодираща за експресия на човешки еритропоетин.
19. ДНК последователност съгласно претенция 18, включваща участък, кодиращ протеин, показан на фиг. 8.
20. ДНК последователност съгласно претенция 7, ковалентно свързана с откриваема маркираща субстанция.
21. ДНК последователност съгласно претенция 20, в която откриваемата субстанция е изотопно маркирана.
22. Едноверижна ДНК последователност съгласно претенция 20.
23. Прокариотна или еукариотна клетка гостоприемник, трансформирана или трансфектирана с ДНК последователност съгласно претенции 7, 8 или 11 по начин, осигуряващ експресия на полипептида в клетката гостоприемник.
24. Трансформирана или транс фектирана клетка гостоприемник съгласно претенция 23. която е способна да гликолизира полипептида.

5
25. Трансформирана или трансфектирана клетка гостоприемник от бозайник съгласно претенция 24.
26. Трансформирана или трансфектирана COS клетка съгласно претенция 25.

10
27. Трансформирана или трансфектирана СНО клетка съгласно претенция 25.
28. Биологично активен кръгов плазмид или вектор на вирусна ДНК,

15 включващ ДНК последователност съгласно претенция 7.
29. Прокариотна или еукариотна клетка гостоприемник стабилно трансфектирана или трансформирана с

20 ДНК вектор съгласно претенция 28.
30. ДНК последователност съглас- но претенция 7, кодираща за [Phe¹⁵]hEPO, [Phe⁴⁹]hEPO, [Phe¹⁴⁵]hEPO, [His⁷]hEPO, [Asn²-des25 Pro² до lle⁶]hEPO, [des Thr¹⁶³ до Arg¹⁶⁶] hEPO или [A27-55]hEPO.
31. Пречистена и изолирана ДНК последователност като показаната на фиг. 5 или 6 или комплементарна ве-

30 рига на такава последователност. Приложение: 21 фигури