ES2574584T3

ES2574584T3 - Transfección estable sin suero y producción de proteinas humanas recombinantes en líneas celulares humanas

Info

Publication number: ES2574584T3
Application number: ES06777525.4T
Authority: ES
Inventors: Haiyan Ding; Cathleen Wegmann; Carola Jüstel
Original assignee: Octapharma AG
Current assignee: Octapharma AG
Priority date: 2005-06-30
Filing date: 2006-06-29
Publication date: 2016-06-20
Anticipated expiration: 2026-06-29
Also published as: US20160177362A1; AU2006265173B2; NO343221B1; NO20076087L; BRPI0613721B1; IL250575A0; KR101320489B1; EP1896590A2; BRPI0613721A2; US8871439B2; DK1896590T3; JP2016154537A; UA99700C2; EP1739179A1; US20150044720A1; SI1896590T1; US9273325B2; IL187676A0; CN101233238A; JP6754414B2

Abstract

Un procedimiento para la preparación de una línea celular humana inmortalizada transfectada de forma estable con una secuencia de ácido nucleico que comprende un gen que codifica una proteína diana humana o un derivado o mutante de la misma, un promotor y una señal de poliadenilación (poliA) de la hormona de crecimiento bovina, estando ligados dichos promotor y señal de poliA a los extremos 5' y 3' del gen que codifica dicha proteína diana humana, respectivamente; este procedimiento comprende transfectar una línea celular huésped humana inmortalizada en condiciones sin suero con un vector de transfección que comprende dicha secuencia de ácido nucleico y un origen de replicación, en el que la línea celular inmortalizada se cultiva en condiciones sin suero.

Description

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limitaciones, proteínas humanas y polipéptidos, mutaciones y modificaciones de las mismos. En particular, las proteínas humanas incluyen proteínas plasmáticas recombinantes, por ejemplo, factores de coagulación sanguínea (como el factor VIII, factor VII/VIIa, factor V, factor IX, factor XI, factor von Willebrand, etc.), factores de crecimiento (como la eritropoyetina, etc.), factores estimulante de colonias (CSF) (como el factor estimulante de granulocitos (G5 CSF), CSF de macrófagos (M-CSF); CSG de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), citocinas (como interleucinas, incluida la interleucina 3, etc.), inhibidores de proteasas (como la alfa-1-antitripsina (A1AT), quimotripsina, etc.), proteínas transportadoras (como hormonas, etc.), proteínas que actúan como inhibidores o reguladores y similares. Se incluyen mutaciones y modificaciones adicionales de estas proteínas o polipéptidos, específicamente mutaciones o modificaciones que proporcionan una mejor estabilidad de la proteína recombinante, una semivida prolongada o

10 una mejor recuperación e incluye mutantes de deleción, sustitución o inserción y mutaciones químicas de grupos funcionales, respectivamente. Las proteínas especialmente preferidas que pueden producirse mediante el procedimiento de la invención de la solicitud son el factor VIII humano (incluidos el natural o con la deleción del dominio B), factor IX humano, G-CSF humano, A1AT humano, factor VII/VIIa humano y factor von Villebrand.

15 Se conoce en la técnica la producción recombinante de los factores VIII y IX (documentos EP-A-160457, WO-A86/01961, patentes de EE. UU. N.º 4.770.999, 5.521.070 y 5.521.070).

Se conoce en la técnica el caso de la expresión de subunidades del factor VIII recombinante para la producción de complejos que muestran actividad coagulante (por ejemplo, en los documentos EP-A-150735, EP-A-232112, EP-A20 0500734, WO-91/07490, WO-95/13300, patentes de EE. UU. N.º 5.045.455 y 5.789.203). Además, se ha descrito la expresión de versiones de ADNc truncadas parcial o completamente carentes de la secuencia que codifica el dominio B altamente glucosilado (p. ej., los documentos WO-86/06101, WO-87/04187, WO-87/07144, WO-88/00381, EP-A-251843, EP-A-253455, EP-A-254076, patentes de EE. UU. 4.868.112 y 4.980.456, documentos EP-A-294910, EP-A-265778, EP-A-303540 y WO-91/09122). Un mutante del factor VIII en particular, en el que el dominio B entre

25 las posiciones Arg740 y Glu1649 se ha sustituido por un péptido enlazador rico en Arg que tiene al menos tres restos de Arg y comprende de 10 a 25 restos de aminoácidos (donde la numeración de dicho factor VIII se relaciona con la secuencia del factor VIII natural maduro mostrada en la SEC ID N.º 9), se describe en el documento WO 01/70968 que se incorpora a este documento en su integridad. En particular, el péptido enlazador rico en Arg tiene de 14 a 20 restos de aminoácidos, mientras que un enlazador que comprende:

30 la secuencia de aminoácidos SFSQNSRH (SEC ID N.º 10), y/o

la secuencia de aminoácidos QAYRYRRG (SEC ID N.º 11), y/o

35 la secuencia de aminoácidos SFSQNSRHQAYRYRRG (SEC ID N.º 12)

es especialmente preferida. Esta muteína de dominio B del factor VIII está codificada por los nucleótidos 783 a 5162 de la SEC ID N.º 3.

40 El G-CSF es una molécula pequeña específica de linaje de sangre humana que estimula la producción de un tipo de leucocitos a partir de la médula ósea denominados neutrófilos. Los neutrófilos tienen una función importante en el sistema inmunológico del organismo y lo defienden de la infecciones. El G-CSF (especialmente secuencias de ADNc de la forma a, b y c del mismo que se proporcionan en las SEC ID N.º 15, 16 y 17, respectivamente; la proteína de la forma b de G-CSF [denominada a partir de ahora proteína «G-CSFb»] se muestra en la SEC ID N.º 27) se produce

45 de forma natural en monocitos, fibroblastos y células endoteliales. Normalmente la concentración en sangre es de aproximadamente 40 pg/ml en personas sanas. En el plasma del paciente, el nivel de G-CSF puede descender más de diez veces. El G-CSF también se produce en líneas celulares de cáncer como las células 5637 que secretan aproximadamente 70 ng/ml. Para terapia, Amgen Inc. (Filgrastim/Neupogen®) produce G-CSF humano recombinante en E. coli como forma no glucosilada y metilada en el extremo N-terminal, que está disponible como producto

50 PEGilado (Pegfilgrastim/Neulasta®). Chugai Pharmaceuticals Co. produce otro fármaco en células CHO que tiene como resultado un producto glucosilado (Lenograstim/Granocyte®). El G-CSF se utiliza como fármaco para tratar la neutropenia hereditaria o inducida por quimioterapia (cáncer), SIDA o trasplante de médula ósea. Para ello, la dosis típica es de 5 μg/kg y día.

55 Una secuencia de ADNc de A1AT particular adecuada con la invención de la presente solicitud se proporciona en los pb 973 a 2259 de la SEC ID N.º 2. Las secuencias del ADNc del factor VII/VIIa en particular se proporcionan en las SEC ID N.º 13 y 14 que se corresponden con las formas a y b de los mismos. Un ADNc del vWF en particular se proporciona en la SEC ID N.º 18.

El sistema de marcador de selección incluye resistencia a higromicina, resistencia a puromicina, resistencia a neomicina, resistencia a adenosina desaminasa (ADA), resistencia a aminoglucósido fosfotransferasa (neo, G418, APH), resistencia a bleomicina (fleo, bleo, zeocina), resistencia a citosina desaminasa (CDA, CD), resistencia a citosina desaminasa (CDA, CD), resistencia a dihidrofolato reductasa (DHFR), resistencia a histidinol

5 deshidrogenasa (hisD), resistencia a higromicina-B-fosfotransferasa (HPH), resistencia a puromicina-N-acetil transferasa (PAC, puro), resistencia a timidina quinasa (TK) y resistencia a xantina-guanina fosforribosiltransferasa (XGPRT, gpt). Es especialmente preferido el gen de resistencia a higromicina. También el gen para el marcador de selección puede estar unido funcionalmente a una señal de poliA como la derivada de la hormona de crecimiento bovino (BGH) o la señal de poliadenilación de SV40.

10 Las células transfectadas se exponen de forma constante en su medio de cultivo a la proteína del sistema marcador de selección, como higromicina durante la fase de selección, lo que da lugar a la supervivencia de solo aquellas células portadoras del vector. Un experto en la materia está familiarizado con marcadores de selección alternativos adecuados para el establecimiento de células transfectadas de forma estable, así como con las concentraciones de

15 los agentes de selección elegidos que es necesario aplicar.

Un vector especialmente preferido de la invención lleva un promotor de CMV, un gen de la higromicina, una secuencia de poliA y el gen de interés y preferiblemente es el vector pcDNA3.1 de Invitrogen que tiene la secuencia de SEC ID N.º 4 en el que se encontró que la resecuenciación de dicho vector tiene de hecho la secuencia mostrada

20 en la SEC ID N.º 5.

Las líneas celulares inmortalizadas adecuadas para el procedimiento de la invención se seleccionan a partir del grupo de células de riñón, vejiga, hígado, pulmón, músculo cardíaco, músculo liso, ovario o grastrointestinales. Esas células pueden llevar en su genoma secuencias de ADN adenovírico, en particular los primeros 4344 nucleótidos de 25 secuencias Ad5. Se prefieren las células de riñón fetal humano (HEK) seleccionadas a partir del grupo compuesto por células 293 (ATCC CRL-1573; DSM ACC 305; ref. ECACC: 85120602), células 293T (DSM ACC 2494; ECACC: tsa201, ref. 96121229) y células 293 FreeStyle (células 293F; Invitrogen R79007). Las más preferidas son las células 293F. Estas líneas celulares inmortalizadas portadoras de dicho vector se cultivan en condiciones que permiten la expresión del gen recombinante. Esencialmente, estas son condiciones de cultivo estándar conocidas

30 por los expertos en la materia; no obstante, en el caso de células portadoras del gen del factor IX humano, debe incluirse en el medio vitamina K.

Una realización en particular de la presente invención es la producción sin suero de la proteína recombinantes en cultivo sin suero de las células inmortalizadas de forma estable, que también se transfectan en condiciones sin 35 suero. Para cualquiera de las líneas celulares humanas inmortalizadas descritas anteriormente, preferiblemente la línea celular 293F se transfecta y cultiva en condiciones sin suero. Las células se transfectan de forma estable en cultivo en suspensión en ausencia de suero y, a continuación, se adaptan al crecimiento celular adherente para la selección de clones celulares individuales. Una vez obtenidos los clones individuales, se expanden de forma adherida. Tras la selección de los mejores clones productores, las células se transfieren a cultivo en suspensión. 40 Durante el procedimiento completo de la línea celular estable y en el posterior aumento de la escala de producción, las células se crecen en medio sin suero y nunca se ponen en contacto con proteínas séricas, humanas o animales. La proteína sanguínea recombinante como cualquiera de los factores de coagulación sanguínea, un inhibidor de la proteasa como A1AT o factores de crecimiento (como G-CSF y GM-CSF), se aísla a partir del medio de cultivo y se siguen pasos de purificación estándar. En más detalle, la realización en particular de la producción sin suero de la

45 proteína sanguínea humana recombinante, en especial el factor VIII o el factor IX humano o A1AT o G-CSFb comprende los siguientes pasos:

(1) Transfección de las células inmortalizadas humanas, preferiblemente células 293F en cultivo en suspensión sin suero. Las células se cultivan en matraces Erlenmeyer de policarbonato estéril desechables. Las células se

50 transfectaron con una densidad de, por ejemplo, 1×106 células viables por ml con un agente de transfección, preferiblemente un agente de transfección catiónico, más preferiblemente reactivo lipofectamina 2000 CD (Invitrogen) o un reactivo para el procedimiento de transfección con fosfato cálcico); se transfecta un vector que codifica la proteína sanguínea humana, preferiblemente el vector es pcDNA3.1-FIX, pcDNA3.1-FVIII, pcDNA3.1-A1AT o pcDNA3.1-GCSFb;

55

(2) 24 a 120 h, preferiblemente de 36-96, más preferiblemente 48 h después de la transfección, se transfiere un número adecuado de células (de 103 a 1010; preferiblemente de 105 a 108, más preferiblemente 106 células) a una placa de cultivo plana para su sedimentación y establecimiento de crecimiento adherente. Preferiblemente, la placa de cultivo es una placa de 10 cm y las células se cultivan en un medio sin suero ni proteínas; preferiblemente en

medio de expresión de 293 FreeStyle (12338-018, Invitrogen) o medio de uso propio sin suero (Octapharma Stockholm).

(3) La presión de selección se inicia a las 2 a 50 h, preferiblemente 48 h tras la transferencia a la placa de cultivo

5 plana. El medio se suplementa con un agente selectivo adecuado seleccionado a partir del grupo compuesto por marcadores de selección, por ejemplo, higromicina, neomicina, G418 y Zeocina. El agente selectivo preferido es la higromicina con una concentración de 10 a 300 μg/ml, preferiblemente de 50 a 200 μg/ml, más preferiblemente 50 μg/ml. La presión se mantuvo durante al menos 10 a 20 días, preferiblemente durante 14 días, en los que el medio suplementado con higromicina se cambia cada dos días. Solo las células transfectadas de forma estable sobreviven

10 a estas condiciones de selección y forman clones de células adheridos que pueden recogerse de forma individual. Adicionalmente, puede usarse un factor de adherencia para que las células se peguen a la placa y evitar que hagan células flotantes entre clones. Estos factores de adherencia podrían ser, por ejemplo, poli-D-lisina, medio sintético suplementado con proteínas humanas o animales u otras sustancias. Alternativamente, pueden usarse anillos de clonación para recoger los clones.

15

(4): Los clones celulares individuales se recogen y transfieren a recipientes de cultivo independientes para la expansión sin suero de las células (aumento de la escala de producción) mientras se elimina la presión selectiva. Cualquier recipiente de cultivo es apropiado, aunque preferiblemente los clones individuales se transfieren en primer lugar a placas de 96 pocillos con una cantidad de medio suficiente y, a continuación, a placas de 48, 24, 12 y 6 20 pocillos y, después, a tubos de centrífuga. En la fase de tubo de centrífuga, las células se cultivan en medio sin suero con una suave agitación para que las células vuelvan al crecimiento en suspensión. Una vez que las células han alcanzado la fase de placas de 6 pocillos o de tubos de centrífuga, es opcional seleccionar los mejores clones celulares según algunos criterios de selección, es decir, la velocidad de crecimiento de las células, se prefieren las células de crecimiento más rápido y la cantidad de proteína recombinante que producen. No obstante, dicha

25 selección también puede realizarse en cualquier fase posterior.

(5): Las células obtenidas del cultivo en tubos de centrífuga se sembraron en matraces de cultivo Erlenmeyer con una cantidad suficiente de medio sin suero. Los criterios de selección adicionales para aumentar la escala de producción, en clones celulares crecidos en suspensión sin suero ni proteínas son los siguientes: viabilidad, 30 morfología celular, ausencia de agregación, solidez con respecto a la centrifugación y ausencia de restos celulares. El procedimiento de la presente invención funciona especialmente bien si el vector es pcDNA3.1-hygro(+)-zz. Se prefiere que el gen que codifica la proteína humana, en particular FIX, FVIII, A1AT o G-CSFb humano, se inserte de modo que este bajo el control del promotor de CMV como se muestra en las figuras 2, 3, 7 y 11 respectivamente. Preferiblemente, las secuencias naturales de dichos genes se insertan de modo que la proteína expresada de forma

35 recombinante no contiene ninguna mutación y es estructuralmente idéntica a la proteína natural aislada del plasma sanguíneo. Una representación esquemática del factor IX humano natural se muestra en la figura 1. En las SEC ID N.º 1, 2, 3 y 22 se proporcionan la secuencia de ácido nucleico de pcDNA3.1-FIX, pcDNA3.1-A1AT, pcDNA3.1-FVIII y pcDNA3.1-GCSFb, respectivamente. Las proteínas respectivas son codificadas por los nucleótidos 939 a 2224, 913 a 2259, 679 a 5055 y 970 a 1584, respectivamente.

40 Por tanto, la presente invención proporciona un procedimiento para la producción recombinante del factor IX, A1AT, factor VIII y G-CSFb humanos clonados en pcDNA3.1TM dando lugar a pcDNA3.1-FIX, pcDNA3.1-A1AT, pcDNA3.1-FVIII y pcDNA3.1-GCSFb, respectivamente, que se integran en el genoma de células humanas inmortalizadas, preferiblemente células humanas embrionarias de riñón como células 293 (ATCC CRL-1573; DSM ACC 305; ref.

45 ECACC: 85120602), células 293 FreeStyle (células 293F; Invitrogen R79007) o células 293T (DSM ACC 2494; ECACC: tsa201, ref. 96121229).

Aquellas células portadoras de pcDNA3.1-FIX, pcDNA3.1-A1AT, pcDNA3.1-FVIII o pcDNA3.1-GCSFb se cultivan en medio en condiciones estándar que permiten la expresión génica o, alternativamente, se cultivan en condiciones sin 50 suero para minimizar el riesgo de contaminación con patógenos humanos. Pueden incluirse una o más etapas de eliminación de priones, tales como etapas de precipitación de proteínas, filtración, en particular etapas de cromatografía de afinidad. Alternativa o adicionalmente, puede usarse una línea celular que no exprese priones como células de expresión. Esta puede obtenerse mediante tecnología genómica de silenciamiento o antisentido completa. En el caso de producción del factor IX humano, las células se cultivan preferiblemente en presencia de 55 vitamina K. La proteína sanguínea humana se aísla a partir del sobrenadante del cultivo y se somete a etapas de purificación posteriores conocidas en la técnica para maximizar el rendimiento de un producto puro, estable y altamente activo y se selecciona entre cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de exclusión molecular, etc. y combinaciones de las mismas. Estas pueden adaptarse fácilmente a los requisitos específicos necesarios para aislar el factor IX, G-CSFb o A1AT recombinante. La cantidad y actividad de

la proteína purificada durante y después del procedimiento de purificación puede controlarse mediante ELISA y/o ensayos de tiempo de coagulación en un paso (TTPa).

Para solucionar los problemas de posibles contaminaciones infecciosas en las muestras de proteína purificada o en

5 el producto obtenido directamente del sobrenadante del cultivo celular que contiene la proteína recombinante de elección secretada, el sobrenadante del cultivo podría tratarse con procedimientos para la inactivación de virus incluido el tratamiento con calor y/o el tratamiento SD (estado seco o líquido, con o sin la adición de sustancias químicas que incluyen inhibidores de proteasas). Un experto en la materia está familiarizado con los procedimientos de purificación. Por ejemplo, se ha descrito el aislamiento, purificación y recuperación del factor VIII inactivado para

10 virus y de alta pureza a partir de plasma sanguíneo mediante cromatografía de intercambio aniónico (documento WO93/15105). Además se han descrito diversos procesos de producción de factores de coagulación no infecciosos de alta pureza a partir de plasma sanguíneo o de otras fuentes biológicas. Los virus recubiertos de lípidos se inactivan de forma eficaz mediante el tratamiento del material potencialmente infeccioso con una fase hidrófoba formándose un sistema de dos fases a partir del cual se elimina posteriormente la parte insoluble en agua. Se ha

15 probado un avance adicional para complementar el tratamiento con fase hidrófoba de forma simultánea o secuencial con un tratamiento con detergentes no iónicos biocompatibles y fosfatos de dialquilo o trialquilo (documentos WO 96/36369 y EP 0131740, y patente de EE. UU. N.º 6.007.979). Los virus no recubiertos de lípidos requieren protocolos de inactivación que consisten en el tratamiento con detergentes no iónicos seguido por una etapa de calentamiento (60-65ºC) durante varias horas (documento WO 94/17834). Tras la inactivación vírica, puede ser

20 necesaria una etapa de purificación adicional para eliminar las sustancias químicas. En resumen, la presente invención proporciona un procedimiento de producción de proteínas eficaz basado en una línea celular humana ligado a procedimientos aprobados de purificación de proteínas y de inactivación de posibles agentes infecciones peligrosos. Se ha establecido un sistema seguro y fácil de utilizar para la producción de proteínas recombinantes, por ejemplo, los factores de coagulación IX u VIII, A1AT y G-CSFb. La actividad de las proteínas producidas de

25 forma recombinante puede examinarse con ensayos estándar. En el caso del factor IX humano, por ejemplo, con un ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activada usando activación con Dapptin TC (Kaolin/Sulfatid-Phospholipid N.º de cat. 5035090, Technoclone GmbH) con un aparato de coagulación manual. Finalmente, las proteínas recombinantes obtenidas de esta forma, como la proteína sanguínea descrita anteriormente en este documento, en particular el factor IX humano puede usarse en una composición farmacéutica.

30 La invención se describe además en los siguientes ejemplos. No obstante, dichos ejemplos no deben interpretarse como una limitación de la invención.

EJEMPLOS

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Material y métodos

Líneas celulares humanas para la expresión de proteínas: Las líneas celulares preferidas son HEK293 (ref. ECACC: 85120602), 293 FreeStyle (293F; Invitrogen R79007) y 293T (tsA201, ref. ECACC: 96121229) que es una línea 40 celular embrionaria humana de riñón transformada que expresa de forma estable un antígeno T sensible a la temperatura de SV40. Estas líneas celulares de tipo epitelial se han usado en diversos ensayos funcionales de expresión y se ha publicado que producen altos niveles de proteínas recombinantes. En los ejemplos que aparecen a continuación se utilizó preferiblemente la línea celular 293F (Invitrogen), que deriva de la línea celular 293. La línea celular parental 293 es una línea permanente establecida a partir de riñón embrionario humano primario 45 transformada con ADN del adenovirus humano de tipo 5 cortado (Graham y col., 1977; Harrison y col., 1977). La línea celular 293F es una variante de la línea celular 293 que se ha adaptado al crecimiento en suspensión en medio de expresión FreeStyleTM 293 (293F) (12338-018, Invitrogen). La línea celular 293F se obtuvo de Robert Horlick en Pharmacopeia. La línea celular 293F se preparó originalmente a partir de cultivos del Master Cell Bank con bajo número de pases derivados de las células 293F parentales que se clonaron de nuevo mediante dilución límite. Las

50 células se crecieron de forma constante en el medio de expresión FreeStyle 293 sin suero o en un medio sin suero (Octapharma Stockholm) con una buena viabilidad y buena morfología por un periodo de tiempo superior al año durante el desarrollo de la presente invención.

Para la producción eficiente del factor humano IX, el medio puede modificarse mediante la adición de vitamina K. 55 Estas líneas celulares son capaces de crecer en medio sin suero y/o proteínas con suplementos adecuados.

Determinación y medición de proteínas diana

Determinación de la concentración de factor IX humano mediante ELISA: Los niveles de factor IX recombinante

humano en el sobrenadante se determinaron mediante ELISA usando un anticuerpo de cabra anti-FIX humano (GAFIX-AP, Affinity Biologicals) como anticuerpo de captura según el procedimiento estándar. Todas las incubaciones se realizaron en una cámara húmeda a TA. Se usaron ambos patrones, Octanyne (FIX derivado de plasma, Octapharma) y BeneFIX (FIX recombinante, Genetics Institute). El anticuerpo de detección era un

5 anticuerpo de cabra anti-FIX humano conjugado con peroxidasa (GAFIX-APHRP, Affinity Biologicals). Se añadió ABTS (N.º cat. 1682008, Roche Diagnostics) a cada pocillo como sustrato, la reacción colorimétrica se detectó a 405 nm en 15 minutos. Los resultados se calcularon mediante regresión lineal de la concentración estándar frente a la absorbancia estándar.

10 Detección de la actividad del factor IX de coagulación humano: La actividad de coagulación del factor IX humano recombinante en los sobrenadantes se determinó como sigue: la actividad de coagulación se analizó en base a un ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activada usando activación con Dapptin TC (Kaolin/Sulfatid-Phospholipid N.º cat. 5035090, Technoclone GmbH) con un aparato de coagulación manual (Amelung KC 4A micro, Amelung GmbH). Para el estudio se incubaron 50 μl de sobrenadante de las células transfectadas, 50 μl de plasma deficiente

15 en FIX (Progen) y 50 μl de Dapptin TC durante 2 minutos a 37° C. La coagulación se inició añadiendo 50 μl de CaCl2 (N.º cat. 84687-22F, Instumentation Laboratory). El tiempo de coagulación de la muestra se comparó tanto con Oxtanyne como con BeneFIX.

Determinación de BDDFrhVIII con el ensayo COAMATIC:FVIII (Chromogenix): El kit de ensayo cromogénico

20 comercial COAMATIC:FVIII (Chromogenix, N.º cat. 82 25 85) contiene FIX, FX y un cromógeno que se transforma en un colorante hidrosoluble amarillo mediante la escisión de FXa. Este sistema lo completa las muestras que contienen FVIII: el FVIII activa el FIX mediante la formación de complejos, este complejo activa el FX mediante escisión proteolítica para convertirse en el FXa. FXa convierte el cromógeno en un colorante que posteriormente se determina fotométricamente a 405 nm. Esta prueba está diseñada para la determinación del FVIII en los plasmas de

25 pacientes. El procedimiento siguiente se estableció para hacer esta prueba aplicable para la medición del factor VIII en medios de cultivo diluidos. Como patrones control se usó factor VIII de coagulación humano recombinante de longitud completa (NIBSC, N.º de pedido 57814F) y plasma control normal (Instrumentation Laboratory Company).

Preparación de las muestras: las muestras se diluyeron con tampón de dilución suministrado con los reactivos

30 COAMATIC hasta una actividad FVIII final prospectiva de entre 2 y 20 mUI/ml y se comparó con la curva patrón N.º 6 de la OMS.

Procedimiento: en una matriz de 96 pocillos colocada sobre bloque térmico, se midieron por triplicado tanto los patrones como las muestras. 35 Esquema del proceso (por pocillo):

Reactivo: Volumen Incubación (37 ºC)

Patrones y muestras diluidas: 50 μl 4 min

Reactor factor (37 ºC): 50 μl colocar en el dispositivo fotométrico de 96 pocillos, incubar 2 min a 37 ºC en el incubador

S-2765 + I-2581 (37° C): 50 μl colocar en el dispositivo fotométrico de 96 pocillos, incubar 2 min a 37 ºC en el incubador

Ácido acético al 20 %: 50 μl colocar en el dispositivo fotométrico de 96 pocillos, agitar 15 s en fotómetro de 96 pocillos

determinar las absorciones a 405 nm inmediatamente

Determinación de la actividad A1AT con la prueba de actividad de elastasa: Tras la transfección del ADNc de A1AT,

40 se expresó y secretó A1AT al medio de cultivo celular. Tras retirar las células mediante centrifugación (5 minutos, 1000 rpm), se midió la actividad A1AT en el sobrenadante del cultivo. En esta prueba de actividad, la actividad A1AT se determinó mediante su efecto inhibidor sobre la elastasa. La elastasa escinde la pNA a partir del sustrato Nsuccinil-(Ala)3-pNA. La pNA liberada se mide fotométricamente a 405 nm. Comparando con muestras patrón con una actividad A1AT definida, se determina la actividad de las respectivas muestras. Como se comprobó en otros

45 experimentos, la prueba es válida en medio FreeStyle sin suero. Para confirmar el hecho de que el medio FreeStyle

no influye en la prueba, se prepararon dos curvas patrón: el plasma humano patrón se diluyó en tampón T+ o en medio FreeStyle.

Dilución de las muestras: todas las muestras se analizaron sin diluir y diluidas 1:10 y 1:50 en medio FreeStyle y se 5 compararon con diluciones patrón de plasma humano.

Procedimiento: se pipetearon 50 μl de cada dilución patrón y de dilución de la muestra, respectivamente en un pocillo de la placa de microvaloración de 96 pocillos. Tras añadir 150 μl de solución de trabajo de Elastasa a cada pocillo, la placa de 96 pocillos se agitó durante 1 minuto en el lector de ELISA y se incubó durante 30 minutos a 10 37ºC. Se añadieron 100 μl de solución de trabajo del sustrato a cada pocillo con una pipeta multicanal. La absorción a 405 nm se midió inmediatamente después de la adición de la solución sustrato y después de 7 minutos de incubación a 37 ºC en la oscuridad. El primer valor representa la absorción base sin reacción catalizada por la elastasa y se resta de la segunda que representa la absorción después de que la elastasa escinda la pNA del sustrato. Usando el resultado tras la resta, se calculan las actividades A1AT de las muestras según la curva patrón.

15 Determinación de la actividad G-CSF mediante ELISA: Los niveles de G-CSF humano recombinante en los sobrenadantes de los cultivos se determinaron mediante ELISA usando un anticuerpo de ratón anti-G-CSF humano (MAB-214, R&D System) como anticuerpo de captura según el procedimiento estándar. Todas las incubaciones se realizaron en una cámara húmeda a temperatura ambiente. Se usó el patrón de G-CSF (hG-CSF recombinante, E.

20 coli, 214-CS-025, R&D Systems). El anticuerpo de detección fue un anticuerpo de cabra anti-G-CSF humano biotinilado (BAF-214, R&D Systems). La estreptavidina se conjugó con la peroxidasa de rábano picante (DY998, R&D Systems) unida al anticuerpo de detección. El sustrato de peroxidasa fluorogénica QuantaBluTM (15169, Pierce) se añadió a cada pocillo como sustrato, la reacción fluorométrica se detectó a una extinción de 320 nm/emisión de 420 nm antes de 60 min. Los resultados se calcularon mediante regresión lineal de la concentración patrón frente a

25 unidades de fluorescencia relativas (UFR) patrón.

Ejemplo 1: Clonación de las proteínas diana

A. Clonación del factor IX humano: A partir del vector pTG36 como se describe en el documento WO01/70968, se

30 cortó un fragmento de 1,4 kb que contenía el marco de lectura abierta del factor IX de coagulación humano mediante digestión doble con HindIII y NotI. Este fragmento se ligó con el fragmento de 5,6 kb del vector de digestión doble HindIII y Notl pcDNA3.1Hygro(+)-zz (derivado de V870-20, Invitrogen) dando lugar al vector pcDNA3.1-FIX mostrado en la figura 2. La secuencia de ADN de pcDNA3.1-FIX se muestra en la SEC N.º 1. Se encontraron tres inserciones de nucleótidos adicionales en el esqueleto del vector en el vector pcDNA3.1Hygro(+)-zz (véase la SEC ID N.º 5) en

35 comparación con la secuencia publicada por Invitrogen (como se muestra en la SEC ID N.º 4). El vector pcDNA3.1-FIX contiene un casete del gen de resistencia a higromicina que permite un procedimiento de selección de un clon de células transfectadas de forma estable (véanse las figuras 2, 3 y 7). El vector permite el establecimiento de líneas celulares de expresión estable mediante transfección con fosfato cálcico u otros métodos, y la posterior selección de los resistentes a la higromicina.

40

B. Clonación del factor VIII humano: Se aisló ADNc de FVIII de 4380pb que contenía el marco de lectura abierta de un factor VIII de coagulación humano con deleción del dominio B a partir del vector pTGF8-2hyg-s (SEC ID N.º 7 cuya producción se describe en el documento WO01/70968) con digestión de Notl+Xhol y ligado con pcDNA3.1Hygro(+)-zz, que se linealizó con XhoI+PspOMI dando lugar al vector pcDNA3.1-FVIII mostrado en la

45 figura 7.

C. Clonación de A1AT humano: Se aisló el ARNm de A1AT directamente de las células HepG-2 (N.º DSMZ: ACC 180) usando un kit Miniprep de ARNm (Sigma; N.º cat. MRN-10). En la siguiente etapa, el ARNm se capturó en microesferas de oligo (dT). A continuación, el ARNm se transcribió en ADNc de doble hélice con transcriptasa 50 inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV RT, Promega, N.º cat: M5101) seguido de RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa). El ADNc de A1AT se amplificó con una reacción de PCR. El producto de la PCR se cargó en un gel de agarosa. La banda de ADN apropiada se aisló y después se purificó con el kit de extracción de gel Qiaquik (Qiagen, N.º cat.: 28704). A continuación, el fragmento de A1AT se subclonó en un vector comercial (TOPO® Invitrogen, N.º cat.: K4650-01). Para la clonación de pCMV-Script: se digirió PCR II

55 TOPO-A1AT con EcoRI, el fragmento A1AT de 1370 pb se ligó con pCMV-Script linealizado con EcoRI.

Para la clonación de pCI-neo-A1AT, se digirió PCR II TOPO-A1AT con EcoRI, el fragmento de A1AT de 1370 pb se ligó con pCI-neo linealizado con EcoRI.

Para la clonación de pcDNA3.1-FVIII, se aisló A1AT de 1370 pb con PCR II TOPO-A1AT digerido con XhoI+HindIII y ligado con pcDNA3.1 linealizado mediante XhoI+HindIII. El vector resultante se muestra en la figura 3.

Para la clonación de pTG1-A1AT, se digirió PCR II TOPO-A1AT con HindIII y Notl. El fragmento de A1AT de 1370 pb 5 se ligó con pTG1 (sin PRE), linealizado con HindIII y Notl. El vector resultante se muestra en la figura 9.

D. Clonación del ADNc del G-CSF humano: Se aisló el ARN total directamente a partir de células de carcinoma de vejiga urinaria humana 5637 natural con el kit RNeasy mini (QIAGEN, N.º cat. 74104). Después, el ARN total aislado se incubó con ADNasa I para digerir el ADN genómico posiblemente mezclado de las células 5637. Para obtener 10 ARN total sin ADNasa la mezcla de reacción se trató con el kit de limpieza RNeasy (QIAGEN, N.º cat. 74204). Se realizó una RT-PCR con el ARN total como molde con el cebador oligo(dT)12-18 (Invitrogen, N.º cat. 18418-012) y ARNasa H-transcriptasa inversa SuperscriptTM II (Invitrogen, N.º cat., 18064-022) en presencia de inhibidor de ARNasa (Roche, N.º cat. 799-017) para sintetizar una mezcla de ADNc dc a partir de células 5637. El ADNc de G-CSF se amplificó entonces con una reacción de PCR. El ADNc de G-CSF se aisló a partir de gel de agarosa con el

15 kit de extracción de gel rápido QIA (QIAGEN, N.º cat. 28704) y se secuenció con los siguientes cebadores de PCR para G-CSF:

- G-CSF sentido: 5′- ATG GCT GGA CCT GCC ACC CAG AGC -3' (SEC ID N.º: 19)

20 - G-CSF complementario: 5′- TCA GGG CTG GGC AAG GTG GCG TAG-3′ (SEC ID N.º 20)

Se confirmó mediante análisis de secuencia que la secuencia del ADN sintetizado a partir de las células 5637 era la forma G-CSFb (que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID N.º 26). El ADNc de la forma G-CSFb aislado como se describe anteriormente se ligó a continuación directamente en el vector comercial pCR2.1 (Invitrogen). El

25 plásmido resultante se denominó pCR2.1d2-GCSFb y se muestra en la figura 10.

PCR2.1d2-GCSFb se digirió con HindIII y NotI, el fragmento de ADNc de GCSFb de 705 pb se aisló y ligó en el vector pcDNA3.1Hygro(+)-zz, que se linealizó con HindIII y NotI. El vector pDNA3.1-GCSFb resultante se muestra en la figura 11.

30 PCR2.1d2-GCSFb se digirió con EcoRI, el fragmento de ADNc de GCSFb de 629 pb se aisló y ligó en el vector pCINeo, que se linealizó con EcoRI. El vector pCINeo-GCSFb resultante se muestra en la figura 12.

PCR2.1d2-GCSFb se digirió con BamHI y XhoI, el fragmento de ADNc de GCSFb de 693 pb se aisló y ligó en el

35 vector pCMVScript, que se linealizó con BamHI y XhoI. El vector pCMVScript-GCSFb resultante se muestra en la figura 13.

PCR2.1d2-GCSFb se digirió con HindIII y NotI, el fragmento de ADNc de GCSFb de 705 pb se aisló y ligó en el vector pTG2-hyg-as, que se linealizó con HindIII y NotI. El vector pTG2-GCSFb-hyg-as resultante se muestra en la

40 figura 14.

Ejemplo 2: Expresión de proteínas diana en diferentes líneas celulares y diferentes vectores: Cuando se optimizó el presente procedimiento para la producción de proteínas recombinantes se comprobó la capacidad para obtener altos niveles de expresión de diferentes líneas celulares (todas portadoras de un vector que comprende el

45 gen recombinantes para la alfa-1-antitripsina [A1AT]). Se encontró que las líneas celulares CHO, BHK y otras más producen menor proteína recombinante en ensayos de transfección transitoria en comparación con la línea celular 293T. Por tanto, se examinaron otros derivados de líneas celulares de riñón embrionario humano. Los resultados se muestran en las figuras 4 a 6.

50 Ejemplo 3: Transfección transitoria de células 293T y 293 en medio que contiene suero en comparación concélulas 293F, que se transfectaron y cultivaron en condiciones sin suero: Se dispusieron en placas de 6 pocillos 0,1-0,2 × 106 células 293T o 293 viables. Al día siguiente las células se transfectaron usando el procedimiento de fosfato cálcico (Biotechniques 6:7 632-638 [1988]): se diluyeron 4 μg de ADN de plásmido en tampón TE0,1× (con la adición de 200 μl de mezcla de transfección), se mezcló suavemente y se añadieron 20 μl de

55 CaCl2 2,5 M y 100 μl de HBS2× a la muestra de transfección. La muestra de transfección se incubó durante 20 min a temperatura ambiente. Después de 6 horas de incubación se cambió el medio y, a continuación, las células se incubaron durante 48 h.

Ejemplo 4: Transfección y expresión sin suero de proteínas diana en células 293F en medio sin suero: Se

imagen7

C: Transfección y expresión de FIX: En células 293F transfectadas de forma estable usando pcDNA3.1-FIX y un vector pTGR36 basado en pUC 19/X (véase el documento WO 01/70968) que expresan el factor IX, podía mostrarse una productividad prácticamente 3 veces superior con el uso del vector pcDNA3.1 en células 293F como puede

5 observarse en la siguiente tabla 1.

Tabla 1: Productividad de FIX en células 293 y 293F tras la transfección estable con los vectores pcDNA3.1 y pTG2 Productividad de FIX en % [mUI/106 células, día]

Línea celular sustrato/vector: pcDNA3.1-FIX pTG2-FIX

293 (+suero): 100 % —

293F (−suero): 100 % 60 %

10 Ejemplo 5: Producción de G-CSFb

A. Transfección de células 293F en medio sin suero, transfección transitoria: Se preparó un cultivo en suspensión de 28 ml de células 293F con una densidad celular de 1,1 x 106 células 293F viables por ml el mismo día del experimento de transfección. Se preparó un complejo lípido-ADN diluyendo 30 μg de ADN de plásmido (pcDNA3.115 G-CSFb) en Opti-MEM® I (Invitrogen) hasta un volumen total de 1 ml y se diluyeron 30 μl de Lipofectamine 2000 CD en Opti-MEM® I hasta un volumen total de 1 ml. Después de 5 minutos de incubación a temperatura ambiente, se añadió ADN diluido a Lipofectamine 2000 CD para obtener un volumen total de 2 ml. Las muestras de transfección se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente en oscuridad. Se añadieron 2 ml de la mezcla de transfección al cultivo en suspensión de 293F de 28 ml (la densidad celular final es de 1×106 células por ml). Las células 293F

20 transfectadas se incubaron a 37° C/atmósfera humidificada del 8 % de CO2 en aire en un agitador orbital a 125 rpm durante 72 horas.

B. Transfección estable: Setenta y dos horas después de la transfección según se establece anteriormente en A, se transfirió un número adecuado de células (105 y 106 células) a una placa plana para su sedimentación y

25 establecimiento de crecimiento adherente. La presión de selección se inició después de 2 a 50 h, preferiblemente 48 h tras la transferencia a la placa de cultivo plana. El agente selectivo preferido era higromicina con una concentración de 75 μg/ml. La presión se mantuvo durante al menos 10 a 20 días, preferiblemente durante 14 días, en los que el medio suplementado con higromicina se cambió cada 2 a 3 días.

30 C. Selección de los mejores clones productores de G-CSF usando el análisis y el robot de selección ClonePixFL (Genetix): Las células 293F FreeStyle transfectadas de forma estable como se describe en B anteriormente se sembraron en medio a base de metilcelulosas semisólido que contenía un antibiótico apropiado para la selección de clones después de aproximadamente dos días y un anticuerpo marcado para la detección de los clones de mayor producción mediante fluorescencia. Se analizó un gran número de clones (miles) usando ClonePixFL (Genetix) con

35 respecto al número de células y a la secreción de G-CSF para seleccionar posteriormente solo algunos cientos de los mejores clones productores de G-CSF. Al contrario que otros procedimientos conocidos, donde los clones no productores y los clones mezclados se seleccionan también aleatoriamente, el uso de ClonePixFL permite seleccionar los clones que crecen más rápido, que son solo los mayores productores, originados a partir de células individuales. Las células seleccionadas se expanden en placas de microvaloracion y posteriormente en tubos de

40 centrífuga, matraces de cultivo celular y fermentadores en condiciones sin suero para el procedimiento completo.

Aquí también el procedimiento completo de transfección estable se genera en condiciones sin suero. Adicionalmente, durante todo el proceso que sigue a la expansión y el procedimiento de cultivo celular, la célula no tenía ningún contacto con proteínas séricas o derivadas de animales. Durante la expansión se seleccionan los

45 mejores clones en cuanto a solidez, velocidad de crecimiento alta, viabilidad y producción de G-CSF activo según se determina en formato ELISA.

Tras esta fase de selección, los clones seleccionados se cultivan en condiciones sin suero sin suplemento de antibióticos. Las células 293F se cultivaron completamente sin suero durante el procedimiento completo y el medio 50 se cambió cada dos días. El aumento en la escala de producción de las células se realizó en condiciones completamente sin suero desde matraces Erlenmeyer en agitadores Kühner a volúmenes mayores en reactores de

onda (Wave Biotech Europe). Durante esta selección el número se reduce de nuevo a solo unos cuantos mejores

clones productores. La secuencia de ADNc correcta, el contenido de ARNm y el comportamiento durante la

fermentación son los criterios para identificar los mejores clones para su subclonación. Para esto, las células de los

clones seleccionados se dispusieron en placas, se analizaron y seleccionaron con ClonePixFL y, a continuación, se

5 expandieron y seleccionaron como se describió anteriormente. La subclonación es un paso esencial para

seleccionar de nuevo los mejores clones productores para eliminar posibles variaciones genéticas en la

subpoblación dispuesta en placas del clon. Tras la subclonación, los clones seleccionados se depositan de nuevo en

condiciones sin suero. La proteína G-CSF humana recombinante expresada se caracteriza bioquímicamente con

mayor detalle. 10

D. Determinación de la concentración de G-CSF humano mediante ELISA: La cantidad de rhG-CSF expresado por las líneas celulares de 293F FreeStyle obtenidas de este modo se determinó mediante ELISA y se comparó el rendimiento de proteínas obtenido con células transfectadas con vectores diferentes (véase la figura 15). Como cabría esperar de los experimentos de expresión con FIX y A1AT descritos en los ejemplos 2 y 3, aquí de nuevo la

15 combinación del vector pcDNA 3.1-GCSFb con la línea celular 293F mostró la mayor productividad y, por tanto, se usó para la producción de G-CSFb humano recombinante.

E. Inmunotransferencia de rhG-CSF en PAGE-SDS en condiciones reductoras: Se analizaron 10 μl de G-CSF producidos en sobrenadantes de células HEK293 y HEK293F en PAGE-SDS al 15 % e inmunotransferencia. La

20 detección de G-CSF se realizó mediante BAF214-bio/SA-HRP/DAB (véase la figura 16). La flecha indica la banda monomérica de rhG-CSF de la masa molecular correcta.

Texto libre del listado de secuencias

SEC ID N.º 1: pcDNA3.1-FIX

Molécula: ADN circular, 6960 pb

Tipo Inicio Fin Nombre/Descripción

REGIÓN 209 863 Promotor de CMV

REGIÓN 895 911 SCM"

GEN 939 2324 hFIX

GEN 2328 2339 SV40'/SV40 poliA + intrón

REGIÓN 2340 2370 'SCM

REGIÓN 2381 2595 BGH pA

REGIÓN 2658 3071 Origen f1

REGIÓN 3136 3460 Promotor de SV40

GEN 3478 4501 HygR

REGIÓN 4514 4886 pA de SV40

REGIÓN 5819 5146 Origen C PUC

GEN 6824 5964 C AmpR (hebra complementaria)

SEC ID N.º 2: pcDNA3.1-A1AT

Molécula: ADN circular, 6914 pb

Tipo Inicio Fin Nombre/Descripción

REGIÓN 209 863 Promotor de CMV

GEN 913 2259 A1AT

GEN 2328 2339 SV40'/SV40 poliA + intrón

REGIÓN 2335 2549 BGH pA

REGIÓN 2612 3025 Origen f1

REGIÓN 3090 3414 Promotor de SV40

GEN 3432 4455 HygR

REGIÓN 4468 4840 pA de SV40

REGIÓN 5773 5100 Origen C PUC

GEN 6778 5918 C AmpR (hebra complementaria)

SEC ID N.º 3: pcDNA3.1-FVIII

Molécula:: ADN circular, 9975 pb

Tipo REGIÓN: Inicio 1 Fin 655 Nombre/Descripción Promotor de CMV

GEN: 783 3082 Dominios A1 y A2 del FVIII humano

GEN: 3083 3104 Resto del dominio B y nucl. adic.

GEN: 3105 5162 Dominios A3, C1, C2 del factor FVIII humano

REGIÓN REGIÓN REGIÓN: 5188 5465 5943 5402 5878 6267 BGH pA Origen f1 Promotor de SV40

GEN REGIÓN REGIÓN: 6285 7321 8626 7308 7693 7953 HygR pA de SV40 Origen C PUC

GEN: 9631 8771 C AmpR (hebra complementaria)

SEC ID N.º 4: pcDNA 3.1 secuencia publicada por Invitrogen Molécula: ADN circular, 5597 pb Tipo Inicio Fin Nombre/Descripción REGIÓN 209 863 Promotor de CMV REGIÓN 895 1010 SCM REGIÓN 1021 1235 BGH pA REGIÓN 1298 1711 Origen f1 REGIÓN 1776 2100 Promotor de SV40 GEN 2118 3141 HygR REGIÓN 3154 3526 pA de SV40 REGIÓN 4456 3786 Origen C PUC GEN 5461 4601 C AmpR (hebra complementaria)

SEC ID N.º 5: pcDNA3.1Hygro(+)-zz, con 3 nucl. adicionales «GGT» en la posición 4380 en comparación con la SEC ID N.º 4

Molécula: ADN circular, 5600 pb Tipo Inicio Fin Nombre/Descripción REGIÓN 209 863 Promotor de CMV REGIÓN 895 1010 SCM REGIÓN 1021 1235 BGH pA REGIÓN 1298 1711 Origen f1 REGIÓN 1776 2100 Promotor de SV40 GEN 2118 3141 HygR REGIÓN 3154 3526 pA de SV40 REGIÓN 4459 3786 Origen C PUC GEN 5464 4604 C AmpR (hebra complementaria)

SEC ID N.º 6: vector pTG1-A1AT

SEC ID N.º 7: vector pFGF8-hyg-s Molécula: ADN circular, 10705 pb Tipo Inicio Fin Nombre/Descripción REGIÓN 1 586 Promotor de CMV GEN 676 2975 Dominios A1 y A2 del hFVIII Gen 2976 2997 Resto bisagra del dominio B y nucl. adic. Gen 2998 5055 Dominios A3, C1, C2 de hFVIII Región 5067 5916 Intrón poliA y sitio poliA de SV40 Gen 5928 7910 Resistencia a higromicina

Región 8346 8423 Elemento sensible a progesterona

Gen 8681 9469 Resistencia a ampicilina

SEC ID N.º 8: ADNc del factor VIII natural humano

SEC ID N.º 9: factor VIII natural humano

SEC ID N.º 10-12: péptidos enlazadores

SEC ID N.º 13: ADNc de la forma a del hFVII

SEC ID N.º 14: ADNc de la forma b del hFVII

SEC ID N.º 15: ADNc de la forma a del G-CSF humano, SC: 41-661

SEC ID N.º 16: ADNc de la forma b del G-CSF humano, SC: 41-652

SEC ID N.º 17: ADNc de la forma c del G-CSF humano, SC: 229-828

SEC ID N.º 18: ADNc de hvWF

SEC ID N.º 19 y 20: cebadores sentido y complementario de G-CSF SEC ID N.º 21: vector PCR2.1d2-GCSFb Molécula: ADN circular, 4542 pb

Inicio: Fin Característica/Nombre

293: 907 GCSFb

1159: 1596 Origen f1

1930: 2724 KanR

2742: 3602 AmpR

3747: 4420 Origen pUC

SEC ID N.º 22: vector pcDNA3.1-hyg(+)-GCSFb Molécula: ADN circular, 6237 pb Inicio Fin Característica/Nombre 209 863 Promotor de CMV 970 1584 GCSFb 1658 1872 BGH pA 1935 2348 Origen f1 2413 2737 Promotor de SV40 2755 3778 HygR 3791 4163 pA de SV40 5096 4423C Origen PUC 6101 5241 C AmpR

SEC ID N.º 23: vector pCINeo-GCSFb Molécula: ADN circular, 6101 pb Inicio Fin Característica/Nombre 1 1022 Promotor/intrón de CMV 1106 1720 GCSFb 1796 2017 PoliA de SV40 2112 2567 Origen f1 2629 3047 Potenciador/promotor de SV40

Claims

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