JP5925407B2 - ヒト細胞系における組換えヒトタンパク質の無血清安定トランスフェクションおよび製造 - Google Patents

Description

本発明は、目的とするタンパク質をコードする遺伝子を含有する特異的ベクターで無血清条件下において安定にトランスフェクトされた不死化ヒト細胞系の無血清製造のための改良された方法に関する。さらに、本発明は、該方法により得られる生産細胞系、該生産細胞系を使用する目的とするタンパク質の製造方法、および目的とする遺伝子自体を含有する特異的ベクターに関する。

ヒトタンパク質の組換え製造は一般に、安定にトランスフェクトされた真核生物（好ましくは哺乳類）細胞系の培養、および培養ブロスからの該タンパク質の単離により行われる。組換えタンパク質が医薬用に意図される場合には、ヒト細胞により保持され発現されうる感染因子が同時精製される危険性を排除するために非ヒト細胞系を使用することが長年にわたり一般的な慣例であった。

ヒト血液凝固因子ＶＩＩＩのようないくつかのヒトタンパク質の製造においては、非ヒト細胞系の使用は或る欠点（例えば、培地内への発現タンパク質の不十分な分泌レベル）を伴うことが見出された。これはタンパク質の翻訳および修飾のための細胞内経路に関する異なるタイプの哺乳類細胞における若干の相違によるものである可能性があり、これは発現ポリペプチドの生物活性にも影響を及ぼしうると考えられている。これとは別に、非ヒト発現系から精製された治療用タンパク質は、患者において抗原反応を引き起こしうる細胞成分で汚染される懸念があった。また、非ヒト発現系において組換え製造されたヒトタンパク質上で見出される非ヒトグリコシル化パターンも懸念材料であった。これは患者における抗原反応の可能性を増大させると考えられている。さらに、凝固因子のような血液タンパク質の生物学的安定性および効力はそれらのＮ−グリコシル化パターンにより相当に影響される。特に末梢および末端単糖が重要である。なぜなら、それらは、それらの分解を引き起こす細胞からの特異的受容体により検出されるからである。例えば凝固因子は末端単糖としてシアル酸残基を含有する。糖タンパク質のアンテナにおけるシアル酸の組成の修飾は不均一なグリコシル化パターンを招きうる。したがって、生物学的安定性および効力は、修飾が生じると決定的な影響を受ける。したがって、ヒト細胞系に対する非ヒト生産細胞系からのグリコシル化の影響を評価することが組換え凝固因子の製造における重要な考慮事項である。一方、ウイルス転写アクチベータータンパク質を発現する安定にトランスフェクトされた不死化哺乳類細胞系を含む、所望の遺伝子の高レベルのタンパク質発現のための一般的な方法が利用可能となった（例えば、米国特許第５，７１２，１１９号）。これらの細胞系は、目的とする遺伝子を定めるＤＮＡ配列に対して適当なウイルス転写プロモーターが作動的に連結されたベクター構築物で形質転換されうる。該細胞系により付与される転写アクチベータータンパク質はウイルス転写プロモーターを活性化して、目的とする遺伝子の発現を開始させる。

細胞系と同様に重要なのは、固定化された生産細胞系内への組換え遺伝子の導入に使用されるベクターである。哺乳類タンパク質の翻訳には多種多様なベクターが利用される［例えば、Ｗｉｔｓｃｈ−Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，Ｍら，Ａｍ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ（２０００）．６６，４０２−４１２はＤＨＣＲ７ ｃＤＮＡをｐＣＩ−ｎｅｏ哺乳類発現ベクター内にクローニングし、ＨＥＫ ２９３細胞において発現させた；ＭｃＧａｒｖｅｙ，Ｔ．Ｗ．ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００１）２０，１０４１−１０５１はＴＥＲＥｌ遺伝子をｐＴＡＲＧＥＴ哺乳類発現ベクター内にクローニングし、ヒト膀胱移行上皮癌において発現させた；そして、Ｌｉｎ Ｌｉｎら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２００２）２７７（４４）４１８７２−８はＡｃｈＲ遺伝子を哺乳類細胞発現ベクターｐＥＦ６／ｍｙｃ−Ｈｉｓベクター内にクローニングし、それを２９３細胞において発現させた］。組換えタンパク質を過剰発現させうることが判明している最近開発された非常に有効なベクターは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐｃＤＮＡ（商標）３．１と称されるベクターである。Ｌｉ Ｊ．ら，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．２００４ Ａｐｒ １６；７４（２２）：２６９３−７０５は、ＨＥＫ２９３細胞においてｐｃＤＮＡ３．１を使用してヒストンデアセチラーゼを過剰発現させることに成功している。該細胞は血清の存在下で安定にトランスフェクトされ培養された。Ｙｕａｎ−Ｇｅｎ Ｆｕ．ら，（Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２００３）は、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）に基づく真核生物ベクターを使用して、血清の存在下で該ベクターで一過性にトランスフェクトされ培養された胃癌細胞系ＳＧＣ７９０１上で、組換えカスパーゼ３を製造した。Ｍａ Ｈ．ら，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２０００ Ｄｅｃ；４１（１３）：４２３２−９は、ＣＯＳ−７を細胞系として使用してｐｃＤＮＡ３．１ベクター内にサブクローニングされたＬｐ８２およびＬｐ８２関連タンパク質を発現させて、安定なタンパク質の欠如および酵素活性の喪失を調べた。該細胞は培地内の血清の存在下で一過性にトランスフェクトされ培養された。チオレドキシンの過剰発現は肺内皮細胞におけるＮＯシンターゼ活性のＮＯ誘導性低下を妨げる。Ｚｈａｎｇ Ｊ．ら，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９８ Ａｕｇ；２７５（２ Ｐｔ １）：Ｌ２８８−９３は、培養ブタ肺動脈内皮細胞における、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターでのこれらの細胞の一過性トランスフェクションによるチオレドキシン遺伝子の過剰発現を開示している。該トランスフェクト化細胞は、血清で補足された培地内で培養された。Ｓｈｉｎｋｉ Ｔ．ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９７ Ｎｏｖ ２５；９４（２４）：１２９２０−５は、ラット腎ミトコンドリアシトクロムＰ４５０混合機能オキシダーゼ２５−ヒドロキシビタミンＤ３−１アルファ−ヒドロキシラーゼの完全長ｃＤＮＡをビタミンＤ欠損ラット腎ｃＤＮＡと比較し、それを哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）内にサブクローニングし、ＣＯＳ−７形質転換サル腎細胞内に該ベクターを一過性にトランスフェクトした。該トランスフェクト化細胞は、血清で補足された培地内で培養された。Ｚｈａｎｇら，Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ ２００４，３６（１０）：７０７−７１２は、ヒト化５２０Ｃ９一本鎖Ｆｖ抗体／ヒトインターロイキン２融合タンパク質をコードする遺伝子を含有するｐｃＤＮＡでのヒト胎児腎２９３細胞のトランスフェクションを開示している。該細胞を無血清ＳＦＭＩＩ培地内で３日間培養した後、上清が採取された。得られた融合タンパク質はｐ１８５（乳癌における抗体療法のための有望な標的である）に対する結合特異性を有し、ＩＬ−２の重要な免疫刺激活性を保有していた。Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｚ．ら，Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００４ Ａｕｇ；３６（８）：１５５４−６１は、ｐｃＤＮＡ−Ｂｉｍアルファ３でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を使用して、アポトーシスのための必須因子であるＢｉｍタンパク質を過剰発現させた。

医薬用の組換えタンパク質の安全性を向上させるためのもう１つの手段は培養プロセスにおける無血清培地の使用である。なぜなら、血清の使用は、安全性を損なう要因の１つであり、望ましくない汚染源となるからである。そのような無血清培養は、製造プロセスの収率が一般に有意に低下するという欠点を有する。もう１つの安全性における懸念は、実施における常法としての、宿主細胞をトランスフェクトする際の血清の使用である。なぜなら、トランスフェクション法における血清の使用は細胞内への望ましくない生物学的物質の取り込みを引き起こすことがあり、それが後に、該製造プロセスにおいて該細胞により発現された産物を汚染しうるからである。組換えタンパク質の製造のための利用可能な方法のいくつか（前記のものを含む）は無血清培養を可能にするが、ヒト細胞の安定な無血清トランスフェクションは公知ではない。第１９回ＥＳＡＣＴ Ｍｅｅｔｉｎｇ（Ｈａｒｒｏｇａｔｅ，２００５年６月５日〜８日）において、ＣＨＯ細胞の無血清トランスフェクションがＫｕｃｈｅｎｂｅｃｋｅｒらにより示唆された。このように、ヒト組換えタンパク質を製造するための有効かつ安全な方法を開発することが望ましい。

発明の概要
驚くべきことに、目的とするタンパク質をコードする遺伝子で無血清条件下において安定にトランスフェクトされた不死化ヒト細胞系から未汚染ヒトタンパク質（すなわち、望ましくないタンパク質を副産物として含有しないタンパク質調製物）が良好な収率で得られうることが見出された。より詳しくは、本発明は、
（１）ヒト標的タンパク質またはその誘導体もしくは突然変異体をコードする遺伝子、プロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化（ポリＡ）シグナル（該プロモーターおよびポリＡシグナルは、それぞれ、該ヒト標的タンパク質をコードする遺伝子の５’および３’末端に連結されている）を含む核酸配列で安定にトランスフェクトされた不死化ヒト細胞系の製造方法であって、該核酸配列および複製起点を含むトランスフェクションベクターで無血清条件下において不死化ヒト宿主細胞系をトランスフェクトすることを含んでなる製造方法；
（２）トランスフェクションベクターが、配列番号４または５の配列を有するｐｃＤＮＡ３．１ベクターに由来する、前記（１）記載の製造方法；
（３）ヒト細胞系が、２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３；ＤＳＭ ＡＣＣ ３０５）、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３細胞（以下、「２９３Ｆ」細胞と称する；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｒ７９００７）および２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １１２６８；ＤＳＭ ＡＣＣ ２４９４）から選ばれるヒト胎児腎細胞である、前記（１）または（２）記載の製造方法；
（４）ヒトタンパク質が血液凝固因子ＩＸ（例えば、配列番号１のｂｐ９３９−２３２４によりコードされるもの）、アルファ−１−アンチトリプシン（以下、「Ａ１ＡＴ」と称する；例えば、配列番号２のｂｐ９１３−２２５９によりコードされるもの）、血液凝固因子ＶＩＩＩ（配列番号８に示すｗｔ因子ＶＩＩＩ、または配列番号３のｂｐ７８３−５１６２によりコードされるＢドメイン欠失因子ＶＩＩＩ突然変異体を含む）、因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ（その配列番号１３および１４によりコードされるａおよびｂ形態を含む）、Ｇ−ＣＳＦ（それぞれ配列番号１５、１６および１７に示すＧ−ＣＳＦ ａ、ｂおよびｃ形態を含む）またはフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）である、前記（１）〜（３）のいずれか１項記載の製造方法；
（５）前記（１）および（２）のいずれか１項記載のヒトタンパク質をコードする遺伝子と複製起点とを含むトランスフェクションベクター（好ましくは、該トランスフェクションベクターは、前記（４）記載のヒトタンパク質の遺伝子を含むｐｃＤＮＡ３．１ベクターである）；
（６）前記（１）〜（５）のいずれか１項記載の製造方法により入手可能な不死化ヒト細胞系、特に、前記（３）または（４）記載のヒト細胞系；ならびに
（７）前記（６）記載の不死化ヒト細胞系を、好ましくは無血清条件下において培養することを含む、ヒト標的タンパク質またはその誘導体もしくは突然変異体の組換え製造のための製造方法を提供する。

発明の詳細な説明
本発明は、完全な無血清および無タンパク質条件下のヒト不死化細胞系におけるヒト組換えタンパク質のトランスフェクションおよび製造のための改良された方法を提供する。それはヒトタンパク質の無血清トランスフェクションおよび製造を可能にする。該方法は、ヒト病原体での組換えタンパク質の汚染の危険性を減少させるウイルス不活性化法を含む１以上の精製工程を含みうる。また、ヒト細胞系において産生されたヒト組換えタンパク質はヒトグリコシル化パターンを含有するため、それらは、それらの天然グリコシル化パターンを欠くヒトタンパク質と比べて分解を受けにくい。要するに、本発明の方法は先行技術に対する種々の利点をもたらす。

特に、本発明の実施形態（７）の方法は、安全かつ高活性なヒト組換え血液凝固因子（例えば、ヒトにおける血友病ＢおよびＡの治療用の因子ＩＸおよびＦＶＩＩＩ）を製造するための有効な系を提供する。該方法はそれらの野生型タンパク質の発現に適しているが、それらのタンパク質の突然変異体（例えば、タンパク質分解不活性化に対して格別に安定であり、したがって過酷なウイルス不活性化プロトコールに付されうる因子ＶＩＩＩ）にも使用されうる。

本発明の実施形態（７）の好ましい態様の方法は、ヒト血液タンパク質をコードするＤＮＡ配列の５’末端に連結されたプロモーターを有するベクターを含有する不死化細胞の無血清培養を含む。該ヒト血液タンパク質をコードするＤＮＡ配列の３’末端は、ウシ成長ホルモンポリＡシグナルに機能的に連結されている。本発明においては、不死化ヒト細胞系は該ベクターで安定にトランスフェクトされる。安定なトランスフェクションを検出するためには、該ベクターは、該ヒト血液タンパク質の遺伝子に加えて更に、プロモーターに機能的に連結された選択マーカー系に関する少なくとも１つの遺伝子を含みうる。

適当なプロモーターには、ウイルスプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター、組織特異的プロモーターなどが含まれる。該プロモーターがウイルスプロモーターである場合、該細胞系は、該プロモーターの対応ウイルス転写アクチベータータンパク質を含まない。しかし、該細胞は、該ヒト血液タンパク質をコードする遺伝子に機能的に連結されていない別のウイルスプロモーターを相補するＴ抗原のようなウイルス転写アクチベータータンパク質を含みうる。好ましくは、該プロモーターはＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ−１アルファプロモーター、ＨＳＶ ＴＫプロモーターなどであり、最も好ましくは、該プロモーターはＣＭＶプロモーター、すなわち、サイトメガロウイルスの構成的主要最初期プロモーターである。

「トランスフェクション」または「トランスフェクト」なる表現は、タンパク質の発現を可能にする条件下の、細胞内への核酸の導入を意味する。一般に、該核酸はＤＮＡ配列であり、特に、適当なプロモーター下、目的とする遺伝子（その発現は該プロモーターにより制御される）を含有するベクターまたはプラスミドである。しかし、トランスフェクションなる語はＲＮＡトランスフェクションをも含む。種々のトランスフェクション法が当業者によく知られており、担体分子、例えばカチオン性脂質、例えばＤＯＴＡＰ（Ｒｏｃｈｅ）、ＤＯＳＰＥＲ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｆｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＴｆｘ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）および２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）、またはリン酸カルシウムおよびＤＥＡＥデキストランを使用するトランスフェクション法が挙げられる。力ずくのトランスフェクション技術も当業者によく知られている。これらには、エレクトロポレーション、核酸で被覆された担体粒子の射入（遺伝子銃）およびマイクロインジェクションが含まれる。最後に、ウイルスベクターを使用する核酸トランスフェクションも当業者によく知られている。「一過性にトランスフェクト」または「一過性トランスフェクション」は、導入された核酸のエピソーム性による、目的とする遺伝子の一過性の、すなわち非永久的な発現を意味する。道理上、ＲＮＡトランスフェクションまたは細胞溶解ウイルスは一過性発現のみに使用されうる。ＤＮＡ（プラスミドまたはベクター）を含むエピソーム核酸は２〜４日後に細胞により分解され、したがって、その時点で、目的とする遺伝子の発現は終結する。

「安定にトランスフェクト」または「安定トランスフェクション」は、細胞のゲノム内へのトランスフェクト化ＤＮＡの組込みによる、目的とする遺伝子の永久的発現を意味する。すべてでなくともほとんどの細胞は、非常に低率でではあるがエピソームＤＮＡをそれらのゲノム内に取り込む能力を有する。しかし、該トランスフェクト化ＤＮＡが組込まれた細胞を増殖させるために、工夫された選択法が用いられる。そのためには、該ベクターは例えばヒグロマイシンのような選択マーカーに関する少なくとも１つの遺伝子を含有する必要がある。

本明細書においては、「安定トランスフェクション」または「安定にトランスフェクト」なる語は、自律複製可能であり従って外来遺伝子の長期発現に使用されうるプラスミドを含有する細胞を表すためにも用いられる。細胞を「安定にトランスフェクト」するのに適用可能な１つの特定の遺伝子導入系は組換えレトロウイルスに基づくものである。プロウイルスＤＮＡの組込みはレトロウイルス複製サイクルにおける必須工程であるため、組換えレトロウイルスによる細胞の感染は、目的とする遺伝子が組込まれて安定にトランスフェクトされた非常に高い比率の細胞を与えるであろう。

「培養」なる語は、細胞／細胞系の増殖および遺伝子発現を支持する培地を含有する容器内でのインビトロでの細胞／細胞系の維持を意味する。したがって、培養は、発現された分泌可能なタンパク質の、培地内の蓄積をもたらす。培地は通常、ｐＨを安定化する補足物質ならびにアミノ酸、脂質、微量元素、ビタミンおよび他の成長増進成分を含有する。

「無血清」、「無血清トランスフェクション」または「無血清培養」は、いずれの種類の血清をも除く適当な補足物質を含有する培地内での細胞のトランスフェクションおよび培養を意味する。補足物質は、アミノ酸、脂質、微量元素、ビタミンおよび他の成長増進成分から選ばれる。しばしば、「無血清」培養条件は、より一層厳密（ストリンジェント）であり、いずれの外因性タンパク質も添加されない又は未だ培地内に含まれていない場合には、該培地は「無タンパク質」と称される。

「不死化ヒト細胞系」なる語は、生物から直接的に採取された初代細胞ではないヒト細胞を意味する。特に、それは、適当な新鮮培地および空間があってヘイフリック限界から逸脱している限り無限に増殖する永久樹立細胞系を意味する。

「濃縮」なる語は、培地からの産生組換えタンパク質の濃縮を意味する。本質的に、それはタンパク質の濃縮をももたらす。限外濾過を含む濾過、遠心分離、沈殿などのような濃縮技術が当業者によく知られている。濃縮は必ずしも純粋なタンパク質を与えるものではなく、単離されたタンパク質は尚も非タンパク質およびタンパク質汚染物を含みうる。追加的な精製工程が必要となる場合が多い。

「精製」なる語は、実質的に純粋（少なくとも６０％純粋、好ましくは少なくとも７５％純粋、より好ましくは９０％以上純粋、最も好ましくは９９．９％以上純粋）なヒト組換えタンパク質を得るために単離タンパク質が付される工程を意味する。純度は適当な方法により測定されうる。免疫アフィニティークロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、タンパク質沈殿、バッファー交換、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、電気泳動のような、組換えタンパク質の精製に利用可能な技術が当業者によく知られている。また、精製は、ウイルス不活性化工程、例えば、プロテアーゼインヒビターなどの化学物質の存在下または非存在下の乾燥または液体状態での溶媒界面活性剤（ＳＤ）処理および／または加熱処理を含みうる。さらに、精製は、プリオン除去のための１以上の工程、例えばタンパク質沈殿、濾過、クロマトグラフィー工程、特にアフィニティークロマトグラフィー工程を含みうる（例えば、“Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｏｆ ＴＳＥ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ｄｕｒｉｎｇ ｅｔｈａｎｏｌ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ”，Ｇｒｅｇｏｒｉ，Ｌ．ら，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ３２ １−１０；２（２００４）；および“Ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ＴＳＥ ａｇｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｂｌｏｏｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ”，Ｆｏｓｔｅｒ，Ｐ．Ｒ．，Ｖａｘ Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ ８７（Ｓｕｐｐｌ．２），Ｓ７−Ｓ１０（２００４））。ウイルス不活性化後、ウイルス不活性化に使用して化学物質の除去のために、前記のものから選ばれる更なる精製工程が必要かもしれない。

「ベクター」なる語は、ＤＮＡの断片が挿入またはクローニングされうる、適当な制御要素と共に存在する場合に複製可能な任意の遺伝的構築物、例えばプラスミド、ファージ、コスミドなどを意味する。ベクターは唯一（ユニーク）の制限部位を含み、宿主細胞内での自律複製能を有しうる。この語はクローニングおよび発現ビヒクルを含む。「ベクター」は更に、１以上の他の調節要素を含有することが可能であり、該調節要素は、好ましくは、スプライス部位、組換え部位、ポリＡ部位、エンハンサー、マルチクローニング部位および原核生物プラスミド配列から選ばれる。

「機能的に連結」なる語は、目的とするタンパク質、特にヒト血液タンパク質をコードするＤＮＡ配列の転写をプロモーターが刺激しうるよう該プロモーターがベクター内に位置する、該ベクターの配置を意味する。

「成熟」なる語は、プロセシングされたタンパク質（すなわち、Ｎ末端輸出シグナルを欠くタンパク質）の、ある与えられたタンパク質の分子構造を意味する。

「プロモーター」なる語は、転写の開始中にＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子が結合する調節ＤＮＡ配列の領域を意味する。

「エンハンサー」なる語は、真核生物プロモーターの利用を向上させ該プロモーターに対していずれの位置（上流または下流）およびいずれの配向においても機能しうるシス作用性配列を意味する。

「ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル」なる語は、特殊化された終結配列を意味する。それは、細胞質へのｍＲＮＡの輸出を可能にする、ｍＲＮＡの末端へのアデニンの「尾部（テール）」の付加を指令する。細胞質に到達すると、ｍＲＮＡのポリＡ尾部はタンパク質翻訳中は維持され、タンパク質発現中にｍＲＮＡを安定化する。

「コード」または「コードする」なる語は、適当な調節配列の制御下に配置された場合にインビトロまたはインビボにおいて転写（ＤＮＡの場合）またはポリペプチド（タンパク質）へと翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸配列の特性を意味する。

本発明の目的においては、「発現」、「発現する」または「発現させる」なる語は、タンパク質をコードする遺伝子の転写および翻訳を意味する。

本発明の「ヒトタンパク質」には、ヒトタンパク質、ポリペプチド、それらの突然変異体および修飾体が含まれるが、これらに限定されるものではない。特に、ヒトタンパク質には、組換え血漿タンパク質、例えば血液凝固因子（例えば、因子ＶＩＩＩ、因子ＶＩＩＩ／ＶＩＩａ、因子Ｖ、因子ＩＸ、因子ＸＩ、フォンビルブラント因子など）、成長因子（例えば、エリスロポエチンなど）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えば、顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ））、サイトカイン（例えば、インターロイキン、例えばインターロイキン３など）、プロテアーゼインヒビター（例えば、アルファ−１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）、キモトリプシンなど）、輸送タンパク質（例えば、ホルモンなど）、抑制または調節作用性タンパク質などが含まれる。さらに、これらのタンパク質またはポリペプチドの突然変異および修飾、特に、組換えタンパク質の、より良好な安定性、半減期の延長またはより良好な回収をもたらす突然変異または修飾が含まれ、欠失、置換または挿入突然変異体、および官能基の化学突然変異体が含まれる。本出願の本発明の方法により製造されうる特に好ましいタンパク質は、ヒト因子ＶＩＩＩ（Ｂドメイン欠失体または野生型を含む）ヒト因子ＩＸ、ヒトＧ−ＣＳＦ、ヒトＡ１ＡＴ、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａおよびフォンビルブラント因子である。

因子ＶＩＩＩおよびＩＸの組換え製造は当技術分野において公知である（ＥＰ−Ａ−１６０４５７；ＷＯ−Ａ−８６／０１９６１、米国特許第４，７７０，９９９号、第５，５２１，０７０号および第５，５２１，０７０号）。因子ＶＩＩＩの場合、凝固活性を示す複合体の製造のためのサブユニットの組換え発現が当技術分野において公知である（例えば、ＥＰ−Ａ−１５０７３５、ＥＰ−Ａ−２３２１１２、ＥＰ−Ａ−０５００７３４、ＷＯ−９１／０７４９０、ＷＯ−９５／１３３００、米国特許第５，０４５，４５５号および第５，７８９，２０３号）。さらに、高グリコシル化Ｂドメインをコードする配列を部分的または全体的に欠くトランケート化ｃＤＮＡ形態の発現が記載されている（例えば、ＷＯ−８６／０６１０１、ＷＯ−８７／０４１８７、ＷＯ−８７／０７１４４、ＷＯ−８８／００３８１、ＥＰ−Ａ−２５１８４３、ＥＰ−Ａ−２５３４５５、ＥＰ−Ａ−２５４０７６、米国特許第４，８６８，１１２号および第４，９８０，４５６号、ＥＰ−Ａ−２９４９１０、ＥＰ−Ａ−２６５７７８、ＥＰ−Ａ−３０３５４０ならびにＷＯ−９１／０９１２２）。少なくとも３個のＡｒｇ残基を有し１０〜２５アミノ酸残基を含むＡｒｇに富むリンカーペプチドによりＡｒｇ７４０位とＧｌｕ１６４９位との間のＢドメインが置換された特定の因子ＶＩＩＩ突然変異体（ここで、該因子ＶＩＩＩの番号付けは、配列番号９に示す成熟野生型因子ＶＩＩＩ配列に関するものである）がＷＯ ０１／７０９６８（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。特に、Ａｒｇに富むリンカーペプチドは１４〜２０アミノ酸残基を有し、一方、
アミノ酸配列ＳＦＳＱＮＳＲＨ（配列番号１０）、および／または
アミノ酸配列ＱＡＹＲＹＲＲＧ（配列番号１１）、および／または
アミノ酸配列ＳＦＳＱＮＳＲＨＱＡＹＲＹＲＲＧ（配列番号１２）
を含むリンカーが特に好ましい。そのようなＢドメイン因子ＶＩＩＩ突然変異タンパク質は配列番号３のｎｔ７８３−５１６２によりコードされる。

Ｇ−ＣＳＦは、好中球として公知の或るタイプの白血球の骨髄からの産生を刺激する、人血中の系列特異的な小さな分子である。好中球は身体の免疫系において中心的な役割を果たし、感染を防御する。Ｇ−ＣＳＦ（特に、そのａ、ｂおよびｃ形態のｃＤＮＡ配列がそれぞれ配列番号１５、１６および１７に示されている；Ｇ−ＣＳＦｂ形態のタンパク質（以下、「Ｇ−ＣＳＦｂ」タンパク質と称する）が配列番号２７に示されている）は単球、繊維芽細胞および内皮細胞により天然で産生される。通常、その血中濃度は健常者で約４０ｐｇ／ｍｌである。患者の血漿においては、Ｇ−ＣＳＦのレベルは１０倍以上低下しうる。Ｇ−ＣＳＦは５６３７細胞のような癌細胞系においても産生され、これは約７０ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦを分泌する。治療用には、組換えヒトＧ−ＣＳＦがＮ末端メチル化非グリコシル化形態としてＡｍｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ／Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標））により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において製造されており、これはペジル化（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）産物（Ｐｅｇｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ／Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））としても入手可能である。もう１つの薬がＣｈｕｇａｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＣｏによりＣＨＯ細胞において製造されており、これはグリコシル化産物（Ｌｅｎｏｇｒａｓｔｉｍ／Ｇｒａｎｏｃｙｔｅ（登録商標））を与える。Ｇ−ＣＳＦは、遺伝的な又は化学療法（癌）、エイズもしくは骨髄移植により生じた好中球減少症の治療薬として使用される。このための典型的な用量は１日当たり５μｇ／ｋｇである。

本出願の本発明に適した特定のＡ１ＡＴ ｃＤＮＡ配列を配列番号２のｂｐ９７３−２２５９に示す。特定の因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ ｃＤＮＡ配列を、それらのａおよびｂ形態に対応する配列番号１３および１４に示す。特定のｖＷＦ ｃＤＮＡを配列番号１８に示す。

選択マーカー系には、ヒグロマイシン耐性、ピューロマイシン耐性、ネオマイシン耐性、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）耐性、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ、Ｇ４１８、ＡＰＨ）耐性、ブレオマイシン（ｐｈｌｅｏ、ｂｌｅｏ、ｚｅｏｃｉｎ）耐性、シトシンデアミナーゼ（ＣＤＡ、ＣＤ）耐性、シトシンデアミナーゼ（ＣＤＡ，ＣＤ）耐性、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）耐性、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ｈｉｓＤ）耐性、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）耐性、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＣ、ｐｕｒｏ）耐性、チミジンキナーゼ（ＴＫ）耐性、およびキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ、ｇｐｔ）耐性が含まれる。特に好ましいのはヒグロマイシン耐性遺伝子である。また、選択マーカーに対応する遺伝子はポリＡシグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）に由来するポリＡシグナルまたはＳＶ４０ポリアデニル化シグナルに機能的に連結されうる。

トランスフェクトされた細胞は、その培地内で、選択マーカー系のタンパク質（例えば、選択期中のヒグロマイシン）に絶えずさらされて、ベクターを含有する細胞のみの生存をもたらす。安定にトランスフェクトされる細胞の樹立に適した他の選択マーカー、および適用されることが必要な選択される選択剤の濃度は、当業者によく知られている。

本発明の特に好ましいベクターはＣＭＶプロモーター、ヒグロマイシン遺伝子、ポリＡ配列および目的とする遺伝子を含有し、好ましくは、配列番号４の配列を有するＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐｃＤＮＡ３．１ベクターである（該ベクターの再配列決定により、それは実際には、配列番号５に示す配列を有することが判明した）。

本発明の方法に適した不死化細胞系は、腎臓、膀胱、肝臓、肺、心筋、平滑筋、卵巣または胃腸細胞よりなる群から選ばれる。それらの細胞は、それらのゲノム内に、アデノウイルスＤＮＡ配列、特に、Ａｄ５配列の最初の４３４４ヌクレオチドを含有しうる。好ましいのは、２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３；ＤＳＭ ＡＣＣ ３０５；ＥＣＡＣＣ ｒｅｆ．：８５１２０６０２）、２９３Ｔ細胞（ＤＳＭ ＡＣＣ ２４９４；ＥＣＡＣＣ：ｔｓａ２０１，ｒｅｆ．９６１２１２２９）、およびＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３細胞（２９３Ｆ細胞；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｒ７９００７）よりなる群から選ばれるヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ）である。最も好ましいのは２９３Ｆ細胞である。該ベクターを含有する不死化細胞系は、該組換え遺伝子の発現を可能にする条件下で培養される。本質的には、それらは、当業者に公知の標準的な培養条件であるが、ヒト因子ＩＸの遺伝子を含有する細胞の場合には、ビタミンＫを培地内に含有させるべきである。

本発明の特定の実施形態は、安定に不死化され同様に無血清条件下においてトランスフェクトされた細胞の無血清培養内の組換えタンパク質の無血清製造である。そのためには、前記の不死化ヒト細胞系のいずれか、好ましくは２９３Ｆ細胞系を無血清条件下においてトランスフェクトし培養する。該細胞を、血清の非存在下の懸濁培養内で安定にトランスフェクトし、ついで単細胞クローンの選択のために付着細胞増殖に適合化する。個々のクローンが得られたら、それらを付着状態で増殖させる。最良の産生クローンの選択の後、該細胞を懸濁培養に移す。全安定細胞系操作中および更なる製造規模の拡大においては、細胞を無血清培地内で増殖させ、血清にもヒトまたは動物タンパク質にも決して接触させないようにする。該組換え血液タンパク質（例えば、血液凝固因子のいずれか、またはプロテアーゼインヒビター、例えばＡ１ＡＴ、または増殖因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ））を培養ブロスから単離し、ついで標準的な精製工程に付す。より詳しくは、組換えヒト血液タンパク質、特にヒト因子ＶＩＩＩまたは因子ＩＸまたはＡ１ＡＴまたはＧ−ＣＳＦｂの無血清製造の特定の実施形態は以下の工程を含む。

（１）血清の非存在下の懸濁培養内でのヒト不死化細胞、好ましくは２９３Ｆ細胞のトランスフェクション。細胞を、使い捨ての無菌ポリカルボナートエーレンマイヤーフラスコ内で培養する。トランスフェクション剤、好ましくはカチオン性トランスフェクション剤、より好ましくはリポフェクタミン２０００ ＣＤ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、またはリン酸カルシウムトランスフェクション法のための試薬を使用して、細胞を例えば１×１０^６生存可能細胞／ｍｌの密度でトランスフェクトする。ヒト血液タンパク質をコードするベクターをトランスフェクトする。好ましくは、該ベクターはｐｃＤＮＡ３．１−ＦＩＸ、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＶＩＩＩ、ｐｃＤＮＡ３．１−ＡｌＡＴまたはｐｃＤＮＡ３．１−ＧＣＳＦｂである。

（２）トランスフェクションの２４〜１２０時間後、好ましくは３６〜９６時間後、より好ましくは４８時間後、適当な数の細胞（１０^３〜１０^１０個；好ましくは１０^５〜１０^８個、最も好ましくは１０^６個の細胞）を沈降のために平坦な培養皿内に移して付着増殖を確立する。好ましくは、該培養皿は１０ｃｍの皿（ディッシュ）であり、細胞を無血清かつ無タンパク質培地、好ましくはＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地（１２３３８−０１８，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または無血清自社製培地（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ）内で培養する。

（３）該平坦培養皿へ移してから２〜５０時間後、好ましくは４８時間後、選択圧をかけ始める。該培地を、選択マーカー、例えばヒグロマイシン、ネオマイシン、Ｇ４１８およびＺｅｏｃｉｎ（ゼオシン）よりなる群から選ばれる適当な選択剤で補足する。好ましい選択剤は、１０〜３００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜２００μｇ／ｍｌ、最も好ましくは５０μｇ／ｍｌの濃度のヒグロマイシンである。該圧を少なくとも１０〜２０日間、好ましくは１４日間維持し、この場合、該ヒグロマイシン補足培地を１日おきに交換する。安定にトランスフェクトされた細胞のみがこれらの選択条件において生存し、個々に拾い上げられうる付着細胞クローンを形成する。また、細胞を該皿に固着させ、細胞が１つのクローンから別の細胞クローンへと浮遊するのを防ぐために、付着因子を使用することが可能である。この付着因子としては、例えば、ポリ−Ｄ−リシン、ヒトまたは動物タンパク質を含有しない合成培地補足物質、あるいは他の物質が挙げられうるであろう。あるいは、クローンを拾い上げるためにクローニングリングを使用することが可能であろう。

（４）個々の細胞クローンを拾い上げ、選択圧をかけないで細胞を無血清増殖（大規模化）させるために別の培養容器に移す。任意の培養容器が適しているが、好ましくは、個々のクローンをまず、十分な量の培地を含有する９６ウェルプレートに移し、ついで４８ウェル、２４ウェル、１２ウェルおよび６ウェルプレートに移し、ついで遠心チューブに移す。該遠心チューブ段階においては、細胞を懸濁増殖に戻すために穏やかに振とうしながら該細胞を無血清培地内で培養する。該細胞が６セルウェルプレートまたは遠心チューブ段階に達したら、所望により、いくつかの選択基準［すなわち、細胞の増殖速度（より速く増殖する細胞が好ましい）、それらが産生する組換えタンパク質の量］に従い最良の細胞クローンを選択することが可能である。しかし、該選択は、より後のいずれかの段階においても行われうる。

（５）遠心チューブ培養から得られた細胞を、十分な量の無血清培地を含有するエーレンマイヤー培養容器内に播いた。大規模化された懸濁増殖している無血清および無タンパク質細胞クローンに関する追加的な選択基準は以下のとおりである：生存度、細胞形態、凝集の非存在、遠心に対する強固さ、および細胞残渣の非存在。

本発明の方法は、該ベクターがｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ（＋）−ｚｚである場合に特に良好に機能する。ヒトタンパク質、特にヒトＦＩＸ、ＦＶＩＩＩ、Ａ１ＡＴまたはＧ−ＣＳＦｂをコードする遺伝子を、それぞれ図２、３、７および１１に示すとおりそれがＣＭＶプロモーターの制御下に置かれるように挿入することが好ましい。好ましくは、組換え発現されるタンパク質がいずれの突然変異をも伴わず、血漿から単離された野生型タンパク質と構造的に同一となるよう、該遺伝子の野生型配列を挿入する。野生型ヒト因子ＩＸの概要図を図１に示す。配列番号１、２、３および２２は、それぞれｐｃＤＮＡ３．１−ＦＩＸ、ｐｃＤＮＡ３．１−Ａ１ＡＴ、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＶＩＩＩおよびｐｃＤＮＡ３．１−ＧＣＳＦｂの核酸配列を示す。推定タンパク質は、それぞれヌクレオチド９３９−２２２４、９１３−２２５９、６７９−５０５５および９７０−１５８４によりコードされる。

したがって、本発明は、ｐｃＤＮＡ３．１（商標）内にクローニングされてそれぞれｐｃＤＮＡ３．１−ＦＩＸ、ｐｃＤＮＡ３．１−Ａ１ＡＴ、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＶＩＩＩおよびｐｃＤＮＡ３．１−ＧＣＳＦｂを形成し、それらが不死化ヒト細胞、好ましくはヒト胎児腎細胞、例えば２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３；ＤＳＭ ＡＣＣ ３０５；ＥＣＡＣＣ ｒｅｆ．：８５１２０６０２）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３細胞（２９３Ｆ細胞；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｒ７９００７）または２９３Ｔ細胞（ＤＳＭ ＡＣＣ ２４９４；ＥＣＡＣＣ：ｔｓａ２０１，ｒｅｆ．９６１２１２２９）のゲノム内に組込まれる、ヒト因子ＩＸ，Ａ１ＡＴ、因子ＶＩＩＩおよびＧ−ＣＳＦｂの組換え製造方法を提供する。

ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＩＸまたはｐｃＤＮＡ３．１−Ａ１ＡＴまたはｐｃＤＮＡ ３．１−ＦＶＩＩＩまたはｐｃＤＮＡ ３．１−ＧＣＳＦｂを含有する細胞を、遺伝子発現を可能にする標準的な条件下で培養し、あるいはそれらを、ヒト病原体での汚染の危険性を最小限度に抑えるために無血清条件下において培養する。１以上のプリオン除去工程、例えばタンパク質沈殿、濾過、クロマトグラフィー工程、特にアフィニティークロマトグラフィー工程を加えることが可能である。その代わりに／それに加えて、プリオンノックアウト細胞系を発現細胞として使用することが可能である。これは完全ゲノムノックアウトまたはアンチセンス技術により入手可能である。ヒト因子ＩＸの製造の場合、該細胞を、好ましくはビタミンＫの存在下で培養する。該ヒト血液タンパク質を培養上清から単離し、純粋で安定で高活性な産物の収率を最大にするために当技術分野で公知の後続の精製工程（免疫アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど及びそれらの組合せから選ばれる）に付す。それらは、組換え因子ＩＸ、Ｇ−ＣＳＦｂまたはＡ１ＡＴを単離するために必要な具体的な要件に容易に適合化されうる。該精製操作の途中および後における精製タンパク質の量および活性はＥＬＩＳＡおよび／または１段階凝固時間アッセイ（ａＰＴＴ）によりモニターされうる。

精製されたタンパク質サンプルにおける及び選択された分泌組換えタンパク質を含有する細胞培養上清から直接的に得られた産物における生じうる感染汚染の問題を克服するために、培養上清を、加熱処理および／またはＳＤ処理（乾燥または液体状態、プロテアーゼインヒビターを含む化学物質の添加の存在下または非存在下）を含むウイルス不活性化のための操作で処理することが可能であろう。精製法は当業者によく知られている。例えば、アニオン交換クロマトグラフィーによる血漿からの高純度のウイルス不活性化因子ＶＩＩＩの単離および精製および回収が既に記載されているＩ（ＷＯ９３／１５１０５）。また、血漿または他の生物学的起源から高純度非感染性凝固因子を製造するためのいくつかの方法が報告されている。潜在的に感染性である物質を疎水相で処理して２相系を形成させ、ついで該系から水不溶性部分を除去することにより、脂質被覆ウイルスは有効に不活性化される。同時に又は後に非イオン性生体適合性界面活性剤およびリン酸ジアルキルまたはトリアルキルで処理することにより疎水相処理が相補されるという利点も判明している（ＷＯ ９６／３６３６９、ＥＰ ０１３１７４０、ＵＳ ６，００７，９７９）。非脂質被覆ウイルスは、非イオン性界面活性剤での処理およびそれに続く数時間の加熱処理（６０〜６５℃）よりなる不活性化プロトコールを要する（ＷＯ ９４／１７８３４）。ウイルス不活性化後、化学物質を除去するための更なる精製工程が必要かもしれない。要約すると、本発明は、潜在的に危険な感染因子の不活性化のための及び受け入れられているタンパク質精製の方法と組合されたヒト細胞系に基づく有効なタンパク質製造方法を提供する。安全で簡便に使用される、組換えタンパク質（例えば、血液凝固因子ＩＸまたはＶＩＩＩ、Ａ１ＡＴおよびＧ−ＣＳＦｂ）の製造のための系を確立した。組換え製造されたタンパク質の活性は標準的な試験で検査されうる。例えばヒト因子ＩＸの場合には、手動凝固装置と共にＤａｐｐｔｉｎ ＴＣ（Ｋａｏｌｉｎ／Ｓｕｌｆａｔｉｄ−Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ Ｃａｔ．Ｎｏ．５０３５０９０，Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ ＧｍｂＨ）活性化を用いる活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイにより検査されうる。最後に、このようにして得られた組換えタンパク質、例えば前記の血液タンパク質、特にヒト因子ＩＸは、医薬組成物において使用されうる。

本発明は以下の実施例において更に詳しく説明されるが、該実施例は本発明を限定するものと解釈されるべきではない。

実施例
材料および方法
タンパク質発現のためのヒト細胞系： 好ましい細胞系は、ＨＥＫ２９３（ＥＣＡＣＣ Ｒｅｆ．８５１２０６０２）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３（２９３Ｆ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｒ７９００７）および２９３Ｔ（ｔｓＡ２０１，ＥＣＡＣＣ Ｒｅｆ．９６１２１２２９）（これは、ＳＶ４０温度感受性Ｔ抗原を安定に発現する形質転換胎児ヒト腎細胞系である）である。これらの上皮様細胞系は種々の機能発現アッセイにおいて使用されており、高レベルの組換えタンパク質を産生すると報告されている。２９３細胞系に由来する２９３Ｆ細胞系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は後記実施例において好ましく使用された。該親細胞系２９３は、せん断されたヒトアデノウイルス５型ＤＮＡで形質転換された初代胎児ヒト腎から樹立された永久系統である（Ｇｒａｈａｍら，１９７７；Ｈａｒｒｉｓｏｎら，１９７７）。２９３Ｆ細胞系は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３（２９３Ｆ）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（１２３３８−０１８，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）における懸濁増殖に適合化された２９３細胞系の変異体である。２９３Ｆ細胞系はＰｈａｒｍａｃｏｐｅｉａのＲｏｂｅｒｔ Ｈｏｒｌｉｃｋから入手した。２９３Ｆ細胞系は元々は、限界希釈により再クローニングされた親２９３Ｆ細胞に由来する低継代Ｍａｓｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ培養から調製された。細胞は一貫して、無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地または無血清培地（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ）内で、良好な生存度および良好な形態学的特徴を伴って、本発明の開発中の１年以上にわたり培養されている。

ヒト因子ＩＸの効率的な製造のために、該培地はビタミンＫの添加により修飾されうる。これらの細胞系は、適当な補足物質を含有する無血清および／または無タンパク質培地内で培養可能である。

標的タンパク質の決定および測定
ＥＬＩＳＡによるヒト因子ＩＸ濃度の測定： 上清中のヒト組換え因子ＩＸのレベルを、標準的な方法に従い、捕捉抗体としてヤギ抗ヒトＦＩＸ（ＧＡＦＩＸ−ＡＰ，Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を使用するＥＬＩＳＡにより測定した。すべてのインキュベーションは室温で加湿室内で行った。Ｏｃｔａｎｙｎｅ（血漿由来ＦＩＸ，Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）およびＢｅｎｅＦＩＸ（組換えＦＩＸ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の両方の標準品を使用した。検出用抗体はペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＦＩＸ（ＧＡＦＩＸ−ＡＰＨＲＰ，Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）であった。ＡＢＴＳ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１６８２００８，Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を基質として各ウェルに加え、比色反応を４０５ｎｍで１５分のうちに検出した。結果を、標準吸光度に対する標準濃度の直線回帰により算出した。

ヒト凝固因子ＩＸの活性の測定： 上清中のヒト組換え因子ＩＸの凝固活性を以下のとりに測定した。手動凝固装置（Ａｍｅｌｕｎｇ ＫＣ ４Ａ ｍｉｃｒｏ，Ａｍｅｌｕｎｇ ＧｍｂＨ）と共にＤａｐｐｔｉｎ ＴＣ（Ｋａｏｌｉｎ／Ｓｕｌｆａｔｉｄ−Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ Ｃａｔ．Ｎｏ．５０３５０９０，Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ ＧｍｂＨ）活性化を用いる部分トロンボプラスチン時間アッセイに基づいて、凝固活性をアッセイした。該研究のために、トランスフェクトされた細胞からの５０μｌの上清、５０μｌのＦＩＸ欠損血漿（Ｐｒｏｇｅｎ）および５０μｌのＤａｐｐｔｉｎ ＴＣを３７℃で２分間インキュベートした。５０μｌのＣａＣｌ_２（Ｃａｔ．Ｎｏ．８４６８７−２２Ｆ，Ｉｎｓｔｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を加えることにより凝固を開始させた。サンプル凝固時間をＯｃｔａｎｙｎｅまたは／およびＢｅｎｅＦＩＸの両方と比較した。

ＣＯＡＭＡＴＩＣ：ＦＶＩＩＩアッセイ（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）によるＢＤＤｒｈＦＶＩＩＩの測定： 市販の色素原アッセイキットＣＯＡＭＡＴＩＣ：ＦＶＩＩＩ（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，ｃａｔ．Ｎｏ．８２ ２５ ８５）は、ＦＩＸ、ＦＸ、およびＦＸａ切断により黄色の水溶性色素に変化する色素原を含有する。ＦＶＩＩＩ含有サンプルがこの系を完成させる。ＦＶＩＩＩは複合体形成によりＦＩＸを活性化し、この複合体がタンパク質分解切断によりＦＸを活性化してＦＸａを与える。ＦＸａは該色素原を色素へと変化させ、ついで該色素が４０５ｎｍで測光により測定される。この試験は、患者の血漿からのＦＶＩＩＩの測定のために設計される。この試験を希釈培地中の因子ＶＩＩＩの測定に適用可能なものにするために、以下の操作手段の準備を行った。対照標準品として、完全長組換えヒト凝固因子ＶＩＩＩ（ＮＩＢＳＣ，ｏｒｄｅｒ ｎｏ．５７８１４Ｆ）および正常対照血漿（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用した。

サンプル調製：サンプルを、ＣＯＡＭＡＴＩＣ試薬と共に届けられた希釈バッファーで、２〜２０ｍＩＵ／ｍｌの、予想された最終的なＦＶＩＩＩ活性にまで希釈し、ＷＨＯ Ｎｏ．６標準曲線と比較する。

方法：加熱ブロック上に配置された９６ウェルアレイ上で、両方の標準品およびサンプルを三重に測定する。

エラスターゼ活性試験によるＡ１ＡＴ活性の測定： Ａ１ＡＴ ｃＤＮＡのトランスフェクションの後、Ａ１ＡＴが発現され、細胞培養内に分泌された。遠心分離（5分間、１０００ｒｐｍ）による細胞の除去の後、培養上清においてＡ１ＡＴ活性を測定した。この活性試験においては、Ａ１ＡＴ活性を、エラスターゼに対するその阻害作用により測定した。エラスターゼは基質Ｎ−スクシニル−（Ａｌａ）_３−ｐＮＡからｐＮＡを切断する。ｐＮＡの遊離は４０５ｎｍにおいて測光的に測定される。一定のＡ１ＡＴ活性を有する標準サンプルとの比較により、それぞれのサンプルの活性を測定する。他の実験において証明されているとおり、該試験は無血清Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地において妥当なものである。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地が該試験に影響を及ぼさないことを確認するために、２つの標準曲線を作成した。標準ヒト血漿をＴ＋バッファー中またはＦｒｅｅｓｔｙｌｅ培地中で希釈した。

サンプルの希釈： すべてのサンプルは、未希釈、１：１０および１：５０希釈（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地中）で試験し、ヒト血漿の標準希釈液と比較する。

方法： ５０μｌの各標準希釈液およびサンプル希釈液をそれぞれ、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル内にピペッティングした。１５０μｌのエラスターゼ使用溶液を各ウェルに加えた後、該９６ウェルプレートをＥＬＩＳＡリーダー上で１分間振とうし、３７℃で３０分間インキュベートした。１００μｌの基質使用溶液をマルチペットで各ウェルに加えた。基質溶液の添加の直後および暗室中で３７℃で７分間のインキュベーションの後、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。第１の値は、エラスターゼ触媒反応を伴わない場合の基底吸収を表し、エラスターゼが基質からｐＮＡを切断した後の吸光度を表す第２の値から差し引かれる。差し引き後の結果を用いて、標準曲線に基づき該サンプルのＡ１ＡＴ活性を算出する。

ＥＬＩＳＡのＧ−ＣＳＦ活性の測定： 標準的な方法に従い、捕捉抗体としてマウス抗ヒトＧ−ＣＳＦ抗体（ＭＡＢ−２１４，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用するＥＬＩＳＡにより、細胞培養上清中のヒト組換えＧ−ＣＳＦレベルを測定した。すべてのインキュベーションは加湿室内で室温で行った。Ｇ−ＣＳＦ標準品（組換えｈＧ−ＣＳＦ，大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ），２１４−ＣＳ−０２５，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。検出用抗体は、ビオチン化ヤギ抗ヒトＧ−ＣＳＦ（ＢＡＦ−２１４，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）であった。該検出用抗体に連結されたホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＤＹ９９８，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）にストレプトアビジンを結合させた。ＱｕａｎｔａＢｌｕ（商標）Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（１５１６９，Ｐｉｅｒｃｅ）を基質として各ウェルに加えた。蛍光測定反応は励起３２０ｎｍ／発光４２０ｎｍで６０分以内に検出された。結果を標準相対蛍光単位（ＲＦＵ）に対する標準濃度の直線回帰により算出した。

標的タンパク質のクローニング
Ａ．ヒト因子ＩＸのクローニング： ＷＯ０１／７０９６８に開示されているベクターｐＴＧ３６から、ヒト凝固因子ＩＸのオープンリーディングフレームを含有する１．４ｋｂの断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩでの二重消化により切り出した。この断片を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで二重消化されたベクターｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇｒｏ（＋）−ｚｚ（Ｖ８７０−２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来）である５．６ｋｂの断片に連結して、図２に示すベクターｐｃＤＮＡ３．１−ＦＩＸを得た。ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＩＸのＤＮＡ配列を配列番号１に示す。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより公開されている配列（配列番号４に示す）と比べて、ｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇｒｏ（＋）−ｚｚ（配列番号５を参照されたい）においては該ベクターバックボーンにおける３つの追加的ヌクレオチド挿入が見出された。ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ＦＩＸは、安定にトランスフェクトされた細胞クローンに関する選択法を可能にするカセットヒグロマイシン耐性遺伝子を含有する（図２、３および７を参照されたい）。該ベクターは、リン酸カルシウムトランスフェクションなどによる安定発現細胞系の樹立、およびそれに続くヒグロマイシン耐性に関する選択を可能にする。

Ｂ．ヒト因子ＶＩＩＩのクローニング： Ｂドメイン欠失ヒト凝固因子ＶＩＩＩのオープンリーディングフレームを含有する４３８０ｂｐのＦＶＩＩＩｃＤＮＡをベクターｐＴＧＦ８−２ｈｙｇ−ｓ（配列番号７；その製造はＷＯ０１／７０９６８に開示されている）からＮｏｔＩ＋ＸｈｏＩ消化により単離し、ＸｈｏＩ＋ＰｓｐＯＭＩで線状化されたｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇｒｏ（＋）−ｚｚに連結して、図７に示すベクターｐｃＤＮＡ３．１−ＦＶＩＩＩを得た。

Ｃ．ヒトＡ１ＡＴのクローニング： ｍＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ＃ ＭＲＮ−１０）を使用して、Ａ１ＡＴ ｍＲＮＡをＨｅｐＧ−２細胞（ＤＳＭＺ＃ ＡＣＣ １８０）から直接単離した。次の工程において、ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）ビーズ上に捕捉した。ついで、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応）の後、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）（ＡＭＶ ＲＴ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ＃ Ｍ５１０１）でｍＲＮＡは二本鎖ｃＤＮＡに転写される。Ａ１ＡＴ ｃＤＮＡをＰＣＲ反応により増幅した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上にローディングした。適当なＤＮＡバンドを単離し、ついでＱｉａｑｕｉｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ＃ ２８７０４）で精製した。ついでＡ１ＡＴ断片を市販ベクター（ＴＯＰＯ（登録商標）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ＃ Ｋ４６５０−０１）内にサブクローニングした。ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔのクローニングのために、ＰＣＲ ＩＩ ＴＯＰＯ−ＡｌＡＴをＥｃｏＲＩで消化し、Ａ１ＡＴの１３７０ｂｐの断片を、ＥｃｐＲＩで線状化されたｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔに連結した。

ｐＣＩ−ｎｅｏ−Ａ１ＡＴのクローニングのために、ＰＣＲ ＩＩ ＴＯＰＯ−Ａ１ＡＴをＥｃｏＲＩで消化し、Ａ１ＡＴの１３７０ｂｐの断片を、ＥｃｏＲＩで線状化されたｐＣＩ−ｎｅｏに連結した。

ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＶＩＩＩのクローニングのために、１３７０ｂｐのＡ１ＡＴをＰＣＲ ＩＩ ＴＯＰＯ−ＡｌＡＴと共に単離し、ＸｈｏＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＸｈｏＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩにより線状化されたｐｃＤＮＡ３．１に連結した。得られたベクターを図３に示す。

ｐＴＧ１−Ａ１ＡＴのクローニングのために、ＰＣＲ ＩＩ ＴＯＰＯ−Ａ１ＡＴをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで消化した。Ａ１ＡＴの１３７０ｂｐの断片を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで線状化されたｐＴＧ１（ｎｏ ＰＲＥ）に連結した。得られたベクターを図９に示す。

Ｄ．ヒトＧ−ＣＳＦ ｃＤＮＡのクローニング： 全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ，ｃａｔ．Ｎｏ．７４１０４）で天然５６３７ヒト膀胱癌細胞から直接単離した。ついで、単離された全ＲＮＡをＤＮアーゼＩと共にインキュベートして、混入しているかもしれない５６３７細胞ゲノムＤＮＡを消化した。ＤＮアーゼ非含有全ＲＮＡを得るために、該反応混合物をＲＮｅａｓｙクリーン・アップ・キット（ＱＩＡＧＥＮ，ｃａｔ．Ｎｏ．７４２０４）で処理した。全ＲＮＡを鋳型として使用するＲＴ−ＰＣＲを、ＲＮアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．７９９−０１７）の存在下、オリゴ（ｄＴ）１２−１８プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１８４１８−０１２）およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ ＲＮａｓｅ Ｈ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１８０６４−０２２）を使用して行って、５６３７細胞からのｄｓ ｃＤＮＡプールを合成した。ついでＧ−ＣＳＦ ｃＤＮＡをＰＣＲ反応により増幅した。Ｇ−ＣＳＦ ｃＤＮＡをＱＩＡ ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０４）でアガロースゲルから単離し、以下のＧ−ＣＳＦ ＰＣＲプライマーの両方を使用して配列決定した。

５６３７細胞から合成されたＤＮＡの配列は、配列分析により、ＧＣＳＦ−ｂ形態（配列番号２６に示す配列を有する）であると確認された。ついで、前記のとおりに単離されたＧＣＳＦ−ｂ形態のｃＤＮＡを市販ベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に直接連結した。得られたプラスミドをｐＣＲ２．１ｄ２−ＧＣＳＦｂと命名し、図１０に示す。

ＰＣＲ２．１ｄ２−ＧＣＳＦｂをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、７０５ｂｐ ＧＣＳＦｂ ｃＤＮＡ断片を単離し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで線状化されたベクターｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇｒｏ（＋）−ｚｚに連結した。得られたｐＤＮＡ３．１−ＧＣＳＦｂベクターを図１１に示す。

ＰＣＲ２．１ｄ２−ＧＣＳＦｂをＥｃｏＲＩで消化し、６２９ｂｐのＧＣＳＦｂ ｃＤＮＡ断片を単離し、ＥｃｏＲＩで線状化されたｐＣＩＮｅｏベクター内に連結した。得られたｐＣＩＮｅｏ−ＧＣＳＦｂベクターを図１２に示す。

ＰＣＲ２．１ｄ２−ＧＣＳＦｂをＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化し、６９３ｂｐのＧＣＳＦｂ ｃＤＮＡ断片を単離し、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで線状化されたｐＣＭＶＳｃｒｉｐｔベクター内に連結した。得られたｐＣＭＶＳｃｒｉｐｔ−ＧＣＳＦｂベクターを図１３に示す。

ＰＣＲ２．１ｄ２−ＧＣＳＦｂをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、７０５ｂｐのＧＣＳＦｂ ｃＤＮＡ断片を単離し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで線状化されたｐＴＧ２−ｈｙｇ−ａｓベクター内に連結した。得られたｐＴＧ２−ＧＣＳＦｂ−ｈｙｇ−ａｓベクターを図１４に示す。

種々の細胞系および種々のベクターにおける標的タンパク質の発現：
本方法を組換えタンパク質の製造のために最適化する際に、種々の細胞系（すべて、アルファ−１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）の組換え遺伝子を含むベクターを含有する）の高レベル発現能を試験した。ＣＨＯ、ＢＨＫおよび他の細胞系は、一過性トランスフェクションアッセイにおいて、２９３Ｔ細胞系の場合より少量の組換えタンパク質を産生することが判明した。したがって、他のヒト胎児腎細胞系誘導体を調べた。結果を図４〜６に示す。

無血清条件下においてトランスフェクトされた培養された２９３Ｆ細胞と比較した場合の血清含有培地内の２９３Ｔおよび２９３細胞の一過性トランスフェクション：
２９３Ｔまたは２９３細胞の０．１〜０．２×１０^６個の生存可能細胞を６ウェル内にプレーティングした。翌日、リン酸カルシウム法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：７ ６３２−６３８（１９８８））を用いて細胞をトランスフェクトした。すなわち、４μｇのプラスミドＤＮＡを０．１×ＴＥバッファー（２００μｌのトランスフェクション混合物を含有）中で希釈し、穏やかに混合し、２０μｌの２．５Ｍ ＣａＣｌ_２および１００μｌの２×ＨＢＳを該トランスフェクションサンプルに加えた。該トランスフェクションサンプルを室温で２０分間インキュベートした。６時間のインキュベーションの後、培地を交換し、ついで細胞を４８時間インキュベートした。

無血清培地内の２９３Ｆ細胞における標的タンパク質の無血清トランスフェクションおよび発現：
１０^６個の生存可能２９３Ｆ細胞の細胞密度で２８ｍｌの懸濁培養を調製した（トランスフェクション実験の当日）。３０μｇのプラスミドＤＮＡをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で１ｍｌの総容量になるまで希釈することにより、脂質−ＤＮＡ複合体を調製し、４０μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎ（登録商標）をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）中で１ｍｌの総容量になるまで希釈した。室温で５分間のインキュベーションの後、希釈されたＤＮＡを２９３ｆｅｃｔｉｎ（登録商標）に加えて２ｍｌの総容量とした。該トランスフェクト化サンプルを暗所で室温で２０分間インキュベートした。２ｍｌの該トランスフェクション混合物を２８ｍｌの２９３Ｆ懸濁培養（最終細胞密度は１×１０^６細胞／ｍｌ）に加えた。該トランスフェクト化２９３Ｆ細胞を、１２５ｒｐｍで回転する軌道（ｏｒｂｉｔａｌ）振とう器上、３７℃／空気中の８％ ＣＯ_２の湿潤雰囲気において７２時間インキュベートした。

Ａ：Ａ１ＡＴのトランスフェクションおよび発現： ２９３Ｆを２９３および２９３Ｔ細胞と比較するそれらの実験の結果を図４に示す。すべての実験において、一定量の細胞（１０^６細胞）をｐｃＤＮＡ３．１−Ａ１ＡＴでトランスフェクトした。これらの種々の細胞系において発現されたＡ１ＡＴの量を比較した。２９３Ｆ細胞におけるＡ１ＡＴの発現量を１００％に設定した。図４から認められうるとおり、２９３および２９３Ｔ細胞は２９３Ｆ細胞に対して僅か１２〜１３％量のＡ１ＡＴを産生したに過ぎなかった。

さらに、種々のベクターバックボーンが、２９３Ｆ細胞において産生される組換えタンパク質の量に影響を及ぼすかどうかを試験した。ヒトアルファ−１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）のコード配列をｐＴＧ（自社製ベクター）、ｐＣＭＶ Ｓｃｒｉｐｔ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃｌ ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびｐｃＤＮＡ３．１（商標）ベクター内に挿入した。

ｐｃＤＮＡ３．１−Ａ１ＡＴからのＡ１ＡＴの発現レベルを１００％に設定した。それらの他のベクターはいずれも、、ｐｃＤＮＡ（商標）３．１−Ａ１ＡＴで見られた高い発現に近い発現を示さなかった。ｐｃＤＮＡ ３．１−Ａ１ＡＴはＥＬＩＳＡでの検出で最大量のＡ１ＡＴを産生することが判明した（図５を参照されたい）。該自社製ベクターは、ｐｃＤＮＡ３．１から発現されたＡ１ＡＴの量に対して僅か２０％の量を発現したに過ぎず、その他の市販ベクターは該Ａ１ＡＴ量に対して１５〜３０％の範囲を示した。したがって、すべての更なる実験のためにｐｃＤＮＡ３．１を選択した。

要約すると、種々の細胞系が、Ａ１ＡＴ遺伝子を含有するｐｃＤＮＡ３．１（商標）で一過性にトランスフェクトされていた。無血清２９３Ｆ細胞系は１０^６細胞当たりに２９３Ｔおよび２９３細胞の場合より７倍多いＡ１ＡＴを発現することが示された。したがって、安定トランスフェクション実験のためにｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３Ｆ細胞系を選択した。

一過性トランスフェクション実験の結果を図６に示す。上パネル（Ａ）は、異なるトランスフェクションベクターを使用する６つの異なるトランスフェクション試験の上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。解析用図面から導き出されるとおり、分析した細胞培養上清中に存在するα１−アンチトリプシンは、１である抗原に対する活性比から推定されうるとおり良好な質を有すると結論づけられうる（非表示データ）。該試験結果の妥当性は、陰性対照がα１−アンチトリプシン活性も抗原も示さないことから推定されうる。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された分子量分布は、それらの３つのα１−アンチトリプシン含有サンプルに関する、十分に比較しうる分子量分布像を示した。該陰性対照においては、予想どおり、α１−アンチトリプシンに相当するバンドが欠如しているだけでなく、２７ｋＤの分子量の追加的なバンドが視認されうる。

ウエスタンブロット法（抗ヒトα１−アンチトリプシン一次抗体を使用するもの）を用いる分析により、該タンパク質は、還元条件下、予想分子量領域において確認されうる。分割（ｓｐｌｉｔ）産物は視認できない。

黒矢印は、５２ｋＤａの組換えタンパク質アルファ−１−アンチトリプシンに対応する優勢バンドを示す。レーン４および８に、２７ｋＤａのＧＦＰタンパク質に対応するバンドも視認可能であり、これは、細胞系ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３Ｆ細胞内で対照として一過性に発現されたものである。レーン１、２、３および５、６および７における追加的なバンドは宿主細胞タンパク質（ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３Ｆ細胞由来）である。下パネル（Ｂ）はウエスタンブロット分析を示す。該アッセイの、より高い厳密さ（ストリンジェンシー）のため、該結果はより簡潔に見え、Ａ１ＡＴに対応するバンドのみが視認されうること以外は、それらの結果は同一である。

Ｂ：ＦＶＩＩＩのトランスフェクションおよび発現： 図８に、最良の３つの安定にトランスフェクトされたクローンの因子ＶＩＩＩの平均量を示す。ｐｃＤＮＡ−ＦＶＩＩＩベクターで発現されたそれらの３つの最良クローンの因子ＶＩＩＩの平均量を産生率（産生度）１００％に設定した。自社製ベクターｐＴＧＦ８−２ｈｙｇ−ｓとの比較は、２９３Ｆ細胞におけるｐｃＤＮＡ３．１−ＦＶＩＩＩベクターでは、約３倍高い因子ＶＩＩＩの産生率を示している。

Ｃ：ＦＩＸのトランスフェクションおよび発現： 因子ＩＸを発現するｐｃＤＮＡ３．１−ＦＩＸおよびｐＵＣ １９／Ｘに基づくベクターｐＴＧＦ３６（ＷＯ ０１／７０９６８を参照されたい）を使用して安定にトランスフェクトされた２９３Ｆ細胞においては、以下の表１において認められうるとおり、２９３Ｆ細胞内でｐｃＤＮＡ３．１ベクターを使用することにより約３倍高い産生率（産生度）を示すことが可能であった。

Ｇ−ＣＳＦｂの製造
Ａ．無血清培地内での２９３Ｆ細胞のトランスフェクション，一過性トランスフェクション： １．１×１０^６生存可能２９３Ｆ細胞／ｍｌの細胞密度での２９３Ｆ細胞の２８ｍｌの懸濁培養をトランスフェクション実験の当日に調製した。３０μｇのプラスミドＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ３．ｌ−Ｇ−ＣＳＦｂ）をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で１ｍｌの総容量になるまで希釈することにより、脂質−ＤＮＡ複合体を調製し、３０μｌのリポフェクタミン２０００ＣＤをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）中で１ｍｌの総容量になるまで希釈した。室温で５分間のインキュベーションの後、希釈されたＤＮＡをリポフェクタミン２０００ＣＤに加えて２ｍｌの総容量とした。該トランスフェクト化サンプルを暗所で室温で２０分間インキュベートした。２ｍｌの該トランスフェクション混合物を２８ｍｌの２９３Ｆ懸濁培養（最終細胞密度は１×１０^６細胞／ｍｌ）に加えた。該トランスフェクト化２９３Ｆ細胞を、１２５ｒｐｍで回転する軌道（ｏｒｂｉｔａｌ）振とう器上、３７℃／空気中の８％ ＣＯ_２の湿潤雰囲気において７２時間インキュベートした。

Ｂ．安定トランスフェクション： 前記Ａに記載の一過性トランスフェクションの７２時間後、適当な数の細胞（１０^５〜１０^６個の細胞）を沈降のために平坦な培養皿内に移して付着増殖を確立した。該平坦皿へ移してから２〜５０時間後、好ましくは４８時間後、選択圧をかけ始めた。好ましい選択剤は７５μｇ／ｍｌの濃度のヒグロマイシンであった。該圧を少なくとも１０〜２０日間、好ましくは１４日間維持し、この場合、該ヒグロマイシン補足培地を２〜３日間の全てにおいて交換した。

Ｃ．分析および採集ロボットＣｌｏｎｅＰｉｘＦＬ（Ｇｅｎｅｔｉｘ）を使用する最良Ｇ−ＣＳＦ産生クローンの選択： 前記Ｂに記載のとおりに安定にトランスフェクトされたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞を、約２日後、クローンの選択のための適当な抗生物質および蛍光による最高産生クローンの検出のための標識抗体を含有する半固体のメチルセルロースに基づく培地内に播いた。後に数百個のＧ−ＣＳＦ最良産生クローンのみを拾い上げるために、多数（数千個）のクローンを、細胞数およびＧ−ＣＳＦ分泌に関して、ＣｌｏｎｅＰｉｘＦＬ（Ｇｅｎｅｔｉｘ）を使用して分析した。非産生クローンおよび混合クローンまでもがランダムに拾い上げられる他の公知法とは対照的に、ＣｌｏｎｅＰｉｘＦＬの使用は、単一の細胞に由来する高産生体のみである速く増殖しているクローンの拾い上げを可能にする。拾い上げられた細胞を、完全な操作のための無血清条件下、マイクロタイタープレート内で、ついで遠心チューブ、細胞培養フラスコおよび発酵槽内で増殖させる。

この場合も、すべての安定トランスフェクション操作は無血清条件下において行う。また、すべての後続の増殖および細胞培養操作中、該細胞は血清または動物由来タンパク質に全く接触しなかった。増殖中、強固さ、高い増殖速度、生存度および活性Ｇ−ＣＳＦの産生（ＥＬＩＳＡ形態で測定されるもの）に関して最良クローンを選択する。この選択段階の後、拾い上げたクローンを、抗生物質補足物の非存在下、無血清条件下において培養する。全操作中、２９３Ｆ細胞を完全無血清条件下において培養し、培地を１日おきに交換した。該細胞の大規模化は、Ｋｕｈｎｅｒ Ｓｈａｋｅｒｓ内のエーレンマイヤーフラスコからより高容量のウェイブ・リアクター（ｗａｖｅ ｒｅａｃｔｏｒ）（Ｗａｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ）へと、完全無血清条件下において行った。この選択中、僅か数個の最良産生クローンへと該数を再び減少させる。適切なｃＤＮＡ配列、ｍＲＮＡ含量および発酵の際の挙動は、サブクローニングのための最良クローンを特定するための基準である。このためには、選択されたクローンの細胞をプレーティングし、分析し、ＣｌｏｎｅＰｉｘＦＬで拾い上げ、ついで前記のとおりに増殖させ選択する。サブクローニングは、該クローンのプレーティングされた亜集団における生じうる遺伝的変異を排除するために、より良好な産生クローンを再び選択するための必須工程である。サブクローニング後、選択されたクローンを再び、無血清条件下において保存する。発現された組換えヒトＧ−ＣＳＦタンパク質は、より詳細に生化学的に特徴づけられる。

Ｄ．ＥＬＩＳＡによるヒトＧ−ＣＳＦ濃度の測定： このようにして得られたＦｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞系により発現されたｒｈＧ−ＣＳＦの量をＥＬＩＳＡにより測定し、種々のベクターでトランスフェクトされた細胞で得られたタンパク質の収量を比較した（図１５を参照されたい）。実施例２および３に記載のＦＩＸおよびＡ１ＡＴでの発現実験から予想されたとおり、この場合も、ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ＧＣＳＦｂと２９３Ｆ細胞系との組合せが最高の産生率を示し、したがって、これを組換えヒトＧ−ＣＳＦｂの製造に使用した。

Ｅ．還元性ＳＤＳ ＰＡＧＥにおけるｒｈＧ−ＣＳＦのウエスタンブロット： ＨＥＫ２９３およびＨＥＫ２９３Ｆ細胞からの上清において産生された１０μｌのＧ−ＣＳＦを１５％ ＳＤＳ ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット上で分析した。Ｇ−ＣＳＦの検出はＢＡＦ２１４−ｂｉｏ／ＳＡ−ＨＲＰ／ＤＡＢにより行った（図１６を参照されたい）。矢印は、正しい分子量のｒｈＧ−ＣＳＦの単量体バンドを示す。

配列表（フリーテキスト）

配列番号６：ベクターｐＴＧ１−ＡｌＡＴ

配列番号８：ヒト野生型因子ＶＩＩＩ ｃＤＮＡ

配列番号９：ヒト野生型因子ＶＩＩＩ

配列番号１０−１２：リンカーペプチド

配列番号１３：ｈＦＶＩＩ ａ形態のｃＤＮＡ

配列番号１４：ｈＦＶＩＩ ｂ形態のｃＤＮＡ

配列番号１５：ヒトＧＣＳＦ ａ形態のｃＤＮＡ，ＣＤＳ：４１−６６１

配列番号１６：ヒトＧＣＳＦ ｂ形態のｃＤＮＡ，ＣＤＳ：４１−６５２

配列番号１７：ヒトＧＣＳＦ ｃ形態のｃＤＮＡ，ＣＤＳ：２２９−８２８

配列番号１８：ｈｖＷＦのｃＤＮＡ

配列番号１９および２０：Ｇ−ＣＳＦフォワードおよびリバースプライマー

配列番号２６：ヒトＧＣＳＦ ｂ形態のｃＤＮＡ

配列番号２７：ヒトＧＣＳＦ ｂ形態タンパク質

野生型ヒト凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）タンパク質。ＦＩＸ遺伝子の、その５’非翻訳（５’ＵＴＲ）領域およびその３’ＵＴＲ領域を伴う概要図。プロセシングされていない４６１アミノ酸のタンパク質の以下の８個のドメインが示されている：Ｓ：シグナルペプチド；Ｐ：プロペプチド；Ｇｌａドメイン：γ−カルボキシグルタミルドメイン；Ｈドメイン：疎水性配列；ＥＧＦドメイン：上皮増殖因子様ドメイン；Ｌ：連結配列；ＡＰ：活性化ペプチド；触媒ドメイン。ＦＩＸ成熟タンパク質は４１５アミノ酸の長さ、および約５５ｋＤａの分子量を有する。 ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ＦＩＸ。該環状ＤＮＡベクターは６，９６０塩基対を含み、その厳密な配列は配列番号１に示されている。該概要図には、ＣＭＶプロモーター（ＣＭＶ）、ヒトＦＩＸ遺伝子（ｈＦＩＸ）、ｆ１起点（ｆ１）、ＳＶ４０プロモーター（ＳＶ４０）の制御下のヒグロマイシン（Ｈｙｇ）遺伝子、ポリＡ領域（ＳＶ４０ポリＡ）、ｐＵＣ起点およびアンピシリン（Ａｍｐ）耐性遺伝子ならびに多数の制限部位が示されている。このベクターは、再配列決定されたｐｃＤＮＡ３．１ベクターである、配列番号５のｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇｒｏ（＋）−ｚｚに由来する。 ベクターｐｃＤＮＡ３．１−Ａ１ＡＴ。該環状ＤＮＡベクターは６，９１４ｂｐを含み、その厳密な配列は配列番号２に示されている。該概要図には、ＣＭＶエンハンサープロモーター、Ａ１ＡＴ ｃＤＮＡ、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ポリＡ）シグナル（ｍＲＮＡ安定性の増強のための転写終結配列を含む）、ｆ１起点（ｆ１）、ＳＶ４０プロモーター（ＳＶ４０）の制御下のヒグロマイシン（Ｈｙｇ）遺伝子、ＳＶ４０ポリＡ領域（ＳＶ４０ポリＡ）、ｐＵＣ起点およびアンピシリン（Ａｍｐ）耐性遺伝子ならびに多数の制限部位が示されている。このベクターは配列番号５のｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇｒｏ（＋）−ｚｚに由来する。 アルファ−１−アンチトリプシンをコードするベクターでの種々のヒト胎児腎細胞の一過性トランスフェクション。一過性トランスフェクション研究における細胞系に比較が示されている。細胞１０^６個当たりに発現されたアルファ−１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）の量（％）が２９３、２９３Ｔおよび２９３Ｆ細胞に関して示されている。ｐｃＤＮＡ３．１−Ａ１ＡＴで一過性にトランスフェクトされた２９３Ｆ細胞において発現されたＡ１ＡＴの量が１００％に設定されている。 アルファ−１−アンチトリプシンをコードする種々のベクターでの２９３Ｆ細胞系の一過性トランスフェクション。一過性にトランスフェクトされたｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞系を使用して種々のベクターから発現されたＡ１ＡＴ濃度の比較が示されている。Ａ１ＡＴ ｐｃＤＮＡ３．１−Ａ１ＡＴの発現レベルが１００％に設定されている。Ａ１ＡＴ遺伝子を含有する種々の他のベクターも試験した。自社製ベクターｐＴＧ１−Ａ１ＡＴ（図１０に示す、ヒト組換えＡ１ＡＴを製造するための自社製ベクター）、ｐＣＭＶ Ｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ａ１ＡＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびｐｃｌ ｎｅｏ−Ａ１ＡＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をｐｃＤＮＡ３．１−Ａ１ＡＴ（ｐｃＤＮＡ３．１）に対して比較した。それらの他のベクターはいずれも、ｐｃＤＮＡ３．１−Ａ１ＡＴで見られた高い発現レベルに近いレベルを示さなかった。 細胞培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット。ｐｃＤＮＡ３．１−Ａ１ＡＴ（レーン１〜３および６〜８）で又はＧＦＰを発現する対照プラスミド（レーン４および８）で一過性にトランスフェクトされたｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞の上清のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットの両方により分析した。レーン１はサイズマーカーを含有し、レーン５は空である。Ａ１ＡＴに関するバンドが矢印で示されている。レーン４および８に、ＧＦＰに対応する２７ｋＤａバンドも視認されうる。 図７は、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｆ．ＶＩＩＩを示す。該ベクターは９，９７５ｂｐを含み、その厳密な配列は配列番号３に示されている。ｂｐ７８３−５１６２によりコードされる因子ＶＩＩＩタンパク質は、ＷＯ ０１／７０９６８に開示されているＢドメイン欠失因子ＶＩＩＩ突然変異体である。この場合も、このベクターは配列番号５のｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇｒｏ（＋）−ｚｚに由来する。 ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＶＩＩＩおよび自社製ベクターｐＴＧＦ８−２ｈｙｇ−ｓで２９３および２９３Ｆ細胞をトランスフェクトして得られた最良の３つの安定にトランスフェクトされたクローンの産生因子ＶＩＩＩの平均量の比較。その厳密な配列は配列番号７に示されている。 図９はベクターｐＴＧ１−Ａ１ＡＴを示す。該ベクターは５，６１０ｂｐを含み、その厳密な配列は配列番号６に示されている。 図１０はベクターｐＣＲ２．１ｄ２−ＧＣＳＦｂを示す。該ベクターは４，５４２ｂｐを含み、その厳密な配列は配列番号２１に示されている。 図１１はベクターｐＤＮＡ３．１−ＧＣＳＦｂを示す。該ベクターは６，２３７ｂｐを含み、その厳密な配列は配列番号２２に示されている。 図１２はベクターｐＣＩＮｅｏ−ＧＣＳＦｂを示す。該ベクターは６，１０１ｂｐを含み、その厳密な配列は配列番号２３に示されている。 図１３はベクターｐＣＭＶＳｃｒｉｐｔ−ＧＣＳＦｂを示す。該ベクターは４，９２０ｂｐを含み、その厳密な配列は配列番号２４に示されている。 図１４はベクターｐＴＧ２−ＧＣＳＦｂ−ｈｙｇ−ａｓを示す。該ベクターは６，９１７ｂｐを含み、その厳密な配列は配列番号２５に示されている。 図１５は、実施例９に従い種々の発現構築物により産生されたｒｈＧ−ＣＳＦの量を比較している。 図１６は、実施例９に従い産生されたｒｈＧ−ＣＳＦのウエスタンブロットを示す。

Claims (13)

1. ヒト標的タンパク質またはその誘導体もしくは突然変異体をコードする遺伝子、プロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを含む核酸配列により安定的にトランスフェクトされた不死化ヒト細胞系の製造方法であって、
   前記プロモーターおよびポリＡシグナルはそれぞれ、前記ヒト標的タンパク質をコードする遺伝子の５’及び３’末端に連結されており、
   前記方法は、ｐｃＤＮＡ３．１に由来し、前記核酸配列および複製起点を含むトランスフェクションベクターにより、不死化ヒト宿主細胞系を無血清条件下においてトランスフェクトすることと、前記不死化ヒト細胞系を無血清条件下において培養することと、安定的にトランスフェクトされた細胞を選択することとを含み、
   前記トランスフェクションベクターは、選択マーカーに対応する少なくとも１つの遺伝子をさらに含み、
   前記核酸配列および複製起点は、不死化ヒト細胞系のゲノム中に組み込まれ、および
   前記不死化ヒト細胞系が、２９３Ｆ細胞である、方法。
2. ヒト標的タンパク質が、ヒト血漿タンパク質、増殖因子、サイトカイン、プロテアーゼインヒビター、輸送タンパク質、ホルモン、及び抑制または調節作用性タンパク質から選択される請求項１記載の製造方法。
3. ヒト標的タンパク質が、因子Ｖ、因子ＩＸ、野生型因子ＶＩＩＩ、Ｂドメイン欠失因子ＶＩＩＩ、因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ、フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）、エリスロポエチン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン、アルファ−１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）およびキモトリプシンから選択されるヒト血漿タンパク質である、請求項１記載の製造方法。
4. ヒト標的タンパク質が、配列番号１のｂｐ９３９−２３２４によりコードされる血液凝固因子ＩＸ、配列番号２のｂｐ９７３−２２５９によりコードされるヒトＡ１ＡＴ、配列番号９に示される野生型因子ＶＩＩＩ、配列番号３のｂｐ７８３−５１６２によりコードされるＢドメイン欠失ヒト因子ＶＩＩＩ、配列番号１３および１４によりコードされる因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ、配列番号１５、１６および１７によりコードされるＧ−ＣＳＦ、または配列番号１８によりコードされるｖＷＦから選択される、請求項１記載の製造方法。
5. トランスフェクションベクターにおいて、
   （ｉ）プロモーターが、ウイルスプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーターおよび組織特異的プロモーターから選ばれ、および／または
   （ｉｉ）複製起点が細菌におけるプラスミドの複製および増幅を可能にし、および／または
   （ｉｉｉ）該ベクターが更に、１以上の他の調節要素を含有する、
   請求項１または２記載の製造方法。
6. トランスフェクションベクターが、ＣＭＶプロモーター、ヒグロマイシン遺伝子、ポリＡ配列および目的とする遺伝子を含有する、請求項５記載の製造方法。
7. 無血清トランスフェクションを、カチオン性トランスフェクション剤またはリン酸カルシウムを使用して血清の存在しない懸濁培養内で行う、請求項１〜６のいずれか１項記載の製造方法。
8. 請求項１〜７のいずれか１項記載の製造方法により入手可能な不死化ヒト細胞系を培養することを含んでなる、ヒト標的タンパク質またはその誘導体もしくは突然変異体の組換え製造方法。
9. ヒト標的タンパク質が、配列番号３に示されるＢドメイン欠失ヒト因子ＶＩＩＩである請求項８記載の製造方法。
10. 組換えヒトタンパク質を培養ブロスから濃縮する工程、および該タンパク質を精製する工程を更に含む、請求項８または９記載の製造方法。
11. ヒトタンパク質の製造を無血清条件下において行う、請求項８〜１０のいずれか１項記載の製造方法。
12. 請求項１〜６のいずれか１項記載の方法における、ヒト標的タンパク質またはその誘導体もしくは突然変異体をコードする遺伝子を含む核酸配列と複製起点とを含んでなるｐｃＤＮＡ３．１ベクターの使用。
13. 標的タンパク質が、ヒトタンパク質凝固因子Ｖ、因子ＩＸ、ヒトＡ１ＡＴ、野生型ヒト血液凝固因子ＶＩＩＩ、Ｂドメイン欠失ヒト血液凝固因子ＶＩＩＩ、Ｇ−ＣＳＦ ａ形態、Ｇ−ＣＳＦ ｂ形態、Ｇ−ＣＳＦ ｃ形態、ＦＶＩＩ／ＶＩＩａ ａ形態、ＦＶＩＩ／ＶＩＩａ ｂ形態およびｖＷＦよりなる群から選ばれる、請求項１２記載の使用。

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