BRPI0613721B1

BRPI0613721B1 - Método para preparar uma linhagem de célula humana imortalizada e método para produção recombinante de uma proteína alvo humana

Info

Publication number: BRPI0613721B1
Application number: BRPI0613721-0A
Authority: BR
Inventors: Carola Schroder; Cathleen Wegmann; Haiyan Ding
Original assignee: Octapharma Ag
Priority date: 2005-06-30
Filing date: 2006-06-29
Publication date: 2022-05-24
Also published as: SI1896590T1; CA2611708C; EP1896590B1; KR20080028891A; IL266122A; WO2007003582A3; CN105755041A; WO2007003582A2; EP1896590A2; EP1739179A1; JP2008544750A; US8871439B2; US20160177362A1; IL250575A0; PL1896590T3; AU2006265173B2; NO20076087L; US9796986B2; BRPI0613721A2; ES2574584T3

Abstract

TRANSFECÇÃO ESTÁVEL ISENTA DE SORO E PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS HUMANAS RECOMBINANTES EM LINHAGENS DE CÉLULAS HUMANAS. A presente invenção refere-se a um método aperfeiçoado para a produção isenta de soro, com um vetor específico transportando a codifiçação gênica para a proteína de interesse. Além disso, a invenção refere-se a uma linhagem de célula de produção obtida pelo dito método, um método de produção para a dita proteína de interesse que utiliza a dita linhagem de célula de produção, e o vetor específico transportando o próprio gene de interesse.

Description

[01] A presente invenção refere-se a um método aper feiçoado para a produção isenta de soro de uma linhagem de célula humana imortalizada estavelmente transfectada, sob condições isentas de soro, com um vetor específico transportando a codificação gênica para a proteína de interesse. Além disso, a invenção refere-se a uma linhagem de célula de produção obtida pelo dito método, um método de produção para a dita proteína de interesse que utiliza a dita linhagem de célula de produção, e o vetor específico transportando o próprio gene de interesse.

ANTECEDENTES

[02] A produção recombinante de proteínas humanas é geralmente realizada por cultivo de linhagens de células eucarióticas esta- velmente transfectadas e, preferivelmente, mamíferas e isolamento da proteína do caldo de cultura. No caso das proteínas recombinantes serem destinadas a aplicações farmacêuticas, foi, por um longo tempo, prática geral empregar linhagens de células não-humanas de modo a excluir o risco de co-purificar agentes infecciosos, que podem ser alojados e expressos por células humanas.

[03] Na produção de algumas proteínas humanas, tal como fator VIII

[04] de coagulação do sangue humano, verificou-se que o uso de linhagens de células não-humanas acarreta certas desvantagens, por exemplo, níveis de secreção insatisfatórios da proteína expressa no meio. Acredita-se que isso pode ser devido a ligeiras diferenças dentro dos tipos diferentes de células mamíferas com respeito a vias intracelulares para tradução e modificação de proteína, que pode também ter efeito sobre a atividade biológica do polipeptídeo expresso. Além disso, há preocupações de que proteínas terapêuticas purificadas de sistemas de expressão não- humanos fiquem contaminadas com componentes celulares que podem produzir reações antigênicas nos pacientes. Também, uma outra preocupação era o padrão de glicosilação não-humana encontrado nas proteínas humanas produzidas recombinantemente em sistemas de expressão não- humanos. Imagina-se que isso aumenta a probabilidade de reações antigê- nicas no paciente. Ademais, a estabilidade e eficácia biológicas das proteínas do sangue, tais como fatores de coagulação, são substancialmente influenciadas pelo seu padrão de N-glicosilação. Especialmente, monossaca- rídeos periféricos e terminais são importantes porque eles são detectados por receptores específicos provenientes de células que são responsáveis por sua degradação. Fatores de coagulação, por exemplo, transportam resíduos de ácido siálico como monossacarídeos terminais. Modificação na composição dos ácidos siálicos nas antenas das glicoproteínas pode resultar em pa-drões de glicosilação heterogênea. Assim, a estabilidade e eficácia biológicas estão crucialmente envolvidas quando a modificação ocorre. Logo, é uma consideração importante na produção de fatores de coagulação recom- binantes para avaliar a influência da glicosilação de linhagens de células de produção não-humanas versus linhagens de células humanas.

[05] Por outro lado, métodos gerais para expressão de proteína de alto nível de um gene desejado compreendendo linhagens de células mamíferas, imortalizadas, estavelmente transfectadas, expressando proteínas ativadoras de transcrição viral (por exemplo, Patente U.S. 5.712.119). Essas linhagens de células podem ser transformadas com uma construção de vetor, onde um promotor de transcrição viral adequado é ope- ravelmente associado a uma seqüência de DNA que define um gene de interesse, as proteínas ativadoras de transcrição fornecidas pelas linhagens de células ativam o promotor de transcrição viral e, logo, iniciam a expressão do gene de interesse.

[06] Tão importante quanto à linhagem de célula é o vetor usado para a introdução do gene recombinante em uma linhagem de célula de produção imobilizada. Uma grande variedade de vetores foi utilizada para tradução de proteínas mamíferas (por exemplo, Witsch Baumgartner, M et al. Am. J. Genet (2000). 66, 402-412, clonaram DHCR7 cDNA em vetor de expressão mamífero pCI-neo e expressaram nas células HEK 293; McGarvey, T. W. et al. Oncogene (2001) 20, 1041-1051 clonaram o gene TERE1 no vetor de expressão mamífero pTARGET e expressaram no carcinoma de células transicionais da bexiga humana; e Lin Lin et al. J Biol Chem (2002) 277 (44) 41872-8 clonaram o gene AchR no vetor de expressão de célula de mamífero, vetor pEF6/vetor myc-His e expressaram este em células 293. Um vetor muito potente recentemente desenvolvido, que provou que é capaz de cuperexpressar proteínas recombinantes, é o assim chamado vetor pcDNA®3.1 da Invitrogen. Li J. et al., Life Sci. 2004, 16 de abril; 74(22):2693-705 têm superexpressado com sucesso histona desacetilases usando pcDNA 3.1 em células HEK 293. As células foram estavelmente transfectadas e cultivadas em presença de soro. Yuan-Gen Fu. et al., World J Gastroenterol 2003 têm produzido Caspase-3 recombinante usando um vetor eucariótico com base em pcDNA 3.1(+) em linhagem de célula de câncer gástrico SGC7901 transientemente transfectada com o dito vetor e cultivada em presença de soro. Ma H. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. Dezembro de 2000; 41(13); 4232-9 examinaram a carência de proteína estável e perda de atividade enzimática expressando Lp82 e proteínas relacionadas a Lp82 subclonadas em vetor pcDNA3.1 usando COS-7 como linhagem de célula. As células foram transientemente transfectadas e cultivadas em presença de soro no meio. Superexpressão de tioredoxina previne a redução induzida por NO da atividade de NO sintase em células endoteliais do pulmão. Zhang J. et al., Am J Physiol. Agosto de 1998; 275(2 Pt 1): L288-93 descrevem a superexpressão de tioredoxina em células endoteliais de artérias pulmonares de porco, cultivadas, por transfecção transiente destas células com vetor pcDNA 3.1. As células transfectadas foram cultivadas em meio suplementado com soro. Shinki T. et al., Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A 25 de novembro de 1997; 94(24):12920-5 compararam um cDNA de comprimento completo para a oxidase de função mista de citocroma P450 mitocondrial de rim de rato, 25-hidrovitamina D3-1alfa-hidroxilase com cDNA de rim de rato com deficiência D e subclonaram este em vetor de expressão mamífero pcDNA 3.1 (+) e transfectaram transientemente o vetor em células de rim de macaco transformadas com COS-7. As células transfectadas foram cultiva- das em meio suplementado com soro. Zhang e al., Acta Biochimica et Bi- ophysica Sinica 2004, 36(10); 707-712 descrevem a transfecção de células 293 de rim embrionário humano com pcDNA contendo um gene que codifica o anticorpo Fv de cadeia simples 520C9 humanizado/proteína de fusão inter- leucina-2 humana. O sobrenadante foi retirado depois de ter cultivado as células por três dias em meios SFM II isentos de soro. A proteína de fusão resultante possuía especificidade de ligação contra p185 (alvo promissor para terapia com anticorpos em câncer da mama) e reteve as importantes atividades imunoestimulantes de IL-2. Chen, J.Z. et al., Int J Biochem Cell Biol., Agosto de 2004; 36(8):1554-61 cuperexpressaram proteínas Bim, que são fatores essenciais para apoptose, usando células HEK 293 tranfectadas com pcDNA alpha 3.

[07] Uma outra medida para aumentar a segurança de proteínas recombinantes para aplicações farmacêuticas é o uso de meio isento de soro no processo de cultura, pois o uso de soro representa um perigo para a segurança, bem como uma fonte de contaminações indesejadas. Tal cultivo isento de soro tem a desvantagem de que os rendimentos do processo de produção são geralmente significantemente reduzidos. Uma outra preocupação com a segurança é o uso de soro quando as células hospedeiras estão sendo transfectadas de um modo regular na prática, pois o uso de soro no procedimento de transfecção pode fazer com que material biológico indesejado seja integrado nas células, que mais tarde contaminarão o produto expresso pelas células no processo de produção. Embora alguns dos métodos disponíveis para a produção de proteínas recombinantes (incluindo aqueles mencionados acima) realmente possibilitem o cultivo isento de soro, a transfecção estável isenta de soro de células humanas não é conhecida. No 19o ESACT Meeting, Harrogate, 5-8 de junho de 2005, as transfecção isenta de soro de células CHO foi sugerida por Kuchenbecker et al.

[08] Assim, é desejável desenvolver um método eficaz e seguro de produzir proteínas recombinantes humanas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[09] Foi verificado, surpreendentemente, que uma pro- teína humana não contaminada (isto é uma preparação de proteína isenta de subprodutos de proteína não desejados) pode ser obtida em bom rendimento a partir de linhagens de células humanas imortalizadas estavelmente transfectadas, sob condições isentas de soro, com o gene codificando a proteína de interesse. Em mais detalhes, a presente invenção proporciona: 1. um método para preparar uma linhagem de célula humana imortalizada estavelmente transfectada com uma seqüência de ácidos nu- cléicos que compreende um gene que codifica uma proteína alvo humana ou um derivado ou mutante desta, um promotor e um sinal de poliadenilação (polyA) de hormônio de crescimento bovino, em que o dito promotor e o sinal polyA estão ligados à extremidade 5’ e 3’ do gene que codifica a dita proteína alvo humana, respectivamente, cujo método compreende transfectar uma linhagem de célula hospedeira humana imortalizada, sob condições isentas de soro, com um vetor de transfecção que compreende a dita seqüência de ácidos nucléicos e uma origem de replicação; 2. o método de (1) acima, em que o vetor de transfecção é derivado do vetor pcDNA 3.1 tendo a seqüência de SEQ ID NO:4 ou 5; (1) o método de (1) ou (2) acima, em que a linhagem de célula hu mana é uma célula de rim embrionária selecionada de células 293 (ATCC CRL-1573; DSM ACC 305), células 293 FreeStyle (daqui por diante célu- las "293F"; Invitrogen R79007), e células 293T (ATCC CRL 11268; DSM ACC 2494); 3. o método de (1) a (3), em que a proteína humana é o fator IX de coagulação do sangue, (por exemplo, conforme codificado por bps 939 a 2324 da SEQ ID NO:1), alfa-1-antitripsina (daqui por diante "A1AT"; por exemplo, conforme codificado por bps 913 a 2259 da SEQ ID NO:2), fator VIII de coagulação do sangue (incluindo o fator VIII wt conforme mostrado na SEQ ID NO:8 ou um fator VIII mutante deletado de domínio B como codificado por bps 783 a 5162 da SEQ ID NO:3), fator VII/VIIa (incluindo a forma a e b deste codificada pelas SEQ ID NOs:13 e 14), G-CSF (incluindo a forma a, b e c de G-CSF mostrado nas SEQ ID NOs:15, 16 e 17, respectivamente), ou o fator de von Willebrand (vWF); 4. um vetor de transfecção que compreende uma origem de re- plicação e um gene que codifica uma proteína humana conforme definição em (1) e (2) acima, preferivelmente o dito vetor de transfecção é um vetor pcDNA3.1 que compreende o gene para uma proteína humana como definida em (4) acima; 5. uma linhagem de célula humana imortalizada obtenível pelo método como definido em (1) a (5) acima, preferivelmente a dita linhagem de célula humana é como definida em (3) ou (4) acima; e um método para a produção recombinante de uma proteína alvo humana ou um derivado ou mutante desta, que compreende cultivar uma linhagem de célula humana imortalizada como definida em (6) acima, preferivelmente sob condições isentas de soro.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0010] Figura 1: a proteína do fator IX (FIX) de coagula ção humano do tipo selvagem. Um desenho esquemático do gene FIX com suas região 5’ não traduzida (5’ TUR) e sua região 3’ UTR. Os oitos domínios da proteína de aminoácido 461 não processado são indicados: S: peptí- deo de sinal; P: propeptídeo; domínio Gla: domínio y-carboxiglutamila; domínio H: seqüência hidrofóbica; domínio EGF: domínio similar ao fator de crescimento epidérmico; L: seqüência de ligação; AP: peptídeo de ativação; domínio catalítico. A proteína madura FIX tem um comprimento de 415 amino- ácidos e um peso molecular aproximado de 55 kDa.

[0011] figura 2:_o vetor pcDNA3-FIX. O vetor de DNA cir cular compreende 6.960 pares de base, em que a seqüência exata destes é dada na SEQ ID NO:1. No desenho esquemático o promotor CMV (CMV), o gene do FIX humano (hFIX), a origem f1 (f1), o gene de higromicina (Hyg) sob controle do promotor SV40 (SV40), um a região poly A (SV40 poly A), a origem pUC e o gene de resistência (Amp) à ampicilina estão indicados, bem como os numeroso sítios de restrição. Esse vetor é derivado o vetor pcDNA 3.1 re-sequenciado, pcDNA3;1Hygro(+)-zz da SEQ ID NO:5.

[0012] figura 3: o vetor pcDNA3.1-A1AT. O vetor de DNA circular compreende 6.914 bps, em que a sua seqüência exata é dada na SEQ ID NO:2. No desenho esquemático, o promotor intensificador CMV, o cDNA de A1AT, sinal de poliadenilação (polyA) de hormônio de crescimento bovino incluindo uma seqüência de terminação de transcrição para a estabilidade intensificada de mRNA, a origem f1 (f1), o gene de higromicina (Hyg) sob controle do promotor SV40 (SV40), a região poly A de SV40 (SVA poly A), a origem pUC e o gene de resistência à ampicilina (Amp) são indicados, bem como os numerosos sítios de restrição. Esse vetor é derivado do vetor pcDNA3.1Hygro(+)-zz da SEQ ID NO:5.

[0013] figura 4: transfecção transiente de células de rim embrionário humano, diferentes, com vetores que codificam alfa-1- antitripsina. É mostrada uma comparação das linhagens de células em estudos de transfecção. A quantidade (%) da alfa-1-antitripsina (A1AT) expressa por 106 células é mostrada para células 293, 293T e 293F. A quantidade de A1AT expressa em células 293F transfectadas transientemente com pcD- NA3.1-A1AT foi estabelecida como 100%.

[0014] figura 5: transfecção de linhagem de células 293F com diferentes vetores codificando alfa-1-antitripsina. Uma comparação de concentrações de A1AT expressas de diferentes vetores usando linhagem de células 293f FreeStyle transfectadas transientemente é mostrada. O nível de expressão de A1AT pcDNA3.1-A1AT foi estabelecido como 100%. Vários outros vetores transportando o gene de A1AT foram também testa- dos. O vetor ""interno"" pTG1-S1AT (um vetor "interno" para produzir A1AT recombinante humano como mostrado na figura 10), o pCMV Script® A1AT (Stratagene) e pcl neo-A1AT (Promega) foram comparados contra o pcD- NA3.1-A1AT (pcDNA3.1). Nenhum dos outros vetores chegou perto dos altos níveis de expressão observado com pcDNA3.1-A1AT.

[0015] figura 6: SDS-PAGE e Western blot de sobrena- dante de cultura de células. Alíquotas do sobrenadante de células 293F FreeStyle transfectadas transientemente com pcDNA3.1-A1AT (faixas 1-3 e 6- 8) ou com um plasmídio de controle de expressão de GFP (faixas 4 e 8) fo- ram analisadas tanto com SDS-PAGE como com Western blot. A faixa 1 contém um marcador de tamanho e a faixa 5 está vazia. A banda para A1AT é marcada com uma seta. Também visível está a banda de 27 kDa correspondente a GFP nas faixas 4 e 8.

[0016] figura 7: mostra o vetor pcDNA 3.1-F.VIII. O vetor compreende 9.975 bps, em que a seqüência exata deste é mostrada na SEQ ID NO:3. A proteína de fator VIII codificada para bps 783 a 5162 é um fator VIII mutante deletado de domínio B conforme mostrado em WO 01/70968. Novamente, este vetor é derivado do vetor pcDNA 3.1 Hygro(+)- zz da SEQ ID NO:5.

[0017] figura 8: comparação da quantidade média de fa tor VIII produzido dos três melhores clones estavelmente transfectados, transfectando células 293 e 293F com pcDNA3.1-FVIII e o vetor "interno" pTGF8-2hyg-s, em que a sua seqüência exata é dada na SEQ ID NO:7.

[0018] figura 9: mostra o vetor pTG1-A1AT. O vetor compreende 5.610 bps, em que a seqüência exata deste é mostrada na SEQ ID NO:6.

[0019] figura 10: mostra o vetor pCR2.1d2p-GCSFb. O vetor compreende 4.542 bps, em que a seqüência exata deste é mostrada na SEQ ID NO:21.

[0020] figura 11: mostra o vetor pDNA3.1-GCSFb. O ve tor compreende 6.237 bps, em que a seqüência exata deste é mostrada na SEQ ID NO:22.

[0021] figura 12: mostra o vetor pCINeo-GCSFb. O vetor compreende 6.101 bps, em que a seqüência exata deste é mostrada na SEQ ID NO:23.

[0022] figura 13: mostra o vetor pCMVScript-GCSFb. O vetor compreende 4.920 bps, em que a seqüência exata deste é mostrada na SEQ ID NO:24.

[0023] figura 14: mostra o vetor pTG2-GCSFb-hyg-as. O vetor compreende 6.917 bps, em que a sua exata seqüência é mostrada na SEQ ID NO:25.

[0024] figura 15: compara a quantidade de rhG-CSF pro duzida por diferentes construções de expressão de acordo com o Exemplo 9.

[0025] figura 16: mostra um Western blot de rhG-CSF produzido de acordo com o Exemplo 9.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0026] A presente invenção proporciona um método aperfeiçoado para a transfecção e produção de proteínas recombinantes humanas em linhagens de células humanas imortalizadas completamente sob condições isentas de soro e de proteína. Isso permite a transfecção e produção isenta de soro de proteínas humanas. O método pode incluir uma ou mais etapas de purificação incluindo procedimento de inativação viral, que reduz o risco de contaminação de proteína recombinante com patóge- nos humanos. Já que as proteínas recombinantes humanas produzidas em linhagens de células humanas transportam um padrão de glicosilação humana, elas são menos suscetíveis à degradação em comparação com as proteínas humanas que carecem de seu padrão de glicosilação natural. Em resumo, o método da invenção oferece várias vantagens em relação à técnica anterior.

[0027] Em particular, o método da modalidade (7) da in venção proporciona um sistema eficaz para produzir fatores de coagulação do sangue humano, recombinantes, seguros e altamente ativos, por exemplo, fatores IX e FVIII para aplicação terapêutica para Hemofilia B e A em seres humanos. O método é adequado para expressão daquelas proteínas do tipo selvagem, mas podem também ser usadas para mutantes daquelas proteínas, por exemplo, de fator VIII, que são excepcionalmente estáveis contra inativação proteolítica e assim permitem ser submetidas a vigorosos protocolos de inativação de vírus.

[0028] Em um modo preferido, o método da modalidade (7) da invenção compreende cultivar, isenta soro, uma linhagem de célula imortalizada transportando um vetor tendo um promotor ligado à extremidade 5’ de uma seqüência de DNA que codifica a dita proteína de sangue humano. A extremidade 3’ da seqüência de DNA que codifica a dita proteína de sangue humano é funcionalmente ligada a um sinal de polyA de hormônio de crescimento bovino. De acordo com a invenção, a linhagem de célula humana imortalizada é estavelmente transfectada com o vetor. Para detectar transfecção estável, o vetor pode compreender ainda, além do gene para a proteína de sangue humano, pelo menos um gene para um sistema de marcador de seleção, que está funcionalmente ligado a um promotor.

[0029] Promotores adequados incluem promotores virais, promotores de gene de manutenção, promotores específicos para tecido, etc. No caso do promotor ser um promotor viral, a linhagem de célula não compreende a proteína ativadora de transcrição viral de emparelhamento para o dito promotor. Contudo, a célula pode compreender uma proteína ati- vadora de transcrição viral tal como o antígeno T que complementa um outro promotor viral, que não está funcionalmente ligado ao gene que codifica a proteína do sangue humano. Preferivelmente, o promotor é um promotor SV40, promotor CMV, promotor EF-1alfa, promotor HSV TK etc., mais preferivelmente o promotor é um promotor CMV, isto é o principal promotor precoce intermediário constitutivo do citomegalovírus.

[0030] A expressão "transfecção" ou "transfectado" refe re-se à introdução de um ácido nucléico em uma célula sob condições que permitem expressar a proteína. Em geral, o ácido nucléico é uma seqüência de DNA, em particular um vetor ou um plasmídio transportando um gene de interesse sob um promotor adequado, cuja expressão é controlada pelo dito promotor. Contudo, o termo transfecção compreende também transfecção de RNA. O versado na técnica está familiarizado com os vários métodos de transfecção tais como aqueles que usam moléculas veículo como lipídios catiônicos, tais como DOTAP (Roche), DOSPER (Roche), Fugene (Roche), Transfectam® (Promega), TransFat® (Promega) e Tfx® (Promega), Lipofec- tamina (Invitrogene) e 293fectin® (Invitrogene), ou fosfato de cálcio e DEAE dextrano. Ele está também familiarizado com técnicas de transfecção por força bruta. Essas incluem eletroporação, bombardeio com partículas carre- adoras revestidas com ácido nucléico (pistola de genes), e microinjeção. Finalmente, o versado na técnica está também familiarizado com transfecção de ácido nucléico usando vetores virais.

[0031] "Transientemente transfectado" ou "transfecção transiente" refere-se à expressão transiente, isto é não permanente do gene de interesse devido à natureza epissômica do ácido nucléico introduzido. Devido à sua própria natureza, transfecção de RNA ou vírus citolíticos podem ser somente usados para expressão transiente. Ácidos nucléicos epis- sômicos, incluindo DNA (plasmídios ou vetores), são degradados pelas células depois de dois a quatro dias, e, logo, a expressão do gene de interesse então cessa.

[0032] "Estavelmente transfectado" ou "transfecção está vel" refere-se à expressão permanente do gene de interesse devido à integração do DNA transfectado no genoma da célula. A maioria, quando não todas as células, tem o potencial para incorporar DNA epissômico em seu genoma, embora a uma taxa muito baixa. Contudo, estratégias de seleção sofisticadas são empregadas para expandir aquelas células que têm integrado o DNA transfectado. Para isso, o vetor deve conter pelo menos um gene para um marcador de seleção, tal como, por exemplo, higromicina.

[0033] O termo "transfecção estável" ou "estavelmente transfectado" é também usado aqui com referência às células que transportam plasmídios que podem replicar de modo autônomo e assim podem ser usadas para expressão de longo prazo de genes estranhos. Um sistema de transferência de gene particularmente aplicável para "transfectar estavel- mente" células é baseado em retrovírus recombinantes. Já que integração do DNA proviral é uma etapa obrigatória durante o ciclo de replicação retroviral, infecção de células com um retrovírus recombinante produzirão um proporção bastante alta de células que têm integrado o gene de interesse e são assim estavelmente transfectadas.

[0034] O termo "cultura" refere-se à manutenção de célu- las/linhagens de células in vitro em recipientes com meio suportando sua proliferação e expressão de gene. Assim, a cultura causa acumulação das proteínas secretáveis expressas na meio de cultura. O meio de cultura normalmente contém suplementos que estabilizam o pH, bem como aminoáci- dos, lipídios, elementos em traços, vitaminas e outros intensificadores de crescimento.

[0035] Os termos "isento de soro", "transfecção isenta de soro" ou "cultura isenta de soro" referem-se à transfecção e à cultura de células em meio contendo suplementos adequados exceto qualquer tipo de soro. Os suplementos são selecionados de aminoácidos, lipídios, elementos em traços, vitaminas e outros componentes intensificadores de crescimento. Freqüentemente, condições de cultura "isenta de soro" são ainda mais severas e, se nenhuma proteína exógena é adicionada, ou já incluída no médio, o meio é chamado "isento de proteína".

[0036] O termo "linhagem de célula humana imortaliza da" refere-se a células humanas que não são células primárias tiradas diretamente de um organismo. Em particular, refere-se à cultura de célula permanentemente estabelecida que irá proliferar indefinidamente em meio fresco e espaço dados, apropriados, e assim têm escapado do limite de Hayflick.

[0037] O termo "concentração" refere-se à concentração da proteína recombinante produzida do meio de cultura. Inerentemente, também em uma concentração da proteína. Aquele versado na técnica está familiarizado com técnicas de concentração, tais como, filtração, incluindo ultrafiltração, centrifugação, precipitação, etc. A concentração não resulta necessariamente em uma proteína pura, e a proteína isolada pode compreender ainda contaminantes não protéicos e protéicos. Etapas de purificação, adicionais, são freqüentemente requeridas.

[0038] O termo "purificação" refere-se a etapas aplicadas às quais a proteína isolada é submetida de modo a obter uma proteína re- combinante substancialmente pura (pelo menos 60% pura, preferivelmente pelo menos 75% pura, mais preferivelmente acima de 90% pura e, de maior preferência, mais que 99,9% pura). Pureza pode ser medida por um método apropriado. Aquele versado na técnica está familiarizado com técnicas empregáveis para a purificação de uma proteína recombinante, tais como cro- matografia de imunoafinidade, cromatografia de afinidade, precipitação de proteína, trocas de tampão, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de exclusão de tamanho, eletroforese. Além disso, a purificação pode compreender uma etapa de inativação de vírus, tais como termotratamento e/ou tratamento com detergente solvente (SD), tanto no estado seco como líquido, em presença, oU.S.em, substâncias químicas, incluindo inibidores de protease. Adicionalmente, a purificação pode incluir uma ou mais etapas para remoção de príon, tais como etapas de precipitação de proteína, filtração, cromatografia, em particular cro- matografia de afinidade (vide, por exemplo, "Partitioning of TSE infectivity during ethanol fractionation of human plasma", Gregori, L. et al., Biologicals 32 1-10; 2 (2004); e "Removal of TSE agents from blood products", Foster, P.R., Vax Sanguinis 87 (Supl. 2), S7-S10 (2004)). Depois da inativação do vírus, uma outra etapa de purificação selecionada de qualquer uma das etapas listadas acima pode ser necessária para remoção das substâncias químicas usadas para inativação de vírus.

[0039] O termo "vetor" refere-se a qualquer construção genética, tais como plasmídio, fago, cosmídio, etc., que é capaz de replica- ção quando em associação com os elementos de controle próprio, nos quais os fragmentos de DNA podem ser inseridos ou clonados. Um vetor compreende sítios de restrição únicos e pode ser capaz de replicação autônoma em uma célula hospedeira. O termo inclui veículos de clonagem e de expressão. O "vetor" pode transportar ainda um ou mais de outros elementos reguladores, em que os ditos elementos reguladores são selecionados de sítios de união, sítios de recombinação, sítios de polyA, intensificadores, sítio de mul- ticlonagem e seqüências de plasmídios procarióticos.

[0040] O termo "ligado funcionalmente" refere-se à confi guração do vetor, onde o promotor está localizado dentro do vetor de tal modo que ele pode estimular transcrição da seqüência de DNA que codifica a proteína de interesse, em particular a proteína do sangue humano.

[0041] O termo "maduro" refere-se à estrutura molecular de uma dada proteína processada, isto é uma proteína que carece do sinal de exportação N-terminal.

[0042] O termo "promotor" refere-se a uma região de se- qüência de DNA reguladora ligada por RNA polimerase e fatores de transcri- ção durante a iniciação da transcrição.

[0043] O termo "intensificador" refere-se a uma seqüên- cia de atuação-cis que aumenta a utilização de um promotor eucariótico, e pode funcionar tanto na orientação como em qualquer local (a montante ou a jusante) relativo ao promotor.

[0044] O termo "sinal de poliadenilação (polyA)" refere- se a uma seqüência de terminação especializada. Ele sinaliza a adição de uma "cauda" de adeninas à extremidade do mRNA que permite exportar o mRNA para o citoplasma. Ao atingir o citoplasma, a cauda de polyA do mRNA é mantida durante a tradução de proteína e estabiliza o mRNA durante a expressão da proteína.

[0045] O termo "codifica" ou "codificando" refere-se a uma propriedade da seqüência de ácidos nucléicos a ser transcrita (em caso de DNA) ou traduzida (em caso de mRNA) em um polipeptídeo (proteína) in vitro ou in vivo, quando colocada sob o controle de uma seqüência reguladora adequada.

[0046] Para o propósito do presente pedido, o termo "ex pressa", "expressando" ou "expressão" refere-se à transcrição ou tradução de um gene que codifica uma proteína.

[0047] As "proteínas humanas" da invenção incluem, mas sem limitação, proteínas humanas, polipeptídeos, mutações e modificações destes. Em particular, as proteínas humanas incluem proteínas de plasma recombinantes, por exemplo, fatores de coagulação do sangue (tal como Fator VIII, Fator VII/VIIa, Fator V, Fator IX, Fator XI, Fator de von Willebrand, etc.), fatores de crescimento (tal como eritripoietina, etc.), fatores estimuladores de colônias (CSFs) (tal como fator estimulador de granulócitos (G-CSF), CSF macrófago (M-CSF), CSF granulócito-macrófago (GM-CSF), citocinas (tais como interleucinas incluindo interleucina 3, etc.), inibidores de protease (tais como alfa-1-antitripsina (A1AT), quimotripsina, etc.), proteínas de transporte (tais como hormônios, etc.), proteínas de ação inibidora ou reguladora e similares. Além disso, mutações e modificações dessas proteínas ou polipeptídeos estão incluídos, especificamente mutações ou modifi- cação que proporcionam uma melhor estabilidade da proteína recombinante, uma meia-vida prolongada, ou uma melhor recuperação e incluem mutantes de deleção, substituição ou inserção e mutações químicas de grupos funcionais, respectivamente. Proteínas particularmente preferidas, que podem ser produzidas pelo método da invenção do pedido são fator VIII humano (inclusive domínio B deletado ou do tipo selvagem), fator IX humano, G-CSF humano, A1AT humano, fator VII/VIIa humano e fator de von Willebrand.

[0048] A produção recombinante do fator VIII e IX é co nhecida do estado da técnica (EP-A-160457; WO-A-86/01961, Patentes U.S. 4.770.999, U.S. 5.521.070 e U.S. 5.521.070).

[0049] No caso do fator VIII, expressão recombinante de subunidades para a produção de complexos que mostram a atividade coagu- lante é conhecida da técnica (por exemplo, de EP-A-150735, EP-A-232112, EP-A-0500734, WO-91/07490, WO-95/13300, Patentes U.S. 5.045.455 e U.S. 5.789.203). Além disso, a expressão de versões de cDNA truncadas carecendo parcial ou inteiramente da seqüência que codifica o domínio B altamente glicosilado foram descritos (por exemplo, em WO 86/06101, WO 87/04187, WO 87/07144, WO 88/00381, EP-A-251843, EP-A-253455, EP-A- 254076, Patentes U.S. 4.868.112 e U.S. 4.980.456, EP-A-294910, EP-A- 265778, EP-A-303540 e WO 91/09122). Um mutante de fator VIII, particular, no qual o domínio B entre as posições Arg740 e Glu1649 foi substituído por um peptídeo ligante rico em Arg tendo pelo menos 3 resíduos Arg e compreendendo 10 a 25 resíduos de aminoácidos (em que a dita numeração do fator VIII é relativa à seqüência de fator VIII, do tipo selvagem, maduro, mostrada na SEQ ID NO:9) está descrito em WO 01/70968, que é aqui incorporado em sua totalidade. Em particular, o peptídeo ligante rico em Arg tem 14 a 20 resíduos de aminoácidos, enquanto um ligante compreendendo: a seqüência de aminoácidos SFSQNSRH (SEQ ID NO:10), e/ou a seqüência de aminoácidos QAYRYRRG (SEQ ID NO:11), e/ou a seqüência de aminoácidos SFSQNSRHQAYRYRRG (SEQ ID NO:12) é particularmente preferido. Tal muteína de fator VIII de domínio B é codifi- cada por nt 783 a 5162 da SEQ ID NO:3.

[0050] G-CSF é uma molécula pequena, específica da linhagem no sangue humano, que estimula a produção de um tipo de célula sangüínea branca da medula óssea, conhecida como neutrófilos. Os neutrófilos desempenham um papel central no sistema imune do corpo e defende de infecções. G-CSF (seqüências de DNA, particulares, da forma a, b e c destas sendo dadas nas SEQ ID NOs:15, 16 e 17, respectivamente; a proteína da forma b de G-CSF (daqui por diante proteína G-CSF-b") é mostrada na SEQ ID NO:27) é naturalmente produzida por monócitos, fibroblastos, e células endoteliais. Normalmente, a concentração no sangue é de cerca de 40 pg/mL em pessoas saudáveis. No plasma do paciente, o nível de G-CSF pode cair mais que dez vezes. G-CSF é também produzido em linhagens de células de câncer como células 5637, que secretam cerca de 70 ng/mL. Para terapia, G-CSF humano recombinante é produzido em E. coli como uma forma metilada, N-terminal, não glicosilada da Amgen Inc. (Filgrastim/Neupogen®), que é também disponível como um produto pegilado (Pegfilgrastim/Neulasta®). Um outro fármaco é produzido em células CHO por Chugai Pharmaceuticals Co, que resulta em um produto glicosilado (Lenograstim/Granocyte®). G-CSF é usado como um fármaco para tratar neutropenia tanto a herdada como a causada por quimioterapia (câncer), AIDS ou transplante de medula óssea. Para isso, uma dose típica é de 5 μg/kg por dia.

[0051] Uma seqüência de cDNA de A1AT, particular, de acordo com a invenção do presente pedido, é dada em bps 913 a 2259 da SEQ ID NO:2. Particulares seqüências de cDNA de fator VII/VIIa são dadas nas SEQ ID NOs:13 e 14 correspondentes às suas formas a e b. Um particular cDNA de vWF é dado na SEQ ID NO:18.

[0052] O sistema de marcador de seleção inclui resistência à higromicina, resistência à puromicina, resistência à neomicina, resistência à adenosina desaminase (ADA), resistência à aminoglicosídeo fosfotransferase (neo, G418, APH), resistência à bleomicina (fleo, bleo, zeocina), resistência à citosina desaminase (CDA, CD), resistência à citosina desaminase (CDA, CD), resistência à diidrofolato redutase (DHFR), resistência à histidinol desidrogenase (hisD), resistência à higromicina-B-fosfotransferase (HPH), resistência à puromicin-N-acetil transferase (PAC, puro), resistência à timidina cinase (TK), e resistência à Xantina-guanina fosforibosiltransfera- se (XGPRT, gpt). Particularmente preferido é o gene de resistência à higro- micina. Também, o gene para o marcador de seleção pode estar funcional- mente ligado com um sinal de polyA, tal como aquele derivado do hormônio de crescimento bovino (BGH) ou o sinal de poliadenilação SV40.

[0053] As células transfectadas são constantemente ex postas em seu meio de cultura à proteína do sistema de marcador de seleção, tal como higromicina, durante a fase de seleção, resultando na sobrevivência de somente aquelas células que transportam o vetor. Aquele versado na técnica está familiarizado com marcadores de seleção alternativos para o estabelecimento de células estavelmente transfectadas, bem como com as concentrações dos agentes seletivos escolhidos que precisam ser aplicados.

[0054] Um vetor particularmente preferido da invenção transporta um promotor CMV, um gene de higromicina, uma seqüência de polyA e o gene de interesse e, preferivelmente, é o vetor pcDNA3.1 da Invi- trogen tendo a seqüência de SEQ ID NO:4, em que ao resseqüenciar o dito vetor foi verificado que ele tem, de fato, a seqüência mostrada na SEQ ID NO:5.

[0055] As linhagens de células imortalizadas adequadas para o método da invenção são selecionadas do grupo de células de rim, bexiga, fígado, pulmão, músculo cardíaco, músculo liso, ovário ou gastrointestinais. Essas células podem transportar em seu genoma seqüências de DNA adenoviral, em particular os primeiros 4344 nucleotídeos das seqüên- cias Ad5. Preferidas são as células de rim de feto humano (HEK) selecionadas do grupo que consiste em células 293 (ATCC CRL-1573); DSM ACC 305; ECACC ref.: 85120602), células 293T (DSM ACC 2494; ECACC: tsa201, ref. 96121229) e células 293 FreeStyle (células 293F; Invitrogen R79007). Mais preferidas são as células 293F. Essas linhagens de células imortalizadas transportando o vetor são cultivadas sob condições que permi tem a expressão do gene recombinante. Essas são, essencialmente, as condições de cultura padrão conhecidas daqueles versados na técnica, contudo, em caso de células transportando o gene para fator IX humano, vitamina K deve ser incluída no meio.

[0056] Uma modalidade particular da presente invenção é a produção isenta de soro da proteína recombinante em cultura isenta de soro das células estavelmente imortalizadas, que são também transfectadas sob condições isentas de soro. Por isso, qualquer uma das linhagens de células humanas, imortalizadas, descritas acima, preferivelmente a linhagem de células 293F, é transfectada e cultivada sob condições isentas de soro. As células são estavelmente transfectadas em cultura de suspensão em ausência de soro e então adaptadas ao crescimento aderente de células para seleção de clones de células simples. Uma vez que os clones individuais são obtidos, eles são expandidos aderentemente. Depois da seleção dos melhores clones produtores de células, as células são transfectadas para a cultura de suspensão. Durante o procedimento de linhagem de células, estável, completo, e depois em posterior aumento de escala para produção, as célu-las são crescidas em meio isento de soro e não ficam nunca em contato com as proteínas do soro ou humanas ou animais. A proteína do sangue recom- binante, tal como qualquer um dos fatores de coagulação do sangue ou um inibidor de protease tal como A1AT, ou fatores de crescimento (tais como G- CSF e GM-CSF) são isolados do caldo de cultura, e em seguida são, de fato, efetuadas etapas de purificação padrão. Em mais detalhes, a modalidade particular de produção isenta de soro da proteína do sangue humano re- combinante, em particular fator VIII humano ou Fator IX ou A1AT ou G-CSFb compreende as seguintes etapas: 1. Transfecção de células imortalizadas humanas, preferivelmente células 293T, em cultura de suspensão, sem soro. As células são cultivadas em frascos Erlenmeyer de policarbonato, estéreis, descartáveis. As células são transfectadas com uma densidade de, por exemplo, 1 x 106 células viáveis por mL com um agente de transfecção, preferivelmente um agente de transfecção catiônico, mais preferido sendo o reagente de lipofectamina 2000 CD (Invitrogen) ou um reagente para o método de transfecção de fosfato de cálcio; um vetor é transfectado codificando a proteína do sangue humano, preferivelmente o vetor é pcDNA3.1-FIX, pcDNA3.1-FVIII, pcDNA3.1- A1AT ou pcDNA3.1-gcsfB; 2. 24 a 120 h, preferivelmente 36-96, mais preferivelmente 48 h pós-transfecção, um número adequado de células (103 a 1010, preferivelmente 105 a 108, mais preferivelmente 106 células) são transferidas em um prato de cultura plano para sedimentação para estabelecer o crescimento aderente. Preferivelmente, o prato de cultura é um prato de 10 cm e as células são cultivadas em meios isentos de soro e de proteína, preferivelmente meio de Expressão 293 FreeStyle (12338-018, Invitrogen) ou o meio "interno" isento de soro (Octapharma Stockholm). 3. Pressão de seleção é estabelecida em 2 a 50 h, preferivelmente 48 horas após transferência para o prato de cultura plano. O meio é suplementado com um agente seletivo adequado selecionado do grupo que consiste em marcadores de seleção, por exemplo, higromicina, neomicina, G418 e Zeocina. O agente seletivo preferido é higromicina com uma concentração de 10 a 300 μg/mL, preferivelmente 50 a 200 μg/mL, mais preferivelmente 50 μg/mL. A pressão é mantida por pelo menos 10 a 20 dias, preferivelmente por 14 dias, por meio de que o meio suplementado com higromici- na é trocado um dia sim, dia não. Somente células estavelmente transfecta- das sobrevivem a essas condições de seleção e formam clones de células aderentes, que podem ser individualmente colhidos. Adicionalmente, um fa-tor de fixação pode ser usado de modo a grudar as células no prato e impedir que as células flutuem de um clone para um outro clone de célula. Esses fatores de fixação podem ser f.e. poly-D-Lisina, suplementos de meio sintético sem proteínas humanas ou animais, ou outras substâncias. Alternativamente, anéis de clonagem podem ser usados para a coleta de clones. 4. Clones de células individuais são colhidos e transferidos para recipientes de cultura separados para expansão isenta de soro de célula (em scaling up), enquanto a pressão seletiva é omitida. Qualquer recipiente de cultura é adequado, mas, preferivelmente, os clones individuais são inicial- mente transferidos em placas de 96 cavidades com uma quantidade suficiente de meio, e então para placas de 48, para de 24, para de 12 e para de 6 cavidades e então para tubos giratórios. No estágio de tubos giratórios, as células são cultivadas em meio isento de soro por agitação branda de modo a fazer com que as células retornem para crescimento em suspensão. Uma vez que as células tenham atingido o estágio da placa de 6 cavidades ou o estágio dos tubos giratórios, é opcional selecionar os melhores clones de células de acordo com alguns critérios de seleção, isto é a taxa de crescimento das células, células que crescem mais rapidamente são preferidas, e a quantidade da proteína recombinante que elas produzem. Contudo, a dita seleção pode ser também realizada em qualquer estágio mais tarde. 5. Células obtidas da cultura em tubos giratórios foram semeadas em vasos de cultura Erlenmeyer com uma quantidade suficiente de meio isento de soro. Critérios adicionais de seleção para clones aumentados em escala de células isentos de soro e proteína, crescendo em suspensão, são como a seguir: viabilidade, morfologia de célula, não agregação, robustez referente à centrifugação e nenhum fragmento celular.

[0057] O método da presente invenção trabalha particu larmente bem se o vetor é pcDNA3.1-hygro(+)-zz. É preferido que o gene que codifica a proteína humana, em particular FIX humano, FVIII, A1AT ou G-CSFb, seja inserido de tal modo que ele fique sob o controle do promotor CMV como mostrado nas figuras 2, 3, 7, e 11, respectivamente. Preferivelmente, as seqüências do tipo selvagem dos ditos genes são inseridas, de modo que a proteína expressa recombinantemente esteja sem qualquer mutação e seja estruturalmente idêntica à proteína do tipo selvagem isolada do plasma sangüíneo. Um desenho esquemático do fator IX humano do tipo selvagem é mostrado na figura 1. SEQ ID Nos: 1, 2, 3 e 22 proporcionam a seqüência de ácido nucléicos para pcDNA3.1-FIX, pcDNA3.1-A1AT, pcD- NA3.1-FVIII e pcDNA3.1-GCSFb, respectivamente. As proteínas respectivas são codificadas pelos nucleotídeos 930 a 2224, 913 a 2259, 679 a 5055 e 970 a 1584, respectivamente.

[0058] A presente invenção proporciona assim um méto- do para a produção recombinante de fator IX humano, A1AT, fator VIII e G- CSFb clonado em pcDNA3.1® produzindo pcDNA3.1-FIX, pcDNA3.1-A1AT, pcDNA3.1-FVIII e pcDNA3.1-GCSFb, respectivamente, que são integrados no genoma de células humanas imortalizadas, preferivelmente células de rim de embrião humano tais como células 293 (ATCC CRL-1573; DSM ACC 305; ECACC ref.: 85120602), células 293 FreeStyle (células 293F; Invi- trogen R79007) ou células 293T (DSM ACC 2494; ECACC: tsa201, ref. 96121229).

[0059] Essas células transportando ou pcDNA3.1-FIX ou pcDNA3.1-A1AT ou pcDNA 3.1-FVIII ou pcDNA 3.1-GCSFb são cultivadas em meio sob condições padrão que permitem expressão de gene ou alternativamente elas são cultivadas sob condições isentas de soro para minimizar o risco de contaminação com patógenos humanos. Uma ou mais etapas de remoção de príon podem ser incluídas, tais como etapas de precipitação de proteína, filtração, cromatografia, em particular etapas de cromatografia por afinidade. Alternativamente/adicionalmente, uma linhagem de células nocaute de príon pode ser usada como células de expressão. Isso pode ser obtido por nocaute genômico completo ou tecnologia anti-sentido. No caso da produção para fator IX humano, as células são, preferivelmente, cultivadas em presença de vitamina K. A proteína do sangue humano é isolada do sobre- nadante da cultura e submetida a subseqüentes etapas de purificação conhecidas do estado da técnica para maximizar o rendimento de um produto puro, estável e altamente ativo e são selecionadas de cromatografia por imunoafinidade, cromatografia de troca aniônica, cromatografia de exclusão de tamanho, etc., e combinações destes. Elas podem ser facilmente adaptadas às exigências específicas necessárias para isolar o fator IX recombinan- te, G-CSFb ou A1AT. Quantidade e atividade da proteína purificada durante e depois do procedimento de purificação podem ser monitoradas por ELISA e/ou ensaios de tempo de coagulação de um estágio (aPTT).

[0060] Para superar os problemas de possíveis contami nações infecciosas nas amostras de proteína purificada ou no produto diretamente obtido do sobrenadante de cultura de célula contendo a proteína recombinante, secretada, de escolha, o sobrenadante de cultura pode ser tratado com procedimentos para inativação de vírus, incluindo termotrata- mento e/oU.S.D-tratamento (seco ou em estado líquido, com oU.S.em a adição de substâncias químicas, incluindo inibidores de protease). Aquele versado na técnica está familiarizado com procedimentos de purificação. Por exemplo, o isolamento e purificação e recuperação de fator VIII inativado de vírus de alta pureza de plasma sangüíneo por cromatografia de troca aniôni- ca foi descrito (WO 93/15105). Além disso, vários processos para a produção de fatores de coagulação, não infecciosos, de alta pureza a partir de plasma sangüíneo ou de outras fontes biológicas têm sido reportados. Vírus revestidos com lipídio são eficazmente inativados por tratamento do material potencialmente infeccioso com uma fase hidrofóbica que forma um sistema de duas fases, do qual a parte insolúvel em água é, subseqüentemente, re-movida. Uma outra vantagem provou complementar o tratamento de fase hidrofóbica, simultânea oU.S.equencialmente, com um tratamento com detergentes biocompatíveis ou fosfatos de dialquila ou de trialquila (WO 96/36369, EP 0131740, U.S. 6.007.979). Vírus revestidos não lipídicos requerem protocolos de inativação que consistem no tratamento com detergentes não iônicos seguido por uma etapa de aquecimento (60-65oC), por várias horas (WO 94/17834). Depois da inativação do vírus, pode ser necessária uma outra etapa de purificação para remover substâncias químicas. Em resumo, a presente invenção proporciona um método de produção de proteína eficaz com base em uma linhagem de célula humana ligada a métodos aprovados de purificação de proteína e para inativação para produção de proteínas recombinantes, por exemplo, o fator IX ou VIII de coagulação do sangue, A1AT e G-CSFb, foi estabelecido. A atividade recombinante das proteínas produzidas de forma recombinantemente pode ser examinada com testes padrão. No caso do fator IX humano, por exemplo, com um ensaio do tempo de tromboplastina parcial ativada usando ativação de Dapptin TC (Caulim/Sulfatídeo-Fosfolipídio Cat. No 5035090, Technoclone GmbH) com um instrumento de coagulação manual. Finalmente, as proteínas recombi- nantes assim obtidas, tal como a proteína do sangue descrita acima, em par ticular o fator IX humano, podem ser usadas em uma composição farmacêutica.

[0061] A invenção é ainda descrita nos seguintes exem plos. Os ditos exemplos não devem, contudo, ser interpretados como limitativos da invenção.

EXEMPLOS MATERIAIS E MÉTODOS LINHAGENS DE CÉLULAS HUMANAS PARA EXPRESSÃO DE PROTEÍNA:

[0062] linhagens de células preferidas são HEK293 (ECACC Ref. 85120602), 293 FreeStyle (293F; Invitrogen R79007) e 293T (tsA201, ECACC Ref. 96121229), que é linhagem de célula de rim hu- mano, embrionário, expressando estavelmente um antígeno T, sensível à temperatura, SV40. E ssas linhagens de células similares às epiteliais têm sido usadas em uma variedade de ensaios de expressão funcional e foi relatado que elas produzem altos níveis de proteínas recombinantes. A linhagem de células 293F (Invitrogen), que é derivada da linhagem de células 293, foi preferivelmente usada nos Exemplos abaixo. A linhagem de células parental 293 é uma linhagem permanente estabelecida do rim humano embrionário primário transformada com DNA de adenovírus humano cisalhado, tipo 5 (Graham et al., 1977; Harrison et al., 1977). A linhagem de células 293F é uma variante da linhagem de células 293 que foi adaptada para crescimento em suspensão em Meio de Expressão para FreeStyle® 293 (293F) (12338-018, Invitrogen). A linhagem de célula 293F foi obtida de Robert Horlick, na Farmacopéia. A linhagem de células 293F foi originalmente preparada de culturas do Mater Cell Bank, de baixa passagem, derivadas das células parentais 293F que foram reclonadas por limitação da diluição. As células foram crescidas constantemente no meio de Expressão 293 FreeStyle, isento de soro ou um meio isento de Soro (Octapaharma Stockholm) com boa viabilidade e boa morfologia por mais que um ano durante o desenvolvimento da presente invenção.

[0063] Para produção eficaz de fator IX humano, o meio pode ser modificado por adição da vitamina K. Essas linhagens de células são capazes de serem cultivadas em meio isento de soro e/ou meio isento de proteína contendo suplementos adequados. DETERMINAÇÃO E MEDIÇÃO DE PROTEÍNAS ALVO DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE FATOR IX HUMANO POR ELISA:

[0064] níveis de fator IX recombinante humano no so- brenadante foram determinados por ELISA usando FIX anti-humano de bode (GAFIX-AP, Affinity Biologicals) com anticorpo de captura de acordo com procedimento padrão. Todas as incubações foram realizadas em uma câmara úmida em temperatura ambiente. Foram usados Octanyne (FIX derivados de plasma) e BeneFIX (FIX recombinante, Genetics Institute), ambos padrões. O anticorpo de detecção foi um FIX anti-humano de bode conjugado com peroxidase (GAFIX-APHRP, Affinity Biologicals). ABTS (Cat. No 1682008, Roche Diagnostics) foi adicionado a cada cavidade como substrato, reação colorimétrica foi detectada em 405 nm em 15 minutos. Os resultados foram calculados por regressão linear de concentração padrão versus absorbância padrão.

DETECÇÃO DA ATIVIDADE DE FATOR IX DE COAGULAÇÃO HUMANO:

[0065] a atividade de coagulação do fator IX recombinan- te, humano, em sobrenadantes foi determinado como a seguir: a atividade de coagulação foi ensaiada com base em um ensaio do tempo de trombo- plastina parcial ativada usando ativação de Dapptin TC (Caulim/Sulfatídeo- Fosfolipídio Cat. No 5035090, Technoclone GmbH) com um instrumento de coagulação manual (Amelung KC 4A micro, Amelung GmbH). Para o estudo, 50 μL de sobrenadante de células transfectadas, 50 μL de plasma deficiente de FIX (Progen) e 50 μL de Dapptin TC foram incubados por 2 minutos a 37oC. A coagulação foi iniciada por adição de 50 μL de CaCl2 (Cat. No84687- 22F, Instrumentation Laboratory). O tempo de coagulação da amostra foi comparado com Octanyne ou/e com BeneFIX. DETERMINAÇÃO DE BDDRHFVIII COM ENSAIO COAMATIC:FVIII (CHROMOGENIX):

[0066] o kit de ensaio cromogênico comercial COAMA- TIC:FVIII (Chromogenix, cat. No 82 25 85) contém FIX, FX e um cromógeno, que se torna um corante solúvel em água, amarelo, por clivagem de FXa. As amostras contendo FVIII completam esse sistema: FVIII ativa FIX por com- plexação, este complexo ativa FX por clivagem proteolítica para se tornar FXa. Fxa torna o cromógeno em um corante, que subseqüentemente é determinado fotometricamente em 405 nm. Esse teste é projetado para determinação de FVIII de plasmas de pacientes. O seguinte procedimento foi estabelecido de modo a tornar esse teste aplicável para a medição do fator VIII em meios de cultura diluídos. Como padrões de controle, fator VIII de coagulação, humano, recombinante, de comprimento completo (NIBSC, ordem no 57814F) e plasma de controle normal (Instrumentation Laboratory Company) foram usados.

[0067] Preparação da amostra: As amostras foram diluí das com tampão de diluição distribuído com reagentes COAMATIC para uma atividade de FVIII final prospectiva entre 2 e 20 mIU/mL e são comparadas à curva padrão WHO No6.

[0068] Método: Em uma fileira de 96 cavidades colocada no termobloco, tanto os padrões como as amostras são medidas em triplica- ta.

DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE A1AT COM TESTE DE ATIVIDADE DE ELASTASE:

[0069] depois da transfecção de cDNA de A1AT, A1AT foi expressa e secretada em meio de cultura de células. Depois da remoção das células por centrifugação (5 minutos, 1.000 rpm), a atividade de A1AT foi medida no sobrenadante da cultura. Nesse teste de atividade, a atividade de A1AT foi determinada por seu efeito inibidor em elastase. Elastase cliva pNA do substrato N-succinil-(Ala)3-pNA. A liberação de pNA é medida fotometri- camente em 405 nm. Por comparação com amostras padrão com atividade de A1AT definida, a atividade das respectivas amostras é determinada. Como provado em outros experimentos, o teste é válido em meio FreeStyle isento de soro. Para confirmar o fato que o meio FreeStyle não influencia o teste, foram preparadas duas curvas padrão: plasma humano padrão foi diluído em T + tampão ou em meio FreeStyle.

[0070] Diluição das amostras: todas as amostras foram testadas não diluídas, diluídas 1:10 e 1:50 em meio FreeStyle e são comparadas com diluições padrão de plasma humano.

[0071] Método: 50 μL de cada diluição padrão e diluição de amostra, respectivamente, foram pipetados em um cavidade da placa de microtítulo de 96 cavidades. Depois da adição de 150 μL de solução de trabalho de Elastase a cada cavidade, a placa de 96 cavidades foi agitada por 1 minuto sobre a leitora ELISA e incubada por 30 minutos, a 37oC. 100 μL de solução de trabalho de substrato foram adicionados a cada cavidade com multipipeta. Absorção em 405 nm foi medida imediatamente após adição da solução de substrato e depois de 7 minutos incubação a 37oC, no escuro. O primeiro valor representa a absorção de base em reação catalisada por elastase e é subtraído do segundo valor, que representa a absorção depois que a elastase clivou pNA do substrato. Usando o resultado depois da subtração, as atividades de A1AT das amostras são calculadas de acordo com a curva padrão. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DO G-CSF POR ELISA:

[0072] níveis de G-CSF recombinante humano nos so- brenadantes de cultura de células foram determinados por ELISA usando anticorpo de G-CSF anti-humano de camundongo (MAB0214, R&D Systems). Todas as incubações foram realizadas em uma câmara úmida, em temperatura ambiente. O padrão de G-CSF (hG-CSF recombinante, E. coli, 214-CS025, R&D Systems) foi usado. O anticorpo de detecção era um G- CSF anti-humano de bode, biotinilado (BAF-215, R&D Systems). Estreptavi- dina foi conjugada à raiz forte peroxidase (DY998, R&D Systems) ligada ao anticorpo de detecção. O substrato de Peroxidase Fluorgênica QuantBlu® (15169, Pierce) foi adicionado a cada cavidade como substrato, a reação fluormétrica foi detectada na extinção em 320 nm/Emissão a 420 nm, dentro de 60 minutos. Os resultados foram calculados por regressão linear de concentração padrão versus unidades de fluorescência relativa padrão (RFU). EXEMPLO 1: CLONAGEM DE PROTEÍNAS ALVO A. CLONAGEM DO FATOR IX HUMANO:

[0073] do vetor pTG36 conforme descrito em WO 01/70968, um fragmento de 1,4 kb contendo um grupo de leitura aberta do fator IX de coagulação, humano, foi cortado por digestão dupla com Hind III e NotI. Esse fragmento foi ligado ao fragmento de 5,6 kb do vetor pcD- NA3.1Hygro(+)-zz (derivado de V870-20, Invitrogen) de dupla digestão com HindIII e NotI resultando no vetor pcDNA3.1-FIX mostrado na figura 2. A se- qüência de DNA do pcDNA3.1-FIX é mostrada em SEQ ID NO:21. Três inserções de nucleotídeos adicionais na cadeia principal do vetor estavam no vetor pcDNA3.1Hygro(+)-zz (vide SEQ ID NO:5) em comparação com a se- qüência publicada por Invitrogen (conforme mostrado na SEQ ID No: 4). O vetor pcDNA3.1-FIX contém um gene de resistência à higromicina do cassete para permitir um método de seleção para um clone de célula estavelmente transfectado (vide figuras 2, 3 e 7). O vetor permite o estabelecimento de linhagens de células que expressam estavelmente por transfecção com fosfato de cálcio ou outros, e seleção subseqüente para resistentes à higromici- na. B CLONAGEM DO FATOR VIII HUMANO:

[0074] a 430 bp FVIIIcDNA contendo o grupo de leitura aberta de um fator VIII de coagulação, humano, deletado do domínio B, foi isolado do vetor pTGF8-2hyg-s (SEQ ID NO:7); cuja produção está descrita em WO 01/70968, com digestão com NotI+XHoI e ligado com pcD- NA3.1Hygro(+)-zz, que foi linearizado com XhoI+PspOMI resultando no vetor pcDNA3.1-FVIII mostrado na figura 7. C. CLONAGEM DE A1AT HUMANA:

[0075] mRNA de AIAT humana foi isolado diretamente das células HepG-2 (DSMZn° ACC 180) usando Kit de Miniprep de mRNA (Sigma, Catn° MRN-10). Na etapa seguinte, mRNA foi capturado com contas de oligo (dT). Depois disso, mRNA será transcrito em cDNA de fita dupla com Transcriptase Reversa do Vírus da Mieloblastose Aviária (AMV RT, Promega, Catn° M5101) seguinte à RT-PCR (Transcrição Reversa - Reação em Cadeia de Polimerase). cDNA de A1AT foi ampliado com reação de PCT. O produto de PCR foi carregado em gel de agarose. A banda de DNA apropriada foi isolada e depois disso purificada com o Kit de Extração de Gel Qiaquik (Qiagen, Catn° 28704). O fragmento de A1AT foi subclonado em um Vetor comercial (TOPO® Invitrogen, Catn° K4650-01). Para clonagem do pCMV-Script: PCR II TOPO-A1AT foi diferido com EcoRI, o fragmento de 1370 bp de A1AT foi ligado com pCMV-Script linearizado com EcoRI.

[0076] Para clonagem de pCI-neo-A1AT, PCR II TOPO- A1AT foi digerido com EcoRI, o fragmento de 1370 bp de A1AT foi ligado com pCI-neo linerizado com EcoRI.

[0077] Para clonagem de pcdNA3.1, A1AT de 1370 bp foi isolada com PCR II TOPO-A1AT digerida com XhoI+HindIII e ligada com pcDNA3.1 linearizado por XhoI+HindIII. O vetor resultante é mostrado na figura 3.

[0078] Para clonagem de pTG1-A1AT, PCR II TOPO A1AT foi digerida com HindIII e NotI. O fragmento de 1370 bp de A1AT foi ligado com pTG1 (sem PRE), linearizado com HindIII e NotI. O vetor resultante é mostrado na figura 9. D. CLONAGEM DE CDNA DE G-CSF HUMANO:

[0079] RNA total foi isolado diretamente de células de carcinoma de bexiga urinária humana 5637 com mini-Kit RNeasy (QIAGEN, cat. No 74104). Depois disso, o RNA total isolado foi incubado com DNase I digerido possivelmente com DNA genômico das células 5637. Para conseguir RNA total isento de DNase, a mistura reacional foi tratada com kit de limpeza RNeasy (QIAGEN, cat. No 74204). RT-PCR com o RNA como molde foi realizada com iniciador oligo(dT)12-18 (Invitrogen, Cat. No 18418-012) e Superscritpt® II RNase H - Transcriptase Reversa (Invitrogen, Cat. No 18064022) em presença de inibidor de RNase (Roche, Cat. No 799-017) para sintetizar um grupo de ds cDNA das células 5637. cDNA de G-CSF foi ampliado então com reação de PCR. cDNA de G-CSF foi isolado de gel de agarose com kit de Extração de Gel, rápida, QIA (QIAGEN, Cat. 28704) e seqüenciado com ambos dos seguintes iniciadores G-CSF:

[0080] - G-CSF de Avanço: 5’- ATG GCT GGA CCT GCC ACC CAG AGC -3'(SEQ ID NO:19)

[0081] - G-CSF de Reverso: 5’- TCA GGG CTG GGC AAG GTG GCG TAG-3'(SEQ ID NO:20)

[0082] A seqüência do DNA sintetizado de células 5637 foi confirmada por análise de seqüência como sendo um GCSF-forma b (tendo a seqüência mostrada na SEQ ID NO:26).

[0083] O cDNA de GCSF-forma b isolado conforme des crito acima foi então diretamente ligado ao vetor comercial pCR2.1 (Invitro- gen). O plasmídio resultante foi designado como pCR2.1d2-GCSF e é mostrado na figura 10.

[0084] PCR2.1d2-GCSFb foi digerido com HindIII e NotI, o fragmento de cDNA de GCSFb de 705 bp foi isolado e ligado ao vetor pcDNA3.1Hygro(+)-zz, que foi linearizado com HindIII e NotI. O vetor pDNA3.1-GCSFb resultante está mostrado na figura 11.

[0085] PCR2.1d2-GCSFb foi digerido com EcoRI, o fra gmento de cDNA de GCSFb de 629 bp foi isolado e ligado ao vetor pCINeo, que foi linearizado com EcoRI. O vetor pCINeo-GCSFb resultante é mostrado na figura 12.

[0086] PCR2.1-d2GCSFb foi digerido com BamHI e XhoI, o fragmento de cDNA de GCSFb de 693 bp foi isolado e ligado ao vetor pCMVScript, que foi linearizado com BamHI e XhoI. O vetor pCMVScript- GCSFb resultante é mostrado na figura 13. PCR2.1d2-GCSFB foi digerido com HindIII e NotI, o fragmento de cDNA de GCSFb de 705 bp foi isolado e ligado ao vetor pTG2-hyg-as, que foi linearizado com HindIII e NotI. O vetor pTG2-GCSFb-hyg-as resultante é mostrado na figura 14.

EXEMPLO 2: EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS ALVO EM LINHAGENS DE CÉLULAS DIFERENTES E VETORES DIFERENTES:

[0087] quando se estava otimizando o presente método para produção de proteína recombinante, foi testada a capacidade para altos níveis de expressão de diferentes linhagens de células - todas transportando um vetor que compreende o gene recombinante para Alfa-1-antitripsina (A1AT). Foi verificado que linhagens de células CHO, BHK e outras produziam menos proteína recombinante em ensaios de transfecção transiente em comparação com a linhagem de células 293T. Portanto, foram examinados outros derivados de linhagens de células de rim embrionário, humano. Os resultados são mostrados nas figuras 4 a 6.

[0088] EXEMPLO 3: TRANSFECÇÃO DE CÉLULAS 293T E 293 EM MEIO CONTENDO SORO EM COMPARAÇÃO COM AS CÉLULAS 293F, QUE FORAM TRANSFECTADAS E CULTIVADAS EM CONDIÇÕES ISENTAS DE SORO: 0,1 a 0,2 x 106 células viáveis de células 293T ou 293 foram plaqueadas na cavidade 6. No dia seguinte, as células foram transfectadas usando-se o método de fosfato de cálcio (Biotechniques 6:7 632-638 (1988)): 4 μg de DNA plasmidial foram diluídos em 0,1 x tampão TE (ad 200 μL de mistura de transfecção), misturados suavemente, 20 μL de CaCl2 2,5M e 100 μL 2 x HBS foram adicionados à amostra de transfecção. A amostra de transfecção foi incubada por 20 minutos, à temperatura ambiente. Depois de 6 horas, o meio de incubação foi trocado e as células foram então incubadas por 48 horas.

EXEMPLO 4: TRANSFECÇÃO ISENTA DE SORO E EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS ALVO EM CÉLULAS 293F EM MEIO ISENTO DE SORO:

[0089] 28 mL de cultura de suspensão foram preparados com uma densidade de 106 células 293F viáveis (no mesmo dia do experimento de transfecção). Um complexo de lipídio-DNA foi preparado por diluição de 30 μg de DNA plasmidial em Opti-MEM® I (Invitrogen) para um volume total de 1 mL, e 40 μL de 293fectin® foram diluídos em Opti-MEM® I para um volume total de 1 mL. Depois da incubação por 5 minutos, à temperatura ambiente, o DNA diluído foi adicionado à 293fectin® para obter um volume total de 2 mL. As amostras transfectadas foram incubadas por 20 minutos à temperatura ambiente no escuro. 2 mL de mistura de transfecção foram adicionados a 28 mL da cultura de suspensão de 293F (densidade de células final é de 1x106 células/mL). As células 293F transfectadas foram incubadas a 37oC/atmosfera umidificada de 8% de CO2, em ar, em um agitador orbital girando a 125 rpm por 72 horas. A: TRANSFECÇÃO E EXPRESSÃO DE A1AT:

[0090] os resultados daqueles experimentos comparando células 293F com 293 e 293T são mostrados na figura 4. Em todos os experimentos, uma quantidade definida de células (106 células) foram transfecta- das com pcDNA3.1-A1AT. A quantidade de A1AT expressa em diferentes linhagens de células foi comparada. A quantidade expressa de A1AT em células 293F foi estabelecida como 100%. Como pode ser visto da figura 4, células 293 e 293T produziram somente 12 a 13% da quantidade de A1AT que as células 293F.

[0091] Além disso, foi testado se diferentes cadeias de vetor influenciam a quantidade de proteína recombinante produzida em células 293F. A seqüência de codificação para Alfa-1-antitripsina (A1AT) humana foi inserida em pTG (vetores "interno"), pCMV Script® (Stratagene), pcl neo (Promega), bem como no vetor pcDNA3.1®.

[0092] O nível de expressão de A1AT de pcDNA3.1- A1AT foi estabelecido como 100%. Nenhum dos outros vetores chegaram perto da alta expressão observada com pcDNA®3.1-A1AT. Foi constatado que pcDNA - A1AT produziu a maior quantidade de A1AT conforme detecção por ELISA (vide figura 5). O vetor "interno" expressoU.S.omente uma quantidade de 20% e os outros vetores comerciais revelaram uma faixa de 15-30% em comparação com a quantidade de A1AT expressa de pcDNA 3.1. Portanto, pcDNA 3.1 foi escolhido para todos os futuros experimentos.

[0093] Em resumo, diferentes linhagens de células foram transientemente transfectadas com pcDNA3.1® transportando o gene de A1AT. Foi mostrado que a linhagem de células 293F isenta de soro expressa 7 vezes mais A1AT por 106 células que as células 293T e 293. Portanto, a linhagem de células 293F FreeStyle foram escolhidas para experimentos de transfecção estáveis.

[0094] Os resultados de experimentos de transfecção transiente são mostrados na figura 6. O painel de topo (A) mostra a análise SDS-PAGE do sobrenadante de 6 experiências diferentes usando vetores de transfecção diferentes. Derivados de figuras analíticas se conclui que a a1- antitripsina presente nos sobrenadantes de cultura de célula analisados é de boa qualidade como pode ser deduzido da razão de atividade para antígeno sendo 1 (dados não mostrados). A validade dos resultados de teste pode ser deduzida do fato que o controle negativo não mostra atividade de a1- antitripsina ou de antígeno.

[0095] A distribuição de peso molecular analisada por SDS-PAGE mostra resultados bem comparáveis para as três amostras contendo a1-antitripsina. No controle negativo, além da falta na banda que representa a a1-antitripsina, uma banda adicional em um peso molecular de 27 kD é visível, como esperado.

[0096] Por análise usando Western blotting (usando um anticorpo primário de a1-antitripsina humana) a proteína pode ser identificada na região de peso molecular esperada sob condições redutoras. Produtos de divisão não são visíveis.

[0097] A seta preta aponta para a banda proeminente, que corresponde à proteína recombinante alfa-1-antitripsina de 52 kDa. Também visível está uma banda que corresponde à proteína GFP de 27 kDa nas faixas 4 e 8, que foi transientemente expressa como controle em linhagem de células FreeStyle - células 293F. As bandas adicionais na faixa 1,2,3 e 5,6 e 7 são proteínas de células hospedeiras (de células sem padrões 293F). O painel inferior (B) mostra a análise de Western blot. Os resultados são idênticos exceto que devido à severidade maior do ensaio, os resultados parecem mais completos, e somente a banda correspondente à A1AT está visível. B: TRANSFECÇÃO E EXPRESSÃO DE FVIII:

[0098] na figura 8, a quantidade média do fator VIII dos três melhores clones transfectados estavelmente é mostrado. A quantidade média do fator VIII dos três melhores clones expressos com o vetor pcDNA- FVIII é estabelecido como 100% de produtividade. Uma comparação com o vetor "interno" pTGF8-2hyg-s revela uma produtividade quase 3 vezes maior do fator VIII com o vetor pcDNA3.1-FVIII em células 293F. C: TRANSFECÇÃO E EXPRESSÃO DE FIX:

[0099] em células 293F estavelmente transfectadas usando pcDNA3.1-FIX e um vetor pTGF36 baseado em pUC 19/X (vide WO 01/70968) que expressa o fator IX, uma produtividade quase três vezes maior pode ser mostrada com o uso do vetor pcDNA3.1 em células 293F como pode ser visto na seguinte Tabela 1. TABELA 1: Produtividade de FIX em células 293 e 293F depois de transfec- ção com vetor pcDNA3.1 e pTG2.

EXEMPLO 5: PRODUÇÃO DE G-CSFB A TRANSFECÇÃO DE CÉLULAS 293F EM MEIO ISENTO DE SORO, TRANSFECÇÃO TRANSIENTE:

[00100] 28 mL de cultura de suspensão de células 293F com uma densidade de células de 1,1x 106 de células 293F viáveis por mL foram preparados no mesmo dia do experimento de transfecção. Um complexo de lipídio-DNA foi preparado por diluição de 30 μg de DNA plasmidial (pcDNA3.1-G-CSFb) em Opti-MEM® I (Invitrogen) para um volume total de 1 mL e 30 μL de Lipofectamina 2000 CD foram diluídos em Opti-MEM® I para um volume total de 1 mL. Depois de 5 minutos de incubação à temperatura ambiente, DNA diluído foi adicionado à Lipofectamina 2000 CD para obter um volume total de 2 mL. As amostras de transfecção foram incubadas por 20 minutos, à temperatura ambiente, no escuro. 2 mL da mistura de trans- fecção foram adicionados aos 28 mL de cultura de suspensão de 293F (densidade de células final é de 1x 106 células por mL). As células 293F transfec- tadas foram incubadas a 37oC/atmosfera umidificada de 8% de CO2 em ar em um agitador orbital girando a 125 rpm, por 72 horas. B TRANSFECÇÃO ESTÁVEL:

[00101] 72 horas depois da transfecção transiente, como estabelecida em A. Acima, um número adequado de células (105 e 106 células) foi transferido para um prato plano, para sedimentação, para estabelecer o crescimento aderente. Pressão de seleção foi iniciada depois de 2 a 50 horas, preferivelmente 48 horas após a transferência para o prato plano. O agente seletivo preferido era higromicina com uma concentração de 75 μg/mL. A pressão foi mantida por pelo menos 10 a 20 dias, preferivelmente 14 dias, por meio de que o meio suplementado com higromicina era todo trocado 2 a 3 dias. C. SELEÇÃO DOS MELHORES CLONES PRODUTORES DE G-CSF USANDO A ANÁLISE E ROBÔ DE COLETA CLONEPIXFL (GENETIX):

[00102] células FreeStyle 293F estavelmente transfe- ridas como em B., acima, foram semeadas em meio com base em metil- celuloses semi-sólidas contendo um antibiótico apropriado para seleção de clones depois de cerca de dois dias e um anticorpo marcado para detecção dos clones de maior produção, via fluorescência. Números altos (milhares) de clones foram analisados usando ClonePixFL (Genetix) com respeito ao número de células e à secreção de G-CSF de modo a colher subseqüente- mente somente umas poucas centenas de melhores clones produtores de G- CSF. Em contraste com outros métodos conhecidos, onde os clones não produtores e clones mistos são também aleatoriamente colhidos, o uso do ClonePixFL permite a coleta de clones de crescimento rápido, que são somente altos produtores originados de células simples. As células colhidas são expandidas em placas de microtítulo e depois disso em tubos giratórios, frascos de cultura de células e fermentadores sob condições isentas de soro, para o procedimento completo.

[00103] Aqui também, o procedimento de transfecção es tável completo é gerado sob condições isentas de soro. Adicionalmente, durante a seguinte expansão completa e o procedimento de cultura de células, a célula não teve nenhum contato com proteínas do soro ou proteínas derivadas de animal.

[00104] Durante a expansão, os melhores clones são selecionados com respeito à robustez, alta taxa de crescimento, viabilidade e produção de G-CSF ativo conforme medição no formato ELISA. Depois dessa fase de seleção, os clones colhidos são cultivados sob condições isentas de soro, sem suplementos de antibióticos. Células 293F foram cultivadas completamente isentas de soro; durante todo o procedimento, o meio foi trocado dia sim, dia não. Up-scaling das células foi realizado sob condições completamente isentas de soro de frascos Erlenmeyer em Agitadores Kühner para volumes mais altos em reator de onda (Wave Biotech Europe). Durante essa seleção, o número é reduzido de novo para somente poucos dos melhores clones produtores. A seqüência de cDNA correta, teor de mRNA e comportamento na fermentação são os critérios para identificar os melhores clones para subclonagem. Para isso, células do(s) clone(s) seleci- onado(s) são plaqueadas, analisadas e colhidas com ClonePixFL, e então expandidas e selecionadas como descrito anteriormente. A subclonagem é uma etapa essencial de modo a selecionar novamente os melhores clones produtores, para eliminar possíveis variações genéticas na subpopulação plaqueada do clone. Depois da subclonagem, o(s) clone(s) selecionado(s) é(são) amontoado(s) de novo sob condições isentas de soro. A proteína de G-CSF humana, recombinante, expressa, é caracterizada bioquimicamante em mais detalhes. D. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE G-CSF HUMANO POR ELISA:

[00105] a quantidade do rhG-CSF expresso pelas linha gens de células 293F FreeStyle assim obtidas foi determinada por ELI- SA, e o rendimento da proteína obtida com células transfectadas com veto- res diferentes foi comparado (vide figura 15). Como esperado dos experimentos de expressão com FIX e A1AT conforme descrição nos Exemplos 2 e 3, aqui, de novo, uma combinação do vetor pcDNA 3.1-GCSFb com a linhagem de células 293F mostrou a mais alta produtividade e foi, portanto, usado para a produção de G-CSFb humano recombinante. E. WESTERN BLOT DE RHG-CSF NA REDUÇÃO DE SDS-PAGE:

[00106] 10 μL de G-CSF produzidos nos sobrenadantes de células HEK293 e HEK293F foram analisados em 15% de SDS-PAGE e Western blot. A detecção de G-CSF foi efetuada via BAF214-bio/SA- HRP/DAB (vide figura 16). A seta indica a banda monomérica do rhG-CSF da massa molecular correta. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS, TEXTO LIVRE SEQ ID NO:1: , pcDNA3.1-FIX,

SEQ ID NO:2: pcDNA3.1-A1AT Molécula: 6914 bps DNA, circular

SEQ ID NO:3: pcDNA3.1-FVIII

SEQ ID NO:4: seqüência de pcDNA 3.1 publicada por Inivitrogen

SEQ ID NO:5: pcDNA3.1Hygro(+)-zz, tendo 3 nts adicionais "GGT" na posição 4380 comparada com SEQ ID NO:4

SEQ ID NO:6: SEQ ID NO:7: 5464 vetor pTG1-A1AT vetor pFGF8-hyg-s 4604 C AmpR(fita com-plementar)

SEQ ID NO:8: cDNA de fator VIII tipo selvagem SEQ ID NO:9: fator VIII humano tipo selvagem SEQ ID NOs:10-12: peptídeo de ligação SEQ ID NO:13: cDNA fr hFVII forma a SEQ ID NO:14: cDNA fr hFVII forma b SEQ ID NO:15: cDNA de GCSF humano forma a, CDS: 41-661 SEQ ID NO:16: cDNA de GCSF humano forma b, CDS: 41-652 SEQ ID NO:17: cDNA of GCSF humano forma c, CDS: 229-828 SEQ ID NO:18: cDNA de hvWF SEQ ID NOs:19 e 20: iniciador de avanço e de reverso de G-CSF SEQ ID NO:21: vetor PCR2.1d2-GCSFb Molécula: 4542 bps DNA; circular

SEQ ID NO:22: vetor pcDNA3.1-hyg(+)-GCSFb Molécula: 6237 bps DNA, circular

SEQ ID NO:23: vetor pCINeo-GCSFb Molécula: 6101 bps DNA, circular

SEQ ID NO:24: vetor pCMVScript_GCSFb,

SEQ ID NO:25: pTG2-GCSFb-hyg-as

SEQ ID NO:26: cDNA de GCSF humano forma b SEQ ID NO:27: proteína de GCSF humano forma b

Claims

1. MÉTODO PARA PREPARAR UMA LINHAGEM DE CÉLULA HUMANA IMORTALIZADA para produção recombinante de uma proteína do Fator VIII (FVIII) humana, caracterizada pelo fato de que a linhagem de célula humana imortalizada é cultivada, transfectada e selecionada sob condições isentas de soro e proteína, e em que linhagem celular humana imortalizada é estavelmente transfectada com um vetor de SEQ ID NO: 3 compreendendo uma sequência de ácidos nucléicos que codifica a proteína FVIII humana nos pares de base 783 a 5126 da SEQ ID NO:3, um promotor de citomegalovírus (CMV), um marcador selecionável e um sinal de poliadenilação (poliA) de hormônio de crescimento bovino, em que o dito promotor e o sinal de poliA estão ligados à extremidade 5’ e 3’ do gene que codifica a proteína FVIII humana, respectivamente, cujo método compreende: (i) cultivar as células de uma linhagem de célula hospedeira humana imortalizada sob condições de cultura de células em suspensão isentas de soro e proteína, em que a linhagem de célula hospedeira humana imortalizada é linhagem de célula 293F; (ii) transfectar as células 293F da etapa (i) sob condições isentas de soro e proteína com o vetor de transfecção de SEQ ID NO: 3, incluindo uma origem de replicação e pelo menos um gene codificando um marcador selecionável; e (iii) transferir as células 293F transfectadas da etapa (ii) para uma placa de cultura plana para sedimentação para estabelecer o crescimento aderente e selecionar uma ou mais células 293F aderentes estavelmente transfectadas em condições de cultura de células isentas de soro e proteína, e em que o meio de cultura é suplementado com higromicina em que pelo menos a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína FVIII, o promotor e o sinal poliA ligados às extremidades 5'e 3' da sequência de nucleotídeos do gene, respectivamente, são integrados ao genoma da linhagem de célula 293F humana imortalizada.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela transfecção isenta de soro e proteína ser efetuada em cultura de suspensão com um agente de transfecção catiônico ou fosfato de cálcio.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pela etapa (iii) de seleção de células compreender seleção por produtividade, atividade ou qualidade do produto da proteína FVIII humana recombinante produzida.

4. MÉTODO PARA PRODUÇÃO RECOMBINANTE DE UMA PROTEÍNA FVIII HUMANA, caracterizado por compreender a execução do método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, para obter estavelmente uma linhagem de célula humana imortalizada e cultivar a linhagem de célula 293F humana imortalizada sob condições isentas de soro e proteína.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por compreender ainda as etapas de concentrar a proteína FVIII humana recombinante do caldo de cultura e/ou purificar a proteína FVIII humana recombinante, e/ou remoção de príon.