JP2004016055A - 組換えフィブリノーゲンの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】ピキア酵母を用いて、完全分子構造のフィブリノーゲンを遺伝子工学的手法により、安定的にかつ大量に製造できる方法を確立すること。
【解決手段】１）ピキア酵母での異種蛋白質の発現を制御可能なプロモーター、フィブリノーゲン由来のシグナル配列、フィブリノーゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖、γ鎖をコードする遺伝子を各々連結した発現用プラスミドを調製する工程、２）当該プラスミドをピキア酵母に導入して形質転換体を調製する工程、３）当該形質転換体をｐＨ５〜８の条件下で培養してフィブリノーゲンを産生する工程、および４）培養上清から回収されたフィブリノーゲンを精製する工程を含む、（Ａα−Ｂβ−γ）２の完全分子構造を有する組換えフィブリノーゲンの製造方法。
【選択図】 図１３
【解決手段】１）ピキア酵母での異種蛋白質の発現を制御可能なプロモーター、フィブリノーゲン由来のシグナル配列、フィブリノーゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖、γ鎖をコードする遺伝子を各々連結した発現用プラスミドを調製する工程、２）当該プラスミドをピキア酵母に導入して形質転換体を調製する工程、３）当該形質転換体をｐＨ５〜８の条件下で培養してフィブリノーゲンを産生する工程、および４）培養上清から回収されたフィブリノーゲンを精製する工程を含む、（Ａα−Ｂβ−γ）２の完全分子構造を有する組換えフィブリノーゲンの製造方法。
【選択図】 図１３
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ピキア酵母を用いた遺伝子組換えによるフィブリノーゲンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
（ヒト）フィブリノーゲンは血漿中に存在する血漿蛋白の一種で、糖鎖構造を有する分子量約３４０ｋＤａの糖蛋白質である。血漿中には約３ｍｇ／ｍＬのレベルで存在する。フィブリノーゲンはＡα鎖、Ｂβ鎖、γ鎖からなり、Ｓ−Ｓ結合により（Ａα−Ｂβ−γ）２の完全分子構造を有する。Ａα鎖は６７ｋＤａ、６１０アミノ酸残基からなり、糖鎖を有しない。Ｂβ鎖は５６ｋＤａ、４６１アミノ酸残基からなり、３６４位のＡｓｎが糖鎖を有する。γ鎖は４８ｋＤａ、４１１アミノ酸残基からなり、５２位のＡｓｎが糖鎖を有する。フィブリノーゲンは血液凝固に関わる。すなわち、フィブリノーゲンは生体内ではトロンビンによってＡα鎖、Ｂβ鎖が各々切断され、ＦＰＡ（フィブリノペプチドＡ）、ＦＰＢ（フィブリノペプチドＢ）が除去されて（α−β−γ）２へと変換される（フィブリンモノマー）。このフィブリンモノマーはＣａ２＋の存在下に重合化してフィブリンポリマーを形成する。さらにトロンビンによって血液凝固第ＸＩＩＩ因子が活性化されると、そのトランスグルタミナーゼ活性によりフィブリンポリマー同士にペプチド結合が形成されて強固な交差架橋フィブリンとなる。フィブリノーゲンは医薬品としてフィブリノーゲン欠損症の補充療法等に適用されている。また、フィブリノーゲンはフィブリン糊の主成分として、外科手術時の組織の接着・閉鎖用に用いられる。
【０００３】
ところで、フィブリノーゲンは通常ヒトのプール血漿から調製されるが、ウイルス感染の恐れがあるにもかかわらず、加熱処理、ＳＤ処理、ウイルス除去膜処理などの現行の方法ではある種のウイルスを完全に不活化・除去することが困難であり、１００％安全な医薬品として供給することができているとは必ずしも断言できない状況にある。
【０００４】
そこで、血漿由来のフィブリノーゲンを用いる代わりの手段として、遺伝子組換え技術を利用してフィブリノーゲンを製造する方法が各種試みられている。例えば、宿主として酵母を用いる方法、動物細胞を用いる方法、トランスジェニック動物を用いる方法などが報告されている。動物細胞はＵＳＰ６０３７４５７、トランスジェニック動物はＷＯ００／１７２３４、ＷＯ００／１７２３９などを参照のこと。
【０００５】
このうち、宿主として酵母を用いる方法としては、最も代表的であるパン酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）を用いてフィブリノーゲンを産生する方法が知られている。特表平１０−５０５４９６；ＪＢＣ、２７０巻４０号、２３７６１〜２３７６７頁、１９９５年を参照のこと。しかしながら、パン酵母でのフィブリノーゲンの産生は比較的少量のレベルにすぎないこと、上記ＪＢＣ誌の共同著者が後述しているように、発現性・再現性に問題があったことを指摘している。ＪＢＣ、２７４巻、５５４頁、１９９９年を参照のこと。従って、当該方法は技術的に確立された方法とは言い難いものがある。
【０００６】
また、ピキア酵母（ピキア・パストリス）を用いてフィブリノーゲンの部分構造（例えば、γ鎖Ｃ末断片）を産生する方法が報告されている。ＪＢＣ、２７２巻３８号、２３７９２〜２３７９８頁、１９９７年；Ｂｌｏｏｄ、９２巻１０号、３６６９〜３６７４頁、１９９８年を参照のこと。しかしながら、当該断片とフィブリノーゲンの完全分子構造とでは分子の大きさが全く異なっており（分子量で、当該断片は約４０ｋＤａ前後にすぎないが、完全分子体では約３４０ｋＤａ）、生理活性も同一のものではないことから、本先行技術での知見が完全分子構造のフィブリノーゲンの製造にそのまま活用できるとはとても考えられない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ピキア酵母を用いて、完全分子構造のフィブリノーゲンを遺伝子工学的手法により、安定的にかつ大量に製造できる方法を確立することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の事情を考慮に入れてさらに研究を行った結果、特定の発現系・宿主系を用いてフィブリノーゲンを産生すること、培地中に産生されたフィブリノーゲンの分解を抑えること、培養上清から回収したフィブリノーゲンを効率よく回収すること、により所期の目的を達成できることを見出して本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、１）ピキア酵母での異種蛋白質の発現を制御可能なプロモーター、フィブリノーゲン由来のシグナル配列、フィブリノーゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖、γ鎖をコードする遺伝子を各々連結した発現用プラスミドを調製する工程、２）当該プラスミドをピキア酵母に導入して形質転換体を調製する工程、３）当該形質転換体をｐＨ５〜８の条件下で培養してフィブリノーゲンを産生する工程、および４）培養上清から回収されたフィブリノーゲンを精製する工程を含む、（Ａα−Ｂβ−γ）２の完全分子構造を有する組換えフィブリノーゲンの製造方法に関するものである。以下にその詳細を説明する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
発現系・宿主系の構築
（ヒト）フィブリノーゲンをコードする遺伝子として、Ａα鎖、Ｂβ鎖、γ鎖の各鎖をコードする遺伝子を用いる。Ａα鎖は６１０アミノ酸残基からなり、その１位がＡｌａ、６１０位がＶａｌである。Ｂβ鎖は４６１アミノ酸残基からなり、その１位、４６１位ともＧｌｎである。γ鎖は４１１アミノ酸残基からなり、その１位はＴｙｒ、４１１位はＶａｌである。これらの遺伝子（配列）は公知のものを用いることができる。例えば、Ａα鎖遺伝子は、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２２巻、３２３７〜３２４４頁、１９８３年；Ｇｅｎ Ｂａｎｋ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｍ５８５６９などに、Ｂβ遺伝子は、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．、２８１巻、３９〜４８頁、１９９０年；Ｇｅｎ Ｂａｎｋ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｍ６４９８３などに、γ鎖遺伝子は、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２２巻、３２５０〜３２５６頁、１９８３年；Ｇｅｎ Ｂａｎｋ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｍ１００１４などに各々報告されているので、これらを利用することができる。
【００１１】
発現系としては、プロモーター、シグナル配列の選択が重要である。プロモーターはピキア酵母において異種蛋白質の発現（分泌）を制御可能なものとして通常利用されているものであれば特に限定されない。具体的にはアルコールオキシダーゼ由来のプロモーター、ＧＡＰ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）プロモーター（ＧＥＮＥ、１８６巻、３７〜４４頁、１９９７年）などが例示される。アルコールオキシダーゼプロモーターとしては、例えば、ＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーターなどが例示される。本発明のプロモーターとして好ましいのは、変異型ＡＯＸ２プロモーター、すなわち、天然型ＡＯＸ２プロモーター（Ｙｅａｓｔ、５巻、１６７〜１７７頁、１９８９年）中の開始コドン上流２５５番目の塩基がＴからＣに変異したもの（特開平４−２９９９８４）やその他の箇所が変異または欠失したもの（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２４３巻、４８９〜４９９頁、１９９４年）またはＧＡＰプロモーターである。
【００１２】
シグナル配列としては（ヒト）フィブリノーゲン由来のｎａｔｉｖｅなものを用いる。具体的には以下の配列で示される。Ａα鎖のシグナル配列の場合は、ＭＦＳＭＲＩＶＣＬＶＬＳＶＶＧＴＡＷＴで示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子である。当該シグナル配列としては上記のアミノ酸配列に対応するコドンを有する塩基配列であれば特に限定されない。その一例として、ＡＴＧＴＴＴＴＣＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＧＴＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＣＴＡＡＧＴＧＴＧＧＴＧＧＧＣＡＣＡＧＣＡＴＧＧＡＣＴで示される塩基配列などが例示される。
【００１３】
Ｂβ鎖のシグナル配列の場合は、ＭＫＨＬＬＬＬＬＬＣＶＦＬＶＫＳで示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子である。当該シグナル配列としては上記のアミノ酸配列に対応するコドンを有する塩基配列であれば特に限定されない。その一例として、ＡＴＧＡＡＡＣＡＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＣＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＴＧＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＴＡＡＧＴＣＣで示される塩基配列などが例示される。
【００１４】
γ鎖のシグナル配列の場合は、ＭＳＷＳＬＨＰＲＮＬＩＬＹＦＹＡＬＬＦＬＳＳＴＣＶＡで示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子である。当該シグナル配列としては上記のアミノ酸配列に対応するコドンを有する塩基配列であれば特に限定されない。その一例として、ＡＴＧＡＧＴＴＧＧＴＣＣＴＴＧＣＡＣＣＣＣＣＧＧＡＡＴＴＴＡＡＴＴＣＴＣＴＡＣＴＴＣＴＡＴＧＣＴＣＴＴＴＴＡＴＴＴＣＴＣＴＣＴＴＣＡＡＣＡＴＧＴＧＴＡＧＣＡで示される塩基配列などが例示される。
【００１５】
また、ターミネーター、選択マーカーなども公知のものを利用することができる。ターミネーターとしてはＡＯＸ１ターミネーターなどが例示される。選択マーカーとしてはピキア酵母由来のＡＲＧ４、ＨＩＳ４、パン酵母由来のＳＵＣ２、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３などのアミノ酸／核酸合成遺伝子あるいはゼオシン、Ｇ４１８などの薬剤耐性遺伝子等が例示される。
【００１６】
また、発現用プラスミドを宿主の染色体上に導入する場合は相同領域を用いることができる。相同領域としては上記のアミノ酸／核酸合成遺伝子、アルコールオキシダーゼ遺伝子、ｒｉｂｏｓｏｍｅＤＮＡ遺伝子、Ｔｙ因子、その他のピキア酵母の既知遺伝子などが例示される。
【００１７】
発現用プラスミド（発現ベクター）は、プロモーターの下流にシグナル配列、フィブリノーゲンの各鎖をコードする遺伝子、ターミネーター、選択マーカー、相同領域などを連結することにより調製することができる。また、同一プラスミド上にフィブリノーゲンの各鎖を発現するユニットを全て担持させることにより、３鎖の共発現系を構築することができる。
【００１８】
宿主としては、ピキア酵母（ピキア・パストリス）を用いる。具体的にはＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ 寄託番号Ｙ−１５８５１）、ＧＳ１９０株（同Ｙ１８０１４）、ＰＰＦ１株（同Ｙ１８０１７）、野生株（同Ｙ１１４３１）などが例示される。また、本発明においてはプロテアーゼＡ欠損株を用いることが好ましい。具体的にはＳＭＤ１１６８株（インビトロジェン社）などが例示される。
【００１９】
プラスミドをピキア酵母に導入し形質転換体を調製する手段としては、各鎖を発現する複数種のプラスミドを、各々の相異なる相同領域を利用して順次、宿主の染色体上に組込む方法と、３鎖の遺伝子発現ユニットを同一のプラスミド上に組込んだ発現用プラスミドを宿主の染色体上に組込む方法がある。なお、形質転換体は当該発現用プラスミドを１または複数個（コピー数で）組込んでいてもよい。
【００２０】
また、プラスミドを宿主染色体に組込む方法の他に、プラスミドに自律複製配列を付加することにより、細胞内にエピゾーマル型で存在させることもできる。
【００２１】
発現用プラスミドを宿主細胞内に導入する（宿主染色体に組込む、細胞内にエピゾーマル型で存在させる）方法は公知の手法を用いることができる。例えば、アルカリカチオン法、プロトプラストポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法などが例示される。
【００２２】
培養（産生）工程
本工程は形質転換体を培地で培養して組換えフィブリノーゲンを産生させる工程である。培地としてはピキア酵母の培養に通常用いられるものであれば、特に限定されるものではない。例えば、ＹＰＤ培地（酵母エキス、ペプトン、デキストロースからなる）、ＹＰＭ培地（酵母エキス、ペプトン、メタノールからなる）、ＹＰＧ培地（酵母エキス、ペプトン、グリセロールからなる）などが例示される。
【００２３】
ＹＰ濃度としては１×〜１０×程度（１×は１％酵母エキス、２％ペプトンからなる組成の意味）が例示される。好ましくは２×〜５×程度である。メタノール（Ｍ）濃度としては１〜５％程度が例示される。好ましくは２〜３％程度である。グリセロール（Ｇ）濃度としては１〜１０％程度が例示される。
【００２４】
培養はｐＨ５〜８の条件下で行われる。好ましくは培養初期のｐＨ条件としてｐＨ５〜６程度に調整する。ｐＨを調整するにはクエン酸緩衝液を用いることが好ましい。培養途中および培養終了時においてｐＨ５〜８の範囲内にあればよい。
【００２５】
添加剤としてプロテアーゼ阻害剤を用いることができる。好ましくはセリンプロテアーゼ阻害剤である。具体的にはＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフロリド）、アプロチニン、キモスタチン、ＡＥＢＳＦ［４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフロリド］などが例示される。その添加濃度としては０．１〜１０ｍＭ程度が例示される。
【００２６】
培養条件としては培養温度１０〜４５℃程度で、培養時間１０〜５００時間程度が例示される。培養様式としてはバッチ培養、フェドバッチ培養（フェドバッチ）などを用いることができる。
【００２７】
なお、当該本培養に先立って前培養を行うことが好ましい。前培養用の培地としては、例えば、ＹＮＢ（イーストナイトロジェンベースとブドウ糖からなる）、ＹＰＧなどが例示される。また、前培養の培養条件としては温度１０〜４５℃程度、培養時間１０〜１００時間程度が例示される。
【００２８】
精製工程
本工程は培養上清から回収された組換えフィブリノーゲンを精製する工程である。その精製方法としては、陽イオン交換体処理、ゲル濾過処理が挙げられる。得られた培養上清をそのまま、あるいは適当な方法により濃縮等の操作を施してから精製処理を行ってもよい。そのような前処理としては、エタノール分画、硫安分画、透析などが例示される。
【００２９】
陽イオン交換体処理は陽イオン交換体を用いて、吸着した組換えフィブリノーゲンを溶出することにより精製するものである。陽イオン交換体は陽イオン交換能を持った置換基を有する水不溶性担体である。陽イオン交換能を持った置換基としてはカルボキシアルキル、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）など、スルホアルキル、例えば、スルホプロピル（ＳＰ）などが例示される。水不溶性担体としては、アガロース（例えば、セファロースなど）、架橋デキストラン（例えば、セファデックスなど）、セルロース、ポリビリル（例えば、トヨパールなど）が例示される。陽イオン交換体は市販のものを用いることもできる。
【００３０】
ｐＨ条件としては、アプライ・洗浄時はｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．１Ｍ程度が挙げられる。具体的には５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）などが用いられる。溶出時はｐＨ６〜８、塩濃度０．１〜０．５Ｍ程度が挙げられる。具体的には、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む上記緩衝液（ｐＨ７．０）などが用いられる。陽イオン交換体処理はカラム、バッチのいずれの様式で行ってもよい。また、当該溶媒は１〜１０ｍＭ程度のＥＡＣＡ（イプシロンアミノカプロン酸）、ＥＤＴＡなどを含んでいてもよい。
【００３１】
ゲル濾過処理は、ゲル濾過用担体を用いて分子量の違いにより目的とする組換えフィブリノーゲンを精製・回収するものである。ゲル濾過用担体としてはアガロース、架橋デキストラン（例えば、セファデックスなど）、ポリアクリルアミドなどを用いることができる。組換えフィブリノーゲンの分子量（約３４０ｋＤａ）を考慮して、分画分子量領域が１０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ程度にあるものを用いることが好ましい。
【００３２】
展開時のｐＨ条件としてはｐＨ６〜９程度、塩濃度としては０．０１〜０．５Ｍ程度が挙げられる。具体的には、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０２５Ｍクエン酸ナトリウムを含む０．０２５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）などが例示される。また、当該溶媒は０．０１〜０．１Ｍ程度のＥＡＣＡなどを含んでいてもよい。
【００３３】
精製された組換えフィブリノーゲンの性状は、（Ａα−Ｂβ−γ）２の完全分子構造を有する。分子量は３４０ｋＤａ程度であり、フィブリノーゲン抗体吸着ビーズの凝集、フィブリン血栓の形成、トロンビンおよび血液凝固第ＸＩＩＩ因子による交差架橋フィブリンの形成などの生理活性を有する。また、当該組換えフィブリノーゲンはＮ型糖鎖を付加していてもよい。
【００３４】
【実施例】
本発明をより詳細に説明するために実施例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００３５】
なお、本実施例において、ウェスタンブロットによる分析は以下の条件で行った。還元または非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ウェスタンブロットで検出した。分子量マーカーとして３７、５０、７５、１００、２５０ｋＤａの組換え蛋白（ＢＩＯ ＲＡＤ製、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）を用いた。また対照としてヒト血漿由来フィブリノーゲン（以下ｐフィブリノーゲン。三菱ウェルファーマまたはカルビオケム社）を用いた。
【００３６】
実施例１ 変異型ＡＯＸ２プロモーターの制御下でヒトフィブリノーゲンが発現される発現ベクターの構築
１）Ａα鎖発現ベクターの構築
Ａα鎖ｃＤＮＡの取得
ＰＣＲ法によりＡα鎖ｃＤＮＡを５’および３’末端にそれぞれＡｓｕＩＩ、ＢａｍＨＩサイトを付加するように増幅した。ＰＣＲプライマー用オリゴＤＮＡは公知のＡα鎖ｃＤＮＡの塩基配列（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２２巻、３２３７〜３２４４頁、１９８３年；Ｇｅｎ Ｂａｎｋ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｍ５８５６９）を参考に合成した。鋳型ＤＮＡにはＨｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ ｃＤＮＡＬｉｂｒａｒｙ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、ＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅した結果、Ａα鎖ｃＤＮＡに相当する約１．９ｋｂのＰＣＲ産物を得た。当該ＤＮＡは１９アミノ酸残基のシグナル配列から６１０アミノ酸残基の成熟配列に至り、６１０位のＶａｌの後に停止コドンを付加した遺伝子である。
【００３７】
Ａα鎖発現ベクターの構築
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）発現ベクターであるｐＭＭ０４２（特開平４−２９９９８４）をＥｃｏＲＶ＋ＳｐｈＩで消化してＨＩＳ４遺伝子を除いた断片に、ｐＹＭ３０（パン酵母由来。特開昭６２−１０７７８９）を同制限酵素で消化して得たＡＲＧ４遺伝子断片を挿入し、ＡＲＧ４マーカーを有するＨＳＡ発現ベクターを構築した。さらにこのベクターをＡｓｕＩＩ＋ＢａｍＨＩ消化することによりＨＳＡ遺伝子を除いた断片に、上記１．９ｋｂのＰＣＲ産物を同制限酵素で消化したＡα鎖ｃＤＮＡ断片を挿入し、Ａα鎖発現ベクターｐＩＭ１０４を構築した。ｐＩＭ１０４は変異型ＡＯＸ２プロモーター（以下ｍＡＯＸ２プロモーター）、Ａα鎖ｃＤＮＡ、ＡＯＸ１ターミネーター、ＡＲＧ４マーカーを含んでなる（図１）。
【００３８】
Ａα鎖ｃＤＮＡの塩基配列の確認
構築したＡα鎖発現ベクターｐＩＭ１０４にクローニングされたＡα鎖ｃＤＮＡの塩基配列を確認した。シークエンスプライマー用オリゴＤＮＡは公知のＡα鎖ｃＤＮＡの塩基配列（上述の文献およびデータベース）を参考にして合成した。プライマー３．２ｐｍｏｌ、テンプレートＤＮＡ３００ｎｇ、プレミックス８μＬおよび蒸留水（全量２０μＬとなるように添加）を混合して常法により反応させた。反応液をスピンカラムで精製して遊離の蛍光ターミネーターを除いた後に、ＴＳＲ（ｔｅｍｐｌｅｔｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ）２０μＬを加えて攪拌し、９５℃で２分間加熱し、氷中で急冷したものについてシークエンスを行った。さらにオートシークエンサーによって得られた配列データを配列情報解析システム（Ｖｅｃｔｏｒ Ｎｔｉ、Ｃｏｎｔｉｇ ＥｘｐｒｅｓｓおよびＡｌｉｇｎ Ｘ）により編集、連結し、データベース上のＤＮＡ配列（上述のＧｅｎ Ｂａｎｋ）と比較した。その結果、両者のＤＮＡ配列および推定されるアミノ酸配列は一致した。
【００３９】
２）Ｂβ鎖発現ベクターの構築
Ｂβ鎖ｃＤＮＡの取得
ＰＣＲプライマー用オリゴＤＮＡは公知のＢβ鎖ｃＤＮＡの塩基配列（Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．、２８１巻、３９〜４８頁、１９９０年；Ｇｅｎ Ｂａｎｋ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｍ６４９８３）を参考に合成した。その他は１）に準じて行った。ＰＣＲの結果、Ｂβ鎖ｃＤＮＡに相当する約１．５ｋｂのＰＣＲ産物を得た。当該ＤＮＡは１６アミノ酸残基のシグナル配列から４６１アミノ酸残基の成熟配列に至り、４６１位のＧｌｎの後に停止コドンを付加した遺伝子である。
【００４０】
Ｂβ鎖発現ベクターの構築
上記１．５ｋｂのＰＣＲ産物を１）と同様にｐＭＭ０４２からＡｓｕＩＩ＋ＢａｍＨＩ消化によりＨＳＡ遺伝子を除いた断片に挿入し、Ｂβ鎖ｃＤＮＡの発現ベクターを構築した。まず、５’側のＡｓｕＩＩサイトからＢβ鎖ｃＤＮＡのＢａｍＨＩのサイトまでを挿入したベクターを構築し、次にこのベクターをＢａｍＨＩ消化した断片に、Ｂβ鎖ｃＤＮＡの残りの領域を同サイトを用いて挿入することによりＢβ鎖ｃＤＮＡの全領域が挿入されたベクターを得た。さらにＳｐｈＩ＋ＥｃｏＲＶで消化してＨＩＳ４遺伝子断片を除去したものにパン酵母由来のＳＵＣ２遺伝子断片（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１巻、１９４３〜１９５４頁、１９８３年）を挿入し、Ｂβ鎖発現ベクターｐＮＴ４０を構築した。ｐＮＴ４０はｍＡＯＸ２プロモーター、Ｂβ鎖ｃＤＮＡ、ＡＯＸ１ターミネーター、ＳＵＣ２マーカーを含んでなる（図２）。
【００４１】
塩基配列の確認
構築したＢβ鎖発現ベクターｐＮＴ４０にクローニングされたＢβ鎖ｃＤＮＡの塩基配列を確認した。シークエンスプライマー用オリゴＤＮＡは公知のＢβ鎖ｃＤＮＡの塩基配列（上述の文献およびデータベース）を参考にして合成した。その他は１）の方法に従った。その結果、両者のＤＮＡ配列および推定されるアミノ酸配列は一致した。
【００４２】
３）γ鎖発現ベクターの構築
γ鎖ｃＤＮＡの取得
ＰＣＲプライマー用オリゴＤＮＡは公知のγ鎖ｃＤＮＡの塩基配列（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２２巻、３２５０〜３２５６頁、１９８３年；Ｇｅｎ Ｂａｎｋ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｍ１００１４）を参考に合成した。その他は１）に準じて行った。その結果、γ鎖ｃＤＮＡに相当する約１．３ｋｂのＰＣＲ産物を得た。当該ＤＮＡは２６アミノ酸残基のシグナル配列から４１１アミノ酸残基の成熟配列に至り、４１１位のＶａｌの後に停止コドンを付加した遺伝子である。
【００４３】
γ鎖発現ベクターの構築
上記１．３ｋｂのＰＣＲ産物を１）と同様にｐＭＭ０４２からＡｓｕＩＩ＋ＢａｍＨＩ消化によりＨＳＡ遺伝子を除いた断片に挿入し、γ鎖発現ベクターｐＮＴ４１を構築した。ｐＮＴ４１はｍＡＯＸ２プロモーター、γ鎖ｃＤＮＡ、ＡＯＸ１ターミネーター、ＨＩＳ４マーカーを含んでなる（図３）。
【００４４】
塩基配列の確認
構築したγ鎖発現ベクターｐＮＴ４１のγ鎖ｃＤＮＡ領域の塩基配列を確認した。シークエンスプライマー用オリゴＤＮＡは公知のγ鎖ｃＤＮＡの塩基配列（上述の文献およびデータベース）を参考に合成した。その他は１）の方法に従った。その結果、両者のＤＮＡ配列および推定されるアミノ酸配列は一致した。
【００４５】
４）Ａα・Ｂβ・γ共発現ベクターの構築
ｐＮＴ４０をＥｃｏＲＩ＋ＣｌａＩ消化して得られたＢβ発現ユニットの両端を末端平滑化し、これをｐＮＴ４１のＥｃｏＲＩ消化、末端平滑化ベクターと連結することにより、２鎖（Ｂβ・γ）発現ベクターｐＮＴ４２を得た。次にｐＩＭ１０４をＥｃｏＲＶ消化後にＥｃｏＲＩで部分消化して得られたＡα発現ユニットを末端平滑化し、ｐＮＴ４２をＮａｅＩ消化して得られたベクターに連結し、３鎖（Ａα・Ｂβ・γ）共発現ベクターｐＮＴ４３を構築した。ｐＮＴ４３はＡα、Ｂβおよびγ鎖の発現ユニット、ＨＩＳ４マーカーを含んでなる（図４）。
【００４６】
実施例２ 酵母形質転換体の作製
１）Ａα、Ｂβ、γの各単鎖発現ベクターを用いた酵母形質転換体の作製
Ａα鎖、Ｂβ鎖、γ鎖の各鎖単独発現ベクター（ｐＩＭ１０４、ｐＮＴ４１、ｐＮＴ４０）を、各々の選択マーカー（相同領域）を利用してピキア酵母を順次形質転換を行っていくことで、各鎖が組込まれた３鎖共発現株を作製した。まず、ｐＩＭ１０４をＳａｌＩで消化、線状化し、アルカリカチオン法によりピキア酵母ＰＰＦ１株（ｈｉｓ４，ａｒｇ４）に導入した。ヒスチジンを含み、アルギニンを含まないＳＤ寒天培地に再生したアルギニン非要求性のクローンよりＳｉｎｇｌｅ Ｃｏｌｏｎｙ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎを行い、Ａα単鎖発現形質転換体の単一クローンを得た。次にｐＮＴ４０をＳｔｕＩで消化、線状化し、Ａα単鎖発現形質転換体に導入した。ＳＤ ｗ／ｏ ａ．ａ．寒天培地に再生したヒスチジン非要求性クローンよりＳｉｎｇｌｅ Ｃｏｌｏｎｙ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎを行い、Ａα・γ２鎖発現形質転換体の単一クローンを得た。さらに、ｐＮＴ４１をＳｐｅＩで消化、線状化し、Ａα・γ２鎖発現形質転換体に導入した。ＳＵＣ選択寒天培地（１／２ＭＳｕ ｐｌａｔｅ）に再生したクローンよりＳｉｎｇｌｅＣｏｌｏｎｙ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎを行い、Ａα・Ｂβ・γ３鎖発現形質転換体の単一クローンを得た。
【００４７】
２）３鎖共発現ベクターを用いた酵母形質転換体の作製
３鎖共発現ベクターｐＮＴ４３をピキア酵母ＧＴＳ１１５株（ｈｉｓ４）およびプロテアーゼＡ欠損株であるＳＭＤ１１６８（ｈｉｓ４，ｐｅｐ４）株に導入した。ｐＮＴ４３をＳａｌＩで消化、線状化し、アルカリカチオン法により形質転換した。ＳＤ ｗ／ｏ ａ．ａ．寒天培地に再生したクローンよりＳｉｎｇｌｅＣｏｌｏｎｙ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎを行うことにより形質転換体の単一クローンを得た。各宿主酵母（ＧＴＳ１１５株およびＳＭＤ１１６８株）を用いて得られた形質転換体をそれぞれＧＮＴ４３株およびＳＮＴ４３株と命名した。
【００４８】
形質転換体はＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％デキストロースからなる）で３０℃、４８時間培養し、遠心（２８００ｒｐｍ×１０分）にて集菌し、１０％グリセロールを分散溶媒として１ｍＬずつセラムチューブに分注し、−８０℃で保存した。
【００４９】
３）形質転換体のフラスコ培養
以上のようにして作製した組換えヒトフィブリノーゲン発現形質転換体を通常の方法でＹＰ−２％メタノール培地を用いて３０℃で最大９６時間まで培養したが、培養２４、４８、７２、９６時間のいずれの時点でも検出することができなかった。これは産生された組換えヒトフィブリノーゲンが激しく分解を受けたためと考えられた。
【００５０】
実施例３ 血漿由来フィブリノーゲンと酵母培養上清を用いた分解抑制条件の検討
組換え酵母を用いて異種蛋白質を発現させる場合、宿主由来のプロテアーゼによって目的産物が分解を受ける場合がある。フィブリノーゲンも宿主酵母由来のプロテアーゼにより分解を受けることが明らかとなった。そこで、酵母による組換えヒトフィブリノーゲンを産生させる培養条件を決定するために、ヒト血漿由来フィブリノーゲンを用いて以下の検討を行った。
【００５１】
１）プロテアーゼ阻害剤
ピキア酵母ＧＴＳ１１５株を１×ＹＰ−２％メタノール培地で３０℃７２時間培養して培養上清を得た。これにｐフィブリノーゲン（終濃度３０μｇ／ｍＬ）および適量のプロテアーゼ阻害剤を添加して、３０℃で６０分間共存させた。その後に当該溶液をウェスタンブロットで分析して、ｐフィブリノーゲンの残存度および分解物の生成度を確認した。フィブリノーゲンの残存度、分解物の生成度とも、−（なし）、±（若干あり）、＋（あり）、＋＋（大いにあり）の４段階で判定した。その結果、ｐフィブリノーゲンは培養上清中に産生された酵母由来のプロテアーゼにより分解されｐフィブリノーゲンの分解はＰＭＳＦ、アプロチニン、キモスタチンの添加により完全に抑制された（表１）。また、ｐフィブリノーゲンの分解は培養上清中に産生された酵母由来プロテアーゼによるものと考えられた。
【００５２】
【表１】
【００５３】
２）ｐＨ
ｐフィブリノーゲンと酵母培養上清を各ｐＨ条件下で共存させた。ｐＨ調整は０．１Ｍクエン酸ナトリウム塩緩衝液、０．１Ｍリン酸カリウム塩緩衝液を用いた。実験は１）に準じて行った。その結果、ｐＨがアルカリ性になるほど、ｐフィブリノーゲンが分解され易いことが判明した（表２）。
【００５４】
【表２】
【００５５】
実施例４ フィブリノーゲンの分解が抑制される酵母培養条件の検討
フィブリノーゲンの分解が抑制されるような酵母培養条件を検討するために、酵母培養系にｐフィブリノーゲンを添加し、各培養条件がその分解に及ぼす影響を調べた。
【００５６】
１）培地のｐＨ
各ｐＨの緩衝液を用いて調製した３×ＹＰ−２％メタノール培地を用いたＧＴＳ１１５株の培養系にｐフィブリノーゲン（終濃度３０μｇ／ｍＬ）を添加し、３０℃で７２時間の培養を行った。培地中のｐＨは０．１Ｍクエン酸ナトリウム塩緩衝液（ｐＨ４．５、５．５）、０．１Ｍリン酸カリウム塩緩衝液（ｐＨ６．５）を用いて調整した。培養終了後にｐフィブリノーゲンの残存度と分解物の生成度を実施例３に準じて確認した。その結果、ｐフィブリノーゲンはｐＨ５．５の緩衝液を用いて調製した３×ＹＰ−２％メタノール培地で培養したとき最も分解が抑制された（表３）。
【００５７】
【表３】
【００５８】
２）ＹＰ（酵母エキスおよびペプトン）濃度
ＹＰ濃度を１×、３×、５×とする以外は、１）に準じて行った。その結果、ｐフィブリノーゲンはＹＰ濃度が高いほど分解が抑制された（表４）。
【００５９】
【表４】
【００６０】
３）カザミノ酸添加
カザミノ酸を終濃度３％となるように培地に添加する以外は、１）に準じて行った。その結果、カザミノ酸添加によるｐフィブリノーゲン分解抑制効果は著しいものではなかった（表５）。
【００６１】
【表５】
【００６２】
４）炭素源
培地として３×ＹＰ−２％メタノール培養系（３×ＹＰ−Ｍ）または３×ＹＰ−４．５％グリセロール培養系（３×ＹＰ−Ｇ）を用いる以外は、１）に準じて行った。その結果、３×ＹＰ−Ｇ培養系を用いることにより、ｐフィブリノーゲンの分解は抑制された（表６）。
【００６３】
【表６】
【００６４】
実施例５ 分解抑制条件下で培養した酵母形質転換体による組換えヒトフィブリノーゲンの産生
１）ｐＨを調整した培地を用いた培養
形質転換体ＧＮＴ４３株を、クエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を用いて調製した３×ＹＰ−２％メタノール培地を用いて、３０℃で９６時間まで培養し、培養上清を回収してウェスタンブロットにて分析した。その結果、培養上清中に組換えヒトフィブリノーゲンの分泌産生を確認した（図５）。
【００６５】
２）培地にキモスタチンを添加した培養
形質転換体ＧＮＴ４３株を、１ｍＭのキモスタチンを添加した３×ＹＰ−２％メタノール培地を用いて１）と同様に実験を行った。その結果、培養上清中に組換えヒトフィブリノーゲンの分泌産生を確認した（図６）。
【００６６】
実施例６ フィブリノーゲン産生量を向上させる条件の検討
１）酵母宿主株
形質転換体（ＧＮＴ４３株、ＳＮＴ４３株。いずれも１コピー組込み体）を３×ＹＰ（ｐＨ５．５）−４．５％グリセロール培地で３０℃、３日間の前培養後に、３×ＹＰ（ｐＨ５．５）−２％メタノール培地にＯＤ５４０ｎｍ＝１となるように植菌し、３０℃で振盪培養した。ｐＨ５．５の調整はクエン酸緩衝液によった（以下の実験も同様）。培養２４、４８および７２時間目にサンプリングし、培養上清中に産生された組換えヒトフィブリノーゲンをウェスタンブロットにて分析した。その結果、プロテアーゼＡ欠損株ＳＭＤ１１６８を宿主とするＳＮＴ４３株が野生株ＧＴＳ１１５を宿主とするＧＮＴ４３株よりも高い産生量を示した（図７）。
【００６７】
２）培地のｐＨ
形質転換体ＳＮＴ４３株を３×ＹＰ（なりゆきｐＨ）−４．５％グリセロール培地および３×ＹＰ（ｐＨ５．５）−４．５％グリセロール培地で３０℃、３日間の前培養後に、各々３×ＹＰ（なりゆきｐＨ）−２％メタノールおよび３×ＹＰ（ｐＨ５．５）−２％メタノール培地で振盪培養した。その後は１）と同様に実験を行った。その結果、３×ＹＰ（ｐＨ５．５）の培養系では分解が抑制されており、より高い産生量を示した（図８）。
【００６８】
３）導入したベクターの組込みコピー数
ＳＮＴ４３株の１、２および３コピー組込み体を用いて１）に準じて実験を行った。その結果、２および３コピー組込み体は１コピー組込み体よりも高い産生量を示した（図９）。
【００６９】
４）メタノール濃度
ＳＮＴ４３株を用い、本培養時の培地におけるメタノール濃度を２％または３％とし、１）に準じて実験を行った。その結果、３％メタノールの培地の方が組換えヒトフィブリノーゲンの産生量が高いことが判明した（図１０）。
【００７０】
５）ＹＰ（酵母エキスおよびペプトン）濃度
ＳＮＴ４３株を用い、本培養時の培地におけるＹＰ濃度を１×、３×、５×とする以外は１）に準じて実験を行った。併せて菌体の増殖も確認した。増殖度は培養７２時間目に当該培地の５４０ｎｍでの吸光度を測定した。その結果、ＹＰ濃度に依存して菌体の増殖も進み（表７）、産生量も増加した（図１１）。
【００７１】
【表７】
【００７２】
６）産生量測定
ＳＮＴ４３株の１、２および３コピー組込み体を用いて１）に準じて培養し、培養２４、４８、７２、９６時間目における培養上清中の組換えフィブリノーゲン量を２種類のヒトフィブリノーゲン特異的ポリクローナル抗体［Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｈｕＦｂｇ（ＤＡＫＯ，Ｃｏｄｅ Ｎｏ．Ａ００８０）およびＲａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｈｕＦｂｇ−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ，Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＰＯ０４５５）］を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した（検出感度約３ｎｇ／ｍＬ）。コピー数を増加させた場合の産生量の増大が確認され、ＳＮＴ４３（３コピー組込み体）株で培養９６時間目の産生量は１０．７μｇ／ｍＬに達した（表８）。
【００７３】
【表８】
【００７４】
実施例７ 培養上清中に分泌された組換えヒトフィブリノーゲンの性状分析
実施例６により調製した、ＳＮＴ４３株を４８時間培養した際の培養上清中に分泌された組換えヒトフィブリノーゲンの性状を分析した。対照としてｐフィブリノーゲンを用いて比較した。
【００７５】
１）分子量と３鎖のアセンブリ
培養上清についてウェスタンブロットで分析した。これらの結果から、分泌産生された組換えヒトフィブリノーゲンは分子量約３４０ｋＤａであり、Ａα鎖、Ｂβ鎖、γ鎖の３鎖がアセンブリしていると推察された（図１２、図１３）。すなわち、（Ａα−Ｂβ−γ）２の完全分子構造であることが判明した。
【００７６】
２）Ｎ型糖鎖の付加
培養上清についてグリコペプチダーゼＦ（ＧＰＦ）を用いて３７℃で１７時間処理して組換えヒトフィブリノーゲンを消化し、ウェスタンブロットで分析して、各鎖のＮ型糖鎖付加について解析した。ｐフィブリノーゲンと比較し、ウェスタンブロットの結果を図１４に、それをまとめた結果を表９に示す。
【００７７】
【表９】
【００７８】
３）交差架橋フィブリン形成能
培養上清を緩衝液［２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＡＣＡ、１ｍＭ ＣａＣｌ２］に交換したものを血液凝固第ＸＩＩＩ因子（０．７Ｕ／ｍＬ）存在下または非存在下にトロンビン（３．３ＮＩＵ）と３７℃で反応させて、交差架橋フィブリン（フィブリン複合体）を形成させた。これを還元条件下でウェスタンブロッティングにより分析した。その結果、血液凝固第ＸＩＩＩ因子存在下にトロンビンと反応させたときのみ、分子量約９０ｋＤａの高分子領域にγ２鎖からなる交差架橋フィブリンのバンドが検出された（図１５）。
【００７９】
実施例８ 培養上清からの組換えヒトフィブリノーゲンの精製
実施例６の培養上清を回収し、緩衝液Ａ［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＥＡＣＡ］に透析後、同緩衝液で平衡化したＣＭ−セファロースカラムに吸着させた。同緩衝液で洗浄後、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む同緩衝液で溶出させた。溶出液の各画分についてＥＬＩＳＡを行い、ヒトフィブリノーゲンを含むことが確認された画分をプールし、ゲル濾過クロマト処理を行った。ゲル濾過にはＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムを用いた。展開液は０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０２５Ｍクエン酸ナトリウム、０．０２Ｍ ＥＡＣＡを含む０．０２５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。流速は１ｍＬ／分とした。分子量約３４０ｋＤａの画分を回収した。
【００８０】
実施例９ 精製フィブリノーゲンのフィブリン塊形成能
実施例８により精製した組換えヒトフィブリノーゲンを血液凝固第ＸＩＩＩ因子（０．７Ｕ／ｍＬ）存在下でトロンビン（３．３ＮＩＵ）と３７℃で反応させた。その結果、フィブリン塊の形成が肉眼で観察された。また、当該塊は血栓溶解剤（プラスミン）を添加することにより分解・溶解した。
【００８１】
実施例１０ ＧＡＰプロモーターの制御下に組換えヒトフィブリノーゲンが発現される酵母発現系
１）Ａα鎖発現ベクターの構築
ＧＡＰプロモーター遺伝子の取得
市販のＧＡＰプロモーターを有する発現ベクターｐＧＡＰＺαＡ（インビトロジェン社）を鋳型としてＰＣＲによりＧＡＰプロモーター遺伝子を増幅した。ＰＣＲプライマー用オリゴＤＮＡは公知のｐＧＡＰＺαＡの配列（ＧＥＮＥ、１８６巻、３７〜４４頁、１９９７年）を参考に合成した。すなわち、正方向プライマーはＧＡＰプロモーターの５’末端ＢｇｌＩＩサイトを除去し、代わりにＥｃｏＲＩおよびＰｍａＣＩサイトを付加するように合成した。また、逆方向プライマーはｐＧＡＰＺαＡのＧＡＰプロモーターの下流に位置するαファクタープレプロ配列の３’末端に相補的な配列とし、末端にＥｃｏＲＩサイトを付加するように設計した。得られた約０．８ｋｂのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ消化し、市販のクローニングベクターｐＵＣ１９の同サイトにクローニングした。このベクターをｐＩＭ１０８と命名した。
【００８２】
塩基配列の決定
構築したベクターＩＭ１０８のＧＡＰプロモーターに相当する領域の塩基配列を決定した。シークエンスプライマー用オリゴＤＮＡは公知のＧＡＰプロモーターのｃＤＮＡの塩基配列（上記のＧＥＮＥ誌）を参考にして合成した。その他は実施例１の１）の方法に従った。その結果、両者は一致した。
【００８３】
Ａα鎖発現ベクターの構築
実施例１で構築したベクターｐＩＭ１０４をＰｍａＣＩ＋ＡｓｕＩＩ消化してｍＡＯＸ２プロモーターを除いた断片にｐＩＭ１０８を同制限酵素で消化して得られたＧＡＰプロモーター遺伝子を挿入し、Ａα発現ベクターｐＩＭ１０９を構築した。ｐＩＭ１０９はＧＡＰプロモーター、Ａα鎖ｃＤＮＡ、ＡＯＸ１ターミネーター、ＡＲＧ４マーカーを含んでなる（図１６）。
【００８４】
２）Ｂβ鎖発現ベクターの構築
実施例１で構築したベクターｐＮＴ４０をＰｍａＣＩ＋ＡｓｕＩＩ消化してｍＡＯＸ２プロモーターを除いた断片にｐＩＭ１０８を同制限酵素で消化して得られたＧＡＰプロモーター遺伝子を挿入し、Ｂβ発現ベクターｐＩＭ１１０を構築した。ｐＩＭ１１０はＧＡＰプロモーター、Ｂβ鎖ｃＤＮＡ、ＡＯＸ１ターミネーター、ＳＵＣ２マーカーを含んでなる（図１７）。
【００８５】
３）γ鎖発現ベクターの構築
実施例１で構築したベクターｐＮＴ４１をＥｃｏＲＩ＋ＡｓｕＩＩ消化してｍＡＯＸ２プロモーターを除いた断片にｐＩＭ１０８を同制限酵素で消化して得られたＧＡＰプロモーター遺伝子を挿入し、γ発現ベクターｐＩＭ１１１を構築した。ｐＩＭ１１１はＧＡＰプロモーター、γ鎖ｃＤＮＡ、ＡＯＸ１ターミネーター、ＨＩＳ４マーカーを含んでなる（図１７）。
【００８６】
４）Ｂβ・γ２鎖を共発現させるベクターの構築
ｐＩＭ１１０をＥｃｏＲＩ＋ＣｌａＩ消化して得られたＢβ発現ユニットの両端を末端平滑化し、これをｐＩＭ１１１のＥｃｏＲＩ消化、末端平滑化ベクターと連結することにより、２鎖（Ｂβ・γ）発現ベクターｐＩＭ１１２を構築した。ｐＩＭ１１２はＧＡＰプロモーター制御のＢβおよびγ鎖の発現ユニット、ＨＩＳ４マーカーを含んでなる（図１７）。
【００８７】
５）酵母形質転換体の作製
Ａα単鎖発現ベクターｐＩＭ１０９およびＢβ・γ２鎖発現ベクターｐＩＭ１１２を各々の選択マーカー（相同領域）を利用して、ピキア酵母宿主ＰＰＦ１株を順次形質転換することでフィブリノーゲン３鎖共発現株を作製した。作製した株をＧＡＰ１１１株（１コピー組込み体）およびＧＡＰ２２２株（２コピー組込み体）と命名した。
【００８８】
６）分解抑制条件下での培養における組換えヒトフィブリノーゲンの産生
ＧＡＰプロモーターの制御下にヒトフィブリノーゲンを産生する形質転換体ＧＡＰ１１１株をクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を用いて調製した３×ＹＰ−３％の炭素源を含む培地を用いて、３０℃で７２時間まで培養した。炭素源はメタノール、デキストロース、グリセロールとした。培養上清を回収し、ウェスタンブロットで分析した。その結果、ヒトフィブリノーゲンの産生はいずれの培地でも確認されたが、メタノールを炭素源として用いたときに最も高いものであった（図１８）。
【００８９】
【発明の効果】
本発明によれば、血漿由来のフィブリノーゲンと同じ完全分子構造を有し、しかも生理活性も同一である組換えフィブリノーゲンを、安定的にかつ大量に製造することができる。また、血漿由来品とは異なり原料血漿に起因するウイルス汚染の危険性も生じない。従って、より安全性に優れたフィブリノーゲンをより安定的に臨床の場に供給することが可能となる。
【００９０】
【配列表】
配列表配列番号１：フィブリノーゲンＡα鎖のシグナル配列
配列表配列番号２：Ａα鎖のシグナル配列をコードする遺伝子
配列表配列番号３：フィブリノーゲンＢβ鎖のシグナル配列
配列表配列番号４：Ｂβ鎖のシグナル配列をコードする遺伝子
配列表配列番号５：フィブリノーゲンγ鎖のシグナル配列
配列表配列番号６：γ鎖のシグナル配列をコードする遺伝子
【００９１】
【００９２】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１〜４はｍＡＯＸ２プロモーターの制御下で組換えフィブリノーゲンを発現させるベクターの構築手順を概略的に示したものである。そのうち、本図はＡα鎖発現ベクターｐＩＭ１０４の構築手順を示す。
【図２】Ｂβ鎖発現ベクターｐＮＴ４０の構築手順を示す。
【図３】γ鎖発現ベクターｐＮＴ４１の構築手順を示す。
【図４】Ａα・Ｂβ・γ３鎖共発現ベクターｐＮＴ４３の構築手順を示す。
【図５】形質転換体の培養におけるｐＨの効果について、産生された組換えフィブリノーゲンをウェスタンブロット（還元条件、図６〜１１も同じ）にて分析した結果を示したものである。符号１〜４はなりゆきｐＨ（ｐＨ未調整）の場合を、符号５〜８はｐＨ５．５に調整した場合を各々示す。また、符号１と５は培養２４時間後のものを、符号２と６は同４８時間後のものを、符号３と７は培養７２時間後のものを、符号４と８は同９６時間後のものを各々示す。
【図６】形質転換体の培養におけるキモスタチンの効果について、産生された組換えフィブリノーゲンをウェスタンブロットにて分析した結果を示したものである。符号１〜４はキモスタチン無添加の場合を、符号５〜８はキモスタチンを培地に添加した場合を各々示す。また、符号１と５は培養２４時間後のものを、符号２と６は同４８時間後のものを、符号３と７は培養７２時間後のものを、符号４と８は同９６時間後のものを各々示す。
【図７】宿主株の種類と組換えフィブリノーゲンの産生量との関係についてをウェスタンブロットにて分析した結果を示したものである。符号１〜４はＧＮＴ４３株（野生株ＧＴＳ１１５）の場合を、符号５〜８はＳＮＴ４３株（プロテアーゼ欠損株ＳＭＤ１１６８）の場合を各々示す。また、符号１と５は培養２４時間後のものを、符号２と６は同４８時間後のものを、符号３と７は培養７２時間後のものを、符号４と８は同９６時間後のものを各々示す。
【図８】培地のｐＨと組換えフィブリノーゲンの産生量との関係についてウェスタンブロットにて分析した結果を示したものである。符号１〜３はなりゆきｐＨ（ｐＨ未調整）の場合を、符号４〜６はｐＨ５．５に調整した場合を各々示す。また、符号１と４は培養２４時間後のものを、符号２と５は同４８時間後のものを、符号３と６は同７２時間後のものを各々示す。
【図９】導入したベクターのコピー数と組換えフィブリノーゲンの産生量との関係についてウェスタンブロットにて分析した結果を示したものである。符号１〜３は１コピー株の場合を、符号４〜６は２コピー株の場合を、符号７〜９は３コピー株の場合を各々示す。また、符号１、４、７は培養２４時間後のものを、符号２、５、８は同４８時間後のものを、符号３、６、９は同７２時間後のものを各々示す。
【図１０】培地のメタノール濃度と組換えフィブリノーゲンの産生量との関係についてウェスタンブロットにて分析した結果を示したものである。符号１〜４はメタノール濃度２％の場合を、符号５〜８は同濃度３％の場合を各々示す。また、符号１と５は培養２４時間後のものを、符号２と６は同４８時間後のものを、符号３と７は同７２時間後のものを、符号４と８は同９６時間後のものを各々示す。
【図１１】培地のＹＰ濃度と組換えフィブリノーゲンの産生量との関係についてウェスタンブロットにて分析した結果を示したものである。符号１〜３はＹＰ濃度１×の場合を、符号４〜６はＹＰ濃度３×の場合を、符号７〜９はＹＰ濃度５×の場合を各々示す。また、符号１、４、７は培養２４時間後のものを、符号２、５、８は同４８時間後のものを、符号３、６、９は同７２時間後のものを各々示す。
【図１２】図１２と１３は各鎖の分子量と３鎖のアセンブリをウェスタンブロットにて分析した結果を示したものである。そのうち、図１２は還元条件での分析結果を示す。符号１は組換えフィブリノーゲンを示す。また、左端の符号は各分子量マーカーに対応するバンドの位置とその分子量を示したものである。
【図１３】非還元条件での分析結果を示す。符号１は組換えフィブリノーゲンを示す。また、左端の符号は図１２に同じ。
【図１４】Ｎ型糖鎖付加をウェスタンブロットにて分析した結果を示したものである。符号１と２は血漿由来フィブリノーゲンを、符号３と４は組換えフィブリノーゲンを各々示す。また、符号１と３はＧＰＦ未処理を、符号２と４はＧＰＦ処理後を各々示す。
【図１５】交差架橋フィブリンの形成をウェスタンブロット（還元条件）にて分析した結果を示したものである。符号１〜３は血漿由来フィブリノーゲンを、符号４〜６は組換えフィブリノーゲンを各々示す。また、符号１と４は未処理を、符号２と５はトロンビン処理を、符号３と６はトロンビンおよび血液凝固第ＸＩＩＩ因子処理を各々示す。
【図１６】図１６〜１７はＧＡＰプロモーターの制御下で組換えフィブリノーゲンを発現させるベクターの構築手順を概略的に示したものである。そのうち、本図はＡα鎖発現ベクターｐＩＭ１０９の構築手順を示す。
【図１７】Ｂβ鎖発現ベクターｐＩＭ１１０、γ鎖発現ベクターｐＩＭ１１１およびＢβ・γ２鎖共発現ベクターｐＩＭ１１２の、各々の構築手順を示す。
【図１８】ＧＡＰプロモーターの制御下で組換えフィブリノーゲンを発現させた場合のウェスタンブロット（還元条件）による分析結果を示したものである。符号１〜３は３×ＹＰ−３％メタノール培養系を、符号４〜６は３×ＹＰ−３％グルコース培養系を、符号７〜９は３×ＹＰ−３％グリセロール培養系を各々示す。また、符号１、４、７は培養２４時間後、符号２、５、８は同４８時間後、符号３、６、９は同７２時間後のものを各々示す。
【００９３】
【符号の説明】
Ｍ 分子量マーカー
Ｓ 血漿由来フィブリノーゲン
Ａα Ａα鎖に対応するバンド
Ｂβ Ｂβ鎖に対応するバンド
γ γ鎖に対応するバンド
γ２ 交差架橋フィブリンに対応するバンド
【発明の属する技術分野】
本発明は、ピキア酵母を用いた遺伝子組換えによるフィブリノーゲンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
（ヒト）フィブリノーゲンは血漿中に存在する血漿蛋白の一種で、糖鎖構造を有する分子量約３４０ｋＤａの糖蛋白質である。血漿中には約３ｍｇ／ｍＬのレベルで存在する。フィブリノーゲンはＡα鎖、Ｂβ鎖、γ鎖からなり、Ｓ−Ｓ結合により（Ａα−Ｂβ−γ）２の完全分子構造を有する。Ａα鎖は６７ｋＤａ、６１０アミノ酸残基からなり、糖鎖を有しない。Ｂβ鎖は５６ｋＤａ、４６１アミノ酸残基からなり、３６４位のＡｓｎが糖鎖を有する。γ鎖は４８ｋＤａ、４１１アミノ酸残基からなり、５２位のＡｓｎが糖鎖を有する。フィブリノーゲンは血液凝固に関わる。すなわち、フィブリノーゲンは生体内ではトロンビンによってＡα鎖、Ｂβ鎖が各々切断され、ＦＰＡ（フィブリノペプチドＡ）、ＦＰＢ（フィブリノペプチドＢ）が除去されて（α−β−γ）２へと変換される（フィブリンモノマー）。このフィブリンモノマーはＣａ２＋の存在下に重合化してフィブリンポリマーを形成する。さらにトロンビンによって血液凝固第ＸＩＩＩ因子が活性化されると、そのトランスグルタミナーゼ活性によりフィブリンポリマー同士にペプチド結合が形成されて強固な交差架橋フィブリンとなる。フィブリノーゲンは医薬品としてフィブリノーゲン欠損症の補充療法等に適用されている。また、フィブリノーゲンはフィブリン糊の主成分として、外科手術時の組織の接着・閉鎖用に用いられる。
【０００３】
ところで、フィブリノーゲンは通常ヒトのプール血漿から調製されるが、ウイルス感染の恐れがあるにもかかわらず、加熱処理、ＳＤ処理、ウイルス除去膜処理などの現行の方法ではある種のウイルスを完全に不活化・除去することが困難であり、１００％安全な医薬品として供給することができているとは必ずしも断言できない状況にある。
【０００４】
そこで、血漿由来のフィブリノーゲンを用いる代わりの手段として、遺伝子組換え技術を利用してフィブリノーゲンを製造する方法が各種試みられている。例えば、宿主として酵母を用いる方法、動物細胞を用いる方法、トランスジェニック動物を用いる方法などが報告されている。動物細胞はＵＳＰ６０３７４５７、トランスジェニック動物はＷＯ００／１７２３４、ＷＯ００／１７２３９などを参照のこと。
【０００５】
このうち、宿主として酵母を用いる方法としては、最も代表的であるパン酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）を用いてフィブリノーゲンを産生する方法が知られている。特表平１０−５０５４９６；ＪＢＣ、２７０巻４０号、２３７６１〜２３７６７頁、１９９５年を参照のこと。しかしながら、パン酵母でのフィブリノーゲンの産生は比較的少量のレベルにすぎないこと、上記ＪＢＣ誌の共同著者が後述しているように、発現性・再現性に問題があったことを指摘している。ＪＢＣ、２７４巻、５５４頁、１９９９年を参照のこと。従って、当該方法は技術的に確立された方法とは言い難いものがある。
【０００６】
また、ピキア酵母（ピキア・パストリス）を用いてフィブリノーゲンの部分構造（例えば、γ鎖Ｃ末断片）を産生する方法が報告されている。ＪＢＣ、２７２巻３８号、２３７９２〜２３７９８頁、１９９７年；Ｂｌｏｏｄ、９２巻１０号、３６６９〜３６７４頁、１９９８年を参照のこと。しかしながら、当該断片とフィブリノーゲンの完全分子構造とでは分子の大きさが全く異なっており（分子量で、当該断片は約４０ｋＤａ前後にすぎないが、完全分子体では約３４０ｋＤａ）、生理活性も同一のものではないことから、本先行技術での知見が完全分子構造のフィブリノーゲンの製造にそのまま活用できるとはとても考えられない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ピキア酵母を用いて、完全分子構造のフィブリノーゲンを遺伝子工学的手法により、安定的にかつ大量に製造できる方法を確立することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の事情を考慮に入れてさらに研究を行った結果、特定の発現系・宿主系を用いてフィブリノーゲンを産生すること、培地中に産生されたフィブリノーゲンの分解を抑えること、培養上清から回収したフィブリノーゲンを効率よく回収すること、により所期の目的を達成できることを見出して本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、１）ピキア酵母での異種蛋白質の発現を制御可能なプロモーター、フィブリノーゲン由来のシグナル配列、フィブリノーゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖、γ鎖をコードする遺伝子を各々連結した発現用プラスミドを調製する工程、２）当該プラスミドをピキア酵母に導入して形質転換体を調製する工程、３）当該形質転換体をｐＨ５〜８の条件下で培養してフィブリノーゲンを産生する工程、および４）培養上清から回収されたフィブリノーゲンを精製する工程を含む、（Ａα−Ｂβ−γ）２の完全分子構造を有する組換えフィブリノーゲンの製造方法に関するものである。以下にその詳細を説明する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
発現系・宿主系の構築
（ヒト）フィブリノーゲンをコードする遺伝子として、Ａα鎖、Ｂβ鎖、γ鎖の各鎖をコードする遺伝子を用いる。Ａα鎖は６１０アミノ酸残基からなり、その１位がＡｌａ、６１０位がＶａｌである。Ｂβ鎖は４６１アミノ酸残基からなり、その１位、４６１位ともＧｌｎである。γ鎖は４１１アミノ酸残基からなり、その１位はＴｙｒ、４１１位はＶａｌである。これらの遺伝子（配列）は公知のものを用いることができる。例えば、Ａα鎖遺伝子は、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２２巻、３２３７〜３２４４頁、１９８３年；Ｇｅｎ Ｂａｎｋ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｍ５８５６９などに、Ｂβ遺伝子は、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．、２８１巻、３９〜４８頁、１９９０年；Ｇｅｎ Ｂａｎｋ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｍ６４９８３などに、γ鎖遺伝子は、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２２巻、３２５０〜３２５６頁、１９８３年；Ｇｅｎ Ｂａｎｋ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｍ１００１４などに各々報告されているので、これらを利用することができる。
【００１１】
発現系としては、プロモーター、シグナル配列の選択が重要である。プロモーターはピキア酵母において異種蛋白質の発現（分泌）を制御可能なものとして通常利用されているものであれば特に限定されない。具体的にはアルコールオキシダーゼ由来のプロモーター、ＧＡＰ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）プロモーター（ＧＥＮＥ、１８６巻、３７〜４４頁、１９９７年）などが例示される。アルコールオキシダーゼプロモーターとしては、例えば、ＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーターなどが例示される。本発明のプロモーターとして好ましいのは、変異型ＡＯＸ２プロモーター、すなわち、天然型ＡＯＸ２プロモーター（Ｙｅａｓｔ、５巻、１６７〜１７７頁、１９８９年）中の開始コドン上流２５５番目の塩基がＴからＣに変異したもの（特開平４−２９９９８４）やその他の箇所が変異または欠失したもの（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２４３巻、４８９〜４９９頁、１９９４年）またはＧＡＰプロモーターである。
【００１２】
シグナル配列としては（ヒト）フィブリノーゲン由来のｎａｔｉｖｅなものを用いる。具体的には以下の配列で示される。Ａα鎖のシグナル配列の場合は、ＭＦＳＭＲＩＶＣＬＶＬＳＶＶＧＴＡＷＴで示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子である。当該シグナル配列としては上記のアミノ酸配列に対応するコドンを有する塩基配列であれば特に限定されない。その一例として、ＡＴＧＴＴＴＴＣＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＧＴＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＣＴＡＡＧＴＧＴＧＧＴＧＧＧＣＡＣＡＧＣＡＴＧＧＡＣＴで示される塩基配列などが例示される。
【００１３】
Ｂβ鎖のシグナル配列の場合は、ＭＫＨＬＬＬＬＬＬＣＶＦＬＶＫＳで示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子である。当該シグナル配列としては上記のアミノ酸配列に対応するコドンを有する塩基配列であれば特に限定されない。その一例として、ＡＴＧＡＡＡＣＡＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＣＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＴＧＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＴＡＡＧＴＣＣで示される塩基配列などが例示される。
【００１４】
γ鎖のシグナル配列の場合は、ＭＳＷＳＬＨＰＲＮＬＩＬＹＦＹＡＬＬＦＬＳＳＴＣＶＡで示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子である。当該シグナル配列としては上記のアミノ酸配列に対応するコドンを有する塩基配列であれば特に限定されない。その一例として、ＡＴＧＡＧＴＴＧＧＴＣＣＴＴＧＣＡＣＣＣＣＣＧＧＡＡＴＴＴＡＡＴＴＣＴＣＴＡＣＴＴＣＴＡＴＧＣＴＣＴＴＴＴＡＴＴＴＣＴＣＴＣＴＴＣＡＡＣＡＴＧＴＧＴＡＧＣＡで示される塩基配列などが例示される。
【００１５】
また、ターミネーター、選択マーカーなども公知のものを利用することができる。ターミネーターとしてはＡＯＸ１ターミネーターなどが例示される。選択マーカーとしてはピキア酵母由来のＡＲＧ４、ＨＩＳ４、パン酵母由来のＳＵＣ２、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３などのアミノ酸／核酸合成遺伝子あるいはゼオシン、Ｇ４１８などの薬剤耐性遺伝子等が例示される。
【００１６】
また、発現用プラスミドを宿主の染色体上に導入する場合は相同領域を用いることができる。相同領域としては上記のアミノ酸／核酸合成遺伝子、アルコールオキシダーゼ遺伝子、ｒｉｂｏｓｏｍｅＤＮＡ遺伝子、Ｔｙ因子、その他のピキア酵母の既知遺伝子などが例示される。
【００１７】
発現用プラスミド（発現ベクター）は、プロモーターの下流にシグナル配列、フィブリノーゲンの各鎖をコードする遺伝子、ターミネーター、選択マーカー、相同領域などを連結することにより調製することができる。また、同一プラスミド上にフィブリノーゲンの各鎖を発現するユニットを全て担持させることにより、３鎖の共発現系を構築することができる。
【００１８】
宿主としては、ピキア酵母（ピキア・パストリス）を用いる。具体的にはＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ 寄託番号Ｙ−１５８５１）、ＧＳ１９０株（同Ｙ１８０１４）、ＰＰＦ１株（同Ｙ１８０１７）、野生株（同Ｙ１１４３１）などが例示される。また、本発明においてはプロテアーゼＡ欠損株を用いることが好ましい。具体的にはＳＭＤ１１６８株（インビトロジェン社）などが例示される。
【００１９】
プラスミドをピキア酵母に導入し形質転換体を調製する手段としては、各鎖を発現する複数種のプラスミドを、各々の相異なる相同領域を利用して順次、宿主の染色体上に組込む方法と、３鎖の遺伝子発現ユニットを同一のプラスミド上に組込んだ発現用プラスミドを宿主の染色体上に組込む方法がある。なお、形質転換体は当該発現用プラスミドを１または複数個（コピー数で）組込んでいてもよい。
【００２０】
また、プラスミドを宿主染色体に組込む方法の他に、プラスミドに自律複製配列を付加することにより、細胞内にエピゾーマル型で存在させることもできる。
【００２１】
発現用プラスミドを宿主細胞内に導入する（宿主染色体に組込む、細胞内にエピゾーマル型で存在させる）方法は公知の手法を用いることができる。例えば、アルカリカチオン法、プロトプラストポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法などが例示される。
【００２２】
培養（産生）工程
本工程は形質転換体を培地で培養して組換えフィブリノーゲンを産生させる工程である。培地としてはピキア酵母の培養に通常用いられるものであれば、特に限定されるものではない。例えば、ＹＰＤ培地（酵母エキス、ペプトン、デキストロースからなる）、ＹＰＭ培地（酵母エキス、ペプトン、メタノールからなる）、ＹＰＧ培地（酵母エキス、ペプトン、グリセロールからなる）などが例示される。
【００２３】
ＹＰ濃度としては１×〜１０×程度（１×は１％酵母エキス、２％ペプトンからなる組成の意味）が例示される。好ましくは２×〜５×程度である。メタノール（Ｍ）濃度としては１〜５％程度が例示される。好ましくは２〜３％程度である。グリセロール（Ｇ）濃度としては１〜１０％程度が例示される。
【００２４】
培養はｐＨ５〜８の条件下で行われる。好ましくは培養初期のｐＨ条件としてｐＨ５〜６程度に調整する。ｐＨを調整するにはクエン酸緩衝液を用いることが好ましい。培養途中および培養終了時においてｐＨ５〜８の範囲内にあればよい。
【００２５】
添加剤としてプロテアーゼ阻害剤を用いることができる。好ましくはセリンプロテアーゼ阻害剤である。具体的にはＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフロリド）、アプロチニン、キモスタチン、ＡＥＢＳＦ［４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフロリド］などが例示される。その添加濃度としては０．１〜１０ｍＭ程度が例示される。
【００２６】
培養条件としては培養温度１０〜４５℃程度で、培養時間１０〜５００時間程度が例示される。培養様式としてはバッチ培養、フェドバッチ培養（フェドバッチ）などを用いることができる。
【００２７】
なお、当該本培養に先立って前培養を行うことが好ましい。前培養用の培地としては、例えば、ＹＮＢ（イーストナイトロジェンベースとブドウ糖からなる）、ＹＰＧなどが例示される。また、前培養の培養条件としては温度１０〜４５℃程度、培養時間１０〜１００時間程度が例示される。
【００２８】
精製工程
本工程は培養上清から回収された組換えフィブリノーゲンを精製する工程である。その精製方法としては、陽イオン交換体処理、ゲル濾過処理が挙げられる。得られた培養上清をそのまま、あるいは適当な方法により濃縮等の操作を施してから精製処理を行ってもよい。そのような前処理としては、エタノール分画、硫安分画、透析などが例示される。
【００２９】
陽イオン交換体処理は陽イオン交換体を用いて、吸着した組換えフィブリノーゲンを溶出することにより精製するものである。陽イオン交換体は陽イオン交換能を持った置換基を有する水不溶性担体である。陽イオン交換能を持った置換基としてはカルボキシアルキル、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）など、スルホアルキル、例えば、スルホプロピル（ＳＰ）などが例示される。水不溶性担体としては、アガロース（例えば、セファロースなど）、架橋デキストラン（例えば、セファデックスなど）、セルロース、ポリビリル（例えば、トヨパールなど）が例示される。陽イオン交換体は市販のものを用いることもできる。
【００３０】
ｐＨ条件としては、アプライ・洗浄時はｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．１Ｍ程度が挙げられる。具体的には５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）などが用いられる。溶出時はｐＨ６〜８、塩濃度０．１〜０．５Ｍ程度が挙げられる。具体的には、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む上記緩衝液（ｐＨ７．０）などが用いられる。陽イオン交換体処理はカラム、バッチのいずれの様式で行ってもよい。また、当該溶媒は１〜１０ｍＭ程度のＥＡＣＡ（イプシロンアミノカプロン酸）、ＥＤＴＡなどを含んでいてもよい。
【００３１】
ゲル濾過処理は、ゲル濾過用担体を用いて分子量の違いにより目的とする組換えフィブリノーゲンを精製・回収するものである。ゲル濾過用担体としてはアガロース、架橋デキストラン（例えば、セファデックスなど）、ポリアクリルアミドなどを用いることができる。組換えフィブリノーゲンの分子量（約３４０ｋＤａ）を考慮して、分画分子量領域が１０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ程度にあるものを用いることが好ましい。
【００３２】
展開時のｐＨ条件としてはｐＨ６〜９程度、塩濃度としては０．０１〜０．５Ｍ程度が挙げられる。具体的には、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０２５Ｍクエン酸ナトリウムを含む０．０２５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）などが例示される。また、当該溶媒は０．０１〜０．１Ｍ程度のＥＡＣＡなどを含んでいてもよい。
【００３３】
精製された組換えフィブリノーゲンの性状は、（Ａα−Ｂβ−γ）２の完全分子構造を有する。分子量は３４０ｋＤａ程度であり、フィブリノーゲン抗体吸着ビーズの凝集、フィブリン血栓の形成、トロンビンおよび血液凝固第ＸＩＩＩ因子による交差架橋フィブリンの形成などの生理活性を有する。また、当該組換えフィブリノーゲンはＮ型糖鎖を付加していてもよい。
【００３４】
【実施例】
本発明をより詳細に説明するために実施例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００３５】
なお、本実施例において、ウェスタンブロットによる分析は以下の条件で行った。還元または非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ウェスタンブロットで検出した。分子量マーカーとして３７、５０、７５、１００、２５０ｋＤａの組換え蛋白（ＢＩＯ ＲＡＤ製、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）を用いた。また対照としてヒト血漿由来フィブリノーゲン（以下ｐフィブリノーゲン。三菱ウェルファーマまたはカルビオケム社）を用いた。
【００３６】
実施例１ 変異型ＡＯＸ２プロモーターの制御下でヒトフィブリノーゲンが発現される発現ベクターの構築
１）Ａα鎖発現ベクターの構築
Ａα鎖ｃＤＮＡの取得
ＰＣＲ法によりＡα鎖ｃＤＮＡを５’および３’末端にそれぞれＡｓｕＩＩ、ＢａｍＨＩサイトを付加するように増幅した。ＰＣＲプライマー用オリゴＤＮＡは公知のＡα鎖ｃＤＮＡの塩基配列（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２２巻、３２３７〜３２４４頁、１９８３年；Ｇｅｎ Ｂａｎｋ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｍ５８５６９）を参考に合成した。鋳型ＤＮＡにはＨｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ ｃＤＮＡＬｉｂｒａｒｙ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、ＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅した結果、Ａα鎖ｃＤＮＡに相当する約１．９ｋｂのＰＣＲ産物を得た。当該ＤＮＡは１９アミノ酸残基のシグナル配列から６１０アミノ酸残基の成熟配列に至り、６１０位のＶａｌの後に停止コドンを付加した遺伝子である。
【００３７】
Ａα鎖発現ベクターの構築
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）発現ベクターであるｐＭＭ０４２（特開平４−２９９９８４）をＥｃｏＲＶ＋ＳｐｈＩで消化してＨＩＳ４遺伝子を除いた断片に、ｐＹＭ３０（パン酵母由来。特開昭６２−１０７７８９）を同制限酵素で消化して得たＡＲＧ４遺伝子断片を挿入し、ＡＲＧ４マーカーを有するＨＳＡ発現ベクターを構築した。さらにこのベクターをＡｓｕＩＩ＋ＢａｍＨＩ消化することによりＨＳＡ遺伝子を除いた断片に、上記１．９ｋｂのＰＣＲ産物を同制限酵素で消化したＡα鎖ｃＤＮＡ断片を挿入し、Ａα鎖発現ベクターｐＩＭ１０４を構築した。ｐＩＭ１０４は変異型ＡＯＸ２プロモーター（以下ｍＡＯＸ２プロモーター）、Ａα鎖ｃＤＮＡ、ＡＯＸ１ターミネーター、ＡＲＧ４マーカーを含んでなる（図１）。
【００３８】
Ａα鎖ｃＤＮＡの塩基配列の確認
構築したＡα鎖発現ベクターｐＩＭ１０４にクローニングされたＡα鎖ｃＤＮＡの塩基配列を確認した。シークエンスプライマー用オリゴＤＮＡは公知のＡα鎖ｃＤＮＡの塩基配列（上述の文献およびデータベース）を参考にして合成した。プライマー３．２ｐｍｏｌ、テンプレートＤＮＡ３００ｎｇ、プレミックス８μＬおよび蒸留水（全量２０μＬとなるように添加）を混合して常法により反応させた。反応液をスピンカラムで精製して遊離の蛍光ターミネーターを除いた後に、ＴＳＲ（ｔｅｍｐｌｅｔｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ）２０μＬを加えて攪拌し、９５℃で２分間加熱し、氷中で急冷したものについてシークエンスを行った。さらにオートシークエンサーによって得られた配列データを配列情報解析システム（Ｖｅｃｔｏｒ Ｎｔｉ、Ｃｏｎｔｉｇ ＥｘｐｒｅｓｓおよびＡｌｉｇｎ Ｘ）により編集、連結し、データベース上のＤＮＡ配列（上述のＧｅｎ Ｂａｎｋ）と比較した。その結果、両者のＤＮＡ配列および推定されるアミノ酸配列は一致した。
【００３９】
２）Ｂβ鎖発現ベクターの構築
Ｂβ鎖ｃＤＮＡの取得
ＰＣＲプライマー用オリゴＤＮＡは公知のＢβ鎖ｃＤＮＡの塩基配列（Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．、２８１巻、３９〜４８頁、１９９０年；Ｇｅｎ Ｂａｎｋ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｍ６４９８３）を参考に合成した。その他は１）に準じて行った。ＰＣＲの結果、Ｂβ鎖ｃＤＮＡに相当する約１．５ｋｂのＰＣＲ産物を得た。当該ＤＮＡは１６アミノ酸残基のシグナル配列から４６１アミノ酸残基の成熟配列に至り、４６１位のＧｌｎの後に停止コドンを付加した遺伝子である。
【００４０】
Ｂβ鎖発現ベクターの構築
上記１．５ｋｂのＰＣＲ産物を１）と同様にｐＭＭ０４２からＡｓｕＩＩ＋ＢａｍＨＩ消化によりＨＳＡ遺伝子を除いた断片に挿入し、Ｂβ鎖ｃＤＮＡの発現ベクターを構築した。まず、５’側のＡｓｕＩＩサイトからＢβ鎖ｃＤＮＡのＢａｍＨＩのサイトまでを挿入したベクターを構築し、次にこのベクターをＢａｍＨＩ消化した断片に、Ｂβ鎖ｃＤＮＡの残りの領域を同サイトを用いて挿入することによりＢβ鎖ｃＤＮＡの全領域が挿入されたベクターを得た。さらにＳｐｈＩ＋ＥｃｏＲＶで消化してＨＩＳ４遺伝子断片を除去したものにパン酵母由来のＳＵＣ２遺伝子断片（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１巻、１９４３〜１９５４頁、１９８３年）を挿入し、Ｂβ鎖発現ベクターｐＮＴ４０を構築した。ｐＮＴ４０はｍＡＯＸ２プロモーター、Ｂβ鎖ｃＤＮＡ、ＡＯＸ１ターミネーター、ＳＵＣ２マーカーを含んでなる（図２）。
【００４１】
塩基配列の確認
構築したＢβ鎖発現ベクターｐＮＴ４０にクローニングされたＢβ鎖ｃＤＮＡの塩基配列を確認した。シークエンスプライマー用オリゴＤＮＡは公知のＢβ鎖ｃＤＮＡの塩基配列（上述の文献およびデータベース）を参考にして合成した。その他は１）の方法に従った。その結果、両者のＤＮＡ配列および推定されるアミノ酸配列は一致した。
【００４２】
３）γ鎖発現ベクターの構築
γ鎖ｃＤＮＡの取得
ＰＣＲプライマー用オリゴＤＮＡは公知のγ鎖ｃＤＮＡの塩基配列（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２２巻、３２５０〜３２５６頁、１９８３年；Ｇｅｎ Ｂａｎｋ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｍ１００１４）を参考に合成した。その他は１）に準じて行った。その結果、γ鎖ｃＤＮＡに相当する約１．３ｋｂのＰＣＲ産物を得た。当該ＤＮＡは２６アミノ酸残基のシグナル配列から４１１アミノ酸残基の成熟配列に至り、４１１位のＶａｌの後に停止コドンを付加した遺伝子である。
【００４３】
γ鎖発現ベクターの構築
上記１．３ｋｂのＰＣＲ産物を１）と同様にｐＭＭ０４２からＡｓｕＩＩ＋ＢａｍＨＩ消化によりＨＳＡ遺伝子を除いた断片に挿入し、γ鎖発現ベクターｐＮＴ４１を構築した。ｐＮＴ４１はｍＡＯＸ２プロモーター、γ鎖ｃＤＮＡ、ＡＯＸ１ターミネーター、ＨＩＳ４マーカーを含んでなる（図３）。
【００４４】
塩基配列の確認
構築したγ鎖発現ベクターｐＮＴ４１のγ鎖ｃＤＮＡ領域の塩基配列を確認した。シークエンスプライマー用オリゴＤＮＡは公知のγ鎖ｃＤＮＡの塩基配列（上述の文献およびデータベース）を参考に合成した。その他は１）の方法に従った。その結果、両者のＤＮＡ配列および推定されるアミノ酸配列は一致した。
【００４５】
４）Ａα・Ｂβ・γ共発現ベクターの構築
ｐＮＴ４０をＥｃｏＲＩ＋ＣｌａＩ消化して得られたＢβ発現ユニットの両端を末端平滑化し、これをｐＮＴ４１のＥｃｏＲＩ消化、末端平滑化ベクターと連結することにより、２鎖（Ｂβ・γ）発現ベクターｐＮＴ４２を得た。次にｐＩＭ１０４をＥｃｏＲＶ消化後にＥｃｏＲＩで部分消化して得られたＡα発現ユニットを末端平滑化し、ｐＮＴ４２をＮａｅＩ消化して得られたベクターに連結し、３鎖（Ａα・Ｂβ・γ）共発現ベクターｐＮＴ４３を構築した。ｐＮＴ４３はＡα、Ｂβおよびγ鎖の発現ユニット、ＨＩＳ４マーカーを含んでなる（図４）。
【００４６】
実施例２ 酵母形質転換体の作製
１）Ａα、Ｂβ、γの各単鎖発現ベクターを用いた酵母形質転換体の作製
Ａα鎖、Ｂβ鎖、γ鎖の各鎖単独発現ベクター（ｐＩＭ１０４、ｐＮＴ４１、ｐＮＴ４０）を、各々の選択マーカー（相同領域）を利用してピキア酵母を順次形質転換を行っていくことで、各鎖が組込まれた３鎖共発現株を作製した。まず、ｐＩＭ１０４をＳａｌＩで消化、線状化し、アルカリカチオン法によりピキア酵母ＰＰＦ１株（ｈｉｓ４，ａｒｇ４）に導入した。ヒスチジンを含み、アルギニンを含まないＳＤ寒天培地に再生したアルギニン非要求性のクローンよりＳｉｎｇｌｅ Ｃｏｌｏｎｙ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎを行い、Ａα単鎖発現形質転換体の単一クローンを得た。次にｐＮＴ４０をＳｔｕＩで消化、線状化し、Ａα単鎖発現形質転換体に導入した。ＳＤ ｗ／ｏ ａ．ａ．寒天培地に再生したヒスチジン非要求性クローンよりＳｉｎｇｌｅ Ｃｏｌｏｎｙ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎを行い、Ａα・γ２鎖発現形質転換体の単一クローンを得た。さらに、ｐＮＴ４１をＳｐｅＩで消化、線状化し、Ａα・γ２鎖発現形質転換体に導入した。ＳＵＣ選択寒天培地（１／２ＭＳｕ ｐｌａｔｅ）に再生したクローンよりＳｉｎｇｌｅＣｏｌｏｎｙ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎを行い、Ａα・Ｂβ・γ３鎖発現形質転換体の単一クローンを得た。
【００４７】
２）３鎖共発現ベクターを用いた酵母形質転換体の作製
３鎖共発現ベクターｐＮＴ４３をピキア酵母ＧＴＳ１１５株（ｈｉｓ４）およびプロテアーゼＡ欠損株であるＳＭＤ１１６８（ｈｉｓ４，ｐｅｐ４）株に導入した。ｐＮＴ４３をＳａｌＩで消化、線状化し、アルカリカチオン法により形質転換した。ＳＤ ｗ／ｏ ａ．ａ．寒天培地に再生したクローンよりＳｉｎｇｌｅＣｏｌｏｎｙ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎを行うことにより形質転換体の単一クローンを得た。各宿主酵母（ＧＴＳ１１５株およびＳＭＤ１１６８株）を用いて得られた形質転換体をそれぞれＧＮＴ４３株およびＳＮＴ４３株と命名した。
【００４８】
形質転換体はＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％デキストロースからなる）で３０℃、４８時間培養し、遠心（２８００ｒｐｍ×１０分）にて集菌し、１０％グリセロールを分散溶媒として１ｍＬずつセラムチューブに分注し、−８０℃で保存した。
【００４９】
３）形質転換体のフラスコ培養
以上のようにして作製した組換えヒトフィブリノーゲン発現形質転換体を通常の方法でＹＰ−２％メタノール培地を用いて３０℃で最大９６時間まで培養したが、培養２４、４８、７２、９６時間のいずれの時点でも検出することができなかった。これは産生された組換えヒトフィブリノーゲンが激しく分解を受けたためと考えられた。
【００５０】
実施例３ 血漿由来フィブリノーゲンと酵母培養上清を用いた分解抑制条件の検討
組換え酵母を用いて異種蛋白質を発現させる場合、宿主由来のプロテアーゼによって目的産物が分解を受ける場合がある。フィブリノーゲンも宿主酵母由来のプロテアーゼにより分解を受けることが明らかとなった。そこで、酵母による組換えヒトフィブリノーゲンを産生させる培養条件を決定するために、ヒト血漿由来フィブリノーゲンを用いて以下の検討を行った。
【００５１】
１）プロテアーゼ阻害剤
ピキア酵母ＧＴＳ１１５株を１×ＹＰ−２％メタノール培地で３０℃７２時間培養して培養上清を得た。これにｐフィブリノーゲン（終濃度３０μｇ／ｍＬ）および適量のプロテアーゼ阻害剤を添加して、３０℃で６０分間共存させた。その後に当該溶液をウェスタンブロットで分析して、ｐフィブリノーゲンの残存度および分解物の生成度を確認した。フィブリノーゲンの残存度、分解物の生成度とも、−（なし）、±（若干あり）、＋（あり）、＋＋（大いにあり）の４段階で判定した。その結果、ｐフィブリノーゲンは培養上清中に産生された酵母由来のプロテアーゼにより分解されｐフィブリノーゲンの分解はＰＭＳＦ、アプロチニン、キモスタチンの添加により完全に抑制された（表１）。また、ｐフィブリノーゲンの分解は培養上清中に産生された酵母由来プロテアーゼによるものと考えられた。
【００５２】
【表１】
２）ｐＨ
ｐフィブリノーゲンと酵母培養上清を各ｐＨ条件下で共存させた。ｐＨ調整は０．１Ｍクエン酸ナトリウム塩緩衝液、０．１Ｍリン酸カリウム塩緩衝液を用いた。実験は１）に準じて行った。その結果、ｐＨがアルカリ性になるほど、ｐフィブリノーゲンが分解され易いことが判明した（表２）。
【００５４】
【表２】
実施例４ フィブリノーゲンの分解が抑制される酵母培養条件の検討
フィブリノーゲンの分解が抑制されるような酵母培養条件を検討するために、酵母培養系にｐフィブリノーゲンを添加し、各培養条件がその分解に及ぼす影響を調べた。
【００５６】
１）培地のｐＨ
各ｐＨの緩衝液を用いて調製した３×ＹＰ−２％メタノール培地を用いたＧＴＳ１１５株の培養系にｐフィブリノーゲン（終濃度３０μｇ／ｍＬ）を添加し、３０℃で７２時間の培養を行った。培地中のｐＨは０．１Ｍクエン酸ナトリウム塩緩衝液（ｐＨ４．５、５．５）、０．１Ｍリン酸カリウム塩緩衝液（ｐＨ６．５）を用いて調整した。培養終了後にｐフィブリノーゲンの残存度と分解物の生成度を実施例３に準じて確認した。その結果、ｐフィブリノーゲンはｐＨ５．５の緩衝液を用いて調製した３×ＹＰ−２％メタノール培地で培養したとき最も分解が抑制された（表３）。
【００５７】
【表３】
２）ＹＰ（酵母エキスおよびペプトン）濃度
ＹＰ濃度を１×、３×、５×とする以外は、１）に準じて行った。その結果、ｐフィブリノーゲンはＹＰ濃度が高いほど分解が抑制された（表４）。
【００５９】
【表４】
３）カザミノ酸添加
カザミノ酸を終濃度３％となるように培地に添加する以外は、１）に準じて行った。その結果、カザミノ酸添加によるｐフィブリノーゲン分解抑制効果は著しいものではなかった（表５）。
【００６１】
【表５】
４）炭素源
培地として３×ＹＰ−２％メタノール培養系（３×ＹＰ−Ｍ）または３×ＹＰ−４．５％グリセロール培養系（３×ＹＰ−Ｇ）を用いる以外は、１）に準じて行った。その結果、３×ＹＰ−Ｇ培養系を用いることにより、ｐフィブリノーゲンの分解は抑制された（表６）。
【００６３】
【表６】
実施例５ 分解抑制条件下で培養した酵母形質転換体による組換えヒトフィブリノーゲンの産生
１）ｐＨを調整した培地を用いた培養
形質転換体ＧＮＴ４３株を、クエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を用いて調製した３×ＹＰ−２％メタノール培地を用いて、３０℃で９６時間まで培養し、培養上清を回収してウェスタンブロットにて分析した。その結果、培養上清中に組換えヒトフィブリノーゲンの分泌産生を確認した（図５）。
【００６５】
２）培地にキモスタチンを添加した培養
形質転換体ＧＮＴ４３株を、１ｍＭのキモスタチンを添加した３×ＹＰ−２％メタノール培地を用いて１）と同様に実験を行った。その結果、培養上清中に組換えヒトフィブリノーゲンの分泌産生を確認した（図６）。
【００６６】
実施例６ フィブリノーゲン産生量を向上させる条件の検討
１）酵母宿主株
形質転換体（ＧＮＴ４３株、ＳＮＴ４３株。いずれも１コピー組込み体）を３×ＹＰ（ｐＨ５．５）−４．５％グリセロール培地で３０℃、３日間の前培養後に、３×ＹＰ（ｐＨ５．５）−２％メタノール培地にＯＤ５４０ｎｍ＝１となるように植菌し、３０℃で振盪培養した。ｐＨ５．５の調整はクエン酸緩衝液によった（以下の実験も同様）。培養２４、４８および７２時間目にサンプリングし、培養上清中に産生された組換えヒトフィブリノーゲンをウェスタンブロットにて分析した。その結果、プロテアーゼＡ欠損株ＳＭＤ１１６８を宿主とするＳＮＴ４３株が野生株ＧＴＳ１１５を宿主とするＧＮＴ４３株よりも高い産生量を示した（図７）。
【００６７】
２）培地のｐＨ
形質転換体ＳＮＴ４３株を３×ＹＰ（なりゆきｐＨ）−４．５％グリセロール培地および３×ＹＰ（ｐＨ５．５）−４．５％グリセロール培地で３０℃、３日間の前培養後に、各々３×ＹＰ（なりゆきｐＨ）−２％メタノールおよび３×ＹＰ（ｐＨ５．５）−２％メタノール培地で振盪培養した。その後は１）と同様に実験を行った。その結果、３×ＹＰ（ｐＨ５．５）の培養系では分解が抑制されており、より高い産生量を示した（図８）。
【００６８】
３）導入したベクターの組込みコピー数
ＳＮＴ４３株の１、２および３コピー組込み体を用いて１）に準じて実験を行った。その結果、２および３コピー組込み体は１コピー組込み体よりも高い産生量を示した（図９）。
【００６９】
４）メタノール濃度
ＳＮＴ４３株を用い、本培養時の培地におけるメタノール濃度を２％または３％とし、１）に準じて実験を行った。その結果、３％メタノールの培地の方が組換えヒトフィブリノーゲンの産生量が高いことが判明した（図１０）。
【００７０】
５）ＹＰ（酵母エキスおよびペプトン）濃度
ＳＮＴ４３株を用い、本培養時の培地におけるＹＰ濃度を１×、３×、５×とする以外は１）に準じて実験を行った。併せて菌体の増殖も確認した。増殖度は培養７２時間目に当該培地の５４０ｎｍでの吸光度を測定した。その結果、ＹＰ濃度に依存して菌体の増殖も進み（表７）、産生量も増加した（図１１）。
【００７１】
【表７】
６）産生量測定
ＳＮＴ４３株の１、２および３コピー組込み体を用いて１）に準じて培養し、培養２４、４８、７２、９６時間目における培養上清中の組換えフィブリノーゲン量を２種類のヒトフィブリノーゲン特異的ポリクローナル抗体［Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｈｕＦｂｇ（ＤＡＫＯ，Ｃｏｄｅ Ｎｏ．Ａ００８０）およびＲａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｈｕＦｂｇ−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ，Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＰＯ０４５５）］を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した（検出感度約３ｎｇ／ｍＬ）。コピー数を増加させた場合の産生量の増大が確認され、ＳＮＴ４３（３コピー組込み体）株で培養９６時間目の産生量は１０．７μｇ／ｍＬに達した（表８）。
【００７３】
【表８】
実施例７ 培養上清中に分泌された組換えヒトフィブリノーゲンの性状分析
実施例６により調製した、ＳＮＴ４３株を４８時間培養した際の培養上清中に分泌された組換えヒトフィブリノーゲンの性状を分析した。対照としてｐフィブリノーゲンを用いて比較した。
【００７５】
１）分子量と３鎖のアセンブリ
培養上清についてウェスタンブロットで分析した。これらの結果から、分泌産生された組換えヒトフィブリノーゲンは分子量約３４０ｋＤａであり、Ａα鎖、Ｂβ鎖、γ鎖の３鎖がアセンブリしていると推察された（図１２、図１３）。すなわち、（Ａα−Ｂβ−γ）２の完全分子構造であることが判明した。
【００７６】
２）Ｎ型糖鎖の付加
培養上清についてグリコペプチダーゼＦ（ＧＰＦ）を用いて３７℃で１７時間処理して組換えヒトフィブリノーゲンを消化し、ウェスタンブロットで分析して、各鎖のＮ型糖鎖付加について解析した。ｐフィブリノーゲンと比較し、ウェスタンブロットの結果を図１４に、それをまとめた結果を表９に示す。
【００７７】
【表９】
３）交差架橋フィブリン形成能
培養上清を緩衝液［２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＡＣＡ、１ｍＭ ＣａＣｌ２］に交換したものを血液凝固第ＸＩＩＩ因子（０．７Ｕ／ｍＬ）存在下または非存在下にトロンビン（３．３ＮＩＵ）と３７℃で反応させて、交差架橋フィブリン（フィブリン複合体）を形成させた。これを還元条件下でウェスタンブロッティングにより分析した。その結果、血液凝固第ＸＩＩＩ因子存在下にトロンビンと反応させたときのみ、分子量約９０ｋＤａの高分子領域にγ２鎖からなる交差架橋フィブリンのバンドが検出された（図１５）。
【００７９】
実施例８ 培養上清からの組換えヒトフィブリノーゲンの精製
実施例６の培養上清を回収し、緩衝液Ａ［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＥＡＣＡ］に透析後、同緩衝液で平衡化したＣＭ−セファロースカラムに吸着させた。同緩衝液で洗浄後、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む同緩衝液で溶出させた。溶出液の各画分についてＥＬＩＳＡを行い、ヒトフィブリノーゲンを含むことが確認された画分をプールし、ゲル濾過クロマト処理を行った。ゲル濾過にはＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムを用いた。展開液は０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０２５Ｍクエン酸ナトリウム、０．０２Ｍ ＥＡＣＡを含む０．０２５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。流速は１ｍＬ／分とした。分子量約３４０ｋＤａの画分を回収した。
【００８０】
実施例９ 精製フィブリノーゲンのフィブリン塊形成能
実施例８により精製した組換えヒトフィブリノーゲンを血液凝固第ＸＩＩＩ因子（０．７Ｕ／ｍＬ）存在下でトロンビン（３．３ＮＩＵ）と３７℃で反応させた。その結果、フィブリン塊の形成が肉眼で観察された。また、当該塊は血栓溶解剤（プラスミン）を添加することにより分解・溶解した。
【００８１】
実施例１０ ＧＡＰプロモーターの制御下に組換えヒトフィブリノーゲンが発現される酵母発現系
１）Ａα鎖発現ベクターの構築
ＧＡＰプロモーター遺伝子の取得
市販のＧＡＰプロモーターを有する発現ベクターｐＧＡＰＺαＡ（インビトロジェン社）を鋳型としてＰＣＲによりＧＡＰプロモーター遺伝子を増幅した。ＰＣＲプライマー用オリゴＤＮＡは公知のｐＧＡＰＺαＡの配列（ＧＥＮＥ、１８６巻、３７〜４４頁、１９９７年）を参考に合成した。すなわち、正方向プライマーはＧＡＰプロモーターの５’末端ＢｇｌＩＩサイトを除去し、代わりにＥｃｏＲＩおよびＰｍａＣＩサイトを付加するように合成した。また、逆方向プライマーはｐＧＡＰＺαＡのＧＡＰプロモーターの下流に位置するαファクタープレプロ配列の３’末端に相補的な配列とし、末端にＥｃｏＲＩサイトを付加するように設計した。得られた約０．８ｋｂのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ消化し、市販のクローニングベクターｐＵＣ１９の同サイトにクローニングした。このベクターをｐＩＭ１０８と命名した。
【００８２】
塩基配列の決定
構築したベクターＩＭ１０８のＧＡＰプロモーターに相当する領域の塩基配列を決定した。シークエンスプライマー用オリゴＤＮＡは公知のＧＡＰプロモーターのｃＤＮＡの塩基配列（上記のＧＥＮＥ誌）を参考にして合成した。その他は実施例１の１）の方法に従った。その結果、両者は一致した。
【００８３】
Ａα鎖発現ベクターの構築
実施例１で構築したベクターｐＩＭ１０４をＰｍａＣＩ＋ＡｓｕＩＩ消化してｍＡＯＸ２プロモーターを除いた断片にｐＩＭ１０８を同制限酵素で消化して得られたＧＡＰプロモーター遺伝子を挿入し、Ａα発現ベクターｐＩＭ１０９を構築した。ｐＩＭ１０９はＧＡＰプロモーター、Ａα鎖ｃＤＮＡ、ＡＯＸ１ターミネーター、ＡＲＧ４マーカーを含んでなる（図１６）。
【００８４】
２）Ｂβ鎖発現ベクターの構築
実施例１で構築したベクターｐＮＴ４０をＰｍａＣＩ＋ＡｓｕＩＩ消化してｍＡＯＸ２プロモーターを除いた断片にｐＩＭ１０８を同制限酵素で消化して得られたＧＡＰプロモーター遺伝子を挿入し、Ｂβ発現ベクターｐＩＭ１１０を構築した。ｐＩＭ１１０はＧＡＰプロモーター、Ｂβ鎖ｃＤＮＡ、ＡＯＸ１ターミネーター、ＳＵＣ２マーカーを含んでなる（図１７）。
【００８５】
３）γ鎖発現ベクターの構築
実施例１で構築したベクターｐＮＴ４１をＥｃｏＲＩ＋ＡｓｕＩＩ消化してｍＡＯＸ２プロモーターを除いた断片にｐＩＭ１０８を同制限酵素で消化して得られたＧＡＰプロモーター遺伝子を挿入し、γ発現ベクターｐＩＭ１１１を構築した。ｐＩＭ１１１はＧＡＰプロモーター、γ鎖ｃＤＮＡ、ＡＯＸ１ターミネーター、ＨＩＳ４マーカーを含んでなる（図１７）。
【００８６】
４）Ｂβ・γ２鎖を共発現させるベクターの構築
ｐＩＭ１１０をＥｃｏＲＩ＋ＣｌａＩ消化して得られたＢβ発現ユニットの両端を末端平滑化し、これをｐＩＭ１１１のＥｃｏＲＩ消化、末端平滑化ベクターと連結することにより、２鎖（Ｂβ・γ）発現ベクターｐＩＭ１１２を構築した。ｐＩＭ１１２はＧＡＰプロモーター制御のＢβおよびγ鎖の発現ユニット、ＨＩＳ４マーカーを含んでなる（図１７）。
【００８７】
５）酵母形質転換体の作製
Ａα単鎖発現ベクターｐＩＭ１０９およびＢβ・γ２鎖発現ベクターｐＩＭ１１２を各々の選択マーカー（相同領域）を利用して、ピキア酵母宿主ＰＰＦ１株を順次形質転換することでフィブリノーゲン３鎖共発現株を作製した。作製した株をＧＡＰ１１１株（１コピー組込み体）およびＧＡＰ２２２株（２コピー組込み体）と命名した。
【００８８】
６）分解抑制条件下での培養における組換えヒトフィブリノーゲンの産生
ＧＡＰプロモーターの制御下にヒトフィブリノーゲンを産生する形質転換体ＧＡＰ１１１株をクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を用いて調製した３×ＹＰ−３％の炭素源を含む培地を用いて、３０℃で７２時間まで培養した。炭素源はメタノール、デキストロース、グリセロールとした。培養上清を回収し、ウェスタンブロットで分析した。その結果、ヒトフィブリノーゲンの産生はいずれの培地でも確認されたが、メタノールを炭素源として用いたときに最も高いものであった（図１８）。
【００８９】
【発明の効果】
本発明によれば、血漿由来のフィブリノーゲンと同じ完全分子構造を有し、しかも生理活性も同一である組換えフィブリノーゲンを、安定的にかつ大量に製造することができる。また、血漿由来品とは異なり原料血漿に起因するウイルス汚染の危険性も生じない。従って、より安全性に優れたフィブリノーゲンをより安定的に臨床の場に供給することが可能となる。
【００９０】
【配列表】
配列表配列番号１：フィブリノーゲンＡα鎖のシグナル配列
配列表配列番号２：Ａα鎖のシグナル配列をコードする遺伝子
配列表配列番号３：フィブリノーゲンＢβ鎖のシグナル配列
配列表配列番号４：Ｂβ鎖のシグナル配列をコードする遺伝子
配列表配列番号５：フィブリノーゲンγ鎖のシグナル配列
配列表配列番号６：γ鎖のシグナル配列をコードする遺伝子
【００９１】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１〜４はｍＡＯＸ２プロモーターの制御下で組換えフィブリノーゲンを発現させるベクターの構築手順を概略的に示したものである。そのうち、本図はＡα鎖発現ベクターｐＩＭ１０４の構築手順を示す。
【図２】Ｂβ鎖発現ベクターｐＮＴ４０の構築手順を示す。
【図３】γ鎖発現ベクターｐＮＴ４１の構築手順を示す。
【図４】Ａα・Ｂβ・γ３鎖共発現ベクターｐＮＴ４３の構築手順を示す。
【図５】形質転換体の培養におけるｐＨの効果について、産生された組換えフィブリノーゲンをウェスタンブロット（還元条件、図６〜１１も同じ）にて分析した結果を示したものである。符号１〜４はなりゆきｐＨ（ｐＨ未調整）の場合を、符号５〜８はｐＨ５．５に調整した場合を各々示す。また、符号１と５は培養２４時間後のものを、符号２と６は同４８時間後のものを、符号３と７は培養７２時間後のものを、符号４と８は同９６時間後のものを各々示す。
【図６】形質転換体の培養におけるキモスタチンの効果について、産生された組換えフィブリノーゲンをウェスタンブロットにて分析した結果を示したものである。符号１〜４はキモスタチン無添加の場合を、符号５〜８はキモスタチンを培地に添加した場合を各々示す。また、符号１と５は培養２４時間後のものを、符号２と６は同４８時間後のものを、符号３と７は培養７２時間後のものを、符号４と８は同９６時間後のものを各々示す。
【図７】宿主株の種類と組換えフィブリノーゲンの産生量との関係についてをウェスタンブロットにて分析した結果を示したものである。符号１〜４はＧＮＴ４３株（野生株ＧＴＳ１１５）の場合を、符号５〜８はＳＮＴ４３株（プロテアーゼ欠損株ＳＭＤ１１６８）の場合を各々示す。また、符号１と５は培養２４時間後のものを、符号２と６は同４８時間後のものを、符号３と７は培養７２時間後のものを、符号４と８は同９６時間後のものを各々示す。
【図８】培地のｐＨと組換えフィブリノーゲンの産生量との関係についてウェスタンブロットにて分析した結果を示したものである。符号１〜３はなりゆきｐＨ（ｐＨ未調整）の場合を、符号４〜６はｐＨ５．５に調整した場合を各々示す。また、符号１と４は培養２４時間後のものを、符号２と５は同４８時間後のものを、符号３と６は同７２時間後のものを各々示す。
【図９】導入したベクターのコピー数と組換えフィブリノーゲンの産生量との関係についてウェスタンブロットにて分析した結果を示したものである。符号１〜３は１コピー株の場合を、符号４〜６は２コピー株の場合を、符号７〜９は３コピー株の場合を各々示す。また、符号１、４、７は培養２４時間後のものを、符号２、５、８は同４８時間後のものを、符号３、６、９は同７２時間後のものを各々示す。
【図１０】培地のメタノール濃度と組換えフィブリノーゲンの産生量との関係についてウェスタンブロットにて分析した結果を示したものである。符号１〜４はメタノール濃度２％の場合を、符号５〜８は同濃度３％の場合を各々示す。また、符号１と５は培養２４時間後のものを、符号２と６は同４８時間後のものを、符号３と７は同７２時間後のものを、符号４と８は同９６時間後のものを各々示す。
【図１１】培地のＹＰ濃度と組換えフィブリノーゲンの産生量との関係についてウェスタンブロットにて分析した結果を示したものである。符号１〜３はＹＰ濃度１×の場合を、符号４〜６はＹＰ濃度３×の場合を、符号７〜９はＹＰ濃度５×の場合を各々示す。また、符号１、４、７は培養２４時間後のものを、符号２、５、８は同４８時間後のものを、符号３、６、９は同７２時間後のものを各々示す。
【図１２】図１２と１３は各鎖の分子量と３鎖のアセンブリをウェスタンブロットにて分析した結果を示したものである。そのうち、図１２は還元条件での分析結果を示す。符号１は組換えフィブリノーゲンを示す。また、左端の符号は各分子量マーカーに対応するバンドの位置とその分子量を示したものである。
【図１３】非還元条件での分析結果を示す。符号１は組換えフィブリノーゲンを示す。また、左端の符号は図１２に同じ。
【図１４】Ｎ型糖鎖付加をウェスタンブロットにて分析した結果を示したものである。符号１と２は血漿由来フィブリノーゲンを、符号３と４は組換えフィブリノーゲンを各々示す。また、符号１と３はＧＰＦ未処理を、符号２と４はＧＰＦ処理後を各々示す。
【図１５】交差架橋フィブリンの形成をウェスタンブロット（還元条件）にて分析した結果を示したものである。符号１〜３は血漿由来フィブリノーゲンを、符号４〜６は組換えフィブリノーゲンを各々示す。また、符号１と４は未処理を、符号２と５はトロンビン処理を、符号３と６はトロンビンおよび血液凝固第ＸＩＩＩ因子処理を各々示す。
【図１６】図１６〜１７はＧＡＰプロモーターの制御下で組換えフィブリノーゲンを発現させるベクターの構築手順を概略的に示したものである。そのうち、本図はＡα鎖発現ベクターｐＩＭ１０９の構築手順を示す。
【図１７】Ｂβ鎖発現ベクターｐＩＭ１１０、γ鎖発現ベクターｐＩＭ１１１およびＢβ・γ２鎖共発現ベクターｐＩＭ１１２の、各々の構築手順を示す。
【図１８】ＧＡＰプロモーターの制御下で組換えフィブリノーゲンを発現させた場合のウェスタンブロット（還元条件）による分析結果を示したものである。符号１〜３は３×ＹＰ−３％メタノール培養系を、符号４〜６は３×ＹＰ−３％グルコース培養系を、符号７〜９は３×ＹＰ−３％グリセロール培養系を各々示す。また、符号１、４、７は培養２４時間後、符号２、５、８は同４８時間後、符号３、６、９は同７２時間後のものを各々示す。
【００９３】
【符号の説明】
Ｍ 分子量マーカー
Ｓ 血漿由来フィブリノーゲン
Ａα Ａα鎖に対応するバンド
Ｂβ Ｂβ鎖に対応するバンド
γ γ鎖に対応するバンド
γ２ 交差架橋フィブリンに対応するバンド
Claims (5)
- 以下の工程を含む、（Ａα−Ｂβ−γ）２の完全分子構造を有する組換えフィブリノーゲンの製造方法；
１）ピキア酵母での異種蛋白質の発現を制御可能なプロモーター、フィブリノーゲン由来のシグナル配列、フィブリノーゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖、γ鎖をコードする遺伝子を各々連結した発現用プラスミドを調製する工程、
２）当該プラスミドをピキア酵母に導入して形質転換体を調製する工程、
３）当該形質転換体をｐＨ５〜８の条件下で培養してフィブリノーゲンを産生する工程、および
４）培養上清から回収されたフィブリノーゲンを精製する工程。 - 前記プロモーターがアルコールオキシダーゼプロモーターまたはＧＡＰプロモーターである、請求項１記載の方法。
- 前記ピキア酵母がプロテアーゼ欠損株である請求項１記載の製造方法。
- 前記培養をセリンプロテアーゼ阻害剤の存在下で行う、請求項１記載の製造方法。
- 前記精製手段が陽イオン交換体処理、ゲル濾過処理である請求項１記載の製造方法。
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